Tubulosid B Cistanche Salsadan PC12 neyron hujayralarini 1-metil-4-fenilpiridiniy ioni bilan bog'liq apoptoz va oksidlovchi stressdan qutqaradi

Kirish

Patologik jihatdan sporadik Parkinson kasalligi (PD) odatda katexolaminergik neyronlarning, xususan qora substantsiyaning (SNc) dopaminerjik neyronlarining yo'qolishi va xarakterli intraneyronning mavjudligi bilan tavsiflanadi. miyaning ta'sirlangan hududlarida Lyui jismlari deb ataladigan qo'shimchalar. PD patogenezida turli omillar ta'sir ko'rsatgan bo'lsa-da, PD ning boshlanishi va rivojlanishida ishtirok etuvchi mexanizmlar noaniq bo'lib qolmoqda, hatto PD sabablariga javob topilgan bo'lsa-da, bir nechta dalillar oksidlovchi stressning ishtirokini aniq ko'rsatmoqda va nihoyat etakchi. neyronlarning o'limiga yoki erkin radikallarning haddan tashqari ko'payishi bilan apoptozga olib keladi. Nigral dopaminerjik tizim yuqori darajadagi erkin radikallarni ishlab chiqarishi va oksidlovchi mudofaa tizimining nisbatan past darajalariga ega ekanligi bu gipotezani yanada qo'llab-quvvatlaydi. Ham in vivo, ham in vitro tadkikotlar dopaminergik neyronlarda l-metil{2}}fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ning faol metaboliti bo'lgan MPP ＋ ning oksidlovchi stress vositasida neyrotoksikligini ko'rsatdi. PD kabi neyrodegenerativ kasalliklarning yaqin sababi sifatida oksidlovchi stress tomonidan haddan tashqari ishlab chiqarilgan erkin radikallarning ishtiroki antioksidantlar uchun muhim rol o'ynaydi. Tubulosid B (1-rasm) Cistanche salsa poyasidan ajratilgan fenileta noid birikmalaridan biri edi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ko'plab feniletanoidlar, shu jumladan tubulozid B kuchli erkin radikallarni tozalash faolligini ko'rsatdi.

Ushbu topilmalarni hisobga olgan holda, biz ushbu tadqiqotda tubu]nside B ning MPP{0}}in vitro neyrotoksikligiga ta'sirini, neyron funktsiyasini o'rganish uchun yillar davomida muvaffaqiyatli qo'llanilgan simpatik nerv feokromotsitoma PC12 hujayra chizig'idan foydalangan holda tekshirdik.

PARKINSON KASALLIKI OLDINI OLISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiallar va usullar

Materiallar

Cistanche Salsa'dan Tubuloside B ni mehribonlik bilan doktor Li Lei (Pekin universiteti, Pekin, Xitoy, Farmatsevtika fanlari fakulteti, tabiiy mahsulotlar bo'limi) etkazib berdi. HPLC tahlilida birikmaning tozaligi 98% dan ortiq edi. Dulbekkoning modifikatsiyalangan Eagle muhiti (DMEM), ot zardobi va homila buzoq zardobi GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridi onium ioni (MPP+), poli-L-lizin, 3-(4,{) dan sotib olingan. {8}}dimetil tiazol-2 -il)-2,5- difeniltetrazolium bromid (MTT), propidiy yodid (PI), RNaz A, proteinaz K va 2; 7'-diklorofloressein diasetat (DCFH-DA) Sigma'dan sotib olindi.

Hujayra madaniyati

PCI2 hujayralari 10% ot zardobi, 5% homila buzoq zardobi, 100U/ml penitsillin va 100ug/ml streptomitsin bilan to'ldirilgan DMEMda saqlangan. Hujayralar 37 daraja haroratda 95% havo va 5% CO2 bilan gazlangan namlangan inkubatorda o'stirildi. Barcha tajribalar hujayralar ekilganidan 24-48 soat o'tgach amalga oshirildi. Hujayralar to'planish bosqichiga yaqinlashganda, 0,25% tripsinlash yo'li bilan muntazam ravishda yig'ib olinadi va 1: 8 nisbatda bo'lingan 25 sm madaniyat kolbalariga qo'yiladi.

