NADH/NAD ga tolerantlik va nomutanosiblik qarish va qarishga qarshi choralarni kutadi

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

XULOSA

Redoks juftlari hujayra funktsiyasini muvofiqlashtiradi, ammo ularning nomutanosibligining oqibatlari aniq emas. Bu ma'lum darajada ularning eksperimental miqdorini aniqlash cheklovlari bilan bog'liq. Bu erda biz metabolizmning silikonli ko'rinishidan foydalangan holda redoks juftlikdagi nomutanosibliklarga fitnesga asoslangan bardoshlik profillarini tavsiflovchi yondashuvni taqdim etish orqali ushbu qiyinchiliklarni chetlab o'tamiz. Xamirturushdagi NADH/NAD1-qaytarilish-qaytarilish juftligiga e'tibor qaratsak, biz reduktiv nomutanosiblik saraton hujayralarida kuzatilganlar bilan taqqoslanadigan metabolik sindromlarni keltirib chiqarishini ko'rsatamiz.Cistanche ekstraktining foydalariXamirturush mutantlarining oksidlanish-qaytarilish muvozanatiga tolerantligi, shuningdek, ularning eksperimental o'lchangan xronologik umr ko'rish davomiyligidagi o'zgaruvchanlikning 30 foizini tushuntirishi mumkin. Bundan tashqari, nomutanosibliklarga bardosh berish uchun ba'zi metabolitlarning ahamiyatini bashorat qilish orqali biz patologiyaning mexanizmlari, umrini himoya qiluvchi molekulalar yoki kaloriya cheklovi mimetikasi asosidagi ozuqa moddalarini to'g'ri aniqlaymiz. Oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligiga tolerantlik shu tarzda qarish fenotipining xususiyatlarini tan olish uchun asos bo'lib, qarishga qarshi choralarni baholash uchun biologik asosga mos keladi.

KIRISH

Oksidlanish-qaytarilish gomeostazi bo'yicha tadqiqotlar so'nggi yigirma yil ichida sezilarli darajada kengayib, oksidlovchi hujayra shikastlanishining klassik tushunchalarini doimiy ravishda o'zgartirdi (Xalliwell va Gutteridge, 2015). Ushbu gomeostazning asosini tashkil etuvchi eng paradigmatik molekulyar agentlar orasida glutation, NADPH va NADH ning konjugat shakllari kabi redoks juftlarining nisbati paydo bo'ladi. Ikkala glutation ham, NADPH ham mitoxondriyadagi reaktiv kislorod turlarini (ROS) tozalashning muhim mexanizmlari sifatida ishlaydi, NADPH va NADH esa hujayraning redoks holati bilan mos ravishda anabolik va katabolik yo'llarni birlashtiradi.

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

Shunga qaramay, NADPH / NADP * va NADH / NAD * juftlarini redoks gomeostaziga bog'laydigan yangi mexanizmlar tan olinmoqda. Masalan, NADPH / NADP plyus muvozanati AMP bilan faollashtirilgan protein kinazning omon qolish oqibatlarini qisman tushuntiradi (She va boshq., 2014). Shuningdek, u sirkadiyalik vaqtni saqlashni redoks holatlari bilan bog'laydi (Rey va boshq., 2016). Hozirgi vaqtda NADH/NAD plyus nisbati mitoxondriyal va yadroviy funktsiyani muvofiqlashtirishda, DNKni tiklash va hujayra o'ziga xosligini epigenetik tartibga solishda va energiya almashinuvini atrof-muhit o'zgaruvchilariga moslashtirishda ishtirok etadi deb taxmin qilinadi (Canto va boshq., 2015; Gomes va boshqalar. boshq. 2013). Patologik bo'lmagan sharoitlarda NADH / NAD * nisbati kislorod kuchlanishi bilan o'zgaradi, gipoksik sharoitlar va yuqori kislorod mavjudligi mos ravishda qaytaruvchi va oksidlovchi og'ishlar bilan birga keladi (Clanton, 2007; Graef va boshq., 1999).

Ammo redoks juftlik nisbatlariga ortib borayotgan qiziqish, asosan, ularning patologiyaga ta'siridan kelib chiqadi.cistanche ChingizxonROS ning reduktiv (gipoksik, NADHga moyil) va oksidlovchi (giperoksik, NAD plyus moyil) sezgilarida paydo bo'lishi mitoxondriyaning eng yaxshi ishlashini ta'minlaydigan optimal oksidlanish-qaytarilish potentsialidan ajralib chiqish bilan bog'liq (Aon va boshq., 2010). ; Klanton, 2007). Saraton kasalligiga kelsak, NADH / NAD plyusning pasayishi glioblastomalarning o'limga olib kelishi (Gujar va boshq., 2016) va yo'g'on ichak saratoni rivojlanishini rag'batlantirishi mumkin (Hong va boshq., 2019), shu bilan birga u ba'zi sog'lom fenotiplarni hujayralardagi turli darajalarda qutqarishi mumkin. boshqa o'sma turlari (Garrido va Djouder, 2017).

Cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

NADH ham Toronto biologiyasining qiziqish nuqtasiga aylandi. Shu nuqtai nazardan, NAD plyus hovuzining ko'payishi organizmlar bo'ylab qarish va boshqa tegishli patologik fenotiplarning qisman o'zgarishiga olib keldi (Das va boshq., 2018; Mendelsohn va Larrick, 2014; Wei va boshqalar, 2017; Zhu va boshq. , 2017) va qarigan va neoplastik hujayralar NADH / NAD plyus nisbati nomutanosibligini ko'rsatishi aniqlandi (Braidy va boshq., 2011; Schwartz va Passonneau, 1974; Wiley va boshqalar, 2016). Bundan tashqari, NADPH ning yangi kashf etilgan rollari va NADH / NADH ning redoks gomeostazasi va qarishning asosiy regulyatori sifatida paydo bo'lgan kontseptsiyasi qarishning metabolik barqarorlik nazariyasiga mos keladi (Demetrius, 2004). Ushbu nazariya qarishning sababi oksidlanish-qaytarilish juftlarining barqaror holat darajasining ferment reaktsiyasi tezligidagi tasodifiy atrof-muhit buzilishlariga zaifligi ekanligini taklif qiladi va odamlarga taalluqli bir nechta qiziqarli bashoratlarni beradi.

