Cur-induced autofagiyaning CBMSC qarishiga ta'sirini o'rganish

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

2.5. CBMSC qarish davrida Curning himoya ta'sirini amalga oshirishda inovololarning avtofagiyasi

Cur-induktsiya qilingan autofagiyaning cBMSC qarishiga ta'sirini o'rganish uchun avtofagiya darajasi RAP (200 nM) yoki 3-MA (5 mM) yordamida modulyatsiya qilindi.3-MA muhim inhibitiv ta'sir ko'rsatadi. mikronaychalar bilan bog'langan protein 1 engil zanjiri 3(LC3), autofagiya bilan bog'liq gen (ATG)7, ATG12 va avtofagiyani faollashtiruvchi kinazga o'xshash51-mRNK ifodasining sezilarli darajada pasayishi bilan namoyon bo'ladigan otofagik faollik. {14}}(ULK1); mikronaychalar bilan bog'liq bo'lgan oqsil 1 engil zanjiri 3 turi Ⅱ/I (LC3-I/I) ifoda nisbatining pasayishi; va nazorat guruhi bilan solishtirganda p62 ning ortib borayotgan ifodasi (5A, B-rasm). Shunga ko'ra, Cur guruhi bilan solishtirganda, 3-MA plus Cur guruhida otofagik faollikning pasayishi kuzatildi (5A, B-rasm). Aksincha, RAP guruhida otofagik faollikning oshishi kuzatildi, bu LC3, ATG12 va ATG7 ning yuqori tartibga solingan mRNK ifodasi bilan tasdiqlanadi; LC3-I ning LC3-II ga konversiyasi ortdi; va p62 degradatsiyasi (5A, B-rasm).

Birinchidan, avtofagik faollik tizimli ravishda o'rganildi. Avtofagik vakuolalarning (shuningdek, autofagosomalar deb ataladi) shakllanishi morfologik kuzatish orqali baholandi va natijalar nazorat guruhiga nisbatan Cur guruhi va RAP guruhida avtofagik vakuolalar va LC3 nuqtalari ko'proq ekanligini, avtofagik vakuolalar soni esa kamayganligini ko'rsatdi. 3-MA va 3-MA plyus Cur guruhlarida kamroq LC3 nuqtalari kuzatildi (5C, E-rasm). Bundan tashqari, LysoTracker binoni cBMSC'larda lizosomal kislotalanish RAP va Cur tomonidan kuchaytirilganligini va kamayganligini ko'rsatdi. 3-MA va 3-MA va Cur guruhlari (5D-rasm). Natijalar shuni ko'rsatadiki, Cur va RAP otofagiya faollashuviga xuddi shunday ijobiy ta'sir ko'rsatadi va autofagik faollik 3-MA tomonidan bostiriladi.cistanche jinsiy olatni o'lchami,Biroq, 3-MA ning autofagiyaga inhibisyon ta'sirini Cur yordamida qisman qutqarish mumkin.

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

Autofagiya CB MSc qarishini tartibga solishda ishtirok etadimi yoki yo'qligini tasdiqlash uchun biz farmakologik davolash orqali avtofagiyani rag'batlantirish yoki bostirishdan keyin qarilik bilan bog'liq fenotiplarni ko'rib chiqdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Cur va RAP guruhlarida SA- -gal-musbat hujayralar soni kamaygan, {{5}da esa SA- -gal-musbat hujayralar soni ko'paygan. }MA guruhi nazorat guruhi bilan solishtirildi. Shunisi e'tiborga loyiqki, SA{6}}gal-musbat hujayralar soni Cur guruhiga nisbatan 3-MA plus Cur guruhida sezilarli darajada oshdi (rasm). RT-qPCR tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, RAP va Cur bilan davolash SOX-2 va Nanog ifoda darajasini oshirdi va IL-6, TNF-a, p21 va p16 ifoda darajasini pasaytirdi. nazorat guruhi bilan. Biroq, 3-MA tomonidan autofagiyaning inhibisyonu p16, p21, TNF- va IL-6 ifodasini ko'tardi (6C-E-rasm). Bundan tashqari, nazorat guruhi bilan solishtirganda, Cur va RAP guruhlarida cBMSClarning koloniya hosil qiluvchi samaradorligi oshdi, 3-MA guruhida CFU-F soni va hajmi sezilarli darajada kamaydi. Bundan tashqari, Cur ning koloniya hosil qiluvchi cBMSC soniga kuchaytirilgan ta'sirini 3-MA bilan oldindan shartlash orqali bekor qilish mumkinligi ko'rsatildi (6B-rasm).cistanche kukuniBu dalillar shuni ko'rsatadiki, RAP va Cur cBMSC qarishini yaxshilashi mumkin, 3-MA esa cBMSC qarishini kuchaytiradi va Cur tomonidan qo'llaniladigan foydali ta'sirlarni susaytiradi.

