qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Qandli diabet buyrak kasalligida tubulointerstitial shikastlanish bilan bog'liq immunitet bilan bog'liq hubgen sifatida qon tomir hujayrali protein 1ni aniqlash va tekshirish

Yan Jia va boshqalar

ANTRACT

Diabetik buyrak kasalligi(DKD) asosiy sababdirsurunkali buyrak kasalligi(CKD) va oxirgi bosqich buyrak kasalligi (ESRD), ammo patogenezi to'liq tushunilmagan. Tubulointerstitial shikastlanish DKD rivojlanishi va rivojlanishida hal qiluvchi rol o'ynaydi(diabetik buyrak kasalligi). Ushbu tadqiqot tubulointerstitial immun hujayra infiltratsiyasi profilini o'rganish va DKDda quvurli hujayralar shikastlanishi va interstitsial yallig'lanish o'rtasidagi asosiy mexanizmlarni ochib berishga qaratilgan.(diabetik buyrak kasalligi)bioinformatika strategiyalaridan foydalanish. Birinchidan, xCell tahlili DKDda sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatadigan immunitet hujayralarini aniqladi(diabetik buyrak kasalligi)tubulointerstitium, shu jumladan yuqori tartibga solingan CD4 plyus T hujayralari, Th2 hujayralari, CD8 plyus T hujayralari, M1 makrofaglar, faollashtirilgan dendritik hujayralar (DC) va an'anaviy DC'lar, shuningdek, pastga regulyatsiya qilingan Treglar. Ikkinchidan, piroptoz boshqa dasturlashtirilgan hujayra o'limi shakllari bilan solishtirganda hujayra o'limining asosiy shakli sifatida aniqlandi. Qon tomir hujayralari yopishish oqsili 1 (VCAM1) eng yuqori darajadagi markaz geni sifatida aniqlandi. Korrelyatsiya tahlili shuni ko'rsatdiki, VCAM1 tubulointerstitiumdagi piroptoz va infiltratsiyalangan immun hujayralari bilan sezilarli darajada ijobiy korrelyatsiya qilingan. DKD tubulointerstitiumida VCAM1 ning ko'tarilishi Evropa buyrak cDNA banki kohortida qo'shimcha tekshirildi va glomerulyar filtratsiya tezligi (GFR) bilan salbiy bog'liqligi kuzatildi. Bizning in vitro tadqiqotimiz qandli diabet sharoitida HK{10}} hujayralarida VCAM1 ekspressiyasining ortishi va disulfiram tomonidan piroptozning inhibisyoni VCAM1 ekspressiyasini, yallig‘lanishli sitokinlar chiqishi va fibrozni kamaytirganini tasdiqladi. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz buyrak quvurli hujayralarida VCAM1 ekspressiyasini yuqori darajada aniqladi, bu infiltratsiyalangan immun hujayralari bilan o'zaro ta'sir qilishi va shu bilan fibrozni rag'batlantirishi mumkin. FDA tomonidan tasdiqlangan disulfiram preparati DKDda fibrozni yaxshilashi mumkin(diabetik buyrak kasalligi)quvurli piroptoz va VCAM1 ifodasini nishonga olish orqali.

Kalit so‘zlar:DKD; tubulointerstitium; immunitet hujayralari; piroptoz; VCAM1; disulfiram

Cistanche davolay oladiDiabetik buyrak kasalligi

Buyrak kasalligi uchun Cistanche uchun bosing

Kirish

Diabetik buyrak kasalligiQandli diabetning keng tarqalgan asoratlaridan biri bo'lgan (DKD) ko'plab rivojlangan va rivojlanayotgan mamlakatlarda surunkali buyrak kasalligi (KBY) va oxirgi bosqich buyrak kasalligi (ESRD) ning asosiy sababidir [1,2]. Xitoy buyrak kasalliklari tarmog'i (CK NET) hisobotiga ko'ra, DKD(diabetik buyrak kasalligi)KKH barcha holatlarining 26,70 foizini tashkil qiladi va katta tibbiy va iqtisodiy yukni yuklaydi [2]. DKD patogenezi murakkab va ko'plab turli yo'llarni o'z ichiga oladi. DKD ning patologik xususiyatlarini va patogenezini aniqlashtirish klinik boshqaruvni yaxshilashga va yangi terapevtik maqsadlarni aniqlashga yordam beradi.