Bularning barchasini hisobga olgan holda, ko'plab tadqiqotlar redoks juftlik nisbatlarining fenomenologiyasini ularning darajalarini passiv ravishda hisobot berish yoki ularni faol ravishda o'zgartirish orqali o'rganib chiqdi. Biroq, eksperimental manipulyatsiyalar juda qiyin. Eng an'anaviylar chuqur eksperimental ogohlantirishlarni ayblaydilar (Sun va boshq., 2012) va yangilari harorat va pH oraliqlari bilan cheklanganligi sababli hali ham ba'zi biologik holatlarni o'tkazib yuborishadi (Hung va boshq., 2011; Zhao va boshq., 2015). Bundan tashqari, metabolitlarni qo'shish (Hou va boshq., 2010) va mutatsiyalar yoki NAD (H) ni iste'mol qiluvchi fermentlarni haddan tashqari ifodalash orqali koenzim hovuzlarining o'zgarishidan keyin keng ko'lamli fenotiplarni kuzatish eksperimental jihatdan qimmat (Bait boshq., 2011; Felipe va boshqalar, 1998). Shunday qilib, redoks juftlarini manipulyatsiya qilish orqali redoks gomeostazini nazorat qilish, shuningdek, ushbu nazoratning biologik oqibatlarini tushunish uchun muqobil strategiyalarga ehtiyoj bor.

Silico modellari tajribaviy yondashuvlar cheklangan bo'lganda amaliy tadqiqot strategiyasiga aylanadi, buning afzalligi kuzatilgan hodisalarni to'liq mexanik hisobga olish imkonini beradi. Oqim balansi tahlili (FBA) (Orth va boshq, 2010) orqali o'rganilishi mumkin bo'lgan genom miqyosidagi metabolik modellar metabolik buzilishlarning hujayra funktsiyasiga ta'sirini o'rganish uchun tizim biologiyasida standartga aylandi (S1 usullari). Boshqa hissalar qatorida ular yangi antibiotiklar va kimyoterapevtiklarni kashf qilishda, qiziq bo'lgan moddalarni sanoat ishlab chiqarish uchun optimallashtirilgan bakterial shtammlarni loyihalashda va inson metabolik kasalliklarini yaxshiroq tushunishda yordam berdi (Burgard va boshq., 2003; Pagliarini va boshq. 2016; Raman va boshqalar, 2009). FBA dan foydalanish metabolik bo'lmagan chalkash omillar (genetik, epigenetik, mexanik va boshqalar) ta'sirisiz metabolik hodisalar haqida tushuncha berishning qo'shimcha afzalligiga ega. Shunday qilib, genom miqyosidagi metabolik modellar, ayniqsa, redoks gomeostazidan og'ishning metabolik oqibatlarini o'rganish uchun juda mos keladi.

Bu erda biz FBA dan bir hujayrali eukariot Saccharomyces cerevisiae ning genom miqyosida rekonstruksiya qilishda redoks juftliklari muvozanatini tekshirish uchun foydalanamiz, bu orqali biz mavjud NADH/NAD va turli genetik oqimlar oqimining boshqariladigan buzilishining metabolik va uzoq umr ko'rish bilan bog'liq oqibatlarini tavsiflaymiz. fonlar. Aniqrog'i, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, bu nomutanosiblikka tolerantlik patologiyani eslatuvchi o'ziga xos metabolik yo'nalishni o'zgartirishga olib keladi va shuningdek, mitozdan keyingi hayotdagi o'ziga xos o'zgaruvchanlikning to'rtdan biridan ko'prog'ini tushuntiradi. Bundan tashqari, ushbu tizim yoshga bog'liq patologiyalar kontekstida terapevtik maqsadlar sifatida potentsialga ega bo'lgan metabolitlar va fermentlarni aniqlash uchun hisoblash protokolini (biz hayvonlar va odamlarning metabolik modellariga ham qo'llaymiz) belgilashga yordam beradi.

NATIJALAR

Fitnesga asoslangan bardoshlik profili redoks juftlik buzilishlarini tavsiflaydi

Redoks juftligining konjugat shakllari o'rtasidagi nomutanosiblikni ko'rsatish uchun biz mos keladigan metabolik tarmoqni genom miqyosida rekonstruksiya qilishda sun'iy qaytariladigan reaktsiyani - "muvozanat reaktsiyasini" qo'shdik (STAR ​​usullari). Reaksiya o'ziga xos hujayra bo'linmalarini (masalan, sitozol, mitoxondriya va boshqalar) hisobga olgan holda juftlikni oksidlaydi yoki kamaytiradi va uning faolligi istalgan tezlik qiymatiga o'rnatilishi mumkin. Ushbu qiymatlarning har biri uchun o'sish sur'atini ("fitness") hisoblash mumkin.U xamirturush hujayrasining ushbu muayyan holatga tolerantligi uchun proksi sifatida ishlaydi.Nihoyat, bardoshlik profili diapazon uchun o'sish tezligini hisoblash orqali aniqlanadi. nomutanosiblik qiymatlari (1A-rasm; qo'lyozma bo'ylab qaytaruvchi/oksidlanish sharoitlari mos ravishda ko'k/qizil rangda ko'rsatilganiga e'tibor bering).