Birgalikda bu natijalar shuni ko'rsatadiki, 3-MA bilan autofagiyaning inhibisyonu cBMSC qarishini tezlashtiradi, Cur va RAP bilan autofagiya faollashishi esa cBMSC qarishini engillashtiradi (6F-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, Cur tomonidan qo'llaniladigan himoya ta'siri 3-MA (6F-rasm) bilan oldindan ishlov berish orqali susaytirildi, bu Cur tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya cBMSC qarishini yaxshilash uchun potentsial molekulyar mexanizm ekanligini ko'rsatadi.

3. Munozara

Organizmlar shikastlangan to'qimalarni doimiy ravishda tiklaydi va turli to'qimalar va organlarda keng tarqalgan MSClarning o'ziga xos funktsional xususiyatlari tufayli qarish bilan bog'liq jarayonlarni kechiktiradi [15]. Afsuski, yosh va kasallik in vivo MSC qarishi uchun asosiy omillardir va hujayra muhitidagi ichki va tashqi farqlar MSC qarishini in vitro madaniyatida tezlashtiradi, bu ikkalasi ham ularning immunosupressiya, differentsiatsiya va migratsiya qobiliyatiga salbiy ta'sir qiladi va natijada o'z-o'zini boshqarish samaradorligini pasaytiradi. -MSKlarda ta'mirlash va transplantatsiya [7,14,49-51].cistanche salsa ekstraktiOja va uning hamkasblari shuni ta'kidladilarki, inson BMSClari klinik darajadagi madaniyatlarning beshinchi to'qqizinchi o'tishida proliferatsiyani to'xtatdi va gipertrofik va tekis morfologiya kabi tipik qarish fenotiplarini namoyish etdi, hujayra sikli kinaz inhibitörleri p16 va p21 faollashishi, proliferatsiya tezligining pasayishi. , va SA{3}}gal [52] faolligini oshirdi. Ko'rinib turibdiki, in vitro kengayish muqarrar ravishda in vitro hujayrali qarish tadqiqotlari uchun muhim model tizimi hisoblangan MSClarda qarishning erta paydo bo'lishiga olib keladi [42, A4, A5]. Bizning hozirgi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, 3-chi o'tishdan oldin cBMSC'lar bir xil morfologiyani namoyish etgan, ammo 6-chi o'tishdan keyin hujayra morfologiyasi, fiziologiyasi va gen ifodasi jihatidan bir qator o'zgarishlarga duchor bo'lganligi kuzatilgan (2 va 7-rasmlar), erta qarish bilan mos keladi. .

Cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

Ko'payib borayotgan dalillar farmakologik stimulyatsiya MSClarni qarilikdan qutqarish uchun istiqbolli yondashuv ekanligini ko'rsatadi [53,54]. Buni hisobga olgan holda, in vivo va in vitro [15,55] yallig'lanishga qarshi, antioksidant va qarishga qarshi potentsialini aniqlash uchun bir qator tabiiy va sintetik birikmalar keng ko'lamda o'rganildi. Tabiiy fenolik birikma sifatida Cur MSC biologiyasiga foydali ta'siri tufayli katta e'tiborni tortdi [36,37,56,57]. Biroq, turli xil biotibbiyot tadqiqotlarini amalga oshirishdan oldin Cur ta'sirining MSClarga murakkab ta'sirini diqqat bilan ko'rib chiqish kerak. Yang va uning hamkasblari Curning yuqori konsentratsiyasi (50 va 100 uM) in vitro inson BMSClarida o'tkir toksik ta'sirlarni keltirib chiqarishi mumkinligini xabar qilishdi, shu bilan birga doimiy ta'sir qilish (7 d) dan 10 umM Cur inson BMSC proliferatsiyasini inhibe qiladi va hujayra apoptozini qo'zg'atadi [58]. Qizig'i shundaki, boshqa tadqiqot shuni ko'rsatdiki, Cur bilan davolash (<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