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

Hujayra hayotiyligi yuqorida tavsiflangan [10] modifikatsiyalangan MTT tahlili yordamida aniqlandi, Qisqacha aytganda, PC12 xujayralari 96-quduq plastinkalariga har bir quduqqa I × 104 hujayra zichligida ekilgan. Kulturalar 48 soat davomida o'stirildi, so'ngra muhit B yoki MPP ning turli konsentratsiyasini o'z ichiga olgan muhitga o'zgartirildi. 48 soat va 72 soat davomida inkubatsiyadan so'ng, MTr eritmasi (DMEMda 5 mg/ml) 96-quduq plitalariga qo'shildi va hujayralar 4 soat davomida 37 daraja inkubatsiya qilish uchun ruxsat berildi. Muhit olib tashlangandan so'ng, hujayra va bo'yoq kristallari 200 mkl DMSO qo'shilishi bilan eruvchan ozuqaga aylandi va yutilish 550 mikroplata o'quvchi (Bio-Rad) bilan 570 nm (ma'lumotnoma sifatida 540 nm) da o'lchandi. Hujayra hayotiyligi, shuningdek, tripan ko'kni istisno qilish usuli yordamida tahlil qilindi. Hujayralar to'plangan, muloyimlik bilan pelletlangan va 3 yomg'ir uchun tripan ko'kning 0,6% eritmasi bilan bo'yalgan. Rangsiz hujayralar foizi keyinchalik tasodifiy tanlangan mikroskopning o'nta maydonida baholandi. Ijobiy dori sifatida 100 ng／ml epidermal o'sish omili (EGF) ishlatilgan.

TABIY CISTANCHE TUBULOSA BEPUL RADIKAL YUKLASH FAOLIYATI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Oqim sitometriyasi orqali apoptozni aniqlash

Apoptotik hujayralar propidiy yodid (PI) [11] yordamida oqim sitometriyasi orqali aniqlandi. Qisqacha aytganda, sinov moddalari bilan inkubatsiya qilingan taxminan 1 × 106 hujayra santrifüjlash orqali yig'ib olindi va bir marta PBS bilan yuvildi. Hujayralar 7{9}}% etanol bilan 24 soat davomida - 20 darajada mahkamlandi va bir marta PBS bilan yuvildi. Keyin hujayralar 0,5 mg / ml RNaseA va 0,5 mg / ml PI o'z ichiga olgan 300 mkl PBSda qayta suspenziya qilindi. Qorong'ida 30 daqiqa davomida keyingi inkubatsiyadan so'ng, oqim sitometriyasi FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germaniya) yordamida amalga oshirildi.