Tolerantlik profillari odatda nomutanosiblik nuqtasi atrofida maksimal o'sishni ko'rsatadi, taxminan har qanday og'ish (ya'ni, reaktsiyaning nolga teng bo'lmagan qiymati) fitnesning pasayishiga olib keladi. Bu shuni ta'kidlaydiki, metabolizm ishlashi uchun bir ma'noda oksidlanish-qaytarilish nisbatini sozlaydigan reaktsiyalar faolligi boshqa ma'noda uni sozlaydiganlarning faolligiga mutanosib bo'lishi kerak. Aniqroq aytganda, S.da NADH/NADt ning sitozolik nomutanosibliklari.cistanche umrini uzaytirishglyukoza va aerob sharoitda o'sadigan cerevisiae maksimal o'sish bilan profilni hosil qiladi, bu erda ~50 mmol/DW/soat NADH NADH ga aylanadigan nomutanosiblik profilining nuqtasida oksidlanish tomoniga sezilarli darajada siljiydi (1B-rasm). Buning o'rniga mitoxondriyadagi nomutanosiblikni ko'rib chiqayotganda, biz nomutanosiblik nuqtasida maksimalni kuzatdik (1C-rasm), biz boshqa profillarda ham xuddi shunday kuzatganmiz (S1-rasm). Umuman olganda, reduktiv sharoitlar paydo bo'ladi

Shakl 1. Tolerantlik profili oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligiga javobni tavsiflaydi

(A) Yuqori. Redoks koenzimining ikkita konjugat shaklini (bu erda NADH / NADH juftligi) o'zaro aylantirish uchun biz organizmning metabolik qayta qurish modeliga sun'iy reaktsiyani kiritdik (bu holda xamirturush). Har bir qator nomutanosiblik sharoitlarida, ya'ni sun'iy reaksiya tezligi qiymatlarida biz o'sish tezligini hisoblash uchun oqim balansi tahlilini qo'llaymiz. Pastki. O'sishning bashorat qilingan qiymatlari tolerantlik profilini belgilaydigan nomutanosiblik tezligi qiymatlariga nisbatan chiziladi; tanlangan bezovtalanishga duch kelganda metabolizmning bardoshliligi uchun proksi.cistanche nz(B) sitozolda joylashgan nomutanosiblik bilan bog'liq xamirturushdagi bardoshlik profili.

(C) Mitoxondriyalarda joylashgan nomutanosiblik bilan bog'liq xamirturushdagi bardoshlik profili. Moviy/qizil rang mos ravishda pasaytirilgan va oksidlangan muvozanat rejimlarini ifodalaydi, kulrang nuqta esa nomutanosiblik yoki o'sishni keltirib chiqarmaydigan ekstremal reduktiv/oksidlovchi nomutanosibliklarga mos keladigan qiymatlarni ko'rsatadi. oksidlovchi rejimlarga qaraganda tezroq zararli va halokatli. Ikki holatda (sitozolik NADH yoki mitoxondrial tioredoksinning konjugatsiyalangan juftlari) juftlikning engil sun'iy oksidlanishi o'sishni yaxshilaydi (S1-rasm).

NADH/NAD* buzilishlari patologiyani eslatuvchi metabolik sindromlarni keltirib chiqaradi

Nomutanosibliksiz xamirturushning energiya almashinuvi glyukoza (o'rganilayotgan o'sish sharoitlari) ishtirokidagi xarakterli aerob metabolizmiga to'g'ri keladi, bunda glikoliz trikarboksilik kislota aylanishi (TCA) va oksidlovchi fosforillanish bilan bog'lanadi. Pentoza-fosfat yo'li glyukozani oksidlaydi va nukleotidlar sintezi uchun riboza-5P va anabolizm uchun NADPH tomonidan tug'ilgan qaytaruvchi kuchni ta'minlaydi, anaplerotik yo'llar esa TCA siklidan glutamin metabolizmiga o'xshash tarzda chiqib ketadi va asosan pirimidinni oziqlantirish uchun ishlatiladi. aminokislotalar sintezi. FBA bizga ushbu yo'llardagi o'zgarishlarni va ular oxir-oqibat har qanday nomutanosiblik rejimining asosi bo'lgan metabolik xususiyatlarni qanday qilib batafsilroq aniqlashga imkon beradi.

Xususan, 2A-rasmda sitozolik NADH/NADH ning reduktiv nomutanosibliklari glikolitik oqimning ko'payishiga, TCA sikli va elektron tashish zanjiri faolligining pasayishiga va glutamin metabolizmining oshishiga qanday olib kelganini ko'rsatadi. Bu psevdohipoksik metabolik belgi - kislorod mavjudligida - anaerob metabolizmga o'xshaydi, bu erda glikoliz mitoxondriyal yo'llarga zarar etkazadigan alkogolli yoki laktik fermentatsiya bilan birlashtiriladi; pentoza fosfat yo'lining kislorodli qismi yopiladi va glutamin metabolizmi, faolroq, anabolizmga hissa qo'shishdan tashqari, piruvat ishlab chiqarish uchun qayta yo'naltirilishi mumkin. Shunisi e'tiborga loyiqki, bu fenotip turli xil saraton hujayralarida kuzatilgan paradoksal hosildorlik metabolizmining ba'zi xususiyatlarini qamrab oladi (Warburg effekti) (Potter va boshq., 2016).

Shakl 2. Xamirturushdagi bardoshlik profili asosidagi energiyani boshqarishning asosiy yo'llarining oqimlari (A) Sitozolik NADH/NAD muvozanati (yuqori) va beshta vakillik yo'llarining oqim qiymatlari (pastki); i / glikoliz (Glikoliz, yadro), ii / Krebs tsikli (TCA, pushti), ili / pentoza fosfat (Penphos, yashil), iv / oksidlovchi fosforillanish (Oksfos, kulrang) va glutamin metabolizmi (Glutamin, binafsha). Taqdim etilgan oqim vektorlari ma'lum bir yo'lning barcha reaktsiyalari oqimini o'rtacha hisoblash natijasidir.

(B) Mitoxondrial muvozanatga nisbatan (A) bilan bir xil. Glikolizda salbiy oqimlarning mavjudligiga e'tibor bering (panel A, pastki) glyukoneogenezning kuchayganligini anglatadi. Tafsilotlar uchun asosiy matnga qarang.