So'nggi paytlarda Curning biologik faolligi turli xil in vitro yoki in vivo modellarida, xususan, MSC biologik xususiyatlarini modulyatsiya qilish bo'yicha keng tarqalgan. Curning qarishga qarshi faolligi tez-tez muhokama qilingan va Cur organizm va hujayra darajasida qarish va yoshga bog'liq kasalliklarga foydali ta'sir ko'rsatishi aniqlangan. Biroq, uni tartibga solish mexanizmi Curning turli dozalari va shakllari, shuningdek, qarish mexanizmi [19] tufayli murakkabdir. Molekula degradatsiyasi va organellalar almashinuvining asosiy hujayra ichidagi mexanizmi sifatida avtofagiya MSClarni stress sharoitlaridan himoya qilish va hujayra gomeostazini saqlashda katta rol o'ynaydi. Avtofagiya modulyatsiyasi MSC funktsiyalarini yaxshilash uchun yangi strategiya hisoblanadi [59]. Muhim tadqiqotlar natijasida to'plangan ma'lumotlarga ko'ra, turli hujayra modellarida Cur tomonidan otofagiyani rag'batlantirish yoki bostirish qoniqarli sitoprotektiv ta'sir ko'rsatadi [38-40].cistanche poyasiBizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, Cur ta'siridan keyin autofagiya faolligining oshishi kuzatilgan, bu autofagiya bilan bog'liq genlarning (LC3, ULK1, Atg7 va Atg12) ko'tarilishi, LC 3-II generatsiyasi, sonining ko'payishi bilan aniqlangan. otofagik vakuolalar va kislotali vesikulyar organellalar va p62 oqsil darajasining sezilarli darajada pasayishi (4-rasm). Bundan tashqari, lizosoma avtofagiya uchun ajralmas organella sifatida qaraladi, shu bilan birga MSC qarish jarayonida lizosomal pH ning buzilishi va vakuolyar H va -ATPase (v-ATPase) faolligining o'zgarishi kuzatildi, shu bilan lizosomal kislotalanish va autofagiya va hissa qo'shadi. MSC qarishini kechiktirish uchun [60]. Yan va uning hamkasblari Cur sichqon embrion fibroblastlarining (MEF) lizosoma funktsiyasini faollashtirishi va omon qolish uchun muhim signal bo'lib xizmat qiluvchi avtofagiyani keltirib chiqarishi mumkinligini ta'kidladilar [38]. Xuddi shunday, biz Cur bilan davolash cBMSClarda lizosomal kislotalanishni kuchaytirishini kuzatdik (4-rasm), bu Curning avtofagik faollikni oshirish uchun ajralmas bo'lgan lizosoma funktsiyasini faollashtirishda ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatdi.

