Tirozin kinaz C-Abl interferon vositachiligidagi antiviral immunitetni STAT1 fosforillanishi orqali kuchaytiradi.

XULOSA

Transkripsiya (STAT) oilasining signal o'tkazgichi va aktivatorining interferon (IFN) tomonidan faollashishi antiviral immunitetning muhim hodisasidir. Bu erda biz retseptor bo'lmagan c-Abl va Arg kinazlari STAT1 bilan to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir qilishini va Y701da STAT1 ning fosforillanishini kuchaytirishini ko'rsatamiz. c-Abl/Arg IFNg yo'qligida Janus kinazalaridan mustaqil STAT1 fosforillanishiga vositachilik qilishi va IFNg vositachiligidagi STAT1 fosforillanishini kuchaytirishi mumkin. Bundan tashqari, STAT1 dimerizatsiyasi, yadro translokatsiyasi va quyi oqim gen transkripsiyasi c-Abl / Arg tomonidan tartibga solinadi. c-Abl/Arg (abl1/abl2) etishmovchiligi vesikulyar stomatit virusi bilan zararlangan hujayralardagi antiviral javoblarni sezilarli darajada bostiradi. Avtotransport bilan solishtirganda, c-Abl/Arg selektiv inhibitori AMN107 qo'llanilishi odam grippi virusi bilan kasallangan sichqonlarda o'limning sezilarli darajada oshishiga olib keldi. Tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, c-Abl STAT1 faollashuv signalizatsiya yo'lida muhim rol o'ynaydi va virusga qarshi immunitetni tartibga solishga muhim yondashuvni ta'minlaydi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

KIRISH

Interferonlar (IFN) virusli infektsiyaga qarshi tug'ma immunitetda va Yanus kinazlari (JAKs) va signal o'tkazgich va transkripsiya faollashtiruvchisi (STAT) faollashuvini tartibga solish va hujayra gen ifodasini qayta dasturlash orqali immunitetni nazorat qilishda asosiy rol o'ynaydi (Stark va Darnell, 2012). IFN larning tegishli retseptorlari bilan bog‘lanishi uchta bog‘langan JAK ning (JAK1, JAK2 va TYK2) o‘zaro fosforillanishiga va STATlarning to‘planishiga olib keladi, bu STATlarning C-terminal uchlari yaqinidagi yagona tirozin qoldiqlarini JAKlar tomonidan fosforlanishiga imkon beradi. (Platanias, 2005). Keyin faollashtirilgan STATlar dimerlanadi, yadroga o'tadi va ularning transkripsiyasini qo'zg'atish uchun IFNga javob beradigan genlarning promotorlari bilan bog'lanadi. STATlarning tirozin fosforlanishi IFN signalizatsiyasining JAK-STAT yo'lida muhim qadamdir va STAT dimerizatsiyasi, yadro translokatsiyasi va DNKni bog'lashda ishtirok etadi (Stark va Darnell, 2012). Shunday qilib, tirozin fosforillanishi STAT faollashtirish kaliti sifatida ishlaydi. Sichqonlarda JAK genlarini maqsadli ravishda buzish orqali olingan dalillar JAKlarning eng muhim STAT tirozin kinazlari ekanligini ko'rsatadi (Villarino va boshq., 2017). Shu bilan birga, STAT1, STAT3 va STAT5 dagi tirozin qoldiqlari epidermal o'sish omili va ichki tirozin kinaz faolligi bo'lgan trombotsitlardan kelib chiqadigan o'sish omili retseptorlari tomonidan JAK etishmovchiligi bo'lgan hujayralarda fosforlanganligi ham ko'rsatilgan (Leaman va boshq., 1996; Vignais va boshq. ., 1996). Bundan tashqari, v-Src, v-Abl va BCR-Abl kabi onkogen tirozin kinazlarni ifodalovchi transformatsiyalangan hujayralarda STATlarning konstitutsiyaviy faollashuvi kuzatilgan, ammo STATlar bu kinazalarning bevosita substratlarimi yoki yo'qligini aniqlash kerak (Danial va Rothman). , 2000; Reddy va boshqalar, 2000). c-abl (abl1) geni tomonidan kodlangan sutemizuvchilar Abelson kinaz c-Abl va arg (abl2) geni tomonidan kodlangan Abl bilan bog'liq gen oqsili Arg ko'p hujayrali jarayonlar uchun zarur bo'lgan hujayra ichidagi retseptorsiz tirozin kinazlar oilasining a'zolaridir, proliferatsiya, apoptoz, adezyon, hujayra migratsiyasi va stressga javoblar (Bradley va Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber va boshq., 2013; Pendergast, 2002). c-Abl ning kinaz faolligi normal fiziologik sharoitda qattiq tartibga solinadi. Retrovirus transduktsiyasi va xromosoma translokatsiyasi hodisalari mos ravishda Abl ning onkogen shakli bo'lgan v-Abl yoki BCR-Abl ifodasini keltirib chiqaradi (Advani va Pendergast, 2002). Bundan tashqari, sichqonlarda c-abl genini maqsadli ravishda yo'q qilish immun disfunktsiyasi bilan bog'liq pleiotropik fenotiplarga olib keladi, shu jumladan yuqori perinatal o'lim, taloq va timik atrofiya, limfopeniya va infektsiyaga sezgirlikning oshishi (Schwartzberg va boshqalar, 1991). Bundan tashqari, BCR-Abl-musbat surunkali miyeloid leykemiyani (CML) Abl inhibitörleri STI571 (imatinib) va AMN107 (nilotinib) bilan davolash bemorlarning bir qismidagi immunosupressiya bilan bog'liq (Dietz va boshq., 2004; Hochhaus va boshq., 2016; Mattiuzzi va boshqalar, 2003). Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, cAbl TCR (T hujayra retseptorlari) va BCR (B hujayra retseptorlari) vositachiligida signal uzatish, rivojlanish, ko'payish va sitokin ishlab chiqarishni tartibga solishda rol o'ynaydi (Gu va boshq., 2009; Pendergast, 2002). ; Silberman va boshqalar, 2008). Abl etishmovchiligi bo'lgan sichqonlar, shuningdek, T / B hujayralari sonining kamayishini ko'rsatadi (Gu va boshq., 2009; Liberatore va Goff, 2009; Schwartzberg va boshq., 1991). Biroq, c-Abl yo'qligi yoki inhibisyonu natijasida paydo bo'ladigan zaif immunitetning asosiy mexanizmlari tushunarsizligicha qolmoqda. JAK-STAT signalizatsiya yo'li BCR-Abl tomonidan qo'zg'atilgan transformatsiya uchun juda muhim ekanligi keng tarqalgan (Karlesso va boshq., 1996; Danial va boshq., 1998; de Groot va boshq., 1999). Shuning uchun, JAK-STAT c-Abl ishtirokidagi tug'ma immunitetga ham hissa qo'shishi mumkinligini tekshirishga arziydi. Bu erda biz STAT1 ning JAK-mustaqil tarzda c-Abl bilan o'zaro ta'siri va fosforlanganligi haqida xabar beramiz, bu orqali STAT1 ning dimerizatsiyasi, yadro lokalizatsiyasi va quyi oqim gen transkripsiyasi tartibga solinadi. Ushbu topilmalar JAK kinazasiga qo'shimcha ravishda c-Abl STAT1 ning to'liq faollashishi va keyingi IFN vositachiligidagi antiviral javoblar uchun ajralmas ekanligini ko'rsatdi.