Aksincha, oksidlanish tolerantligi asosida yotgan energiya almashinuvi (sitozolga nisbatan, 2A-rasm) ko'proq aerobik konfiguratsiyaga ega, ammo o'ziga xos xususiyatlarga ega, masalan, ayniqsa faol poliamin metabolizmi; va ekstremal xususiyatlar, jumladan glyukoneogenezning kuchayishi, oksidlovchi fosforillanish va TCA sikli faolligi, shuningdek, pentoza fosfat yo'li orqali juda yuqori (normal darajadan 12- barobargacha) oqim. Ikkinchisi, shunga qaramay, juda yuqori (55 mmol/gDVt/soatdan o'tgan) oksidlanish muvozanatining buzilishida biomassa psevdo-reaktsiyasidagi farqlarning artefakti bo'lishi mumkin (S1 usullariga qarang).

Nomutanosiblik reaktsiyasi mitoxondriyada joylashganida, NADH ning kamayishi yana bir farq bilan ma'lum bir psevdohipoksik xatti-harakatni keltirib chiqaradi (2B-rasm). Glikoliz va glutamin metabolizmi orqali oqim kuchayib, TCA siklining qismlari va pentoza fosfat yo'lining yo'qolishi bilan birga keldi. Biroq, sitozolik holatdan farqli o'laroq, oksidlovchi fosforlanish sezilarli darajada oshdi. Boshqa tomondan, mitoxondriyal profilning oksidlovchi tomoni ko'proq o'ziga xos edi: glikolitik faollik TCA sikli bilan parallel ravishda oshdi, ammo oksidlovchi fosforillanish ko'pincha odatdagidan pastroq darajada ishladi va glutamin almashinuvi unchalik ahamiyatga ega emas edi.

Metabolik sindromlar oksidlanish-qaytarilish balansi, biomassa ishlab chiqarish va ATP/NADH almashinuvi o'rtasidagi kelishuvdan kelib chiqadi.

Biz oldingi sindromlarni shakllantirgan bir nechta asosiy elementlarni aniqladik.cistanche jinsiy olatni o'lchamiOksidlanishning buzilishi o'sishni saqlab qolish va nomutanosiblik buzilishini tamponlash o'rtasidagi kelishuv sifatida kuchaygan aerobik reaktsiyaga duch keldi. Bu biomassa tarkibiy qismlarini yaratishga qodir bo'lgan global oqim taqsimotini saqlab qolgan holda NAD plyusni kamaytiradigan maksimal mumkin bo'lgan reaktsiyalar soni orqali oqimning yo'nalishini o'zgartirishni o'z ichiga oldi. Ushbu ikkita mexanik element (buferlash va biomassani maksimallashtirish) optimallashtirish muammosining eng dolzarb talablari bo'lib, bardoshlik profilining oksidlanish rejimini tavsiflash uchun etarli.

Shakl 3. Raqobat mexanizmlari xamirturushning psevdohipoksik harakatini keltirib chiqaradi

(A) NADH, ATP va biomassa prekursorlarini ishlab chiqarish o'rtasidagi muvozanat reduktiv rejimlarning oqibatlarini qoplash uchun imkon qadar ko'proq ATP va imkon qadar kam NAD hosil qiluvchi reaktsiya modullarini qo'llab-quvvatlaydi, masalan, glikolizdan TCA ga nisbatan. Bu erda binafsha o'qlar ATP ishlab chiqarishni, sariq o'qlar NAD(H) ishlab chiqarishni va oq doiralar biomassa prekursorlarini hosil qilishini ko'rsatishiga e'tibor bering, (B) NADHga moyil bo'lgan NADH/NADt buzilishi (x o'qi) sun'iy ADP bilan qoplangan. Fosforlanish reaktsiyasi (y o'qi), bu muvozanatsiz metabolizmga ATP shaklida reduktiv quvvatni kuch bilan kiritadi. Yashil rang gradienti glikolitik va Krebs sikli oqimi o'rtasidagi nisbatni uning normal qiymati (100- barobargacha) bilan normallashtiradi. ADP fosforillanishi psevdohipoksik fenotipni pasaytiradi va tinchlanishni kechiktiradi.

Reduktiv tomon yana bitta qo'shimcha tushunchani talab qildi. NADt dan foydalanadigan va biomassa tarkibiy qismlarini ishlab chiqarish uchun to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita zarur bo'lgan NADH reaktsiyalariga tobora ko'proq NADH ajratilganligi sababli, energiya almashinuvini NADH ning NAD ga yuqori konversiyasini ta'minlash va cheklash uchun qayta yo'naltirish kerak. NAD ning NADH ga kamayishi. Bu hali ham bezovtalanishga qarshi turishga to'g'ri kelmaydi, chunki NADH ko'rinishidagi reduktiv quvvat ko'p metabolik maqsadlar, reaktsiyalar va o'sish uchun mohiyatan foydasizdir: NADHda saqlanadigan energiya ADPga qayta taqsimlanishi kerak. Shunday qilib, metabolizm imkon qadar ko'proq ATP va kamroq NADH ishlab chiqaradigan reaktsiya modullariga ustunlik berishi kerak; u yuqori ATP/NADH rentabelligiga ega bo'lgan shuntlar va yo'llarga tayanishi kerak, masalan, glikoliz va oksidlovchi fosforillanish.

Bu natijalar TCA siklining qisqarishi va glikolitik oqimning kuchayishiga olib keladi (3A-rasm). Ushbu ATP/NADH almashinuvining ta'sirini qo'shimcha o'rganish uchun biz reduktiv NADH/NAD buzilishini ADP fosforillanishiga imkon beruvchi sun'iy reaktsiya bilan qopladik. . Simulyatsiyalar shuni ko'rsatdiki, reduktiv metabolizmni tavsiflovchi yuqori glikolizdan TCA tsikliga nisbati ATP/NADH hosiliga bog'liq.

Shakl 4. Xamirturushlarning xronologik umr ko'rish muddatini bashorat qiluvchi sifatida tolerantlik balli

(A) xamirturush mutantlari uchun olingan bardoshlik profillari; egri chiziqning ko'k/qizil sektorlari NADH/NADH muvozanatining qaytaruvchi/oksidlanish rejimini ifodalaydi.