Elektroforez yordamida DNK parchalanishini tahlil qilish

Biz Mur protokolini [12] qo'lladik, bunda faqat parchalangan DNK ajratildi va tajribalar har bir test guruhidan teng miqdordagi madaniyatlar yordamida normallashtirildi. Qisqacha aytganda, ishlov berilgan namunalarning har biridan 3 × 1{20}}6 ta neyron Hankning muvozanatli tuz eritmasida yuvildi (1000g 10 daqiqa davomida) va naychaning pastki qismida hosil bo'lgan granulalar bir hil holga keltirildi. 1 ml lizis buferi (pH 7,4 da 10 mM Tris. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) bilan 20 daqiqa muz ustida. 11,{25}} g haroratda 20 yomg'ir uchun 4 daraja santrifüjdan so'ng, parchalangan DNKni o'z ichiga olgan supernatantlar olib tashlandi va 20 mg/ml RNase A bilan 37 darajada 1 soat va 0,1 mg/ml proteinaz K bilan 56 darajada hazm qilindi. qo'shimcha 1 soat. Parchalangan DNK fenol va xloroform yordamida ekstraksiya qilindi va 1 O,{33}}g da 4 C da 1 yomg'ir uchun santrifüj qilindi. Suvli faza yangi Eppendorf trubasiga o'tkazildi, 2 hajm muzdek sovuq etanol bilan aralashtirildi va keyin DNKni cho'ktirish uchun kamida 1 soat davomida 20 darajaga joylashtiriladi. 15,{38}}g 4 daraja 20 daqiqa santrifüjdan so'ng, supernatantlar olib tashlandi va DNK granulalari bir marta 80% etanol bilan yuvildi (4 darajada 15 min uchun 15000 g), havoda quritildi va 20 mklda eritildi. TE buferi pH 7,6 da. Keyin butun namuna 1,5% agaroz jelida 85 V da 1 soat davomida elektroforezlandi. Jel Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, AQSH) tomonidan tekshirildi va suratga olindi.

Hujayra ichidagi ROS shakllanishini o'lchash

Hujayra ichidagi peroksidlarning hosil bo'lishi lyuminestsent bo'lmagan birikma, 2 "7"-diklorofloressein diasetat (DCFH-DA) [13] yordamida konfokal skanerlash lazer mikroskopida aniqlandi, u hujayralar ichida endogen esterazlar orqali ionlashtirilgan erkin esterizatsiya qilinadi. kislota, 2;7"-diklorofloressein. 2",7-Dixlorofloressein gidroantioksidantlar ta'sirida 2"7"-dixlorofloressein (DCF) floresangacha oksidlanishga qodir. Hujayralar 10 mkM DCFH-DA bilan 30 daqiqa davomida 37 darajada inkubatsiya qilindi. Madaniyatlar Hankning muvozanatli tuz eritmasi bilan ikki marta yuvilgan va bir xil muhitda tasvirlangan. Tasvirlash konfokal skanerlash lazer mikroskopi yordamida amalga oshirildi, DCF 488 nm da qo'zg'atildi va emissiya filtri 510 nm to'siq filtri edi, To'g'ri taqqoslashni ta'minlash uchun barcha kuzatishlar uchun bir xil olish parametrlari ishlatilgan. Hujayralarning o'rtasida optimal vertikal holat o'rnatildi, so'ngra maydon tezda skanerdan o'tkazildi. 488 nm qo'zg'alish to'lqin uzunligidagi yorug'lik bu bo'yoqning oksidlanishi tufayli floresansning kuchayishiga olib kelganligi sababli, har bir maydon bir vaqtning o'zida yorug'likka ta'sir qildi. Stimulyatsiya qilinmagan hujayralarning boshlang'ich qiymatlari MPP＋ bilan ishlov berilgan hujayralar bilan solishtirish uchun nazorat qiymatlari sifatida ishlatilgan yoki mavjud bo'lmaganda.tubulozid B. Skanerlashdan so'ng, mikroskop maydonidagi 15-20 neyron hujayra tanalaridagi o'rtacha nisbiy floresans intensivligi har bir davolash holati uchun to'rtta alohida kulturada aniqlandi.

Statistik tahlil

Olingan barcha qiymatlar o'rtacha ±SD sifatida ifodalangan. Guruhlar orasidagi farqlarning statistik ahamiyati Student t-testi bilan aniqlandi; 0.05 dan kichik hisoblangan p qiymatlari statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblanadi.