Avtofagiya asosan sitoprotektiv mexanizm bo'lib, ortib borayotgan dalillar tabiiy va sintetik birikmalarning qarishga qarshi xususiyatlari otofagiya modulyatsiyasi bilan bog'liqligini ko'rsatdi [29,54,61,62]. Biroq, avtofagiya modulyatsiyasining MSC qarishiga ta'siri va tegishli mexanizmlar hali to'liq baholanmagan va o'rganilmagan. Dastlabki ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, avtofagiya asosan sitoprotektiv mexanizmdir va avtofagiyaning yuqori darajasi zaharli metabolitlarning to'planishini kamaytirish va organellalar funktsiyasini tiklash orqali hujayra qarishini kechiktirishi mumkin [63]. Qizig'i shundaki, yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, avtofagik vakuolalar va otofagiya bilan bog'liq oqsillar (LC{7}}II, ATG7 va ATG12) sonining ko'payishi MSC qarish davrida kuzatilgan, shu bilan birga bafilomisin A1 va {{11} bilan autofagiya inhibisyonu kuzatilgan. }}MA SA{12}}gal-musbat hujayralar foizini va p16 va p21 [35] ifodasini kamaytirishi ko'rsatilgan. Cur tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya va uning cBMSCsenesensiyaga ta'siri o'rtasidagi bog'liqlikni yanada aniqroq aniqlash uchun avtofagiya rapamisin yoki 3-MA bilan oldindan ishlov berish orqali modulyatsiya qilindi. Shubhasiz, otofagik faollik 3-MA tomonidan zaiflashgani aniqlandi, RAP va Cur (1 uM) esa avtofagiyani sezilarli darajada kuchaytirishi ko'rsatilgan (5-rasm). Oldingi hisobotlarga [5] muvofiq, bizning topilmalarimiz, shuningdek, 3-MA tomonidan autofagiyaning inhibisyonu cBMSClarda hujayra qarishini tezlashtirganini ko'rsatadi. Autofagiya faollashuviga deyarli izchil ta'sirlar Cur (1uMand RAP) tomonidan amalga oshirilgan va shunga o'xshash sitoprotektiv ta'sirlar. cBMSC'lar ko'rsatildi. Shunga ko'ra, 3-MA tomonidan autofagiya inhibe qilinganida, Cur tomonidan qo'llaniladigan himoya ta'siri kamaydi (rasm), bu Cur sabab bo'lgan autofagiya cBMSC qarishini yaxshilash uchun potentsial molekulyar mexanizm ekanligini ko'rsatadi (7-rasm).

Fiziologik sharoitda autofagiya hujayra gomeostazini saqlab turish uchun barcha eukaryotik hujayralarda bazal darajada sodir bo'ladi. Biroq, turli xil stress holatlari, agar autofagiya optimal darajaga qaytarilmasa, hujayra taqdiriga ta'sir qiladigan g'ayritabiiy otofagiyaga olib kelishi mumkin [41,44,64]. Bizning dalillarimiz Cur tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya cBMSC qarishini tartibga solishga foydali ta'sir ko'rsatishini tasdiqladi. Ushbu stsenariyda turli xil stressni keltirib chiqaradigan stimullar va hujayradan tashqari sozlamalar Cur bilan davolashdan oldin diqqat bilan ko'rib chiqilishi kerak va Cur tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya MSC funktsiyasini oldindan belgilangan dozada va muddatda tanlab yaxshilay oladimi yoki yo'qligini tekshirish qiziq. Bundan tashqari, nanotexnologiyaga asoslangan curcumin yetkazib berish tizimi yaxshi suvda eruvchanlik va bioavailability darajasini ko'rsatdi [65,66]; bu MSC qarishini kechiktirish va unga qarshi kurashish uchun istiqbolli vosita bo'lishi mumkin. Avtofagiya MSC qarishini kechiktirishning asosiy mexanizmimi yoki yo'qmi degan savolga javob hali ham kelajakdagi tadqiqotlar tomonidan taqdim etiladigan qo'shimcha ma'lumotlarni talab qiladi.

4. Materiallar va usullar

4.1.Hayvonlar

Suyak iligi namunalari 6 ta sog'lom katta yoshli xitoylik qishloq itlaridan (12-oylik) olingan. Barcha tadqiqotlar Sichuan qishloq xoʻjaligi universitetining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish fakulteti qoʻmitasi tomonidan tasdiqlangan (tasdiqlash raqami.2020-0608) va Xitoy Xalq Respublikasining hayvonlarni himoya qilish qonunlarining axloqiy meʼyorlariga muvofiq olib borilgan.

4.2. Curcumin eritmasini tayyorlash

Cur (HPLC 98 foizdan katta yoki unga teng, CAS raqami:458-37-7; Solar Science & Technology Co., Ltd., Pekin, Xitoy) DMSOda 20 mmol/aktsiya konsentratsiyasigacha eritildi. L. 0,22 mkm organik mikro gözenekli filtrli membrana orqali filtrlanadi va -80 darajada saqlanadi. Turli xil Cur eritmalari in vitro o'rganish uchun muhitda tayyorlangan.

4.3. Hujayra madaniyati va kengayishi

cBMSCs suyak iligidan olingan. Hujayralar kam glyukozali Dulbecco modifikatsiyalangan burgut muhiti (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, AQSh), 10 foizli homila sigir zardobidan (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Pekin, Xitoy) tashkil topgan to'liq muhitda yetishtirildi. ), va 1 foiz penitsillin/streptomitsin. 80-90 foiz qo'shilishda, yopishgan hujayralar Trypsin Digestion Solution (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanxay, Xitoy) bilan ajralib chiqdi va 1:2-1:3 nisbatda yanada kengaytirildi [67] ].