(B) Normallashtirilgan tolerantlik ko‘rsatkichi (oksidlanish va reduktiv rejimlardagi nomutanosiblik qiymatlari kengligiga mutanosib, STAR usullari) va xronologik xizmat muddati o‘rtasidagi bog‘liqlik. Korrelyatsiya umumiy dispersiyaning ~30 foizini (R'= 0) tushuntiradi. 29, p-qiymati=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Ushbu assotsiatsiyani ko'rishning muqobil usuli sifatida biz bardoshlik ko'rsatkichi va umr ko'rish davomiyligi o'rtasidagi tasodifiy yaratilgan o'n mingta assotsiatsiyadan olingan regressiya nishab qiymatlarining gistogrammasini oldik. Ushbu namunadan biz bardoshlilik ko'rsatkichi va umr ko'rish davomiyligi ma'lumotlari o'rtasidagi bog'liqlik topilganidan (qizil vertikal chiziq bilan ko'rsatilgan) kuchliroq bo'lgan faqat 3 ta holatni topamiz.

(3B-rasm). Majburiy ravishda fosforillanadigan ADP bu psevdohipoksik belgini hatto juda kuchli NADHga moyil bo'lgan nomutanosiblik darajasida ham kamaytiradi.

Tolerantlik turli xil xamirturush mutantlari o'rtasidagi eksperimental xronologik umr farqlarini tushuntiradi

Biz tolerantlik profilining umr ko'rish davomiyligini bashorat qiluvchi omili bo'lishi mumkinligini so'radik, chunki redoks juftliklari umr ko'rishning potentsial determinantlari sifatida muhokama qilingan. Buni o'rganishning bir usuli - turli mutantlardagi pro-faylni hisoblash (4A-rasm) va keyin uning aniq umr ko'rish o'lchovlariga, normallashtirilgan xronologik umr ko'rish davomiyligiga (CLS) qanchalik mos kelishini miqdoriy aniqlash, eksperimental o'lchangan mutantlarning omon qolish egri chizig'idan foydalanish mumkin (Garay va boshq., 2014). CLSlar ushbu mutant omon qolish egri chiziqlaridan yovvoyi turga nisbatan statsionar fazada omon qolishning ortishi sifatida hisoblanadi.

FBAda ma'lum genlardagi mutatsiyalar ular bilan bog'liq reaktsiyalar oqimini mantiqiy qoidalar orqali cheklash orqali simulyatsiya qilinadi, bu har bir kimyoviy reaktsiyani reaktsiya fermenti (STAR ​​usullari) uchun tarjima qilingan ORFlar bilan bog'laydi. Ushbu mutantlarning har biri uchun biz mutant bardoshlik profilini hisoblab chiqdik (4A-rasm) va o'sish tezligi ikki baravar kamaygan (qaytaruvchi va oksidlovchi rejimlarda) muvozanatning mutlaq qiymatlari yig'indisidan tolerantlikning skalyar balli (STAR) sifatida foydalandik. usullari).

Bizning mutant to'plamimiz ba'zi cheklovlar bilan cheklangan edi (STAR ​​usullari). Shunisi e'tiborga loyiqki, biz yovvoyi turning qiymatining 10 ppm dan past bo'lgan bardoshlikdagi farqlarni taqiqlovchi hisoblash vaqtlariga etmasdan ajrata olmadik va ko'plab mutantlar umr ko'rish davomiyligidagi ahamiyatsiz farqlarni ham, bardoshlikdagi ahamiyatsiz farqlarni ham taqdim etdilar. Bunga qo'shimcha ravishda, odatda, FBA funktsiyani o'chirishni tavsiflashga qodir emas deb hisoblanadi va oldindan aytish mumkinki, hech qanday mutant bardoshlik yovvoyi turdan oshmaydi.

Ushbu cheklovlardan tashqari, silico bardoshlik profillari eksperimental o'lchangan umr ko'rish muddati o'zgaruvchanligining -30 foizini tushuntira oldi (4B-rasm, R2= 0.29, N{4}},p qiymati{{5) }}.2x 10-) katta ahamiyatga ega:10,000 maʼlumotlar juftlarining tasodifiylashuvi kattaroq regressiya qiyaligiga ega boʻlgan atigi 3 ta misolga olib keldi (4C-rasm).

An'anaviy ozuqa moddalari NADH/NADH nomutanosibligiga tolerantlikni ta'minlaydi

Nihoyat, biz o'ziga xos dietali metabolitlar redoks muvozanatining buzilishiga javob berishda ayniqsa hal qiluvchi ekanligini tekshirdik. Shu maqsadda biz FBA modellarining qo'shimcha xususiyatidan foydalandik, ya'ni ma'lum bir metabolitdan foydalanishga kirish imkoniyati (barqaror holat, STAR usullarida iste'mol tezligi sifatida aniqlanadi). Biz qaytaruvchi va oksidlovchi NADH/NAD va nomutanosiblikning ortib borayotgan qiymatlari bilan bu nisbat qanday o'zgarishini ko'rib chiqdik.

Foydalanish profilning ikkala tomonida ham, ko'pgina metabolitlar uchun ham chiziqli edi. Shunday qilib, biz ushbu o'zgaruvchan naqshni chiziqli modelga moslashtirdik va (mutlaq) nishabni oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligiga toqat qilish uchun tegishli metabolitning ahamiyatining skaler vakili sifatida ko'rib chiqdik (5A-rasm). iAZ900 ning eng yuqori sezgir ozuqa moddalari orasida biz xamirturushning umrini tartibga solishda muhim rol o'ynashi ma'lum bo'lgan parhez metabolitlarini, masalan, asetatni (Burtner va boshq., 2009), shuningdek, xamirturush, qurtlarni eksperimental ravishda umrini oshiradigan ko'plarini payqadik. yoki hatto inson hujayralari (Madeo va boshq., 2018; Mishur va boshq., 2016), shu jumladan malat, gidroksibutirat, spermidin yoki oksaloatsetat (5B -5D-rasm, S1-jadval).