Natijalar

2-rasmda ko'rsatilganidek, MPP + PCI2 hujayralarining hayotiyligining dozaga bog'liq pasayishiga olib keldi. Bundan farqli o'laroq, taniqli neyrotrofik omil bo'lgan EGF 100 ng/ml MPPda hujayra hayotiyligini sezilarli darajada himoya qilgan va sitotoksik ta'sir tubulozid B (5, 10, 50 yoki 100 ug-ml) ishtirokida ham susaygan.{{12} }), havolaga qaraganda kamroq kuchga ega bo'lsa-da

dori (3-rasm). Tubulosid B ushbu konsentratsiyalarda dozaga bog'liq bo'lgan sitoprotektiv ta'sir ko'rsatdi va birikmaning o'zi hech qanday aniq sitotoksiklikni keltirib chiqarmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). 48 soat davomida 200 µM MPP+ bilan ishlov berilgan PCI 2 hujayralaridan DNK ekstraktining gel elektroforezi DNK narvonlarini ko‘rsatdi. apoptozning klassik o'ziga xos belgisi, tubulozid B, 10 va 100 mkg·ml-1DNA zinapoyasining hosil bo'lishi (4-rasm). 5-rasmda tubulozid B borligi yoki yo'qligida PC12 hujayralarida MPP＋ tomonidan qo'zg'atilgan apoptotik hujayralar o'limining oqim sitometrik tahlilining tipik gistogrammalari ko'rsatilgan. PI bilan hujayra sikli profilining miqdori subdiploid xususiyatlarga ega bo'lgan hujayralar sonini aniqladi (M1 mintaqasi) apoptotik DNK parchalanishidan dalolat beradi. Davolanmagan hujayralarda apoptotik subdiploid fraktsiya jami 10000 hujayraning 5 ． 94% gacha minimal edi (5 A-rasm). MPP＋ ga 48 soat ta’sir qilgandan so‘ng apoptoz ulushi 43．02;j;(．5B)，，，，，，，，，，，，，，，，，，， ， ，，，）））））））））））） Hujayra madaniyatiga qo'shilsa, tubulozid BMPP{0}}induktsiyali apoptozni inhibe qildidozaga bog'liq holda. 10 ug·ml-1konsentratsiyasida tubulozid B bilan himoyalanish statistik ahamiyatga ega emas edi, lekin 50 va 1 00ug·ml-1 da mos ravishda 45% va 63% pasayish, kuzatildi. omon qolish hujayralari foizini oshirish (5D, E-rasm).

Hujayra ichidagi ROS to'planishi DCFH-DA yordamida aniqlanishi mumkin. 200 uM MPP＋ bilan 48 soat davomida ishlangan PC12 hujayralari DCFH-DA bo'yog'i bilan bo'yalgandan so'ng hujayra ichida kuchli floresansni ko'rsatadi (6-rasm). Tubulozid B bilan bir vaqtda davolash (10 va 100 ug·ml dozalarda) MPP ＋wín induktsiyalangan ROS ishlab chiqarishni inhibe qildi (kamaytirilgan foiz mos ravishda 24％52% va 55．63% ni tashkil etdi).

PARKINSON KASALLIGINI DAVOLASH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Munozara

PD patogenezi kuchli oksidlovchi stress, kamaytirilgan antioksidant darajalari va mitoxondriyal nuqsonlarni o'z ichiga oladi. Ularning barchasi bir nechta hujayrali tizimlarda apoptozni keltirib chiqarishi ma'lum. Xususan, erkin radikallar neyronlarda faol hujayralar o'limini qo'zg'atishi ko'rsatilgan [14]. MPTP odamlarda nigrostriatal dopaminerjik neyronlarning tanlab degeneratsiyasiga olib keladigan qaytarilmas va og'ir Parkinsonga o'xshash sindromni keltirib chiqaradi. Bu neyrotoksin yaratish uchun ishlatilgan. PD ning hayvonlar modellarini egan [15]. MPTP monoamin oksidaza B tomonidan mitoxondriyalarda to'plangan Mpp＋ ga aylanadi. Bu erda u mitoxondrial kompleks I va mitoxondrial disfunktsiyani inhibe qiladi. funktsiyasi apoptozni keltirib chiqaradi [16]. Shu sababli, dopaminerjik neyronlarda MPP + nörotoksikligi neyroprotektiv vositalarni skrining qilish uchun PD ning etiologik modeli sifatida keng qo'llaniladi.

Ushbu tadqiqotda biz PC12 hujayralarida oksidlovchi stress orqali MPP{0}}induktsiya qilingan hujayra o'limi tubulozid B tomonidan kamayganligini ko'rsatdik. Bundan tashqari, biz tubulozid B MPPdan dozaga bog'liq holda ham himoyalanganligini ko'rsatdik{{ 3}}DNK gel elektroforezi va oqim sitometrik tahlili yordamida o'lchangan DNK zinapoyasi va apoptoz. Bundan tashqari, tubulozid B ning yuqori konsentratsiyasi bilan bir vaqtda davolash MPP tomonidan qo'zg'atilgan ROS ishlab chiqarishni inhibe qildi. Shunday qilib, tubuloside B ko'p funktsiyali neyro-himoya ta'sirini ko'rsatdi. Tubulozid B ning ta'sirida bir nechta mexanizmlar alohida yoki assotsiatsiyada ishtirok etishi mumkin. Antioksidant ta'sir tubuloside B vositachiligida neyroproteksiyaning mumkin bo'lgan mexanizmi hisoblanadi. Xiong Q tubulozid B 1,{8}}difenil-2-pikrilgidrazil radikali va ksantin]ksantin oksidaza hosil qilgan superoksid anion radikalida kuchli erkin radikallarni tozalash faolligini ko'rsatdi.

So'nggi paytlarda bir nechta feniletanoidlar erkin radikallarni tozalash xususiyatlariga ega va oksidlovchi stressdan kelib chiqqan toksik shikastlanishlardan himoya qiladi. Vodorod peroksid, superoksid anioni va gidroksil radikali kabi MPP+ tomonidan ishlab chiqarilgan ROS biologik molekulalarga osonlikcha zarar etkazadi, bu oxir-oqibat apoptotik yoki nekrotik hujayra o'limiga olib kelishi mumkin. Shunday qilib, tubuloside B ROSga qarshi to'g'ridan-to'g'ri tozalash ta'siriga ega bo'lishi mumkin. Bizning ma'lumotlarimiz tubulozid B ning ROS to'planishini bostirish uchun harakat qiladigan aniq joyni aniqlamasa-da, ular neyroprotektiv mexanizm antioksidant yo'llarni rag'batlantirishni o'z ichiga oladi. Tubulozid B ning molekulyar tuzilishini o'rganish, shuningdek, uning kuchli quvvatga ega ekanligini ko'rsatadi.erkin radikallarni tozalash(shaxsiy aloqa).

Boshqa mexanizmlar ham tegishli bo'lishi mumkin. Masalan, tubuloside B mitoxondriyal o'tkazuvchanlik o'tish teshiklarining ochilishini va disfunktsiyani inhibe qilish orqali MPP ning toksikligiga qarshi turish qobiliyatiga ega bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, tubuloside B ning neyron hujayralariga to'g'ridan-to'g'ri o'sishni rag'batlantiruvchi ta'siri bor yoki yo'qligini ham hisobga olish kerak. Tubulozid B ning neyroprotektiv ta'sirining aniq mexanizmi noaniqligicha qolmoqda. Uning neyroprotektiv ta'sirining to'liq rasmini aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab qilinadi.

Xulosa qilib aytganda, tubuloside B danCistanche salsa ekstraktiMPP{0}}bo'lgan apoptoz va oksidlovchi stressga aniq himoya ta'siri bor. Uning MPP ＋ toksikligiga qarshi neyroprotektiv ta'siri muhim bo'lishi mumkin va PDning oldini olish va davolashda terapevtik salohiyatga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

PARKINSON KASALLIGINI DAVOLASH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%