4.4. Hujayra o'sishi Kyuri

(P)3,6 va 9-o'tish joylarida cBMSClarning ko'payish qobiliyatini aniqlash uchun hujayralar uchta 48-quduq plastinkasiga (2500 hujayra/quduqqa) ekilgan. 48 soatlik inkubatsiyadan so'ng hujayralar Tripsin hazm qilish eritmasi bilan chiqarildi va gemositometr bilan hisoblandi. Hujayralarni hisoblash protsedurasi har 48 soatda takrorlanadi va 14 kun davomida davom ettiriladi.

4.5.Oqim sitometriyasi yordamida cBMSC immunofenotipini aniqlash

3-chi o'tishda cBMSC'lar PBS bilan yuvilgan va tripsinlangan. Hujayralar (3 × 105 hujayra / ml) binoni tamponida qayta suspenziya qilindi va hujayra suspenziyalari (100 mkl) CD45, CD34 va sirt antijenlariga qarshi FITC, PE yoki APC floresan etiketli monoklonal antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. ITGB1 (eBioscience, San-Diego, CA, AQSH) va flüoresansiz etiketli CD31, CD90 va CD105 (Biosintez biotexnologiyasi Co.Ltd. Pekin, Xitoy) 4 daraja haroratda 15 daqiqa. Hujayralar PBS bilan yuvildi va FITC-konjugatsiyalangan echki quyonga qarshi IgG bilan 4 daraja haroratda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Yuzaki antijenler oqim sitometriyasi yordamida aniqlandi (FACS Calibur, Becton Dickinson, San-Xose, CA, AQSH). Ma'lumotlarni tahlil qilish CytExpert dasturi yordamida amalga oshirildi.

4.6. In vitro farqlash tahlili

cBMSC'lar 6-quduq plastinkalarida 5 × 104 hujayra/ml zichlikda qoplangan. 70-80 foiz qo'shilishda to'liq muhit osteogen yoki adipogen differensiatsiya induksiya muhiti bilan almashtirildi va har 3 kunda o'zgartirildi (Cvagen, Suzhou, Xitoy). Kaltsiy cho'kishi Alizarin Red S (Solarbio, Pekin, Xitoy) bilan 3 haftalik osteogenik indüksiyadan so'ng aniqlandi va 2 haftalik adipogen induktsiyadan keyin Oil Red O (Solarbio, Pekin, Xitoy) yordamida lipid tomchilarining to'planishi kuzatildi.

4.7.Kurning hujayra hayotiyligiga ta'siri

CBMSC larning hujayra hayotiyligi CCK{0}}to'plami (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nankin, Xitoy) yordamida aniqlandi.cistanche tubulosa foydalari va yon ta'siricBMSC'lar 96-quduq plastinkasida 24 soat davomida oldindan kultivatsiya qilindi. cBMSC'lar turli konsentratsiyalarda Cur bilan ishlov berildi (0.1, 0.5, 1, 5 va 1{ {14}} umol/L) 12 soat, 24 soat, 48 soat va 72 soat. Hujayralar nazorat sifatida ishlatilgan 0,1 foiz DMSO bilan ishlov berildi. Har bir quduqqa 10 mL CCK-8 eritmasi bilan 2 soat davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, optik zichlik 450 nm mikroplata o'quvchi bilan o'lchandi (Thermo Scientific, Waltham, MA, AQSH). Nisbiy hujayra hayotiyligi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq hisoblab chiqilgan.

4.8. Koloniyaning shakllanishi tahlili

CBMSClarning o'z-o'zini yangilash samaradorligi koloniya hosil qiluvchi birlik-fibroblast (CFU-F) tahlili yordamida aniqlandi. cBMSClar (3× 10² hujayra/quduq) 6-quduq plitalariga ekilgan. Ikki haftalik madaniyatdan so'ng hujayralar 30 daqiqa davomida 4 foizli paraformaldegid bilan biriktirildi va 10 daqiqa davomida 1 foiz kristalli binafsha rang bilan bo'yalgandan so'ng invert mikroskop ostida (LX73, Olympus korporatsiyasi, Tokio, Yaponiya) kuzatildi. CFU-F uchun 50 dan ortiq hujayralar hisoblangan. CFU-F samaradorligi quyidagicha hisoblangan:

CFU-F samaradorligi=CFU-F soni/urug' soni (300 hujayra)[68].