Ba'zi oziq moddalar NADreduksiyaga, boshqalari NADHoksidlanishga va bir nechtasi bu rejimlarning ikkalasiga tolerantlik uchun ko'proq mos edi. Reduktiv bardoshlik uchun eng muhim dietali metabolitlar asetat, beta-gidroksibutirat (BHB), glutamat va glutamin (5B-rasm), shu bilan birga, NADH oksidlanishiga toqat qilish uchun eng muhimi asetat, NADP plyus, putresin va spermidin edi. (5D-rasm). Profilning har ikki tomonida tolerantlikdan ishtirok etganlar orasida eng mos keladigani asetat, glutamat, oksaloatsetat va oksoglutarat tartibida edi (5C-rasm).

Biz boshqa organizmlardagi metabolik modellarni ko'rib chiqdik, qaysi ozuqa moddalari nomutanosibliklarga javob berishda hal qiluvchi omil ekanligini qo'shimcha tasdiqlash uchun (S1 usullari, shuningdek, asosiy yo'llarning oqimlari qanday o'zgarishi uchun S2-rasmga qarang). Bu eng yaxshi hissa qo'shuvchilarning barchasi o'zgardi, ammo alfa-keto kislotalar, redoks juftliklari, ba'zi vitaminlar va ba'zi aminokislotalar C.elegansdagi NADH/NADt buzilishlarini nazorat qilish va insonni qayta tiklash uchun sezilarli darajada zarur. Ushbu organizmlarda oksidlanish-qaytarilish muvozanatining buzilishiga eng ko'p uchraydigan reaktsiya asetat, bikarbonat, bifosfat, natriy, suv va boshqalar kabi pH gomeostazasiga vositachilik qiluvchi metabolitlarga tegishli. Xuddi shunday, glutamat, glutamin, aspartat, treonin, serin va glitsinning ahamiyati ularni boshqa aminokislotalar va ko'pchilik metabolitlardan ajratib turadi. Oksoglutarat, malat va oksaloatsetat kabi o'rta o'lchamdagi oksidlangan kislotalar ham doimiy ravishda tolerantlikda rol o'ynaydi, chunki ular biotin va ba'zi folatlarga ta'sir qiladi (to'liq ro'yxat uchun S1-jadvalga qarang).

MUHOKAZA

Biz bu erda redoks juftliklaridagi o'zgarishlarning keng biologik oqibatlarini tushunish uchun muqobil yondashuvni taklif qilamiz. Ushbu yondashuv silico metabolik modellariga asoslanadi va ushbu o'zgarishlarga hujayra chidamliligini aniqlaydigan o'lchov sifatida tolerant-anseprofil tushunchasini kiritadi.

5-rasm. Xamirturush tarkibidagi gomeostatik ozuqalar

(A) Mos ravishda m va m. qiyaliklar bilan tavsiflangan mos ravishda qaytaruvchi (ko'k) va oksidlovchi (qizil) chiziqli regressiyalari bilan oziq moddalarining foydalanish profili (mutlaq qiymatlarda). Biz mos yozuvlar sifatida fonda sitozolik bardoshlik profilini qo'shdik.

(B) NADH/NAD va buzilishning reduktiv ma'nosida eng yaxshi 4 ta gomeostatik oziq moddalarning chiziqli regressiya qiyaliklari (m,).

(C) Har ikki ma’noda ham buzilish ma’nosida gomeostatik bo‘lgan yuqori 4 oziq moddalarning chiziqli regressiya qiyaliklari; Moviy: Reduktiv chiziqli regressiya qiyaligi; Qizil: Oksidlovchi chiziqli regressiya qiyaligi.

(D) NADH/NAD plyus bezovtalanishning oksidlovchi ma'nosida 4 ta eng yaxshi gomeostatik ozuqa moddalarining chiziqli regressiya qiyaliklari (m.).

Profil asosidagi metabolik o'zgarishlar reduktiv NADH rejimlari bilan bog'liq bo'lgan psevdohipoksik fenotip mavjudligini ko'rsatadi. Ushbu fenotip saraton kasalliklarida (Varburg effekti) kuzatilgan ba'zi bir paradoksal past rentabellikdagi energiya almashinuvini eslatadi va xamirturush (Qisqichbaqa effekti) va bakterial (toshib ketadigan metabolizm) hujayralarida ham tanilgan (Basan va boshq., 2015; Mori va boshq., 2016; Potter va boshqalar, 2016). Ushbu xatti-harakat nisbatan yuqori o'sish yoki glyukoza olish tezligida yuzaga keladigan resurslarni taqsimlash cheklovlari tufayli yuzaga kelishi mumkinligi so'nggi yillarda ilgari surilgan (Basan va boshq, 2015; Mori va boshq, 2016). Biroq, biz kuzatadigan psevdohipoksik fenotip o'sish tezligi va glyukoza iste'moliga bog'liq emas va aslida u past o'sish sur'atlari (STAR ​​usullari) bilan birga sodir bo'ladi. Biz uning sababi ATP/NADHning fundamental o'zaro kelishuvida ekanligini ko'rsatdik, bu mantiqiy asos yaqinda o'tkazilgan eksperimental tadqiqot tomonidan qo'llab-quvvatlanadi (Maldo-nado va Lemasters, 2014).

Bundan tashqari, bizning oqim tahlilimiz shuni ko'rsatadiki, ATP ta'minoti reduktiv NADH / NAD va muvozanatsizlik bilan salbiy ta'sir ko'rsatishi mumkin. NADH ning ortishi ATP mavjudligining pasayishi bilan bog'liq deb hisoblanadi, chunki oksidlovchi fosforillanishning buzilishi NADH / NAD plyusning ko'payishiga va ATP / ADP ning pasayishiga olib kelishi mumkin. Biz ko'rsatamizki, tashqi hosil bo'lgan NADH nomutanosibligi, oksidlovchi fosforlanish normal darajada ishlayotgan bo'lsa ham, ortogonal metabolik mexanizmlar orqali energiya mavjudligining pasayishiga sabab bo'lishi mumkin. Bu qarish tadqiqotlari kontekstida juda muhimdir, chunki energiya mavjudligining pasayishi va ATP / ADP nisbati hujayra qarishi va yoshga bog'liq patologiyalarning saqlanib qolgan belgisidir (Moreira va boshq., 2003; Pall, 1990; Yaniv va boshq., 2013). ) va toksik chiqindilarning to'planishiga va proteostazning yo'qolishiga yordam berishi mumkin (qarishning yana bir belgisi) oqsil almashinuvini kamaytirish va shuning uchun oqsilning yarim umrini oshirish (Anisimova va boshq., 2018).

Biz bundan keyin hayot davomiyligini va oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligini tamponlovchi parhez metabolitlarini bashorat qiluvchi sifatidagi asosimizning haqiqiyligini aniqlashni maqsad qilganmiz. Tolerantlik mavjud ma'lumotlar to'plami tufayli ba'zi cheklovlar bilan uyali ishlash muddatini taxmin qiladi. Ushbu cheklovlarni nazorat qilish (Garay va boshq., 2014), biz natijada paydo bo'lgan korrelyatsiyalar tolerantlik va CLS o'zgarishlari o'rtasidagi bog'liqlikning etarli dalili ekanligini aniqlaymiz.

Bizning kutganimizdan farqli o'laroq, dietali metabolitlarni tahlil qilishdan olingan eng aniq saboq shundaki, nomutanosiblikka javob beradigan asosiy modda, ayniqsa, NADt qutqarish tarmog'iga tayanmaydi. Darhaqiqat, eng yuqori "gomeostatik ozuqa moddalari" TCA tsiklining oraliq qismlari va markaziy metabolizmning boshqa qismlari bo'lib, ularning ta'siri NAD prekursorlariga qaraganda ancha kengroqdir. Bundan tashqari, oksidlanish-qaytarilish juftligi va asosiy metabolik yo'llar o'rtasida ko'prik vazifasini o'tagan holda NAD (H) ni kamaytiruvchi yoki oksidlovchi reaktsiyalarning ahamiyati NADtni saqlab qolishni cheklovchi fermentlardan (nikotinamid mononukleotid adeniltransferaza kabi) ancha ustundir.

Masalan, xamirturush modelidagi oksaloatsetat va oksoglutarat reduktiv va oksidlanish sharoitida bardoshlik asosidagi eng samarali to'rtta metabolit qatoriga kiradi, bu avvalgi eksperimental natijalarni tasdiqlovchi izchil xususiyatdir (Chin va boshq., 2014; Uilyams va boshq., 2009). . Boshqa muhim metabolitlar orasida umr ko'rish davomiyligini oshirishi, NADni tartibga solish va ochlikka javob berishda vositachilik qilish (Edvards va boshq., 2014; Nyuman va Verdin, 2014) va poliaminlar oilasiga mansub bo'lgan va ma'lum bo'lgan spermidin doimiy ravishda ko'rsatilgan gidroksibutirat kiradi. yoshga bog'liq jarayonlar, autofagiya va DNKni himoya qilishda rol o'ynaydi (Eisenberg va boshqalar, 2009; Minois va boshq. 2011: Pietrocola va boshq. 2015).

Biz oldingi baholashni kuchaytirish uchun C.elegans va inson modellaridan foydalandik, bu pH gomeostazi, redoks juftliklari va TCA sikli atrofida joylashgan kengroq rasmni ochib berdi. Bu shuni ko'rsatadiki, pH (Burtner va boshq., 2009) va NADH nomutanosibligi (Ayer va boshq., 2014) hujayralardagi qarishni aniqlash usullari chuqur o'zaro bog'liqdir. PH dan tashqari, NADH / NAD va nomutanosiblikni tartibga soluvchi eng keng tarqalgan va muhim oziq moddalar alfa-keto kislotalar oksaloatsetat va oksoglutarat, ularning aminlangan shakllari va boshqa mitoxondriyal metabolitlar, masalan, malat, piruvat va fumarat, ya'ni asosiy hubdir. redoks muvozanatini nazorat qilish TCA siklidir.

Bugungi kunga kelib, aminokislotalar va TCA tsiklining oraliq moddalari xamirturush va C. elegansning umrini uzaytirishga ta'sir qiladigan mexanizmlar noaniq bo'lib qolmoqda. Malat, oksaloatsetat, fumarat, valin, serin yoki treonin kabi metabolitlar haqiqatan ham organizmlarning umrini uzaytirishi mumkin, ammo bu ta'sirga olib keladigan jarayonlar munozarali va murakkab (Edvards va boshq., 2013, 2015). Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, bu uzoq umr ko'rishni qo'llab-quvvatlaydigan barcha hodisalar uchun umumiy tushuntirish ozuqa moddalarining hujayralarning NADH / NAD plyus nisbatidagi buzilishlarga bardosh berish qobiliyatiga ta'sirida yotadi.

Biroq, ko'rib chiqilayotgan metabolitlarning ba'zilari o'z-o'zidan ravshan ko'rinadi, chunki ular NADH va NAD plyusni o'zaro aylantiruvchi reaktsiyalarda ishtirok etadilar. Savol shundaki, nima uchun bizning natijalarimizda apriori o'z-o'zidan ravshan ko'rinadigan boshqa metabolitlar paydo bo'lmaydi. Javob FBAda real bashoratlarni ta'minlaydigan mexanizmlarda yotadi. Oziq moddalar oksidlanish-qaytarilish muvozanatining buzilishiga qarshi "gomeostatik" bo'lishi uchun u nafaqat NADHor NADt ishlab chiqarishni ko'paytirishi, balki ATP/NADH hosildorligi va/yoki biomassa tarkibiy qismlarini ta'minlash qobiliyatiga ega bo'lgan yo'l yoki modulning markazida turishi kerak.

Nihoyat, bizning natijalarimizdan yana ikkita tushuncha diqqatga sazovordir. Bir tomondan, ular oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligiga javoban metabolik tarmoqlar avtofagiya, antioksidant va gormetik reaktsiyalarga bo'lgan ehtiyojni istisno qiladigan signalizatsiya tarmoqlari tomonidan talqin qilinadigan ba'zi metabolitlarni tobora ko'proq ishlab chiqarishga va / yoki iste'mol qilishga tayyorligini ta'kidlaydilar. yoki qo'shimchalar umr ko'rish muddatini uzaytirishi va/yoki kaloriya cheklanishi (CR) ta'sirini boshqa yo'l bilan taqlid qilishi aniqlangan, bu CR vositachiligida umr ko'rish davomiyligini uzaytirishi bilan bog'liq bo'lgan signalizatsiya yo'llariga bog'liq. Bu umrni uzaytirish va salomatlikni mustahkamlash jarayonining bir qismi sifatida CR va NADH / NADH muvozanatini bog'laydigan oldingi dalillarni mustahkamlaydi (Lin va boshq., 2004).

Boshqa tomondan, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, o'zgartirilgan nisbatlarga javoban metabolizm hujayraga kimyoviy zarar etkazishi mumkin bo'lgan atsetat, putresin yoki asetaldegid kabi ba'zi moddalardan ham ko'proq foydalanishga olib keladi; shuningdek, glutamin, süksinat va fumarat kabi metabolik qayta ulanishlar orqali o'simta hosil bo'lishiga yordam beradigan ba'zilar (Sciacovell va boshq., 2016). Bu keyinchalik oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligi bilan bog'liq bo'lgan patologiyalarni va degenerativ va onkologik kasalliklar kabi makroskopik jarayonlarni qisman tushuntirishi mumkin: agar oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligini toksik moddalar bilan tamponlash kerak bo'lsa, demak, bu moddalar, ehtimol, patologiyaning mexanizmlari bo'lishi mumkin. -qaytarilish-qaytarilish muvozanatining buzilishi bilan yuzaga keladi.

Biz oksidlanish-qaytarilish nomutanosibligiga bo'lgan yondashuvimizni metabolik tarmoqning mustahkamligini o'rganishning g'ayrioddiy o'zgarishi sifatida tushunish mumkinligini va u yaxshilanish uchun juda ko'p joy qoldiradigan ba'zi ogohlantirishlarni ayblashi mumkinligini tushunamiz. Mustahkamlikka kelsak, FBA yordamida olib borilgan tadqiqotlar an'anaviy ravishda uni ma'lum bir buzilish (redoks nomutanosibligi) emas, balki reaktsiya tezligining turli xil pasayishiga javoban ob'ektiv yechimning o'zgarishi (odatda o'sish) sifatida aniqladi. ) biz kabi metabolitlarda. Bizning tahlilimiz cheklovlariga kelsak, ularni tartibga soluvchi genlarning yo'qligi kabi FBA ning o'ziga xos cheklovlari bilan bog'lash mumkin. Oxir oqibat, natijalarimizning ishonchliligi metabolik rekonstruksiyalarning bashorat qilish kuchiga bog'liq: hozirgi xamirturush modellari bashoratli va ilg'or, ammo ular mukammal emas (Heavner va Price, 2015) va shunga qaramay, ular hatto eng ko'plaridan ham yaxshiroq. aniq ko'p hujayrali rekonstruktsiyalar mavjud. Bu barcha tashvishlarga qaramay, metabolik modellarning tabiiy xatti-harakatlarga mosligini tasdiqlovchi ko'plab dalillar mavjud.

Hozirgi kunda keng tarqalgan tadqiqotlar NADH/NADH nisbatini beg'araz pasaytirishning mumkin bo'lgan salbiy oqibatlarini e'tiborsiz qoldirishga intiladi. Bu qisman neoplastik fenotiplarning qisqarishi, umr ko'rish davomiyligi va sog'lig'ini kengaytirishni o'z ichiga olgan eksperimental ravishda erishilgan engil pasayish natijasida olingan istiqbolli foyda bilan bog'liq. Biroq, ushbu ijobiy natijalarga nisbatan o'ta ehtiyotkor bo'lishni tavsiya etadigan dalillar mavjud (Gujarat boshq., 2016; Hong va boshq., 2019), shuningdek, NADH / NADH nisbatlarini kamaytirishning salbiy oqibatlarini bashorat qiluvchi mustahkam, eksperimental barqaror nazariy asos. chegara (Aon va boshq., 2010). Bizning NADH/NADt nomutanosibligiga bardoshlik profillarimiz ushbu paydo bo'layotgan rasmga mos keladi, chunki engil oksidlanish og'ishlari foydali bo'lishi mumkin, ammo yuqoriroqlari aksincha ekstremal kabi zararli.

Aniqrog'i, bizning bardoshlik profillarimiz kimyoviy yoki fiziologik muammolarni keltirib chiqarishdan tashqari, past va yuqori NADH / NADH nisbatlari ham faqat metabolik kamchiliklarga, shu jumladan energiya mavjudligi va/yoki biosintetik ishlab chiqarishning pasayishiga olib kelishi kerakligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, va biz ta'kidlaganimizdek, biz hal qiladigan ba'zi savollar bo'yicha mavjud bo'lgan cheklangan eksperimental kuzatuvlar biz bu erda hisobot bergan natijalarni eslatadi.

Tadqiqotning cheklovlari

Bu erda keltirilgan natijalar qo'llaniladigan modellar yanada takomillashtirilganda yaxshilanadi. Bizning ishimiz, shuningdek, texnika sifatida FBA ning ichki cheklovlaridan aziyat chekadi. Misol uchun, dinamik oqim tahlilining mavjud versiyalari juda qisqartirilganligini hisobga olsak, dinamik ma'lumotlarga erishilmaydi. Xuddi shunday, oqim balansida yashirin energiya cheklovlarining yo'qligi uning yuqori o'sish sur'atlari uchun prognozligini pasaytiradi. Ushbu zaiflik qo'lyozmada ko'rib chiqqanimizdek, CAFBA kabi usullarni qo'shishga turtki bo'ldi. Nihoyat, oson boshqarilishi va yoqilishi yoki o'chirilishi mumkin bo'lgan tartibga soluvchi ma'lumotlarga kirish qiziqarli bo'ladi. Hozirgi vaqtda FBAda genlarni tartibga solishni amalga oshirish uchun standartlashtirilgan yondashuvlar mavjud emas. Reaksiya faolligi ballarini cheklash chegaralariga qo'llash bu borada istiqbolli.

Ushbu maqola iScience 24, 102697, 2021 yil 23 iyuldan olingan