Glomerulyar zarar DKD ning asosiy patologik xususiyati bo'lsa-da(diabetik buyrak kasalligi), yaqinda ko'payib borayotgan dalillar tubulointerstitial patologiya [3,4], masalan, quvurli atrofiya, interstitsial fibroz va interstitsial infiltratsiya qiluvchi immun hujayralar DKD rivojlanishi va rivojlanishida hal qiluvchi rol o'ynashini aniqladi.(diabetik buyrak kasalligi)[5–7]. Bioinformatika tahlili juda qisqa vaqt ichida katta hajmdagi ma'lumotlarni qayta ishlashning samarali usuli hisoblanadi va kasallik haqida qimmatli ma'lumotlarni beradi. Biroq, DKDda tubulointerstitial gen ekspressiyasi va immun hujayra infiltratsiyasini o'rganadigan bioinformatika tadqiqotlari nisbatan kam uchraydi.

Tadqiqotning maqsadi DKD xususiyatlarini tavsiflash edi(diabetik buyrak kasalligi)tubulointerstitial immun hujayra infiltratsiyasi va DKD patogenezi va terapiyasi haqida yangi tushunchalar berish uchun ba'zi asosiy immun va yallig'lanish genlarini aniqlash. Birinchidan, DKD ning tubulointerstitial mikroarray ma'lumotlar to'plami(diabetik buyrak kasalligi)Gene Expression Omnibus (GEO) ma'lumotlar bazasidan yuklab olingan. 64 turdagi immun va stromal hujayralar uchun gen ifodasi ma'lumotlarini hujayra turini boyitish tahlilini amalga oshiradigan xCell [8] dan foydalanib, biz birinchi navbatda DKD bilan kasallangan odamlarning buyrak to'qimalari o'rtasidagi immun hujayra infiltratsiyasidagi farqlarni o'rganib chiqdik.(diabetik buyrak kasalligi)va oddiy boshqaruvlar. Ikkinchidan, immun bilan bog'liq differensial ifodalangan genlar (DEG) ro'yxati tekshirildi, ular orasida eng yuqori o'rindagi gen, qon tomir hujayralari yopishish oqsili 1 (VCAM1) DKDda immun markaz geni sifatida aniqlandi.(diabetik buyrak kasalligi). Keyinchalik, hujayra o'limining turli shakllari bilan bog'liq gen to'plamlari GeneCards dan olingan va piroptoz gen to'plamining o'zgarishi tahlillari (GSVA) ​​va gen to'plamini boyitish tahlili (GSEA) yordamida hujayra o'limining asosiy shakli sifatida baholangan. Bundan tashqari, korrelyatsiya tahlili VCAM1 ning tubulointerstitial immun hujayra infiltratsiyasi va piroptoz bilan ijobiy bog'liqligini ko'rsatdi. DKD tubulointerstitiumida VCAM1 ning ko'tarilgan ifodasi Evropa Buyrak cDNA Banki (ERCB) kohortida qo'shimcha ravishda tekshirildi va DKD bo'lgan bemorlarda buyrak funktsiyasi bilan salbiy bog'liqligi kuzatildi. In vitro tadqiqot diabetik sharoitda yetishtirilgan HK{3}} hujayralarida VCAM1 ekspressiyasining ortishi va FDA tomonidan tasdiqlangan disulfiram preparati tomonidan piroptozni inhibe qilish VCAM1 ifodasini, yallig'lanishli sitokinlar chiqarilishini va fibrozni kamaytirganligini tasdiqladi. Shuning uchun quvurli piroptoz va yuqori tartibga solingan VCAM1 ifodasi DKD immunoterapiyasi uchun maqsad bo'lishi mumkin.

Usullari

Mikroarray ma'lumotlari

GSE3{7}}529 inson geni ifodasi maʼlumotlar toʻplami Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi (NCBI) Gen ifodasi Omnibusidan (GEO, maʼlumotlar bazasi. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array) yuklab olindi. ) 10 DKD dan iborat edi(diabetik buyrak kasalligi)tubula namunalari va 12 ta nazorat namunalari

Ma'lumotlarni qayta ishlash

GSE30529 ma'lumotlar to'plamidagi xom ma'lumotlar mos ravishda Limma to'plami va Oligo paketi yordamida yuklab olindi va qayta ishlandi [9,10]. Ma'lumotlarni qayta ishlash fonni tuzatish, normallashtirish va ifodani hisoblashni o'z ichiga oladi. Bir nechta zondlar bitta gen belgisiga ko'rsatilganda, zondlarning o'rtacha ifoda darajasi hisoblab chiqildi va bu genning gen ifoda darajasi sifatida qabul qilindi. Genlarga mos kelmaydigan zondlar olib tashlandi.

Cistanche davolay oladiDiabetik buyrak kasalligi

Immun va stromal hujayralarni tahlil qilish

Hujayra turini boyitish ko'rsatkichini baholash va DKD bilan og'rigan bemorlarning tubulointerstitiumida infiltratsiya qiluvchi immun hujayralarining profilini aniqlash uchun biz xCell [8] gen imzosiga asoslangan yangi usulni qo'lladik.(diabetik buyrak kasalligi). xCell - 64 turdagi hujayralar, shu jumladan 34 turdagi immun hujayralar, 30 turdagi stromal hujayralar va boshqa hujayralar uchun boyitish ko'rsatkichlarini hisoblaydigan yagona namunali gen to'plamini boyitish tahlili (ssGSEA) yordamida hujayra turini boyitish tahlili usuli. U immunitet hujayralarining ko'proq turlarini qamrab olgan va yaqindan bog'liq bo'lgan hujayra turlari o'rtasidagi bog'liqlikni kamaytirish uchun tarqalish kompensatsiyasi texnikasidan foydalangan holda siliko tahlillarida (shu jumladan CIBERSORT) boshqa ko'rsatkichlardan ustundir. Immunitet hujayralarining 34 turi to'qqizta guruhga bo'lingan, shu jumladan CD4 va T hujayralari subpopulyatsiyasi, CD8 va T hujayralari subpopulyatsiyasi, gamma delta T hujayralari (T d hujayralari), NK hujayralari, NKT hujayralari, B hujayralar subpopulyatsiyalari, monotsitlar/makrofaglar subpopulyatsiyalari, dendritik hujayralar (DK) subpopulyatsiyalari va granulotsitlar subpopulyatsiyalari.

Gen to'plamini boyitish tahlillari (GSEA) va gen to'plamining o'zgarishi tahlillari (GSVA)

Belgilangan gen to'plamlaridan mos yozuvlar gen to'plami sifatida foydalanib, biz DKD o'rtasida gen to'plamining o'zgarishi tahlilini (GSVA) ​​o'tkazdik.(diabetik buyrak kasalligi) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Yuqori va pastga regulyatsiya qilingan yo'llar aniqlandi. GSEA GSEA ish stoli ilovasi [12] va noto'g'ri kashfiyotlar darajasi (FDR) bilan amalga oshirildi.<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Hujayra o'limining turli shakllarini ifodalovchi gen to'plamlarini qurish va boyitish tahlili

Hujayra o'limining turli shakllarini ifodalovchi gen to'plamlari GeneCards ma'lumotlar bazasida (https://www.genecards) "piroptoz", "nekroz", "nekroptoz", "apoptoz", "ferroptoz" va "autofagiya" kalit so'zlarini qidirish orqali tuzilgan. .org/). Proteinni kodlamaydigan genlar olib tashlandi. Genlar to'plami S2-jadvalda keltirilgan. Keyinchalik, tubulointerstitiumdagi hujayra o'limi shaklini baholash uchun GSEA ish stoli ilovasi yordamida GSEA gen to'plami amalga oshirildi. Biz tubulointerstitiumdagi asosiy hujayra o'lim yo'llari va infiltratsiya qiluvchi immun hujayralari o'rtasidagi munosabatni o'rganish uchun Pearson korrelyatsiya tahlillarini o'tkazdik.

DEGlarni tahlil qilish va immun markaz genlarini skrining qilish

DKD bilan og'rigan bemorlar o'rtasidagi DEG(diabetik buyrak kasalligi)va sog'lom boshqaruvlar R dasturiy ta'minotidagi "Limma" to'plami [13] yordamida aniqlandi. Sozlangan P qiymati<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(diabetik buyrak kasalligi). Ushbu tadqiqotda to'qson to'rtta umumiy genlarning oqsil-oqsil o'zaro ta'siri (PPI) tarmoqlari STRING ma'lumotlar bazasi (https://string-db.org/) yordamida yaratilgan va Cytoscape dasturi (versiya 3.7.1, http) yordamida vizualizatsiya qilingan. ://www.cytoscape.org/). 0.4 (oʻrtacha ishonch) dan katta boʻlgan oʻzaro taʼsir koʻrsatkichi statistik jihatdan ahamiyatli deb topildi. CytoHubba, Cytoscape plaginidan PPI tarmoq hub genlarini o'rganish uchun foydalanilgan [14]. Ular orasida VCAM1 eng yuqori o'rinni egallagan gen edi. Yuqorida aniqlangan o'ttizta immun markaz genini boyitish tahlillari Metascape onlayn vositasi yordamida amalga oshirildi [15]. Bundan tashqari, PPI tarmog'idagi dominant modullar Cytoscape dasturida MCODE plagini (1.4.2 versiyasi, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) yordamida aniqlandi.