4.9. Beta-galaktosidaza bo'yash tahlili

CBMSClarda qarish bilan bog'liq -galaktosidaza (SA{2}}gal) faolligi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq SA- -gal bo'yash to'plami (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanxay, Xitoy) yordamida baholandi. . Bo'yashdan keyin hujayralar teskari mikroskop ostida tekshirildi. Hujayra qarishini baholash uchun ijobiy bo'yalgan hujayralar hisoblangan.

4.10. teskari transkripsiya real vaqtda miqdoriy PCR (RT-qPCR)

Umumiy RNK Trizol reagent usuli yordamida hujayra pelletlaridan olingan. cDNK gDNA Eraser (Takara, Shiga, Yaponiya) bilan PrimeScriptTM RT reagent to'plami yordamida sintez qilindi. PCR primerlari (2-jadval) GAPDHdan tashqari oldingi tadqiqotlarga [67] asoslanib, cDNK ketma-ketliklariga asoslangan Primer Express dasturi (Applied Biosystems, Foster City, CA, AQSH) yordamida ishlab chiqilgan. qPCR TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Yaponiya) yordamida CFX96 Touch Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, Richmond, CA, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Reaktsiya shartlari quyidagicha edi: 30 s uchun 95 daraja va keyin 5 soniya uchun 95 gradusdan 39 tsikl va 30 soniya uchun 60 daraja. Erish egri chizig'i tahlili 95 gradusdan 10 soniyagacha, so'ngra 65 dan 95 darajagacha o'zgarib, har bir tsiklda 0,5 darajaga ortib bordi. GAPDH barcha ma'lumotlarni normallashtirish uchun ichki nazorat sifatida ishlatilgan va nisbiy ifoda qiyosiy Cycle Threshold (Ct) usuli orqali hisoblangan.

4.11. Lusosomal UIsing LysoTracker-ni kuzatish

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanxay, Xitoy) lizosomal kislotalanishda floresans intensivligini oshirishi mumkin bo'lgan lizosomalarni kuzatish uchun ishlatilgan. Biz cBMSC'larni 12-quduq plitalariga ekdik va ularni 24 soat davomida Cur bilan davolashdik, keyin hujayralar 20 daqiqa davomida Lyso-Tracker (60 nM) va Hoechst 33,342 (2 ug/ml) bilan ishlov berdik. Flüoresans PBS bilan yuvilgandan keyin teskari floresan mikroskop yordamida kuzatildi.

4.12. Immunofluoresans

CBMSClar (2x104 hujayra/slayd) slaydlarga ekilgan va 30 daqiqa davomida 4 foiz paraformaldegid bilan mahkamlangan. 0,5% Triton X-100 bilan 5 daqiqa davomida (Solarbio, Pekin, Xitoy) birgalikda inkubatsiya qilingandan so'ng, bo'limlar 30 daqiqa davomida blokirovkalash eritmasiga botirildi. Yopilgan suyuqlik olib tashlandi va hujayralar anti-LC3B antikorlari (1:1000, Abcam, Kembrij, MA, AQSh) bilan bir kechada 4 daraja haroratda inkubatsiya qilindi, so'ngra ftorxrom bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar (Abcam, Kembrij, MA, AQSh) bilan inkubatsiya qilindi. 50 daqiqa davomida 37 daraja S da. Nihoyat, hujayralar DAPI (Beyotime Biotechnology, Shanxay, Xitoy) bilan qarama-qarshi bo'yalgan va konfokal mikroskop ostida kuzatilgan.