Cistanche tubulosa foydalari- immunitet tizimini mustahkamlash

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

NATIJALAR

Interferon gamma-faollashtirilgan ketma-ketlik quyi oqim genlarining transkripsiyasi Abl kinaz tomonidan boshqariladi.

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 tasi c-abl/arg juft nokaut (DKO) va WT MEFlarida aniqlangan, ulardan 960 tasi yuqori va 784 tasi pastga tushirilgan (1A-rasm, chapda). Ushbu DEGlarning potentsial hujayra funktsiyalari va bog'liq yo'llarini qo'shimcha tekshirish uchun biz Gen Ontologiyasi (GO) tahlilini o'tkazdik (biologik jarayon, molekulyar funktsiya va hujayra tarkibiy qismidagi atamalar uchun) (S1A-rasm). c-Abl va Arg tomonidan pastga tushirilgan genlar asosan virusga qarshi mudofaa javoblari (GO: 0009615, GO: 0051607 va GO: 0045071) va immun javoblari (GO: 0002376, GO: 0045087) bilan bog'liq edi. Keyingi tahlillar shuni ko'rsatdiki, IFNga xos genlar (Liu va boshq., 2012) pastga regulyatsiya qilingan genlar (1A, o'ng va S1B-rasmlar) orasida boyitilgan. Differensial ifoda profillarini tasdiqlash uchun antiviral genlarning transkript darajalari, shu jumladan cxcl10, psmb9, tap1 va isg15, miqdoriy real vaqtda teskari transkripsiya-polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR) tahlillari orqali aniqlandi va psma5 darajalariga normallashtirildi. , bu c-Abl tomonidan yuqori darajada tartibga solinmaydi. WT MEF'lari bilan solishtirganda, c-abl / arg / MEF'lar ushbu genlarning transkript darajasini sezilarli darajada pastroq ko'rsatdi, ammo DKO sabab bo'lgan pasayishlar dozaga bog'liq holda c-Abl qutqaruvi bilan butunlay qaytarildi (1B va S1C-rasmlar). Ushbu ma'lumotlar IFN tomonidan qo'zg'atilgan genlar paneli c-Abl va Arg tomonidan tartibga solinganligini ko'rsatdi. IFN ga javoban Abl kinazlar tomonidan tartibga solinadigan asosiy transkripsiya elementlarini o'rganish uchun IFNg tomonidan boshqariladigan tap1/psmb9 umumiy ikki tomonlama promouter asosida lusiferaza reportyorlari tizimi qurilgan (1C-rasm). Kutilganidek, c-Abl/Arg-selektiv inhibitori AMN107 tap1 promouterining (qizil) transkripsiya faolligini sezilarli darajada inhibe qildi (1D-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, NFkB-ta'sir qiluvchi (ko'k) yoki IFN konsensus ketma-ketligi (sariq) elementlarini o'chirishdan farqli o'laroq, AMN107 bilan davolash gamma-faollashtirilgan ketma-ketlik (GAS) elementi (yashil) o'chirilganda tap1 promotor faolligiga ozgina ta'sir ko'rsatdi (1D-rasm). ). Ushbu topilmalar STAT{47}}maqsadli GAS cis-elementi c-Abl tomonidan boshqariladigan tap1 transkripsiyasida ishtirok etishidan dalolat beradi, bu esa STAT1 IFNga javob beruvchi gen ekspressiyasining c-Abl vositachiligida regulyatsiyasi uchun mas'ul ekanligini aniq ko'rsatadi.

c-Abl STAT1 bilan bevosita o'zaro ta'sir qiladi

IFN tomonidan qo'zg'atilgan TAP1 ifodasi c-Abl tomonidan, ehtimol STAT1 orqali tartibga solinadi, bu STAT1 c-Abl bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Ushbu gipotezani tasdiqlash uchun MCF{6}} hujayralarining lizatlari anti-c-Abl immunoprecipitatsiyasidan so'ng anti-STAT1 antikori bilan immunoblotatsiyadan o'tkazildi. STAT1 anti-c-Ablda mavjud edi, lekin IgG immunoprecipitates emas (2A-rasm). Keyinchalik, 293T hujayralari Myc-cAbl va Flag-STAT1 yoki Flag-Vector bilan nazorat sifatida kotransfektsiya qilindi. Flag-STAT1 ni birgalikda ifodalovchi, lekin Flag-Vector emas hujayralardan tayyorlangan anti-Flag immunopresipitatlarida Myc-c-Abl mavjudligi ektopik tarzda ifodalangan Myc-c-Abl va Flag-STAT1 o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rsatdi (2B-rasm, chap). Xuddi shunday natija o'zaro tajribada ham olingan (2B-rasm, o'ngda). Bundan tashqari, N-terminal domenida (NTD) c-Ablga juda homolog bo'lgan Abl oilasining boshqa a'zosi Arg (Abl2) ham STAT1 bilan o'zaro ta'sir qildi (S2A-rasm).

Shakl 1. c-Abl GAS elementlari orqali IFNga javob beruvchi genlarning promouterlarini tartibga soladi

Keyinchalik, Flag-c-Abl ifodalovchi 293T hujayralaridan tayyorlangan lizatlar agaroz-konjugatsiyalangan GST-STAT1 yoki faqat GST bilan inkubatsiya qilindi va Flag-c-Abl GST-STAT1 da aniqlandi, lekin GST adsorbatlari emas (2C-rasm). Hujayra lizatlaridagi boshqa komponentlar vositasida bilvosita bog'lanishni istisno qilish uchun Flag-c-Abl ifodalovchi 293T hujayralaridan tayyorlangan anti-Flag immunopresipitatlar SDS-PAGE (natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi) ga o'tkazildi va oqsillar PVDF (poliviniliden ftorid) membranasi va keyin eruvchan GST-STAT1 yoki GST (nazorat sifatida) bilan tozalanadi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, GST-STAT1, lekin GST emas, c-Abl bilan bevosita in vitro bog'langan (2D-rasm). c-Abl-bog'lovchi domenni aniqlash uchun agaroz-konjugatsiyalangan va GST bilan birlashtirilgan to'liq uzunlikdagi yoki kesilgan STAT1 (2E-rasm, yuqori panel) Flag-c-Ablni ifodalovchi 293T hujayralarining lizatlari bilan inkubatsiya qilindi. Anti-Flag antikori bilan immunoblotlash orqali adsorbatlarni tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, SH2 domeni va transaktivatsiya domenini o'z ichiga olgan hududni tashkil etuvchi STAT1 ning 577-750 aminokislotalari c-Abl o'zaro ta'siri uchun javobgardir (2E-rasm, pastki panel) . Xuddi shunday, anti-Flag antikori tomonidan immunoprecipitatsiya qilingan Flag-STAT1 SDS-PAGE tomonidan fraktsiyalangan va PVDF membranasiga o'tkazilgan. Keyin membrana faqat eruvchan GST-c-Abl SH3 yoki GST-c-Abl SH2 va GST bilan tozalandi. Natija c-Abl SH3 domeni STAT1 assotsiatsiyasi uchun mas'ul bo'lgan asosiy domen ekanligini ko'rsatdi (2F-rasm). Bundan tashqari, endogen c-Abl ning STAT1 bilan in situ o'zaro ta'siri Duolink proximity ligation assay (PLA) bilan baholandi. STAT1:c-Abl komplekslari asosan sitoplazmada kuzatilgan va bu komplekslarning shakllanishi IFNg stimulyatsiyasi bilan sezilarli darajada kuchaygan (2G-rasm). Birgalikda, bu topilmalar c-Abl va STAT1 o'rtasida in vitro va in vivo to'g'ridan-to'g'ri bog'liqligini ko'rsatadi.

Shakl 2. c-Abl STAT1 bilan o'zaro ta'sir qiladi

c-Abl JAK-mustaqil STAT1 fosforillanishiga vositachilik qiladi

STAT1 c-Abl substrati yoki yo'qligini tekshirish uchun tozalangan His-belgilangan STAT1 rekombinant c-Abl (237-643 aminokislotalarda katalitik domenni o'z ichiga olgan) bilan in vitro kinaz tahlili uchun ATP ishtirokida inkubatsiya qilindi. Reaksiya mahsulotini anti-fosfo-tirozin va anti-fosfo-STAT1 Y701 bilan immunoblotlash STAT1 tirozin qoldiqlarida (lar), shu jumladan Y701 da in vitroda c-Abl tomonidan to'g'ridan-to'g'ri fosforlanganligini ko'rsatdi (3A-rasm). Keyinchalik, biz 293T hujayralarida ifodalangan Flag-STAT1 tirozin, ayniqsa Y701 qoldig'ida Myc-c-Abl tomonidan fosforlanganligini, ammo kinaz-inaktiv mutant Myc-c-Abl (K290R) tomonidan emasligini aniqladik. Bundan tashqari, c-Abl/Arg-selektiv inhibitori AMN107 bilan davolashda c-Abl vositachiligidagi STAT1 fosforillanishi deyarli yo'q qilindi, bu STAT1 ning tirozin fosforillanishi c-Abl kinaz faolligiga bog'liqligini ko'rsatadi (3B-rasm). STAT1 Y701 fenilalanin bilan almashtirilganda c-Abl vositachiligida STAT1 fosforillanishi sezilarli darajada buzilgan, bu Y701 Abl ning asosiy fosfoziti ekanligini ko'rsatadi (3C-rasm). Bundan tashqari, STAT1 ham Arg tomonidan fosforlangan (S2B-rasm). c-Abl bilan fosforlangan maxsus STAT1 qoldiqlarini yanada aniqlashtirish uchun Myc-c-Abl bilan birgalikda ifodalangan Flag-STAT1 tandem massa spektrometriya tahlili bilan birga suyuq xromatografiyaga o'tkazildi. Yaxshi aniqlangan va funktsional jihatdan muhim bo'lgan STAT1 fosfoziti Y701 (Schindler va boshq., 1992; Shuai va boshq., 1993) bilan bir qatorda, boshqa ikkita fosfosit, Y106 va Y665 ham aniqlangan (S4A-rasm). WT STAT1 bilan solishtirganda, Y106F va Y701F mutantlari buzilgan tirozin fosforillanishini ko'rsatdi (3C-rasm). Biroq, STAT1 Y701 ning fosforlanishiga Y106 va Y665 fosforillanishi sezilarli darajada ta'sir qilmagan, bu Y106 va Y665 alohida rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi (S4B-rasm). Birgalikda, bu topilmalar STAT1 ning tirozin qoldiqlari, shu jumladan Y701 qoldig'i, Abl oilasi kinazalari tomonidan fosforlangan bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

JAKlar birinchi navbatda IFN-induktsiyali STAT1 Y701 fosforillanishi uchun javobgardir (Villarino va boshq., 2017). Kutilganidek, STAT1 Y701 fosforillanishi IFNg tomonidan qo'zg'atilgan va JAK1 va JAK2 ning bispesifik inhibitori bo'lgan ruxolitinib tomonidan sezilarli darajada inhibe qilingan (3D-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, Y701 fosforillanishining buzilganligi Abl inhibisyonida ham kuzatildi (3D-rasm, 4-bo'lak), bu c-Abl qisman IFNg tomonidan induktsiya qilingan STAT1 faollashuviga hissa qo'shishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, STAT1 Y701 fosforillanishi hujayra o'tkazuvchan c-Abl faollashtiruvchisi bo'lgan DPH tomonidan, AMN107 tomonidan butunlay qaytarilishi mumkin bo'lgan IFNg ga qaraganda kamroq darajada qo'zg'atilgan (3E-rasm). DPH tomonidan induktsiyalangan Abl faollashuvini tasdiqlash uchun Abl faollashuvining indikatori c-Abl Y412 fosforillanishi ham aniqlandi (3E-rasm). JAK2 faollashuvi birinchi bo'lib sodir bo'lishi va JAK1 ning keyingi faollashishi uchun zarur ekanligi ko'rsatilgan (Briscoe va boshq., 1996). JAK2 ning STAT1 faollashuviga ta'sirini istisno qilish uchun biz CRISPR orqali jak2-KO MCF-7 hujayra liniyasini yaratdik. Jak2-KO MCF-7 hujayralarida pasaygan, ammo aniqlanadigan STAT1 Y701 fosforillanishi, Myc-c-Abl ishtirokida xuddi shunday kuchayishi mumkin bo'lgan ota-ona MCF-7 hujayralariga nisbatan kuzatildi. lekin Myc-c-Abl (K290R) emas (3F-rasm) va AMN107 bilan davolashdan keyin yanada kamaygan. c-abl/arg/hujayralarida Y701da STAT1 ning IFNg tomonidan induktsiyalangan fosforillanishi vaqt va dozaga bog'liq holda katta darajada buzilgan (3G-rasm). Bu kuzatuvlarning barchasi shuni ko'rsatadiki, c-Abl kinaz IFNg-JAK signalizatsiya yo'liga bog'liq bo'lmagan holda STAT1 ni to'g'ridan-to'g'ri fosforillashi va faollashtirishi mumkin va eng muhimi, bu ikki kinaz Y701da STAT1 fosforillanishiga sinergik ta'sir ko'rsatishi mumkin.

Shakl 3. STAT1 c-Abl bilan fosforlangan

Shakl 4. c-Abl STAT1 dimer shakllanishiga va yadroviy importga yordam beradi

c-Abl vositachiligidagi fosforillanish STAT1 transaktivatsiyasi faoliyatini tartibga soladi

STATlarning tirozin fosforillanishi IFN signalizatsiyasining JAK-STAT yo'lida muhim bosqich bo'lib, STAT dimerizatsiyasi, yadro translokatsiyasi va DNKni bog'lashda ishtirok etadi. C-Abl vositachiligidagi fosforillanish STAT dimerizatsiyasini tartibga soladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun GFP-STAT1 va Flag-STAT1 Myc-c-Abl bor yoki yo'qligida 293T hujayralarida birgalikda ifodalangan. Anti-Flag immunopresipitatlarida GFP-STAT1 darajalari STAT1 dimerizatsiyasini ko'rsatish uchun tekshirildi. 4A-rasmda ko'rsatilganidek, c-Ablning birgalikda ifodalanishi STAT{16}}STAT1 homodimerlarining shakllanishini kuchaytirdi. MCF-7 hujayralarining immunofluoressensiya mikroskopiyasi shuni ko'rsatdiki, c-abl/arg ablatsiyasi yoki AMN107 bilan davolash IFNg tomonidan qo'zg'atilgan STAT1 yadro translokatsiyasini sezilarli darajada buzgan (4B va 4C-rasmlar).

Bundan tashqari, STAT1 ning promotor bilan bog'lanish faolligini tahlil qilish uchun elektromobillikni o'zgartirish tahlillari qo'llanildi. Aniqlash probi sifatida STAT1 bog'lovchi konsensus ketma-ketligini o'z ichiga olgan biotin yorliqli IRF1 promouter hududi ishlatilgan (Aaronson va Horvat, 2002). Bu zond ekzogen tarzda STAT1ni c-Abl bilan yoki bo'lmasdan ifodalovchi 293T hujayralaridan yadro ekstrakti bilan inkubatsiya qilingan, bu S5A-rasmga asosan muvozanatlangan. 4D-rasmda ko'rsatilganidek, yadro ekstraktida STAT1 ni o'z ichiga olgan ko'plab IRF1 prob bilan bog'langan komplekslar kuzatilgan (4D-rasm, 1-yo'lak). Kompleks shakllanishi IFNg bilan davolash bilan biroz oshdi (4D-rasm, 2-yo'lak) va c-Ablni ektopik tarzda ifodalovchi hujayralarda sezilarli darajada oshdi (4D-rasm, 3-yo'lak). Biroq, WT STAT1 bilan solishtirganda, c-Abl Y701F ni o'z ichiga olgan STAT1 promotorining bog'lanishiga ozgina ta'sir ko'rsatdi (4D-rasm, 7 va 8 qatorlar), Y106F va Y665F mutatsiyalari esa WT STAT1 bilan deyarli farq qilmadi. STAT1 va aniqlash probini o'z ichiga olgan komplekslarning o'ziga xosligi yorliqsiz raqobatchi zond qo'shilgandan so'ng tasdiqlandi (4D-rasm, 9-bo'lak). Bundan tashqari, STAT1ga qarshi antikorning qo'shilishi natijasida o'ta siljishli tasma hosil bo'ldi (4D-rasm, 11-bo'lak). Belgilangan zondlar nazorat sifatida 293T hujayralarining yadro ekstrakti bilan inkubatsiya qilinganida, hech qanday komplekslar kuzatilmadi (4D-rasm, 10-chizma). Ushbu natijalar c-Abl vositachiligidagi STAT1 Y701 fosforillanishi STAT1 ning maqsadli promouterlari bilan bog'lanishini kuchaytirishini ko'rsatadi.

Shakl 5. c-Abl IFN bilan bog'liq gen ifodasini tartibga soladi

Keyin, ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 va tap1 kabi asosiy STAT{1}}boshqariladigan genlarning IFNg tomonidan induktsiyalangan transaktivatsiyasi WT yoki c-abl/da baholandi. arg DKO MCF-7 xujayralari RT-PCR orqali. Kutilganidek, gen transkripsiyasi c-abl/arg kamayishi bilan sezilarli darajada buzilgan (5A-rasm). Bundan tashqari, odatda IFNg va IFNa tomonidan qo'zg'atilgan genlar AMN107 mavjudligida IFNlar tomonidan rag'batlantirilmadi (5B va 5C-rasmlar). Ushbu topilmalar STAT1 ning transaktivatsiya faolligi c-Abl tomonidan ijobiy tartibga solinishini ko'rsatadi.

c-Abl IFNga bog'liq antiviral ta'sirlarni kuchaytiradi

TAP1 va PSMB9 MHC sinf I antijenini qayta ishlash yo'lida peptidlarni ishlab chiqarish va taqdim etishda ishtirok etadi (Ghannam va boshq., 2014; Vitale va boshq., 1998). Oldingi topilmalarga ko'ra, JAWS II hujayralari tomonidan B3Z hujayralariga ovalbuminning antigen taqdimoti IL2 ishlab chiqarilishining kamayishi tufayli AMN107 tomonidan sezilarli darajada bostirildi (6A-rasm). STAT1 regulyatsiyasining antiviral biologik oqibatlarini c-Abl, WT va c-abl / arg / MEFs tomonidan oldindan suyultirilgan IFNg bilan yoki ketma-ket suyultirilgan holda, vesikulyar stomatit virusi (VSV) bilan kasallangan. VSV infektsiyasi AMN107 bilan davolash qilingan c-abl / arg / MEF va WT hujayralarida transport vositalari bilan davolash qilingan WT MEFlarga qaraganda ko'proq jiddiy hujayra o'limiga olib keldi (6B-rasm). IFNg bilan davolash virusli infektsiya natijasida kelib chiqqan hujayralar o'limini sezilarli darajada kamaytirdi, ammo AMN107 mavjudligida bu juda kam aniq ta'sir ko'rsatdi. Ushbu topilmaga muvofiq, MEFlarda c-abl/arg ablatsiyasi IFN stimulyatsiyasiga befarqlik bilan olib keldi, ammo bu ta'sir c-Abl qutqaruvi bilan sezilarli darajada qaytarildi (6B-rasm). Keyinchalik, AMN107 bilan yoki bo'lmagan holda davolash qilingan A549 hujayralari GFPni ifodalovchi Nyukasl kasalligi virusi (NDV) bilan kasallangan va natijalar virusning replikatsiyasi AMN107 bilan davolash orqali ham kuchayganligini, ammo c-Abl ifodasi bilan bostirilganligini ko'rsatdi (6C-rasm). DNK transfeksiyasi endogen IFN javobining faollashishiga olib keladi degan xulosaga ko'ra (Park va boshq., 2003), pcDNK vektori bilan transfeksiya virus tarqalishini inhibe qildi. Shunisi e'tiborga loyiqki, Flag-c-Abl bilan transfeksiya bo'sh vektor bilan transfeksiyadan ko'ra virus tarqalishiga aniqroq inhibitiv ta'sir ko'rsatdi (6C-rasm). Bundan tashqari, IFNg bilan davolash c-Abl-selektiv inhibitori AMN107 mavjudligida virusli infektsiyaga juda oz ta'sir ko'rsatdi (6D-rasm). Bu maʼlumotlar c-Ablning STAT vositachiligida virusga qarshi taʼsirida muhim rol oʻynashini koʻrsatadi. Keyinchalik biz c-Abl ning timositlarda maxsus nokaut qilingan call/fl, Lck-Cre (c-abl-shartli nokaut, c-abl-cKO) sichqonlarida virusli infektsiyadagi rolini o'rganib chiqdik (S7A-rasm). ) chunki c-abl genining germline nokauti tug'ilgandan keyingi dastlabki ikki hafta ichida yugurish va o'limga olib keladi (Koleske va boshq., 1998; Schwartzberg va boshq., 1991). Keyin WT va c-abl-cKO sichqonlari intranazal tarzda A gripp virusi (IAV) bilan kasallangan. WT sichqonlariga qaraganda c-abl-cKO sichqonlari orasida statistik jihatdan ahamiyatsiz yuqori o'lim kuzatildi. Barcha to'qimalarda c-Abl / Arg kinazlarini muntazam ravishda bostiradigan AMN107 ni doimiy ravishda boshqaradigan WT sichqonlari IAVga nisbatan sezuvchanlikni sezilarli darajada oshirdi (6E-rasm). Umuman olganda, bu topilmalar hayvonlarda virusga qarshi immunitet uchun c-Abl zarurligini ko'rsatadi.

Shakl 6. c-Abl IFNga bog'liq antiviral ta'sirlarni kuchaytiradi

MUHOKAZA

IFNg eng muhim immunomodulyatsion sitokinlardan biri bo'lib, virusli infektsiyaga qarshi tug'ma immunitetda muhim rol o'ynaydi. Kanonik IFNg signalizatsiyasida IFNg stimulyatsiyasida JAK1 va JAK2 yig'ilgan IFNg retseptorlarining (IFNGR) sitoplazmatik dumlariga jalb qilinadi va ketma-ket avtofosforilatsiya va transfosforilatsiya hodisalari orqali faollashadi (Stark, 2007; Villarino va boshqalar). Keyin, STAT1 o'zining SH2 domenini IFNGRda (Y440DKPH444) tanib olish ketma-ketligi bilan bog'lash orqali IFNGRga o'rnatiladi, uning ichida Y440 JAKlar tomonidan fosforlanadi (Greenlund va boshq., 1995). JAKlar tomonidan Y701 da fosforlanishidan so'ng, STAT1 dimerlanadi va yadroga o'tadi, u erda IFNg-ga javob beradigan genlar qatorining transkripsiyasini rag'batlantiradi (Aaronson va Horvat, 2002; Stark va Darnell, 2012). Sichqonlarda Stat1 ablasyonu IFNga transkripsiyaviy javoblarning yo'qligiga va hujayralarda IFN tomonidan qo'zg'atilgan antimikrobiyal va antiviral faollikning yo'qligiga olib keladi (Meraz va boshq., 1996). Stat1 / sichqonlar, shuningdek, o'z-o'zidan va kimyoviy (3-metilxolantren) keltirib chiqaradigan o'smalar (Kaplan va boshq., 1998) rivojlanishiga va ayrim yallig'lanish patologiyalariga yuqori sezuvchanlik (Bettelli va boshq., 2004; Villarino va boshq.) ., 2010). Bundan tashqari, STAT1 signalizatsiyasi T hujayralarini tabiiy qotil hujayra vositachiligidagi sitotoksiklikdan himoya qiladi (Kang va boshq., 2019).Ushbu topilmalar STAT1 ning tug'ma immunitet faollashuvi va o'sma immunitetiga vositachilik qilishini ko'rsatadi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Schlatterer va boshqalar. c-Abl, lekin Arg emas, STAT1 faollashuvi va interferon ishlab chiqarishni rag'batlantirish orqali neyronlarning yo'qolishiga olib kelishi mumkinligini xabar qildi. Biroq, c-Abl-ga bog'liq STAT1 faollashuvi uchun javobgar bo'lgan aniq mexanizm aniqlanmagan (Schlatterer va boshq., 2012). Bu erda biz c-Abl STAT1 ni bog'laydi va fosforlaydi va STAT2 bilan bevosita in vitro o'zaro ta'sir qiladi (2 va 3-rasmlar, S8A, S9A va S10A). STAT1 Y701 faqat JAK kinazlari tomonidan fosforlangan bo'lib, u STAT1 dimer shakllanishini (Schindler va boshq., 1992; Shuai va boshq., 1993) va IFNg signalizatsiyasi paytida nukleotsitoplazmatik siljishni tartibga soladi (Mao va boshq., 2005; Mertens va boshqalar; 2006; Zhong va boshq., 2005). Bizning tadqiqotimiz kutilmaganda JAKlardan tashqari boshqa kinaz c-Abl ham mustaqil ravishda STAT1 Y701 fosforillanishiga hissa qo'shishini aniqladi (3-rasm). Garchi c-Abl vositachiligida Y701 fosforillanishi JAKlarniki kabi kuchli bo'lmasa-da, Y701 maksimal fosforlanishga erishish uchun zarur bo'lib tuyuladi, chunki IFNg stimulyatori va IFNg-da c-abl / arg / hujayralarida Y701 fosforillanishining jiddiy buzilganligi kuzatilgan. induksiyalangan STAT1 Y701 fosforillanishi AMN107 tomonidan 1,25 mM dan 5 mM gacha, dozaga bog'liq tarzda inhibe qilingan (3G va S11A-rasmlar). Biroq, Y701 fosforillanishiga Y106 va Y665 ning fosforillanish holati, ya'ni c-Abl ning boshqa ikkita fosfoziti unchalik ta'sir qilmaydi, bu esa kuchaytirilgan STAT1 Y701 fosforillanishi c-Abl vositachiligida emas, balki STAT1 ning ko'p joyli fosforillanishi natijasida yuzaga kelishini ko'rsatadi. yaxshilangan JAK faoliyati bilan bog'liq. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, JAK1 ning konstitutsiyaviy faollashuvi va JAK2 ning o'zgaruvchan faollashuvi BCR-Ablni ifodalovchi hujayralarda kuzatilgan (Chai va boshq., 1997; Henderson va boshq., 1997; Shuai va boshq., 1996). Bundan tashqari, BCR-Abl JAK1, JAK2 va JAK3 ning tirozin fosforillanishi orqali STAT1 va STAT2 ni kamtarona faollashtirishi ko'rsatilgan (Henderson va boshq., 1997). Mavjud dalillar Abl va JAKs Y701 da STAT1 fosforillanishiga aniq sinergik ta'sir ko'rsatishi mumkinligini tasdiqlaydi (3E-rasm).

Y701 ga qo'shimcha ravishda Y106 va Y665 ning fosforillanishi bir vaqtning o'zida aniqlangan (3C va S4A-rasmlar). Ushbu fosfositlar STAT1 Y701 fosforillanishida yoki STAT1 gomodimerizatsiyasida ishtirok etmagan (S4B va S4C rasmlari). Biroq, Merfi va uning hamkasblari monomerlarning NTDlari (N-terminal oqsil o'zaro ta'sir doirasi, aminokislotalar 1-136) o'rtasidagi o'zaro ta'sir fosforlanmagan to'liq uzunlikdagi STAT molekulalarining dimerizatsiyasi uchun zarur ekanligini aniqladilar (Ota va boshq., 2004). STAT1 mutantlari (F77A va/yoki L78A) fosforillanmagan dimerlarni hosil qila olmaydi va bu mutantlar IFN bilan ishlov berilgan hujayralarda fenotip bo'yicha barqaror fosforlanishni va in vitroda TC vositachiligida fosforillanishga qarshilik ko'rsatadi (Mertens va boshq., 2006). F77 va L78 yaqinida joylashgan NTDdagi Y106 STAT1 ni fosforlangan dimer holatida saqlash va ionlashtiruvchi nurlanish ostida yadroda STAT1 ni saqlash uchun javobgar bo'lishi mumkin (S6A va S6B rasmlari). Bundan tashqari, SH2 domeni fosforlangan tirozin o'z ichiga olgan domen bilan fosforlangan homodimer shakllanishi IFN tomonidan qo'zg'atilganda o'zaro ta'sir qiladi (Shuai va boshq., 1994). SH2 domenida joylashgan Y665 dimerizatsiyaga ta'sir qilishi mumkin. c-Abl vositachiligida fosforillanish joylari (Y106 va Y665) funktsiyalari qo'shimcha tekshirishni talab qiladi.

JAKlarga o'xshab, c-Abl vositachiligidagi fosforillanish STAT1 dimerining shakllanishini (jumladan, STAT1- STAT1 homodimer va STAT1-STAT2 geterodimer shakllanishini (4A, S12A va S12B-rasmlar)), yadro translokatsiyasini, DNKni bog'lashni tartibga soladi. , va IFN-stimulyatsiya qilingan genlarning transkripsiyasi. Abl ning buzilishi potentsial virus proliferatsiyasiga va virus keltirib chiqaradigan hujayralar o'limining oshishiga yordam berdi (6B, 6C va 6D rasmlari). Bundan tashqari, biz ionlashtiruvchi nurlanish (IR) c-Abl inhibitori yo'qligida STAT1 yadro translokatsiyasini keltirib chiqarganini aniqladik (S6A va S6B rasmlari). IR to'g'ridan-to'g'ri c-Ablni faollashtiradi (Pendergast, 2002) va keyinchalik STAT{21}}bog'liq IFNg signalizatsiyasi, bu radiatsiya terapiyasi o'simtaga IFN-kaskadli tug'ma va adaptiv immun hujumini boshlaydigan asosiy mexanizmni ta'minlashi mumkin (Burnette va boshq. ., 2011) va IQ stimullariga javoban kuchli tug'ma immunitet holatini taklif qiladi. WT littermates bilan solishtirganda, c-abl shartli ravishda timositlarda nokauta qilingan sichqonlar yuqori, ammo statistik jihatdan ahamiyatli bo'lmagan o'limni ko'rsatdi. Shunisi e'tiborga loyiqki, c-Abl/Arg inhibitori AMN107 ni muntazam ravishda qo'llagan sichqonlar o'lim darajasi yuqori bo'lgan (6E-rasm), bu turli to'qimalarda c-Abl ifodasi hayvonlarda virusga qarshi immunitetga hissa qo'shganligini ko'rsatadi. Ushbu ma'lumotlardan biz endogen Abl virusli infektsiyaga yashirin bazal qarshilik ko'rsatishini va ionlashtiruvchi nurlanish tomonidan qo'zg'atilgan faollashtirilgan Abl hujayralarni himoya qilishini taklif qilamiz. Abl kinazlar KML bilan og'rigan bemorlarning ko'pchiligida konstitutsiyaviy ravishda faollashadi. Abl kinaz inhibitörleri STI571 va AMN107 CML terapiyasi uchun oldingi davolash usuli hisoblanadi. Shu bilan birga, yuqori nafas yo'llarining infektsiyasi va immunosupressiya odatda kuzatiladi, bu STAT vositachiligidagi immunitetni tartibga solish yo'lining repressiyasidan kelib chiqishi mumkin (Hochhaus va boshq., 2016; Mattiuzzi va boshq., 2003). Bizning topilmalarimiz terapiyani optimallashtirish uchun nazariy asosni qo'shdi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Xulosa qilib aytganda, tirozin kinaz c-Abl in vivo va in vitroda STAT1 bilan bog'lanishi, JAKlardan mustaqil Y701 da STAT1 fosforillanishini rag'batlantirishi, transaktivatsiyani kuchaytirishi va infektsiyaga qarshi tug'ma immunitet reaktsiyalariga vositachilik qilishi aniqlandi, ayniqsa c kontekstida. -Abl bilan bog'liq stress. Bizning topilmamiz STAT1 faollashuvi uchun qo'shimcha yondashuvni taqdim etadi, bu esa IFN quyi oqim signalizatsiya yo'lini tartibga solish bo'yicha o'sib borayotgan bilimlarga hissa qo'shadi.

ADABIYOTLAR

Aaronson, DS va Horvat, CM (2002). JAK-STATni bilmaganlar uchun yo'l xaritasi. Fan 296, 1653–1655.

Advani, AS va Pendergast, AM (2002). BcrAbl variantlari: biologik va klinik jihatlari. Leyk. Res. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH va Kuchroo, VK (2004). T-betning yo'qolishi, ammo STAT1 emas, eksperimental otoimmün ensefalomielitning rivojlanishiga to'sqinlik qiladi. J. Exp. Med. 200, 79–87.

Bredli, WD va Koleske, AJ (2009). Abl-oila kinazlari tomonidan hujayra migratsiyasi va morfogenezini tartibga solish: paydo bo'ladigan mexanizmlar va fiziologik kontekstlar. J. Hujayra fanlari. 122, 3441– 3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN va Kerr, IM (1996). JAK1 ning kinaz-salbiy mutantlari interferon-gamma-induktsiyali gen ekspressiyasini saqlab turishi mumkin, ammo antiviral holat emas. EMBO J. 15, 799–809.

Carlesso, N., Frank, DA va Griffin, JD (1996). Bcr/Abl tomonidan o'zgartirilgan gematopoetik hujayra chiziqlaridagi transkripsiya (STAT) oqsillarining signal o'tkazgichlari va faollashtiruvchilarining tirozil fosforillanishi va DNK bilan bog'lanish faolligi. J. Exp. Med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL va Rothman, P. (1997). Leykemiya bilan og'rigan bemorlardan olingan BCR Abl ifodalovchi hujayra chiziqlari va periferik qon hujayralarida JAK va STATlarning konstitutsiyaviy faollashuvi. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Colicelli, J. (2010). ABL tirozin kinazlari: funktsiya evolyutsiyasi, tartibga solish va o'ziga xoslik. Sci. Signal. 3, re6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Vang, JY va Rothman, PB (1998). Jak1 va v-Ablning to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'siri v-Abl-induktsiyali STATlarning faollashishi va tarqalishi uchun talab qilinadi. Mol. Hujayra Biol. 18, 6795–6804.

Danial, NN va Rothman, P. (2000). Abl onkogenlar tomonidan faollashtirilgan JAK-STAT signalizatsiyasi. Onkogen 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R. va Koenderman, L. (1999). BCR-Abl tomonidan STAT5 faollashuvi K562 leykemiya hujayralarining transformatsiyasiga yordam beradi. Qon 94, 1108-1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR va Vuk-Pavlovich, S. (2004). Imatinib mesilat in vitroda T-hujayra proliferatsiyasini va in vivo kechikkan tipdagi yuqori sezuvchanlikni inhibe qiladi. Qon 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. va Liu, X. (2017). c-abl/arg onkogen kinazlar tomonidan differentsial gen ekspressiyasini global tartibga solish. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , va boshqalar. (2014). Miyozitda immunoproteasoma subbirliklarining yuqori regulyatsiyasi antigen taqdim qiluvchi hujayralar, CD8 T-hujayralari va IFNGamma ishtirokida faol yallig'lanishni ko'rsatadi. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. va Schreiber, RD (1995). Statistikani tirozin-fosforlangan sitokin retseptorlari tomonidan jalb qilish: buyurtma qilingan qaytariladigan yaqinlik bilan boshqariladigan jarayon. Immunitet 2, 677–687.

Greuber, EK, Smit-Pirson, P., Vang, J. va Pendergast, AM (2013). Saraton kasalligida ABL oilasi kinazalarining roli: leykemiyadan qattiq o'smalarga qadar. Nat. Rev. Saraton 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR va Pendergast, AM (2009). T-hujayra signalizatsiyasida abl tirozin kinazlar. Immunol. Vahiy 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. va Deisseroth, AB (1997). JAK1 kinazni faollashtirishda bcr-abl ning potentsial roli. Klin. Saraton Res. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE va boshqalar. (2016). Surunkali fazadagi surunkali miyeloid leykemiya uchun frontline nilotinib va ​​imatinibning uzoq muddatli foydalari va xavflari: 5- randomize ENEST sinovining yillik yangilanishi. Leykemiya 30, 1044-1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. va Snapper, SB (2019). STAT1 signalizatsiyasi T hujayralarini NK hujayra vositachiligidagi sitotoksiklikdan himoya qiladi. Nat. Kommun. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ va Schreiber, RD (1998). Immunitetga ega sichqonlarda interferon gammaga bog'liq o'smalarni kuzatish tizimini namoyish qilish. Proc. Natl. akad. Sci. AQSh 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Skott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA va Baltimor, D. (1998). Neyrulyatsiyada Abl va Arg tirozin kinazlari uchun muhim rollar. Neyron 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE va ​​Stark, GR (1996). JAKlarning STATlarni faollashtirishdagi roli va epidermal o'sish omili tomonidan c-fos geni ifodasini rag'batlantirish. Mol. Hujayra Biol. 16, 369–375.