VCAM1 tekshiruvi va buyrak funktsiyasi bilan korrelyatsiya tahlili

DKD bilan og'rigan bemorlarning tubulointerstitiumida VCAM1 ning differentsial ifodasi(diabetik buyrak kasalligi)ERCB kohortida tasdiqlangan (31 sog'lom nazorat va DKD bo'lgan 17 bemor). Keyin, biz Nephroseq v5 onlayn ma'lumotlar bazasidan (http://v5.nephroseq.org), buyrak kasalliklarining gen ifodasi ma'lumotlar to'plamlari uchun integratsiyalashgan ma'lumotlarni ishlab chiqish platformasidan foydalanib, VCAM1 ifodasi va DKD bilan kasallangan bemorlarning klinik xususiyatlari o'rtasidagi bog'liqlikni tasdiqlash uchun foydalandik. ERCBda Pearson korrelyatsiya tahlili. p-qiymati<0.05 was="" considered="" statistically="">

VCAM1 uchun immunofluoresans bo'yash

Klinikopatologik jihatdan DKD tashxisi qo'yilgan bemorning kerosinli buyrak bo'limlari(diabetik buyrak kasalligi)VCAM1 bilan bo'yalgan. Bu Pekin universiteti birinchi kasalxonasi tadqiqot etikasi qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (NO. 20171280). Nonspesifik bog'lanish antigen olish uchun fiksatsiya va issiqlik bilan ishlov berishdan keyin 3 foiz BSA bilan bloklandi. Keyin buyrak bo'limlari VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) ga qarshi birlamchi antikor bilan bir kechada 4 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Cy{8}}yorliqli ikkilamchi antikor Jekson ImmunoResearchdan olingan. Oddiy nazorat sifatida nefrektomiya namunalaridan o'simtaga qo'shni buyrak to'qimalari ishlatilgan. Rasmlar Leica DFC 7000 T kamerasi yordamida Leica Application Suite V4.7.1 dasturi orqali olingan.

Hujayra madaniyati

Inson buyragi 2 (HK-2) hujayralari, inson buyragi proksimal quvurli epitelial hujayra liniyasi DMEMda (11885084, Gibko, AQSh) 10 foizli homila sigir zardobi (10099141 C) bilan to'ldirilgan. Gibco, AQSh) va 1 foiz penitsillin/streptomitsin (10378016, Gibco, AQSh) 37 daraja haroratda 5 foiz CO2. Yuqori glyukoza (30 mM D-glyukoza, G8644, Sigma) [16] va TNF (40 ng/ml, 300-01A, PeproTech) [17] HK-2 hujayralarining shikastlanishini qo'zg'atish uchun ishlatilgan. in vitro. Disulfiram (DSL, 0,3 mkM [18,19], NSC190940, Selleck), g'ovak hosil bo'lishining inhibitori, HK-2 hujayra shikastlanishi induksiyasidan 3 soat oldin qo'shilgan.

G'arbiy dog'

Jami protein HK{0}} hujayralaridan RIPA buferi (Sigma, R0278) yordamida ajratildi va oqsil kontsentratsiyasi Pirs BCA Protein Assay to'plami (Thermo Fisher Scientific, 23227) yordamida aniqlandi. Keyinchalik, denatüratsiyalangan oqsillar natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) bilan ajratildi va keyin elektr bilan poliviniliden diflorid membranalariga (Millipore, IPVH00010) o'tkazildi. Membranalar 0,1% Tween 20 (TBST) ni o'z ichiga olgan Tris-buferli sho'r suvda eritilgan 5% yog'siz sut bilan 60 daqiqa davomida bloklandi. Blotlar bir kechada 4 daraja haroratda quyidagi asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilindi: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) va tubulin (ZSBio, TA-10, 1). : 5000). HRP-konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorni 1:1000 suyultirish bilan inkubatsiya xona haroratida 1 soat davomida amalga oshirildi. TBST bilan besh marta yuvishdan so'ng, membranalar 5 daqiqa davomida xemiluminesans substrati (Millipore, WBKLS0100) bilan inkubatsiya qilindi va tasvirlar Image Quant LAS 4000 Mini tizimi (GE Healthcare) yordamida olingan. Yarim kantitativ tahlil ImageJ dasturi (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) yordamida o'tkazildi.

RNK izolyatsiyasi va RT-PCR tahlili

Jami RNK HK-2 hujayralaridan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq RNAsimple Total RNK to'plami (Tiangen, DP419) yordamida olindi va FastKing RT Kit (Tiangen, KR116) yordamida teskari nusxasi cDNKlarga transkripsiya qilindi. Miqdoriy PCR ikki bosqichli usullar bilan StepOne Real-Time PCR tizimi (Applied Biosystems, AQSH) yordamida amalga oshirildi. Amaldagi primerlarning ketma-ketligi S4-jadvalda ko'rsatilgan. Qiyosiy gen ifodasi yuqorida aytib o'tilganidek, 2−DCt usuli yordamida hisoblab chiqilgan.

Statistik tahlil

Statistik tahlillar uchun GraphPad Prism 6.0 dasturi ishlatilgan va ma'lumotlar ± SEM vositasi sifatida taqdim etilgan. Ikki guruh o'rtasida taqqoslash uchun ikki dumli juftlashtirilmagan t-testi qo'llanildi. P < 0.05="" darajasidagi="" farqlar="" statistik="" jihatdan="" ahamiyatli="" deb="">

Cistanche davolay oladiDiabetik buyrak kasalligi

Natijalar

Yaqinda to'plangan dalillar tubulointerstitial patologiyaning DKD rivojlanishi va rivojlanishida hal qiluvchi rol o'ynashini aniqladi.(diabetik buyrak kasalligi). Tadqiqotning maqsadi DKD xususiyatlarini tavsiflash edi(diabetik buyrak kasalligi)tubulointerstitial immun hujayra infiltratsiyasi va DKD patogenezi va terapiyasi haqida yangi tushunchalar berish uchun ba'zi asosiy immun va yallig'lanish genlarini aniqlash. Ushbu tadqiqotda biz tubulointerstitial immun hujayra infiltratsiyasi profilini o'rganib chiqdik va DKDda dasturlashtirilgan hujayra o'limining asosiy shakli piroptozni aniqladik.(diabetik buyrak kasalligi)bioinformatika tahlilidan foydalanish. VCAM1 immunitet bilan bog'liq bo'lgan yuqori darajadagi gen sifatida aniqlandi va piroptoz va infiltratsiyalangan immun hujayralari bilan ijobiy bog'liq edi. Bundan tashqari, VCAM1 ifodasi diabetik sharoitda yetishtirilgan buyrak naychali hujayralarida ko'tarilganligi tasdiqlangan. FDA tomonidan tasdiqlangan preparat disulfiram buyrak tubulali hujayra piroptozini inhibe qildi va VCAM1 ifodasini, yallig'lanish sitokin darajasini va in vitro fibrozni kamaytirdi.

1. Bioinformatika tahlili ish jarayonlari

Ish jarayonining asosiy bosqichlari 1-rasmda ko'rsatilgan. Biz birinchi navbatda DKD bilan og'rigan bemorlarning tubulointerstitial to'qimalarida immun hujayra infiltratsiyasini baholadik.(diabetik buyrak kasalligi). Keyinchalik, GSEA va GSVA yordamida tubulointerstitiumdagi hujayra o'limining asosiy shakli bo'lgan piroptoz aniqlandi. Keyinchalik, biz immunitet hujayralari infiltratsiyasi bilan chambarchas bog'liq bo'lgan genlar ro'yxatini va aniqlangan markaz genlarini ko'rib chiqdik. Infiltratsiyalangan immun hujayralari, piroptoz va VCAM1 yuqori hub geni o'rtasida korrelyatsiya tahlili o'tkazildi. Bundan tashqari, VCAM1 ning klinik tekshiruvi va immuno-bo'yoq tekshiruvi o'tkazildi. Va nihoyat, biz bioinformatika tahlili natijalarini tasdiqlash uchun in vitro tadqiqotini o'tkazdik.

2. Immun va stromal hujayra dekonvolyutsiyasi tahlillari

Biz tubulointerstitial shikastlanishda potentsial ishtirok etadigan hujayra turlarini aniqlash uchun genlarning ommaviy ma'lumotlaridan foydalangan holda hujayra turini boyitish ko'rsatkichlarini yaratuvchi xCell dan foydalandik.diabetik buyrak kasalligi. Har bir namuna uchun 64 turdagi hujayralar, shu jumladan 34 turdagi immun hujayralar va 30 turdagi stromal va boshqa hujayralar bo'yicha boyitish ko'rsatkichlari olingan (2-rasm (a)). DKD ning immun landshaftini aniqlash uchun 34 ta immun hujayra boyitish ballining issiqlik xaritasi tasvirlangan.(diabetik buyrak kasalligi)tubulointerstitium (2-rasm (b)). Oddiy nazorat bilan solishtirganda, T-hujayra boyitish ko'rsatkichlarining aksariyati DKD bilan og'rigan bemorlarda nisbatan yuqori bo'lgan.(diabetik buyrak kasalligi), CD4 plus Tcm, Tregs, Th1 hujayralari, CD8 plus naif T hujayralari va NKT hujayralari bundan mustasno. DKD bilan og'rigan bemorlarda aDC va cDC ning boyitish ko'rsatkichlari yuqori bo'lgan(diabetik buyrak kasalligi)nazorat guruhlariga qaraganda, Pro-B hujayralarini boyitish ko'rsatkichlari DKD bilan og'rigan bemorlarda pastroq edi. Ko'pgina monositlar/makrofaglar va granulotsitlar to'plamlarining boyitish ko'rsatkichlari DKD o'rtasida sezilarli darajada farq qilmadi.(diabetik buyrak kasalligi)va normal to'qimalar, M1 makrofaglari va neytrofillar va eozinofillardan tashqari (1-jadval).

Shakl 2. DKD tubulointerstitiumida xCell tomonidan immun hujayra infiltratsiyasi tahlili(diabetik buyrak kasalligi). (a) GSE30529 ma'lumotlar to'plamida DKD va nazorat buyrak to'qimalari o'rtasida tubulointerstitiumdagi 64 turdagi hujayralar ko'rsatkichlarini taqqoslash. (b) DKDda immun mikro muhitning uyali landshafti(diabetik buyrak kasalligi). Issiqlik xaritasi barcha namunalar uchun har bir immun hujayra turining hujayra turini boyitish ballini ifodalaydi. DC, dendritik hujayra; Tcm, markaziy xotira T xujayrasi; Tem, samarali xotira T hujayrasi; T d hujayra, gamma delta T hujayra.

3. Belgilangan gen to'plamlarining GSVA va GSEA

DKDdagi biologik jarayonlarni o'rganish uchun GSE30529 ma'lumotlar to'plamida o'rnatilgan GSVA va GSEA belgilarini o'tkazdik.(diabetik buyrak kasalligi)tubulointerstitium. DKD bilan og'rigan bemorlarda tubulointerstitsial shikastlanish patogenezida "interferon-alfa javobi", "interferon-gamma javobi" va "komplement" signalizatsiya yo'llari sezilarli darajada faollashdi (3-rasm (a)) va GSVA natijalarining qisqacha mazmuni ko'rsatiladi. S1-jadvalda. Keyin biz uchta gen to'plamining GSEA ni o'tkazdik va ular ma'lumotlar to'plamida ijobiy boyitilganligini aniqladik. Normallashtirilgan boyitish ko'rsatkichlari (NES) 1,89, 1,89 va 1,7{{10}} bo'lib, normallashtirilgan p qiymatlari (NOM p qiymatlari) 0.000, 0,002 va 0,019, mos ravishda (3-rasm (bd)). GSEA yordamida aniqlangan barcha sezilarli darajada boyitilgan yo'llar 2-jadvalda keltirilgan. Bu ma'lumotlar DKD patogenezida tubulointerstitial immun javob muhim rol o'ynashini ko'rsatadi.(diabetik buyrak kasalligi).

4. Hujayra o'limining turli shakllari bilan bog'liq genlar to'plamining GSEA va GSVA

Hujayra o'limiga turli xil patofizyologik mexanizmlar va signalizatsiya yo'llariga ega bo'lgan piroptoz, nekroz, nekroptoz, apoptoz, ferroptoz va autofagiya kiradi. Dasturlashtirilgan hujayra o'limining turli shakllari yallig'lanish va immunitet reaktsiyalari bilan bog'liqligi haqida xabar berilgan. Biz GeneCards dan hujayra o'limining bir necha turlarining gen to'plamlarini yaratdik (jadval S2) va keyin DKD bo'lgan bemorlarda tubulointerstitial yallig'lanishda hujayra o'limining ishtirokini o'rganish uchun GSEA va GSVA ni bajardik.(diabetik buyrak kasalligi). GSEA DKD bilan og'rigan bemorlarda faqat piroptoz gen to'plamlari sezilarli darajada boyitilganligini ko'rsatdi.(diabetik buyrak kasalligi)oddiy boshqaruv elementlari bilan solishtirganda (NES=1.65, FDR q qiymati=0.023, FWER=0.013) (3(e)-rasm). Shu bilan birga, piroptoz uchun GSVA ko'rsatkichi tahlil qilingan hujayra o'limining barcha turlari orasida eng yuqori bo'ldi (jadval S3). Ushbu natijaga asoslanib, piroptoz DKD bilan og'rigan bemorlarda tubulointerstitial shikastlanishlar patogenezida rol o'ynashi mumkin.(diabetik buyrak kasalligi).

Shakl 3. Gen to'plamini boyitish tahlillari (GSEA) va gen to'plamining o'zgarishi tahlillari (GSVA). (a) 50 ta belgi gen to'plamining GSVA natijalarining shtrixlari. (b)-(d) "Hallmark_ interferon-alfa javobi", "Hallmark_ interferon-gamma javobi" va "Hallmark komplementi" ning GSEA natijalari. (e) piroptozning GSEA natijasi.

5. Piroptozni boyitish ko'rsatkichlari va immun hujayra infiltratsiyasi o'rtasidagi bog'liqlik

Piroptoz uchun GSVA boyitish ko'rsatkichlari immun hujayralar infiltratsiyasi nisbati bilan piroptoz va immun hujayralari infiltratsiyasi o'rtasidagi korrelyatsiyani baholash uchun Pearson korrelyatsiya tahlilini o'tkazish orqali korrelyatsiya qilingan. Biz 15 turdagi immun hujayralar va piroptoz o'rtasida sezilarli korrelyatsiyani kuzatdik (4-rasm), bu immunitet hujayralari va piroptoz o'rtasidagi yaqin o'zaro ta'sirni ko'rsatadi.

6. Asosiy genlarning ochilishi

Buyrak tubulyar hujayralari va interstitsial immun hujayralari o'rtasidagi munosabatlarni yanada o'rganish uchun differentsial ifoda tahlili o'tkazildi. DKD o'rtasida to'rt yuz sakkiz DEG aniqlandi(diabetik buyrak kasalligi)guruh va nazorat guruhi, ularning 65 tasi pastga tushirilgan va 343 tasi yuqori tartibga solingan (5-rasm). Immunitet bilan bog'liq DEGlarni aniqlash uchun immunitet bilan bog'liq genlar ro'yxati yuklab olindi va Venn diagrammasi orqali to'qson to'rtta markaziy immun genlar ikkita ma'lumotlar to'plamidan (DEG va immunitetga bog'liq genlar ro'yxati) olingan (6-rasm (a)). Ushbu to'qson to'rtta hub immun genlarining PPI tahlili 97 ta tugun va 694 ta o'zaro ta'sirni aniqladi (S1-rasm). MCC algoritmi tomonidan hisoblangan eng yaxshi 30 ta tugun markaz genlari sifatida aniqlandi (6-rasm (b) va 3-jadval). Keyin, hub genlarini boyitish tahlili o'tkazildi. "Allograftni rad etish", "interferon-gamma javobi", "yallig'lanishga qarshi javob", "interferon-alfa javob", "epitelial-mezenximaga o'tish" va "komplement" belgilar tahlilida eng boyitilgan moddalar bo'ldi. "Revmatoid artrit", "sitokin retseptorlari o'zaro ta'siri", "Toll-like retseptorlari signalizatsiya yo'li", "ko'k yo'tal" va "NF-kappa B signalizatsiya yo'li" eng boyitilgan KEGG atamalari edi. "Hujayraviy javob interferon gamma", "kimyokin faolligi", "leykotsitlar hujayra-hujayra yopishishi" va "sitokin ishlab chiqarishni tartibga solish" eng boyitilgan GO atamalari edi (6-rasm (c)). Bundan tashqari, MCODE reyting tizimi 5 dan katta yoki teng ballga ega ikkita klasterni aniqladi. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 va CXCL6 1-modulda tugun darajalari yuqori bo'lgan markaz tugunlari edi (6-rasm (d)) va CD1C, EGF, FCER1G, CD3D va CD48 2-moduldagi markaz tugunlari edi (6-rasm (e)).

7. VCAM1 ifodasi va infiltratsiya qiluvchi immun hujayralari o'rtasidagi korrelyatsiya

Aniqlangan markaz genlari orasida eng yuqori o'rindagi gen VCAM1 DKDda immun markaz geni sifatida aniqlandi.(diabetik buyrak kasalligi). DKD bilan og'rigan bemorlarda VCAM1 ifodasi sezilarli darajada oshdi(diabetik buyrak kasalligi)(7-rasm (a)). Korrelyatsiya tahlili shuni ko'rsatdiki, VCAM1 ifodasi CD4 va T hujayralari bilan ijobiy korrelyatsiya qilingan (r=0.6877, P=0.0004), CD4 plus T xotira hujayralari (r=0.7102, P=0.0002), Th2 hujayralar (r=0.7358, P < 0.0001),="" cd8="" va="" tcm="" (r="" {{18)="" }}.6026,="" p="0.0030)," t="" d="" hujayralari="" (r="0.5864," p="0.0041)," nk="" hujayralari="" (r="0.5692," p="0.0057)," makrofaglar="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1="" makrofaglar="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adcs="" (r="0.4814," p="0.0233)" va="" cdcs="" (r="0.6562," p="0.0009)," lekin="" naif="" bilan="" salbiy="" korrelyatsiya="" qilingan="" cd8="" plyus="" t="" hujayralari="" (r="-0,4909," p="0,0204)" va="" nkt="" hujayralari="" (r="-0,5548," p="0,0074)" (7-rasm(b)="">

8. VCAM1 ifodasi va piroptoz o'rtasidagi bog'liqlik

DKD bilan og'rigan bemorlarning tubulointerstitiumida ko'tarilgan VCAM1 ifodasini o'rganish uchun Pearson korrelyatsiya tahlili o'tkazildi.(diabetik buyrak kasalligi)piroptoz bilan bog'liq. VCAM1 ifodasi piroptoz bilan chambarchas bog'liq edi (r=0.6118, P=0.0025) (7-rasm (c)), bu piroptozning VCAM1 ifodasini keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatadi.

9. VCAM1 ifodasining tekshiruvi, klinik ahamiyati va immunofluoresans tekshiruvi

Biz DKD bilan og'rigan bemorlarning tegishli tahlilini o'tkazdik(diabetik buyrak kasalligi)DKDdagi VCAM1 ifodasi o'zgarishini tasdiqlash uchun ERCB dan(diabetik buyrak kasalligi)tubulointerstitium. Izchil ravishda, VCAM1 mRNK darajalari DKD bilan og'rigan bemorlarda sezilarli darajada yuqori edi(diabetik buyrak kasalligi)(8-rasm (a)). VCAM1 ifodasi glomerulyar filtratsiya tezligi (GFR) (r=- 0.5920, P=0.0123) (8-rasm (b)) bilan salbiy bog'liq edi va sarum bilan ijobiy bog'liq edi. kreatinin darajalari (r=0.5189, P=0.0328) (8-rasm (c)). Bundan tashqari, biz DKD bilan og'rigan bemorning buyrak to'qimalarida VCAM1 uchun immunofluoresans bo'yashni amalga oshirdik.(diabetik buyrak kasalligi)va buyrak naychalari VCAM1 ekspressiyasi normal buyraklardagiga nisbatan sezilarli darajada ko'tarilganligini aniqladi (8-rasm (d)).

10. DSL HG-induktsiyali HK-2 hujayra piroptozini, VCAM1 ifodasini va yallig'lanishni inhibe qildi.

DKD bilan og'rigan odamlarda quvurli hujayra piroptozi, VCAM1 ifodasi va tubulointerstitial immun javob o'rtasidagi bog'liqlikni aniqlash uchun biz ekilgan HK{0}} hujayralarini yuqori glyukoza (HG) va TNF-ga 48 soat davomida ta'sir qildik.(diabetik buyrak kasalligi). Uyali piroptozning yadrosi parchalangan GSDMD tomonidan qo'zg'atilgan membrana teshiklarining shakllanishi bo'lganligi sababli, biz GSDMD N-terminal domeni (GSDMD-NT) va VCAM1 darajasini western blot yordamida aniqladik. HG ham, TNF ham GSDMD-NT darajasining sezilarli o'sishiga olib keldi, bu GSDMD vositachiligidagi piroptozning paydo bo'lishini ko'rsatadi (9-rasm (a)). VCAM1 ifodasi HG va TNF-guruhlarida statistik jihatdan sezilarli darajada oshdi (9-rasm (b)). Disulfiram (DSL) GSDMD gözenek shakllanishining samarali inhibitoridir [18]. DSL bilan oldindan davolash GSDMD-NT darajasining oshishini engillashtirdi, bu hujayra piroptozi bostirilganligini ko'rsatadi. Shu bilan birga, VCAM1 ifodasi DSL bilan oldindan ishlov berilgan HG va TNF guruhlarida kamaydi (9-rasm (ab)). Keyinchalik, qPCR yordamida yallig'lanish sitokin profili aniqlandi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, HG tomonidan qo'zg'atilgan MCP-1, IL-1 va IL{19}} mRNKlarining yuqori tartibga solingan darajalari DSL oldindan ishlov berishdan keyin sezilarli darajada pasaygan. TNF-guruhda IL-1 darajasi DSL-oldindan ishlov berilgan guruhda sezilarli darajada kamaydi va MCP-1 va IL-18 darajalari sezilarli darajada o'zgarmadi. Hech qaysi guruhda IL-6 va IL{26}} mRNKlari darajasida sezilarli oʻzgarishlar aniqlanmadi. Muhimi, DSL bilan oldindan ishlov berilgan guruhlarda TGF{27}} mRNK darajalari ham kamaydi. Shunday qilib, piroptotik quvurli hujayralar diabetik sharoitlarda VCAM1 ifodasini oshirdi va piroptozni bekor qiluvchi davolash HK-2 hujayralarida VCAM1 ifodasini, yallig'lanishni va fibrozni inhibe qildi.

Cistanche davolay oladiDiabetik buyrak kasalligi

II qism uchun shu yerni bosing

Kimdan: Yan Jia va boshqalar tomonidan "Diabetik buyrak kasalligida tubulointerstitial shikastlanish bilan bog'liq immunitet bilan bog'liq gen sifatida qon tomir hujayralari yopishish oqsili 1ni aniqlash va tekshirish"

---BIOENGINEERED 2021, JIL. 12, NO. 1, 6655–6673