4.13.Western Blotting tahlili

Hujayra namunalari muzli PBS bilan yuvilgandan so'ng proteaz inhibitori bo'lgan to'qima va hujayra lizati (Solarbio, Pekin, Xitoy) bilan parchalandi. Har bir namunada 15 ug proteinni o'z ichiga olgan hujayra lizatlari natriy-dodesil sulfat-poliakrilamid (SDS-PA) (Solarbio, Pekin, Xitoy) jellariga yuklangan va elektroforez bilan ajratilgan. Proteinlarni poliviniliden ftorid (PVDF) membranasiga o'tkazgandan so'ng, ikkinchisi xona haroratida 1 soat davomida 5 foiz yog'siz quruq sut (Solarbio, Pekin, Xitoy) bilan nonspesifik ravishda bloklandi. Membranalar bir kechada anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, AQSH), anti-p62/SQSTM1 (1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, AQSH) asosiy antikorlari bilan inkubatsiya qilindi. ) va anti{16}}aktin (1:1000, Abcam, Kembrij, MA, AQSH) 4 daraja haroratda va dog'lar ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilishdan oldin TBST (Solarbio, Pekin, Xitoy) bilan yuvilgan (1). :2000, Abcam, Kembrij, MA, AQSH) 37 daraja haroratda 1 soat. Keyinchalik, membranalar xemiluminesans reagentlari (Millipore, Billerica, MA, AQSh) ta'sirida ishlab chiqilgan va ChemiDocTM Imaging Systems (Tanon-5200, Shanxay, Xitoy) yordamida vizualizatsiya qilingan. Tarmoq zichligi har bir guruh uchun Image-Pro Plus 6.0 dasturi (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, AQSH) yordamida aniqlandi va -aktin bilan normallashtirildi.

4.14. Transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM)

Hujayra pelleti hazm qilindi va 1,5 ml santrifüj naychasiga yig'ildi, so'ngra xona haroratida 2 soat davomida 2,5 foizli glutaraldegid (Solarbio, Pekin, Xitoy) bilan mahkamlandi. Namunalar PBS bilan yuvilganidan keyin 1 soat davomida 1 foizli osmiy tetroksid bilan mahkamlangan, keyin biz aseton eritmalarida suvsizlanishni bosqichma-bosqich oshirib, ularni 812 epoksi qatroniga joylashtirdik (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Pekin, Xitoy). Keyinchalik, ultra-mikrotomdan (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Germaniya) 50 nm bo'limlar olindi. Bo'limlar uranil asetat (Chjungjingkevi, Pekin, Xitoy) bilan 10-15 daqiqa va qo'rg'oshin sitrat (Chjungjingkei, Pekin, Xitoy) bilan 2 daqiqa davomida bo'yalgan. Barcha namunalar TEM (EM{14}}PLUS, JEOL, Akishima, Tokio, Yaponiya) da koʻrib chiqildi.

4.15. Statistik tahlil

Natijalar uchta mustaqil tajribadan olingan va barcha ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida ko'rsatilgan. Statistik qiymatlar IBM SPSs Statistics 25 yordamida tahlil qilingan va GraphPad Prism 9 yordamida tasvirlangan.0(GraphPad Software, San-Diego, CA, AQSH). Statistik jihatdan ahamiyatli farqlar bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va Student t-testidan foydalangan holda aniqlandi. p qiymatlari<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Xulosalar

Bizning topilmalarimiz Cur, cBMSC qarishi va autofagiya o'rtasidagi munosabatlarga oydinlik kiritadi. Bizning tadqiqotimiz ma'lumotlari shuni ko'rsatadiki, Cur autofagiyani faollashtirganda va lizosomal kislotalanishni rag'batlantirganda, cBMSClarning qarish holatini engillashtirishi mumkin. Bundan tashqari, qo'shimcha dalillar Cur tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya cBMSC qarishini yaxshilash uchun potentsial mexanizm ekanligini ko'rsatdi. Cur MSC funktsiyasini yaxshilash uchun istiqbolli faollashtiruvchi va konservator bo'lishi mumkin. Bizning fikrimizcha, Curning qarishga ijobiy ta'sirini e'tiborsiz qoldirib bo'lmaydi. Kelajakdagi tadqiqotlar turli xil kasalliklarda, masalan, to'qimalarning shikastlanishi va degenerativ va yallig'lanish kasalliklarida MSClarning terapevtik salohiyatini oshirish uchun Curni tartibga solishning MSC taqdiriga ta'siriga e'tibor qaratish kerak.

Ushbu maqola Int.dan olingan. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms