Tug'ma immunitet reaktsiyasida farq qiluvchi ikkita jo'xori bicolor chizig'i o'rtasidagi gen ifodasining o'zgarishi
Feb 28, 2023
Annotatsiya:
Mikrob bilan bog'liq molekulyar naqsh (MAMPs) qo'zg'atilgan immunitet (MTI) o'simlikning mikroblarning tan olinishiga tug'ma immun javobining asosiy komponentidir. Biroq, MTI haqidagi hozirgi bilimlarimizning aksariyati namunali o'simliklardan (ya'ni, Arabidopsis thaliana) olingan bo'lib, ekin o'simliklari yordamida nisbatan kamroq ish bajariladi. Ushbu ishda biz ikkita Sorghum bikolor genotipi, BTx623 va SC155-14E.da MAMP tomonidan qo'zg'atilgan oksidlovchi portlash (ROS) va transkripsiya reaktsiyasini o'rgandik. SC155-14E - yuqori antraknozga chidamliligini ko'rsatadigan chiziq va BTx623 chizig'i antraknozga sezgir. Natijalarimiz ikkita chiziq o'rtasida flagellin (flg22) yoki xitin chiqishiga javoban gen ifodasi va ROSda aniq o'zgarishlarni aniqladi. Har bir MAMPga va har bir satrga transkripsiyaviy javob noyob bo'lsa-da, sezilarli darajada o'xshashlik bor edi va biz jo'xori MAMP transkripsiya javobi bilan bog'liq bo'lgan asosiy genlar to'plamini aniqlay oldik. GO atamasi va KEGG yo‘lini boyitish tahlili MAMP bilan ishlov berilgan SC155-14E namunalarida bir xil ishlov berilgan BTx623 namunalariga qaraganda ko‘proq immunitet va patogen qarshilik bilan bog‘liq DEGlarni aniqladi. Natijalar jo'xori o'simligining tug'ma immunitet yo'llarini, shu jumladan kasalliklarga chidamliligini oshirishga qaratilgan kelgusi tadqiqotlar uchun asos bo'lib xizmat qiladi.
Sotib olish uchun bosingyaxshilangan immunitet mahsuloti
For more information:1950477648nn@gmail.com
Kalit so‘zlar:
Sorghum ikki rangli; ROS; tug'ma immunitet; MAMPlar; RNK-seq; gen ifodasi
1.Kirish
O'simliklar tabiiy ravishda turli xil stresslarga, jumladan ko'plab bakterial, zamburug'li va virusli patogenlarga duchor bo'ladilar [1]. O'simliklar oldindan tuzilgan tuzilmalar va kimyoviy moddalar yordamida o'zlarini patogenlardan va immunitet tizimining infektsiyadan kelib chiqqan javoblaridan himoya qiladi. O'simliklarning immun tizimi retseptorlarning bir-biriga bog'langan ikkita qatlamiga ega bo'lgan ikki bosqichli idrok tizimidan foydalanadi.
Birinchi daraja sirtda lokalizatsiya qilingan naqshni aniqlash retseptorlari (PRR) tomonidan faollashtiriladi, ular mikrob bilan bog'liq molekulyar naqshlar (MAMPs) deb ataladigan saqlanib qolgan strukturaviy motivlarni aniqlash orqali bosqinchi patogenni tanib, hujayradan tashqaridagi molekulalarni sezadilar, bu esa mo''tadil, lekin keng, mudofaa javob [2]. Flagellin, xitin, lipopolisakkaridlar, peptidoglikanlar (PGN) va cho'zish faktor Tu yaxshi o'rganilgan MAMPlarga misol bo'ladi [3-5]. Ushbu mudofaa reaktsiyasi MAMPtrigged immunitet (MTI) deb ataladi [6]. Effektor bilan qo'zg'atilgan immunitet (ETI) deb nomlanuvchi himoyaning ikkinchi darajasi o'simlik tomonidan qarshilik oqsillari ta'sirida tan olinadigan o'ziga xos patogen kelib chiqadigan effektor oqsillarga javob sifatida yuzaga keladi, natijada kuchli, ammo yuqori o'ziga xos immunitet reaktsiyasi paydo bo'ladi. ETI ko'pincha o'ta sezgir javob (HR) deb ataladigan mahalliy hujayralar o'limining induktsiyasi bilan tan olinishi mumkin [7]. MTI va ETI tizimlari patogenlarni sezadi va infektsiyalangan hujayra va qo'shni hujayralardagi mikroblarga qarshi himoyani faollashtirish orqali javob beradi [3,8]. O'simliklar, shuningdek, yuqori darajada o'zgaruvchan patogen effektorlarni taniydigan immun retseptorlarini ham olib yuradi, bularga NBS-LRR oqsil sinfi kiradi [9].
Bundan tashqari, tizimli orttirilgan qarshilik (SAR) patogenga ilgari mahalliy ta'sir qilishdan keyin yuzaga keladigan "butun o'simlik" qarshilik reaktsiyasidir. SAR keng doiradagi genlarning (patogenez bilan bog'liq genlar) induksiyasi bilan bog'liq va SAR faollashishi endogen salitsil kislotasining (SA) to'planishini talab qiladi [10].
Asosan Arabidopsis yordamida olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, MTI turli xil reaktsiyalarga olib kelishi mumkin, shu jumladan reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarish (ROS), azot oksidi (NO) kabi reaktiv azot turlarini ishlab chiqarish, kalloza cho'kishi, hujayra ichidagi kaltsiy darajasi, plazmadagi ion oqimi membrana, o'simlik himoyasi bilan bog'liq bo'lgan bir nechta genlarning ifodalanishini induksiyalash yoki repressiya qilish, o'simlik hujayra devoridagi o'zgarishlar, mikroblarga qarshi birikmalarning induksiyasi va patogenez bilan bog'liq (PR) oqsillari sintezi [3,11].
Ushbu MTI javoblarining bir nechtasini umumiy o'simlik reaktsiyalari deb hisoblash mumkin bo'lsa-da, ularning kattaligi o'simlik turiga va hatto navga xos bo'lishi mumkin [12-17]. O'simliklarning MTI javobini miqdoriy aniqlash uchun usullar ishlab chiqilgan. Ushbu usullar ROS yoki NO ishlab chiqarishni, mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaz fosforlanishini, o'ziga xos MAMP tomonidan qo'zg'atilgan gen ekspressiyasini, ko'chat o'sishini inhibe qilishni, lignin va hujayra devori bilan bog'langan fenollarni va MAMP tomonidan bakterial va qo'ziqorin patogenlariga qarshilikni o'lchashni o'z ichiga oladi [18-20].
Sorghum bicolor (L.) Moench asosiy, global boshoqli ekin boʻlib, turli yashash joylariga moslashtirilgan va turli maqsadlarda yetishtiriladi [21]. Oziq-ovqat va biomassa ishlab chiqarish uchun asosiy ekinlardan biri sifatida jo'xori yetishtirish butun dunyoda sezilarli darajada oshishi kutilmoqda [22].
Jo‘xori yetishtirish amaliyoti va geografik hududlari ortib borishi bilan kasallik bosimining oshishi muqarrar. Jo‘xori boshqa don ekinlari orasida o‘zining g‘ayrioddiy keng tarqalgan kasalliklari bilan ajralib turadi, bu esa uni etishtirishdagi eng muhim cheklovlardan biridir. Global miqyosda keng tarqalgan qo'ziqorin kasalliklari eng halokatli jo'xori kasalliklari bo'lib, ular hosilning miqdori va sifati jihatidan katta yo'qotishlarga olib keladi [23]. Antraknoz jo'xori donining hosildorligi va biomassa ishlab chiqarishiga ta'sir qiluvchi eng og'ir qo'ziqorin kasalliklaridan biridir. Bu qo‘zg‘atuvchi tufayli hosilning yo‘qolishi sezgir navlarda 50-70 foizni tashkil qilishi mumkin [24,25]. O'simliklar patogenlar hujumiga qarshi kurashish uchun turli xil himoya strategiyalarini ishlab chiqdilar. Sorghumda bu strategiyalar PR oqsillarini faollashtirishni [26], vodorod peroksidni to'plashni [27] va flavonoid fitoaleksinlarning biosintezini [28] o'z ichiga oladi. Sorghumning qarshilik reaktsiyalarini o'rganish, himoya birikmalarini aniqlash va antraknozga qarshi jismoniy to'siqlarni aniqlash uchun turli xil yondashuvlar qo'llanilgan (ko'rib chiqish uchun havola [29,30] ga qarang). Gen ekspressiyasi bo'yicha tadqiqotlar chidamli va sezgir navlar yoki emlanmagan va patogen bilan emlangan o'simliklar o'rtasidagi differentsial ifoda asosida o'simliklardagi nomzod qarshilik genlarini aniqlash uchun keng qo'llanilgan (masalan, havolalar [31-37]). Vang va boshqalar, [37] BTx623 jo'xori navining C. subline-olaga javobini o'rganish uchun transkriptomik tahlilni o'tkazdilar. Ular fenilpropanoid metabolizmida ishtirok etadigan genlar va ikkilamchi metabolitlarning biosintezi emlanmagan nazorat o'simliklariga nisbatan patogen bilan infektsiyaga javoban differentsial tarzda aniqlanganligini xabar qildilar.
Biroq, bu tajribalar sezgir BTx623 navining ko'chatlari bilan o'tkazildi. Sezuvchan va chidamli jo'xori navlarida patogenga gen ekspressiyasini solishtirish uchun qo'shimcha transkriptomik tadqiqotlar qimmatli bo'ladi. Demak, jo'xori bazal kasalliklariga chidamliligini nazorat qiluvchi genetik arxitekturani va uning kasalliklarga miqdoriy qarshilik bilan bog'liqligini tushunish muhimdir.
Ushbu yo'nalishdagi dastlabki qadam sifatida biz yaqinda turli xil jo'xori germplazmasi to'plamini ularning flg22 va xitin chiqarilishiga bo'lgan javoblari, shuningdek, qo'ziqorin kasalliklariga chidamliligi uchun tekshirdik [38]. Bunday holda, MTI, MAMP paydo bo'lishidan keyin ROS ishlab chiqarishni o'lchash orqali aniqlandi. Ushbu oldingi tadqiqot natijalari orasida MAMP chiqishiga kuchli yoki zaif javob ko'rsatadigan jo'xori genotiplarini aniqlash bo'lgan.
Keyingi avlod transkriptomalarining yuqori samarali ketma-ketligi va o'rganilishi o'simliklardagi qo'ziqorin infektsiyasiga javoblarni aniqlashga yordam beradi va xost reaktsiyalari haqida tushunchani oshiradi. Transkriptom tahlillari ko'plab o'simlik turlarida, shu jumladan donli ekinlarda qo'ziqorin infektsiyasiga o'simliklarning javoblarini o'rganish uchun keng qo'llanilgan (masalan, havolalar [31-37]).
Biroq, boshoqli ekinlarning qiyosiy transkriptom tahlili bo'yicha nashr etilgan ma'lumotlar, birinchi navbatda, turli patogenlarga javob berishga qaratilgan. Sorghumda bir nechta nashrlar turli patogenlar, shu jumladan antraknoz bilan davolash qilingan o'simliklarning transkriptoma taqqoslashlariga qaratilgan [35,37]. Ba'zi oldingi nashrlar MAMP va qo'ziqorin kasalligiga javob o'rtasida sezilarli bog'liqlik yo'qligini ko'rsatdi. Masalan, Zhang va boshqalar. [17] makkajo'xori xaritalash populyatsiyasida ikkita MAMP flg22 va xitinga javob o'rtasida kuchli bog'liqlik borligini xabar qildi, ammo qo'ziqorin kasalligiga javob yo'q. Kimball va boshqalar. [38], shuningdek, BTx623/SC155-14E populyatsiyasi boʻlgan ikki joʻxori RIL populyatsiyasida flg{5}}induktsiyalangan ROS javob ballari va maqsadli barglar dogʻiga chidamli ball oʻrtasida past korrelyatsiya borligini xabar qildi. Shuning uchun, ma'lumotlarning kamligini hisobga olgan holda, biz jo'xori javobini MAMP muolajalariga transkripsiyalash muhimligini his qildik.
Ushbu joriy hisobotda biz MAMP chiqishiga global transkripsiya reaktsiyasini o'lchash orqali oldingi tahlilimizni kengaytiramiz. Illumina asosidagi RNK sekvensiyasi tahlilidan jo‘xori BTx623 va SC{3}}E genotiplarida flg22 yoki xitin bilan davolashga javoban transkripsiyaviy o‘zgarishlarni o‘rganish uchun foydalandik, biz ilgari mos ravishda zaif va kuchli MTI javob beruvchilari sifatida tavsiflangan edik. BTx623 - Sorghum bicolor genomining mos yozuvlar chizig'i [22] va SC{6}}E - antraknozga chidamliligi yuqoriligini ko'rsatadigan chiziq [39]. Patil va boshqalar. [39] SC{9}}E sinovdan o'tgan barcha muhitlarda antraknoz kasalligiga yuqori darajadagi barqaror qarshilikni (deyarli kasalliksiz) ko'rsatganligini, BTx623 esa bu qo'ziqorin kasalligiga sezgir ekanligini xabar qildi. Bizning RNK-seq tahlilimiz BTx623 da flg22 va xitin bilan ishlov berilgan 5252 va 8085 Differensial Ekspresslangan Genlarni (DEG) va nazorat qilinmaganlarga nisbatan mos ravishda flg22 va Chitin bilan ishlov berilgan SC{19}}E da 3849 va 5786 DEGni aniqladi. bu ikki genotipdan.
Bundan tashqari, ikkita turli xil bioinformatika quvurlari yordamida tanlangan DEGlarni taqqoslash juda o'xshash natijalarni ko'rsatdi. Differensial ravishda ifodalangan genlarning ekspression profillari, gen ontologiyasi (GO) boyitish tahlili va KEGG yo'lini boyitish tahlili MTI bilan bog'liq gen ekspressiyasida aniq genotipga asoslangan o'zgarishlarni ko'rsatdi. GO atamasi va KEGG yo'lini boyitish natijalari MAMP bilan ishlangan SCda taqdim etilgan immunitet va patogen qarshilik bilan bog'liq ko'proq DEGlarni (PR genlari, genlarning xitinga javobi, salitsil kislotasiga genlarning javobi, stressga genlarning javobi va boshqalar) aniqlandi{{4} }MAMP bilan ishlov berilgan BTx623 ga nisbatan E namunalari. Natijalar jo'xori MTI javobining turli komponentlarini aniqlash uchun bazani beradi.
2. Natijalar va muhokama
2.1. Turli xil jo'xori barglarida oksidlovchi portlashning o'zgarishi
Turli jo'xori genotiplarining MTI javobini oldingi tahlilimiz BTx623 va SC{2}}E [38] genotiplari o'rtasida MAMP tomonidan qo'zg'atilgan oksidlovchi portlashda sezilarli o'zgarishlarni aniqladi. Bundan tashqari, SC155-14E antraknozga yuqori qarshilik ko'rsatadigan chiziq, BTx623 chizig'i esa antraknozga sezgir [39]. Aynan shu sabablarga ko'ra, bu ikki genotip RNK-seq yordamida taqqoslash uchun tanlangan.
Ilgari ROS o'lchovlarini o'tkazar ekanmiz, biz bir xil zavod ichida ham sezilarli o'zgarishlarni topdik, bu bizni ushbu o'zgarish manbasini diqqat bilan o'rganishga olib keldi. Xususan, biz o'n besh kunlik BTx623 va SC{3}}E o'simliklarining pastki qismidan tepasiga qarab uchta barglar to'plami yordamida ROS ishlab chiqarishni sinab ko'rdik. Barglar 1A-rasmda ko'rsatilganidek, №1, №2 va №3, pastdan tepaga qarab belgilangan. ROS tahlili natijalari (1B-rasm) shuni ko'rsatdiki: (1) ROS ishlab chiqarish darajasi eski barglarda (barg №1) pastroq bo'lsa, flg22 yoki xitinga javoban ROS ishlab chiqarishning eng yuqori darajasi eng yosh barglarda edi ( barg №3). (2) MAMP bilan ishlov berilgan va ishlov berilmagan BTx{15}}nchi eng yosh barglar (2-barg) nisbatan past darajadagi ROS ishlab chiqargan.
Aksincha, MAMP bilan ishlov berilgan SC155-14E ning 2-eng yosh barglari ishlov berilmagan soxta, shuningdek, BTx155-14E ning qayta ishlangan yoki masxara qilinganidan ko'ra sezilarli darajada (0.01 darajasida) yuqori ROS ishlab chiqarish darajasini hosil qildi. {5}}eng yosh barglar. (3) Flg22 yoki xitinni qo'llash natijasida yuzaga kelgan oksidlovchi portlash ikkala genotipning eng yosh barglaridan (barg №3) barg disklarida aniqlandi, garchi ilgari kuzatilganidek, MAMP bilan ishlangan SCda ROS ishlab chiqarish darajasi yuqori bo'lgan. 155-14BTx623 ga nisbatan E. SC155-14E 2-chi eng yosh bargda flg{12}}tetiklangan va xitin bilan tetiklangan ROS ishlab chiqarish vaqti kursi shuni ko'rsatdiki, xitin bilan tetiklangan ROS ishlab chiqarilishi flg{17}} ROS ishlab chiqarilishiga qaraganda ertaroq sodir bo'lgan (1C-rasm). ). Shunga o'xshash natijalar Zhang va boshq. [17] bu erda xitin bilan ishlaydigan ROS ishlab chiqarish flg22 va chitin bilan ishlov berilgan makkajo'xori ko'chatlarida flg{21}}qo'zg'atilgan ROS ishlab chiqarishdan oldinroq paydo bo'lgan. Flg22 ga javoban ROS ishlab chiqarish taxminan 12 daqiqada eng yuqori ROS ishlab chiqarishni ko'rsatdi va Arabidopsisda 30 daqiqada eng past bo'lganligi xabar qilindi [40]. Bizning ROS tahlilimiz jo'xori uchun eng yuqori ROS ishlab chiqarishni taxminan 13 daqiqada va eng pastini flg22 davolashdan keyin 30 daqiqada ko'rsatdi, bu Arabidopsis natijalariga juda o'xshash. Maqsadimiz ikki genotipning MTI javobini solishtirish uchun maqbul shart-sharoitlarni topish bo'lganligi sababli, RNK ekstraktsiyasi va keyingi transkriptomik tahlil uchun 15-kunlik o'simliklarning 2-eng yosh barglarini tanladik. Bitta jo'xori o'simliklarining barglari orasidagi o'zgarishlar ma'lum bir tajribaning manbasi, vaqti va boshqa xususiyatlariga qarab natijalar tajribalar orasida farq qilishi mumkinligini va shuning uchun eksperimental parametrlarni diqqat bilan nazorat qilish kerakligini eslatadi.
Oksidlanish portlashi, tez, o'tkinchi, reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarish o'simlikning mudofaa reaktsiyasining eng erta kuzatilishi mumkin bo'lgan jihatlaridan biridir [41]. ROS portlashi darhol javob ekanligini hisobga olsak, MTI bilan bog'liq genlarning biroz kechroq transkripsiyaviy javobi kutilmoqda. Biz namunalarni RNK-Seq tahlili uchun MAMP bilan davolashdan 60 daqiqa o'tgach yig'ib oldik.
2.2. MAMP muolajalariga javoban BTx623 va SC155-14E ning differentsial ifodalangan genlari (DEGs)
Har bir namuna uchun izohlangan Sorghum bicolor oqsilini kodlovchi genlarning ifoda darajasini baholash uchun har bir genga moslashtirilgan RNK-seqning toza o'qishlar soni hisoblab chiqildi va keyin FPKM ga normallashtirildi (har bir million xaritalangan fragmentlar uchun kb ekson modeli uchun fragmentlar). BTx623 va SC{4}}E ning MAMP bilan ishlov berilgan barg disklarida har bir genning soxta (suv) muolajalari bilan solishtirganda ifoda oʻzgarishlari oʻrganildi. Jami ifodalangan genlar ikkala genotipning barcha davolashlarida oʻxshash edi: 27.171, 27.283, 27.161, 27.182, 27.512 va 27.175 genlar BTx623, flg{18}}moslashtirilgan BTx623, BTx623, BTx623 bilan ishlangan. {22}}E, flg22-davolangan SC155-14E va xitin bilan ishlov berilgan SC155-14E, mos ravishda. SC155-14E uchun maxsus havola mavjud emasligi sababli ikkala satrda xaritalash uchun BTx623 mos yozuvlar genomidan foydalandik. Yuqoridagi barcha shartlar bilan BTx623 va SC{{30}E dan olingan ifodalangan gen raqamlari ikkala chiziqda ham bir xil miqdordagi ekspress genlar mavjudligini ko'rsatdi. SC155- 14E soxta (3 nusxa), SC155-14Flg22 bilan ishlov berilgan SC155-14E, xitin bilan ishlov berilgan SC155-14E (3 replikatsiya) namunalarining umumiy oʻqish xaritalash tezligi , BTx623 masxara (3 replikatsiya), flg22 bilan ishlangan BTx623 (3 replikatsiya), xitin bilan ishlov berilgan BTx623 (3 replikatsiya) quyidagilar edi: 93,6 foiz , 93,9 foiz , 93,9 foiz , 93,8 foiz , 93,9 foiz , 93,9 foiz , 95,3 foiz. , 93,1 foiz , 96,9 foiz , 97.{68}} foiz , 97.0 foiz , 97,2 foiz , 96,8 foiz , 97.{78}} foiz , 96,9 foiz , 97.0 foiz , mos ravishda 97,0 foiz. Ushbu natijalar MAMP bilan davolashning BTx623 va SC{82}}E transkriptomlariga turli ta'siri ikki genotip o'rtasidagi genomik ketma-ketlik farqlari bilan bog'liq emasligini ko'rsatdi.
Gen ifodasi PCA syujeti namunalar orasidagi bog'lanish haqida tushuncha beradi. Namunalarimiz o'xshashligini o'rganish uchun biz PCA tahlilini o'tkazdik. PC1 va PC2 dagi namunaviy chizma (2-rasm) shuni ko'rsatdiki, to'rtta eksperimental shart (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_chitin va SC{ {10}}E_xitin) keng tarqaldi. Aksincha, har bir jo'xori liniyasining uchta biologik replikatsiyasi va har bir MAMP bilan ishlov berish, shuningdek, soxta davolash mos ravishda bir-biriga chambarchas bog'langan bo'lib, bu biologik replikatsiyalar o'rtasida yaxshi takrorlanish qobiliyatini ko'rsatadi (2-rasm).
3-rasmdagi vulqon uchastkalari flg22 yoki xitin bilan ishlov berilgan ikkita jo'xori chizig'ida gen ifodasini ko'rsatadi. Vulqon uchastkasi - bu o'zgarish kattaligiga (qatlam o'zgarishi) nisbatan statistik ahamiyatga (p-qiymat) ko'rsatadigan tarqalish sxemasining bir turi. Bu statistik ahamiyatga ega bo'lgan katta o'zgarishlarga ega genlarni tez vizual aniqlash imkonini beradi. Bu eng biologik ahamiyatga ega genlar bo'lishi mumkin. 3-rasmda −log10 (p-qiymati) 3 ga teng yoki undan katta bo‘lgan genlar DEG deb hisoblanadi. Qizil rangli nuqtalar DEG ni, qora nuqta esa DEG bo'lmagan nuqtalarni ifodalaydi. Har bir uchastkada log2 (qatlam{10}}o'zgarishi) 0 dan katta bo'lgan genlar yuqori tartibga solinadigan genlar, aks holda pastga regulyatsiya qilingan genlardir. Eng yuqori tartibga solinadigan genlar o'ng tomonda, eng past tartibga solinadigan genlar chap tomonda va statistik jihatdan eng muhim genlar tepada.
Differensial ravishda ifodalangan genlar (DEG) har bir davolashdan ularning ifodalanish ahamiyatiga qarab tanlab olindi (p-qiymati 0.001). Shuni ta'kidlash kerakki, biz ushbu hisobotda DEGlarni tanlash uchun 0.001 bo'sag'asi sifatida p-qiymatidan foydalanganmiz, lekin FDR (q-qiymatlari) emas. FDR (q-qiymatlari) ham ushbu darajada muhim edi (S2-S5 jadvallari). 0.001 p-qiymatida FDRlar flg22 bilan ishlov berilgan BTx623, flg22 bilan ishlov berilgan SC{23}}E, xitin bilan ishlov berilgan BTx623{{155-14 uchun 0,0039, 0,0051, 0,0025 va 0,0035 edi. 26}}Mos ravishda xitin bilan ishlov berish bilan E. Barcha sharoitlarda BTx623 va SC155-14E genlarining p-qiymatlari va q-qiymatlari S2–S5-jadvallarda keltirilgan. BTx623 va SC{35}}E ning MAMP bilan ishlov berilgan barglarida ushbu genlarning ekspressiya naqshlarini tahlil qilib, biz flg22 yoki xitindan keyin katta farqlarni ko'rsatadigan ko'p sonli genlarni (jami ifodalangan genlarning 14-30 foizini) kuzatdik. har ikkala jo'xori liniyasida davolash. Xitin bilan ishlov berilgan BTx623 (8085) ning umumiy DEG soni antraknoz qo'zg'atuvchisi C. subline-ola (8078) bilan zararlangan BTx623 da oldingi transkriptome tadqiqotida bildirilganiga juda yaqin edi [37]. DEG soni flg22 (19 foiz) yoki xitin (30 foiz) bilan ishlangan BTx623 barglarida SC155-14E (mos ravishda 14 foiz va 21 foiz) ga nisbatan yuqoriroq bo‘lgan.
MAMP bilan ishlov berilgan BTx623 da SC155-14E ga nisbatan koʻproq DEG soni ushbu ikki genotipning ROS javobiga qarama-qarshi boʻlsa ham, bu ajablanarli emas, chunki MAMP bilan davolashga nisbatan ROS javobi va gen ekspressiyasi javobi turli vaqtlar, asosan mustaqildir va turli mexanizmlar bilan vositachilik qiladi [42,43]. GO atamasi va KEGG yo'lini boyitish MAMP bilan ishlov berilgan SC155-14E namunalarida ko'proq immunitet va patogenlarga qarshilik bilan bog'liq DEGlarni aniqladi. Bundan tashqari, xitin bilan ishlov berilgan namunalarda flg22 bilan davolash qilinganlarga nisbatan DEG soni yuqori bo'lganligi ROS javob tahlillari bilan yaxshi mos keldi (1B-rasm), bu erda biz xitin bilan davolashda kuchliroq ROS javobini ko'rdik.
BTx623 va SC155-14E da flg22 va xitin bilan davolash oʻrtasida genlar va biologik jarayonlar qay darajada taqsimlanganligini oʻrganish uchun biz ularning DEGlarini batafsilroq solishtirdik. 4A-rasmdagi Venn diagrammalarida umumiy hajmdagi DEGlardagi bir-biriga o'xshashlik ko'rsatilgan, yuqoriga va pastga tartibga solinadigan genlar p-qiymati 0.001. Jami 10,535 DEGdan 2272 genning asosiy to'plami ikkala jo'xori liniyalarida ham flg22, ham xitin bilan davolashga javob berdi. Xuddi shunday, jami 5410 ta yuqori tartibga solinadigan genlardan 1778 tasi har ikkala genotipda ham yuqori regulyatsiya qilingan, 5125 ta pastga regulyatsiya qilingan genlardan 474 tasi esa ikkala genotipda ham pastga regulyatsiya qilingan. genotiplar.
Bu yerda taqdim etilgan RNK ketma-ketligi maʼlumotlari bioinformatika trubkasi yordamida Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 va Manjet tugmalari 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) standart parametrlari (quvur №1) yordamida tahlil qilindi. Tahlil natijalarini qo'shimcha tasdiqlash uchun biz tahlilni o'tkazish uchun HiSat2, HTSeq va edgeR bilan boshqa quvur liniyasidan (№2 quvur liniyasi) foydalandik. HiSat2 - TopHat2 ning navbatdagi ishlanmasi. Ikkala quvur liniyasidan foydalangan holda tanlangan har bir holatning DEGlarini (ya'ni, flg22 yoki xitin bilan ishlov berilgan ikkita genotip, barchasi, yuqoriga yoki pastga tartibga solinadigan DEG) solishtirdik. Natijalar (5-rasm) ikkala quvur liniyasi yordamida tanlangan DEG raqamlari juda yaqin ekanligini ko'rsatdi.
№1 quvur liniyasi va №2 quvur liniyasi bilan tanlangan jami DEGlar BTx623_flg22: 5241 va 5413; SC155-14E_flg22: 3849 va 3476; BTx{11}}xitin: 8085 va 8320; SC155-14E_chitin: 5786 va 5383. №1 quvur liniyasi va №2 quvur liniyasi bilan tanlangan yuqori tartibga solingan DEGlar BTx623_flg22: 3074 va 3076; SC155-14E_flg22: 2591 va 2483; BTx{30}}xitin: 4156 va 4583; SC155-14E_chitin: 3486 va 3346. №1 quvur liniyasi va №2 quvur liniyasi bilan tanlangan pastga regulyatsiya qilingan DEGlar BTx623_flg22: 2152 va 2237; SC155-14E_flg22: 1257 va 993; BTx{49}}xitin: 3919 va 3757; SC155-14E_chitin: 2296 va 2037. Bundan tashqari, 5-rasmdagi natijalar, shuningdek, ikkita quvur liniyasi yordamida tanlangan DEGlarning yuqori foizi barcha sharoitlarda bir-biriga mos kelishini aniqladi. №1 quvur liniyasi yordamida tanlangan bir-biriga o'xshash DEG raqamlari/DEG raqamlarining ulushi 79,6 foiz va 73,7 foizni tashkil etdi. BTx{66}}flg22, SC{68}}E_flg22, BTx623_chitin va SC155-14E{{73} umumiy DEGlarining 80,8 foizi va 74,4 foizi }chitin, mos ravishda; BTx{82}}flg22, SC155-14E{85}}flg22, BTx623_chitin va SC{{ yuqori tartibga solinadigan DEGlarning 83 foizi, 80,6 foizi, 85,3 foizi va 81,1 foizi. 88}}E{89}}chitin, mos ravishda; BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin va SC623_ning 75,1 foizi, 59,5 foizi, 75,8 foizi va 67,4 foizi past tartibga solingan DEGs. 105}}E{106}}chitin, mos ravishda. Shunday qilib, ushbu qiyosiy natijalar tahlil uchun ikkita usuldan qaysi biri qo'llanilishidan qat'i nazar, taqdim etilgan RNK ketma-ketligi ma'lumotlari to'g'ri ekanligini isbotladi.
Uch biologik replikatsiya uchun flg22 yoki xitin bilan ishlov berilgan BTx623 va SC155-14E DEGlarining klasterli ifoda profillarining issiqlik xaritasi 6-rasmda ko'rsatilgan. Gen ifodasi qiymatlari z-ballari sifatida normallashtirildi. Qiymat ortib borishi bilan rang binafsha rangdan qizil rangga aylanadi, bu gen ifodasini pastdan yuqoriga ko'rsatadi. Ushbu issiqlik xaritasi BTx623 va SC{6}}E genlarining flg22 yoki xitin bilan davolashga javoban differentsial regulyatsiyasini aniq ko'rsatadi. Bundan tashqari, natijalar, shuningdek, har bir holatda uchta biologik replikatsiyaning issiqlik xaritalari juda yaqin ekanligini ko'rsatadi, bu biologik replikatsiyalar o'rtasida yaxshi takrorlanish qobiliyatini ko'rsatadi.
Bundan tashqari, flg22 va xitin bilan davolashdan yuqoriga va pastga tartibga solinadigan DEGlar o'rtasidagi juftlik taqqoslashlari (7A-rasm) BTx623 va SC155-14E o'rtasida katta o'xshashlik mavjudligini ko'rsatdi. BTx623 da 3074 flg{8}}induktsiya qilingan genlar orasida 83,8 foizi BTx623 da xitin bilan davolashga javoban induktsiya qilingan, SC155-14Eda 2591 flg{14}}induktsiya qilingan genlar, {{ 16}},6 foizi xitin bilan davolash qilingan SC155-14E. Buning ajablanarli joyi yo'q, chunki Arabidopsis thalianadagi oldingi ishlar MTIning umumiy yo'llarini belgilaydigan turli xil MAMPlarga javob beradigan genlarda sezilarli o'xshashlikni ko'rsatdi [44-46].
Bundan tashqari, Zhang va boshqalar. [17], shuningdek, makkajo'xoridagi flg22 va xitin reaktsiyasi o'rtasida sezilarli bog'liqlik borligini xabar qildi. Xuddi shu MAMP bilan ishlov berilgan BTx623 va SC{3}}E barg disklari o'rtasida kamroq o'xshashlik kuzatildi (7A-rasm). BTx623 da flg22-induktsiyalangan genlarning 64,3 foizi flg22-davolangan SC155-14E va BTx623 da 68,3 foizi xitin bilan ishlangan SC155-14 E. Xuddi shunday, BTx623 ni flg22 bilan davolashda pasaytirilgan 2152 genning yuqori foizi (75,9 foiz) BTx623 da xitin tomonidan ham pastga regulyatsiya qilingan. SC155-14Eda flg22 tomonidan pastga regulyatsiya qilingan 1257 gendan 70,8 foizi SC155-14Eda ham xitin tomonidan pastga regulyatsiya qilingan. Shu bilan birga, BTx623 da flg22 pastga regulyatsiya qilingan genlarning atigi 29 foizi flg{36}}davolangan SC155-14Eda ham pastga regulyatsiya qilingan va BTx623 da xitin bilan tartibga solinadigan genlarning 45 foizi pastga regulyatsiya qilingan. xitin bilan ishlov berilgan SC155-14E da (7A-rasm). Shunday qilib, MTI yo'llarida flg22 va xitin bilan taqqoslangan ikkita genotipda sezilarli darajada yaqinlashuv mavjud bo'lsa-da, ma'lumotlar, shuningdek, bu ikki genotipning turli MAMPlarga qanday javob berishi haqida qiziqarli murakkablikka ishora qiladi.
2.3. BTx623 va SC155-14E ning MTI javobini solishtiruvchi gen funksional boyitish tahlili
Flg22 yoki xitinga javoban tartibga solinadigan genlarning funktsional toifalarini va sinovdan o'tgan ikkita jo'xori chizig'ining differentsial javobini aniqlash uchun biz biologik ma'lumotlarda aniqlangan DEGlar asosida gen to'plamini boyitish tahlilini o'tkazish uchun PlantRegMap [47,48] platformasidan foydalandik. jarayon toifasi. 8A va B-rasmda BTx623 va SC155-14E dan yuqori regulyatsiya qilingan DEG va pastga regulyatsiya qilingan DEG bilan biologik jarayon bilan boyitilgan genlarning yuqori GO shartlari ko'rsatilgan. DEGlarning to'liq ro'yxati S6-S13 jadvallarida keltirilgan. Ushbu genlarning aksariyati stressga javob, o'simliklarni himoya qilish reaktsiyalari, stimulga javob, biotik stimulga javob, bakteriyaga javob, boshqa organizmga javob, hujayra aloqasi, fosfor almashinuvi jarayoni va oqsil fosforlanishi bilan bog'liq.
8A va B-rasmdagi natijalar odatda ikkita jo'xori genotipi o'rtasida tug'ma immunitet bilan bog'liq bo'lgan genlarning ifodalanishidagi aniq farqlarni ko'rsatadi. O'sha boyitilgan GO shartlarida har bir holatda bir-biriga o'xshash ba'zi noyob DEGlar topildi. Masalan, GO mudofaa javobi (GO 0006952): 91 va 84 yuqori tartibga solingan DEG mos ravishda BTx623 yoki SC155-14E da flg22 bilan boyitilgan. Bu DEGlar ichida BTx623 da 24 DEG noyob bo‘lgan va 15 DEG faqat SC155-14Eda topilgan, qolganlari esa har ikkala jo‘xori genotipida taqdim etilgan. Xuddi shunday, 102 va 93 yuqori tartibga solingan DEG mos ravishda BTx623 yoki SC{16}}E xitin bilan boyitilgan. Ushbu DEGlar ichida BTx623 da 20 DEG va SC155-14Eda 14 DEG noyob bo‘lgan, qolganlari esa har ikkala jo‘xori genotipida taqdim etilgan.
GO "xitinga javob (GO: 0010200)" atamasida biz xitin bilan ishlangan SC155-14E namunalarida boyitilgan ushbu toifadagi jami 779 gendan 18 ta yuqori tartibga solingan DEGni kuzatdik (8-rasm). ), holbuki, xitin bilan ishlov berilgan BTx623 namunalarida hech qanday gen boyilmagan. Bundan tashqari, 16 ta yuqori tartibga solinadigan DEGlar flg22-ilova qilingan SC155-14E namunalarida va 12 ta yuqori tartibga solinadigan DEGlar flg22-bilan BTx623 namunalarida boyitilgan (8-rasm). Flg22 va xitin bilan ishlov berilgan BTX623 va SC155-14E (S9-jadval) da "xitinga javob" GO atamasi DEG ro'yxatlarini taqqoslash shuni ko'rsatdiki, flg22 yoki xitin bilan ishlangan SC155- 14 bilan boyitilgan DEGlar. E bir xil edi, bundan mustasno, xitin induktsiyasi flg22 ga qaraganda ikki ko'proq DEG. Aksincha, flg{28}}bilan boyitilgan BTX623 bilan boyitilgan barcha 12 DEG SC155-14E.dagi MAMPlar tomonidan induktsiya qilingan DEGlardan farq qiladi. MAMPlar keltirib chiqaradigan DEGlar SC155-14E da antraknozning qarshilik reaktsiyasiga hissa qo'shishi mumkin, chunki xitin zamburug'li hujayra devorlaridan olingan odatiy MAMP molekulasi bo'lib, o'simliklarning immun reaktsiyalarini keltirib chiqaradi. Stringlis va boshqalar. [49] shuningdek, yuqori tartibga solinadigan DEGlar to'plami xitin, flg22 va Arabidopsis o'simliklari bilan davolash qilingan Pseudomonas simiae WCS417 o'simlikining foydali rizobakteriyalaridan "xitinga javob" GO atamasi bilan boyitilganligini xabar qildi. Matic va boshqalar. [33] 21 DEG "xitinga javob" GO terminida chidamli navning guruch bargi RNK-seq tahlilidan boyitilganligini, ammo Fusarium fujikuroi qo'ziqorin qo'zg'atuvchisi bilan kasallanganidan keyin sezgir navdan emasligini xabar qildi.
PR (patogenez bilan bog'liq) genlar o'simliklarning immun javobida ishtirok etadi [50] va ko'plab fitopatogen zamburug'larga qarshi antifungal faollikka ega [51]. PR{3}} oqsillari kichik, asosan kislotali, hujayra ichidagi oqsillar bo'lib, antifungal xususiyatga ega bo'lib, ular o'simlik turlarida, shu jumladan jo'xori go'shtida himoya reaktsiyalari bilan bog'liq [52]. PR{5}} genlar oilasi a'zolari turli xil o'simlik turlarida patogen hujumlar bilan qo'zg'atilgan [53]. Sorghumda Lo va boshqalar. [26] PR{8}} ifodasi joʻxori oʻsimligining C. heterostrophus va C. sublineolum zamburugʻli qoʻziqorin qoʻzgʻatuvchilariga qarshi faol himoyasining bir qismi sifatida paydo boʻlganligini xabar qildi. Katie va boshqalar. [54] bir nechta jo'xori navlari dala sinovlarida C. lunata va F. capsicum zamburug'li sporalari bilan inokulyatsiya qilinganidan so'ng normalangan nisbiy PR-10 miqdorining sezilarli darajada induksiyasini ko'rsatdi. Issiqxona sharoitida emlangan o'simliklarning glyuslari PR{11}} mRNK induksiyasini ko'rsatdi va javob ikki sezgir navga nisbatan sinovdan o'tkazilgan ikkita chidamli navda yuqoriroq bo'ldi.
Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, aniqlangan DEGlar orasida to'rtta PR{0}} gen topilgan (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). SC155-14E'da barcha to'rtta PR{10}} DEG flg22 yoki xitin bilan ishlov berish orqali yuqori tartibga solingan, aksincha, BTx623da, SORBI_3001G401000 DEGlarda topilmadi va SORBI{{15} }G401300 (yuqori tartibga solingan) faqat BTx623 da xitin bilan ishlov berilgan, lekin flg22 bilan ishlov berilmagan. Bu shuni ko'rsatdiki, PR genlarining ekspressiyasi MAMPlarni davolashdan so'ng yuqori ROS mahsulot darajasiga javoban va SC155-14E.
Salitsil kislotasi (SA) mahalliy mudofaa reaktsiyasi va tizimli orttirilgan qarshilik uchun zarur bo'lgan o'simlik immun signalidir. Bu patogen hujumlarga qarshi qarshilik va o'simliklarni himoya qilishda muhim rol o'ynaydi [55]. Sorgumda Tugizimana va boshqalar. [56] C. subline-ola yuqtirgan joʻxori tarkibida yasmonik kislota, salitsil kislota konjugatlari va abscisik kislota darajasidagi miqdoriy oʻzgarishlar haqida xabar bergan. C. subline-ola - antraknozning qo'zg'atuvchisi. Aminokislotalar (triptofan va tirozin), yasmonik kislota va salitsil konjugatlari va zeatin miqdori yuqori bo'lgan jo'xori genotiplari antraknozga nisbatan ancha chidamli edi. Ushbu tadqiqotda GO atamasi "salitsil kislotasiga javob" (GO:0009751), shu jumladan 19 ta yuqori tartibga solinadigan DEG, faqat xitin bilan ishlov berilgan SC155-14Eda maxsus boyitilgan (jadval S9). Shunday qilib, salitsil signalizatsiya yo'li MAMP davolashdan so'ng yuqori ROS ishlab chiqarish darajasiga javob berishda va SC155-14E da antraknozga qarshilik ko'rsatishda muhim rol o'ynashi mumkin.
Bundan tashqari, 169 ta yuqori tartibga solingan DEG faqat xitin bilan ishlov berilgan SC{2}}E da stressga GO muddatli javob sifatida boyitilgan (jadval S9). Faqat MAMPlar bilan ishlov berilgan SC155-14E da topilgan boshqa GO atamalar, lekin xuddi shunday davolash bilan BTx623 da emas, ikkilamchi metabolik jarayonlar (GO:0019748), fosfatidilxolin biosintetik jarayoni (GO:0006656) va lipid biosintetik jarayoni ( GO: 0008610).
Bundan tashqari, 169 ta yuqori tartibga solingan DEG faqat xitin bilan ishlov berilgan SC{2}}E da stressga GO muddatli javob sifatida boyitilgan (jadval S9). Faqat MAMPlar bilan ishlov berilgan SC155-14E da topilgan boshqa GO atamalar, lekin xuddi shunday davolash bilan BTx623 da emas, ikkilamchi metabolik jarayonlar (GO:0019748), fosfatidilxolin biosintetik jarayoni (GO:0006656) va lipid biosintetik jarayoni ( GO: 0008610).
Shuningdek, biz flg22 yoki xitin bilan davolashdan so'ng ikkita genotip o'rtasida birgalikda tartibga solinadigan genlar tarkibini, shuningdek, barcha muolajalardagi DEGlarning asosiy to'plamlarini va ikkita genotipni GO boyitish tahlili orqali ko'rib chiqdik (4B va 7B-rasmlar). DEGlarning to'liq ro'yxati S14 va S15 jadvallarida keltirilgan. 4B-rasmda barcha muolajalar bilan BTx623 va SC{10}}E da umumiy, yuqoriga va pastga tartibga solinadigan DEGlarning asosiy to‘plamlarining boyitilgan GO shartlari ko‘rsatilgan. MAMP reaktsiyasi va o'simliklarni himoya qilish bilan bog'liq GO atamalari (masalan, xitin bilan bog'lanish, himoya reaktsiyasi, protein kinaz faolligi, oqsil fosforlanishi, protein serin / treonin kinaz faolligi) yuqori tartibga solinadigan DEGlarda sezilarli darajada boyitilgan, ikkinchi darajali metabolit biosintetik jarayonining GO atamalari, temir ionini bog'lash, oksidoreduktaza faolligi faqat pastga regulyatsiya qilingan DEGlarda boyitilgan. Bu natija Arabidopsis natijalariga o'xshardi, bunda elitsitorlarga (P. simile WCS417 va P. aeruginosa PAO1 dan flg22 peptidlari, xitin va P. simile WCS417 bakteriya hujayralari) javob bilan bog'liq GO atamalari yuqori tartibga solinishda sezilarli darajada boyitilgan. DEG larning asosiy to'plami [49].
7B-rasmda flg22 yoki xitin bilan ishlov berishdan so'ng BTx623 va SC155-14E o'rtasidagi birgalikda tartibga solinadigan (ya'ni, ikkala genotipda yuqoriga yoki pastga regulyatsiya qilingan) DEG to'plamlarining sezilarli darajada boyitilgan GO shartlari ko'rsatilgan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, MAMP reaktsiyasi va o'simliklarni himoya qilish bilan bog'liq GO atamalari (masalan, mudofaa reaktsiyasi, protein kinaz faolligi, oqsil fosforlanishi, protein serin / treonin kinaz faolligi) ikkala genotipda faqat flg22 yoki xitin bilan tartibga solinadigan DEGlarda boyitilgan, GO atamasi. Ikkilamchi metabolitning biosintetik jarayoni, gem bilan bog'lanishi, temir ionlari bilan bog'lanishi, bitta kislorod atomining oksidoreduktaza faolligi va fosfatidilxolin biosintetik jarayoni faqat pastga tartibga solinadigan DEG to'plamlarida boyitilgan.
2.4. BTx623 va SC155-14E ning MTI javobining KEGG yoʻlini boyitish tahlili
9-rasmda DAVID onlayn vositasi [57] yordamida MAMP bilan ishlov berilgan BTx623 va SC{4}}E namunalarida topilgan yuqori tartibga solinadigan DEGlarning KEGG yo'lini boyitish tahlili ko'rsatilgan. DEGlarning to'liq ro'yxati S16-S20 jadvallarida keltirilgan. Natijalar ikkita jo'xori genotipida MTI faollashuvi natijasida boyitilgan o'ziga xos yuqori KEGG yo'llarini aniqlaydi. KEGG yo‘lining “o‘simlik-patogen o‘zaro ta’siri”da biz xitin bilan ishlov berilgan SC155-14E namunalarida 24 ta yuqori tartibga solingan DEG boyitilganini, xitin bilan ishlov berilgan BTx623 namunalarida esa DEGlarning hech biri boyitilmaganini kuzatdik. SC{14}}E genotipining kuchliroq xitin reaktsiyasi ushbu genotipning antraknoz qo'ziqorin kasalligiga nisbatan ko'proq chidamliligi bilan bog'liq [39]. Bundan tashqari, KEGG yo‘lini boyitish flg22 bilan ishlov berilgan SC155-14E da fenilpropanoid biosintezida ishtirok etgan 28 ta genni aniqladi. Fenilpropanoid biosintez yo'li flavonoidlar, benzenoidlar, kumarin, gidroksisinnamatlar va lignin kabi aromatik birikmalarga aylanishi mumkin bo'lgan fenilalanin bilan boshlanadi [58,59]. Ko'pgina fenilpropanoidlar va flavonoidlar kasallikka chidamlilik reaktsiyasida ishtirok etgan [28,60]. Fitoaleksinlarni ishlab chiqarish jo'xori tarkibida antraknoz qo'zg'atuvchisi C. subline-ola [28] ga qarshi asosiy himoya javobidir. 3- deoksi-antosiyanidinlar jo‘xori tarkibida fitoaleksinlar sifatida tan olingan flavonoidlarning noodatiy guruhidir. Fitoaleksinlar patogen infektsiyadan keyin hosil bo'lgan mikroblarga qarshi faollikka ega bo'lgan kichik molekulalardir [61]. Vang va boshqalar. [37], shuningdek, KEGG atamasi fenilpropanoid biosintezi jo'xori o'zlarining transkriptomik tadqiqotlarida C. subline-ola bilan kasallangan o'simliklarning DEGlarida sezilarli darajada boyitilganligini aniqladi. Shuni ta'kidlash kerakki, KEGG yo'lini boyitish natijalari (9-rasm) o'simlik va patogen o'zaro ta'sirlarda (masalan, fenilalanin va triptofan biosintezi, antibiotik biosintezi yo'llari) rol o'ynashi mumkin bo'lgan ba'zi yo'llarda MAMP bilan davolashdan keyin BTx623 ning yuqori javobini ko'rsatdi.
Bundan tashqari, pastga regulyatsiya qilingan DEGlarning KEGG yo'lini boyitish tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, o'nta pastga regulyatsiya qilingan DEG "fotosintez-antenna oqsillari" sifatida izohlangan va "ikkilamchi metabolitlarning biosintezida" ishtirok etgan 84 DEG flg22 da boyitilgan. BTx623. Biroq, bunday gen ekspressiyasi tadqiqotlari MAMP davolash yoki patogen infektsiyaga javoban differentsial tarzda ifodalangan genlarni aniqlashi mumkin, ammo bu genlarning ma'lum bir patogenga qarshilik ko'rsatish uchun juda muhim ekanligini ko'rsatish shart emas. Shunday qilib, RNK-Seq tahlili natijasida aniqlanganidek, qo'ziqorin qarshiligi va ikkala genotipdagi KEGG yo'llarining faollashuvi o'rtasidagi sababchi munosabatlarni tushunish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab qilinadi.
Biz, shuningdek, barcha sharoitlarda DEG larning asosiy to'plamlari uchun KEGG yo'lini boyitish tahlilini o'tkazdik (4C-rasm), shuningdek, flg22 yoki xitin bilan davolashdan keyin ikkita genotip o'rtasidagi birgalikda tartibga solinadigan DEGlar (7C-rasm). Natijalar shuni ko'rsatdiki, oltita muhim yo'l, shu jumladan o'simlik-patogen o'zaro ta'sir yo'li, faqat yuqori tartibga solinadigan asosiy DEG to'plamlarida boyitilgan, lekin pastga regulyatsiya qilingan asosiy DEG to'plamlarida emas. Xuddi shunday, yetti va uchta yoʻl, jumladan oʻsimlik-patogen oʻzaro taʼsir yoʻli mos ravishda BTx623 va SC155-14E da xitin bilan yuqori tartibga solinadigan DEG va flg22 yuqori tartibga solinadigan DEGlarda sezilarli darajada boyitilgan. Aksincha, faqat eukaryotlar yo'lidagi ribosoma biogenezi ikkala genotipda xitin bilan tartibga solinadigan DEGlarda boyitilgan.
2.5. Tanlangan genlarning miqdoriy RT-PCR yordamida RNK-seq ma'lumotlarini tekshirish
RNK-seq tomonidan olingan gen ekspresyon profili ma'lumotlarini tasdiqlash uchun biz to'qqiz tanlangan nomzod genlarning ifodasini baholash uchun qRT-PCR tahlilini o'tkazdik. O'sha to'qqiz gen RNK-seq tomonidan uchta toifada kuzatilgan ifoda asosida tanlangan: (a) BTx623 va SC155-14E da flg22 yoki xitin bilan davolashda xuddi shunday ifodalangan; (b) faqat SC{6}}E bilan davolash qilingan MAMPlarda ifodalangan, lekin ishlov berilgan BTx623da juda past ifodalangan va (c) BTx623ga nisbatan SC{10}}E bilan davolash qilingan MAMPlarda 2–21-baravar yuqori ifodalangan. . qRT-PCR tahlil natijalari (1-jadval) baholangan to'qqizta genning har biri uchun RNK-seq tahlili bilan aniqlangan ifoda darajalari bilan to'liq mos kelishini aniqladi. Ushbu natijalar bizga RNK-seq tomonidan o'tkazilgan o'lchovlar jo'xori liniyalarining MAMP davolashga transkripsiyaviy javobini aks ettirishiga ishonch beradi.
2.6. Xulosa
Ushbu tadqiqotda biz birinchi navbatda uchta barglar to'plamidan foydalangan holda ROS ishlab chiqarishni sinab ko'rish orqali ikkita genotipning MTI javobini taqqoslash uchun optimal sharoitlarni topdik va RNK ekstraktsiyasi va keyingi transkriptomik tahlil uchun o'n besh kunlik o'simliklarning ikkinchi eng yosh barglarini tanladik. SC155-14E jo'xori liniyasida flg{2}}tetiklangan va xitin bilan tetiklangan ROS ishlab chiqarishning vaqt kursi (1C-rasm) xitin bilan qo'zg'atilgan ROS ishlab chiqarish flg22 bilan ishlov berishdan oldin sodir bo'lganligini aniqladi. Biz antraknozga chidamli Sorghum bicolor genotipi SC155-14E qo'ziqorin kasalligining ekspressiv profillarini oldik, ROS ishlab chiqarishda MAMP davolashiga yuqori javob va ROS mahsulotida MAMP bilan davolashning dastlabki bosqichlarida past javob bilan sezgir BTx623 genotipi. tug'ma immunitet reaktsiyasi.
Natijalar MAMP bilan davolashga javoban BTx623 va SC{1}}E jo'xori genotiplarida gen ekspressiyasining aniq o'zgarishini ko'rsatadi. Ikki MAMPga berilgan javoblar har bir satrda (86,6–70,8 foiz) sezilarli darajada oʻxshashligini koʻrsatgan boʻlsa-da, ular bir-biridan farq qilgan. Ikki qatorning bir xil MAMPga bergan javoblari o'rtasida, pastroq bo'lsa-da, bir-biriga mos kelishi (68,3-29 foiz) kuzatildi. Ko'p sonli DEGs, 10,535 DEGdan 2272 tasi to'rtta shartda aniqlandi va asosiy MAMP javobini shartli ravishda belgilaydi. Ushbu genlar ro'yxati MAMP davolashga gen ekspressiyasiga javob berishni xohlaydigan laboratoriyalar uchun foydali bo'lishi kerak. RNK-seq tahlili BTx623 va SC{14}}E da flg22 yoki xitin bilan ishlov berilgan differensial tarzda ifodalangan genlarning katta toʻplamini aniqladi, bu ikki qatorning ishlov berilmagan soxta nazoratiga nisbatan. Bundan tashqari, ikkita turli xil bioinformatika quvurlari yordamida tanlangan DEGlarni taqqoslash juda o'xshash natijalarni ko'rsatdi. Ushbu DEG larning batafsil ekspressiv profil tahlili, GO boyitish tahlili va KEGG yo'li tahlili ikkita genotipning gen ekspresyon javobida aniq o'zgarishlarni aniqladi. GO atamasi va KEGG yo‘lini boyitish MAMP bilan davolash qilingan SCda ko‘proq immunitet va patogen qarshilik bilan bog‘liq DEGlarni (PR genlari, genlarning xitinga javobi, salitsil kislotasiga genlarning javobi, stressga javob, fenilpropanoid biosintezi va boshqalar) topdi{{18} }Bir xil ishlov berish bilan BTx623 ga nisbatan E namunalari. Ushbu ma'lumot ushbu asosiy ekin o'simlikining tug'ma immunitet tizimi MAMPlarning paydo bo'lishiga qanday javob berishi haqida muhim asosiy ma'lumotlarni taqdim etadi. Arabidopsis modeliga nisbatan ekin oʻsimliklarining tugʻma immun reaksiyasi haqida umumiy maʼlumot yoʻqligini inobatga olgan holda, gen roʻyxatlari va tavsiflangan usullar joʻxori oʻsimligining patogen mikroorganizmlarga boʻlgan munosabatini yanada oʻrganish uchun manba boʻlib xizmat qiladi va pirovardida kasalliklarga chidamliligini yaxshilash boʻyicha saʼy-harakatlarni osonlashtirishi kerak. bu muhim oziq-ovqat va biomassa hosili.
3. Materiallar va usullar
3.1. O'simlik materiallari
Ushbu tadqiqotda doktor Uilyam Runi (Texas A&M universiteti, College Station, AQSH) va doktor Stiven Kresovich (Klemson universiteti, Klemson, AQSh) tomonidan taqdim etilgan ikkita jo'xori liniyasi ishlatilgan. BTx623 - mavjud butun genom ketma-ketligiga ega standart jo'xori liniyasi [22] va SC{2}}E antraknozga chidamlilik uchun ishlab chiqilgan chiziqdir [39].
3.2. ROS tahlillari
BTx623 va SC155-14E jo‘xori urug‘lari sirt sterilizatsiya qilindi (1 daqiqa davomida 70% etanol va keyin 10% oqartirgichda 10 daqiqa davomida, avtoklavlangan ddH2O bilan yuviladi) va avtoklavlangan Sunshine idish aralashmasiga ekilgan va o‘sish kameralarida unib chiqqan ( 16 soat / 8 soat yorug'lik / qorong'i, 28/26 ◦C, namlik 60-70 foiz). Tajribalar uchun o'n besh kunlik o'simliklar ishlatilgan.
Ushbu tadqiqotda ikkita MAMP, flg22 (Genscript katalog # RP19986) va qisqichbaqa qobig'idan xitin (Sigma-Aldrich, katalog # C3641) ishlatilgan. Flg22 o'simlik patogen bakteriyalarining flagellin N-terminalidan olingan peptid bo'lib, o'simliklarda o'ziga xos tug'ma immunitet reaktsiyasini keltirib chiqarishi yaxshi ma'lum [62]. Chitin zamburug'li hujayra devorlaridan olingan tipik MAMP molekulasi bo'lib, o'simliklarning immun reaktsiyalarini keltirib chiqaradi [3]. ROS tahlillari Kimball va boshqalarga ko'ra amalga oshirildi. [38]. Alohida genotiplardagi MAMP javobidagi o'zgarishlarni, shuningdek barglarning holatini baholash uchun har bir genotip o'simliklarining uchta to'liq kengaytirilgan barglari alohida baholandi. Har bir genotipning o'n besh kunlik jo'xori o'simliklarining pastdan tepasiga qadar barglari №1, №2 va №3 barg sifatida belgilangan. Biz ROS ishlab chiqarishni o'lchash uchun namuna olish uchun bargning faqat o'rta qismini ishlatdik. Davolanishdan so'ng darhol Photek CCD kamerasi (Photek Ltd., Sharqiy Sasseks Buyuk Britaniya) yordamida har bir namunaning kimyoluminesans signali 30 daqiqa davomida qayd etildi. Sakkizta quduq soxta ishlov berishdan (MAMPsiz) va sakkizta quduq tozalashdan (MAMP bilan) iborat edi. Har bir holatda, har bir davolash uchun jami 8 ta namunadan iborat uchta biologik replikatsiya solishtirildi.
3.3. MAMP bilan davolash namunasi
Tajribalar uchun o'n besh kunlik o'simliklar ishlatilgan. MAMP muolajalari Valdes-Lopez va boshqalarda tasvirlanganidek amalga oshirildi. [12] kichik oʻzgartirishlar bilan. Qisqacha aytganda, har bir jo'xori chizig'i uchun beshta o'simlikning ikkinchi bargi (yuqoridan, ya'ni ikkinchi eng yosh barg) ajratilgan va keyin 2 daqiqa davomida avtoklavlangan ddH2O bilan vakuumli infiltratsiya qilingan. Har bir genotipning suvga singib ketgan barglaridan ellik 1 sm diametrli barg disklari kesilib, birlashtirildi. Har bir genotipdan qirq beshta barg disklari uch xil Petri idishlariga (har bir petri idishida 15 barg disk) o'tkazildi va keyin bir kechada xona haroratida avtoklavlangan ddH2O da alyuminiy folga bilan qoplangan plitalar bilan suzdi. Ertasi kuni suv barcha Petri idishlaridan olib tashlandi va 10 ml ddH2O (soxta), 10 ml 1 mkM flg22 yoki 10 ml 20 mg/ml xitin eritmasi bilan almashtirildi. 60-Daqiqa ishlovdan so'ng, soxta va MAMP bilan ishlov berilgan barg bo'laklari turli naychalarga yig'ilib, darhol suyuq azotda muzlatilgan. Barg boʻlaklari namunalari (101 ta “ied-11272 uchun) immunityBTx623 va SC{24}}E soxta, flg22 yoki xitin bilan davolash, uchta biologik replikatsiya) RNK ekstraktsiyasi uchun -80 ◦C da saqlangan. Yuqorida tavsiflangan protseduralar har qanday mumkin bo'lgan fotosintez ta'sirini bartaraf etish uchun qorong'i sharoitda amalga oshirildi.
3.4. RNKni ajratib olish, tartiblash va kutubxonani qurish
RNK ekstraktsiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Zymoresearch (katalog #R2071) dan Direct-zol RNK Miniprep Plus to'plami yordamida amalga oshirildi.
Missuri universiteti DNK yadro markazida yuqori o'tkazuvchanlik sekvensiyasi amalga oshirildi. Illumina TruSeq mRNK zanjirli namunalar tayyorlash to'plamida ta'minlangan reagentlar bilan ishlab chiqaruvchining protokoliga binoan o'n sakkizta kutubxona qurilgan. Namuna kontsentratsiyasi Qubit HS RNK tahlil to'plamidan foydalangan holda Qubit florometr (Invitrogen) tomonidan aniqlandi va RNK yaxlitligi Fragment Analyzer avtomatlashtirilgan elektroforez tizimi yordamida tekshirildi. Qisqacha aytganda, poli-A ni o'z ichiga olgan mRNK umumiy RNKdan (1 mkg) tozalandi, RNK bo'lindi, parchalangan RNKdan ikki zanjirli cDNK hosil qilindi va adapterlarni o'z ichiga olgan indeks uchlari bilan bog'langan. Kuchaytirilgan cDNK konstruksiyalari Axyprep Mag PCR tozalash boncuklari qo'shilishi bilan tozalandi. Har bir tozalangan kutubxonaning yakuniy konstruksiyasi Fragment Analyzer avtomatlashtirilgan elektroforez tizimi yordamida baholandi, Qubit HS dsDNA tahlil to‘plamidan foydalangan holda Qubit florometr bilan miqdori aniqlandi va NextSeq 500 da ketma-ketlik uchun Illuminaning standart sekvensiyalash protokoliga muvofiq suyultirildi. 75 ta asosda o'qing.
3.5. RNK-seq o'qishlarini xaritalash va qayta ishlash
Ketma-ketlik ma'lumotlari olti xil shartni aks ettirdi: soxta, flg22 yoki xitin bilan ishlov berish bilan BTx623 va soxta, flg22 yoki xitin bilan ishlov berish bilan SC{2}}E. Har bir holat uchta biologik replikatsiya bilan ifodalangan, natijada jami 18 ta namuna olingan. Birinchidan, o'qishning 3{20}} uchi kesadapt yordamida Illumina adapterlari, noaniq nukleotidlar (N) va (NextSeq texnologiyasi tufayli) sun'iy poli-G (G{100} sifatida taqdim etilgan) uchun "qirqilgan". 1.15 versiyasi (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, 2019-yil 21-avgust) 30 ta uchi adapter bilan mos keladigan oʻqishlar uchun 90% identifikatsiyaga ega kamida 3 ta baza uchun. Agar bu kesishdan keyin o'qishda o'ndan kam asos bo'lsa, u o'chirildi (agar mavjud bo'lsa, juftlashtirilgan o'qish bilan birga). Kesishdan keyin RNK ketma-ketligi ma'lumotlari uchun sifat ko'rsatkichlari FASTQC (versiya 0.11.9) [63] yordamida tekshirildi. O'qishdagi barcha pozitsiyalar uchun o'rtacha sifat ko'rsatkichi taxminan 34 ni tashkil qiladi, bu asosiy qo'ng'iroqning aniqligi 99,9 foizdan yuqori ekanligini ko'rsatadi. Har bir namuna uchun oʻqishlar Tophat 2.1.1 bilan mos yozuvlar genomiga (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) moslashtirildi. Olingan tekislash fayllari har bir namuna uchun transkriptlarni yig'ish uchun qo'l tugmalari 2.2.1 ga taqdim etildi. Ushbu tadqiqotda annotatsiya versiyasi ishlatilgan Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Xuddi shu holatdagi namunalar Cuffmerge yordamida birlashtirildi. Maqsad har bir holatda gen va transkript ifodasini hisoblash uchun yagona asosni ta'minlash edi.
3.6. RNK-Seq ma'lumotlarining bioinformatik tahlili
RNK ketma-ketligi ma'lumotlari standart parametrlarga ega Bowtie{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 va Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) bioinformatika vositalari yordamida tahlil qilindi. Biz Trapnell va boshqalarda tasvirlangan ushbu asboblar bilan bir xil quvur liniyasidan foydalandik. [64]. Tahlil natijalarini qo'shimcha tasdiqlash uchun biz tahlilni amalga oshirish uchun HiSat2 (versiya 2.1.0), HTSeq (versiya 0.12.4) va edgeR (versiya 3.26.8) bilan boshqa quvur liniyasidan foydalandik. HiSat2 - TopHat2 ning navbatdagi ishlanmasi. Birinchidan, biz HiSat2 dan Sorghum mos yozuvlar genomidan foydalangan holda hizalanishni amalga oshirdik. Keyin biz HTSeq-dan har bir genga qancha o'qishlar xaritalanganligini hisoblash uchun foydalandik. Buning uchun bizga oldingi bosqichda yaratilgan bam fayllari va genom izohi (gif fayli) kerak edi. E'tibor bering, mos yozuvlar genomi va annotatsiya fayllari biz asl quvur liniyasida ishlatganimiz bilan bir xil. Nihoyat, har bir holatda differentsial ifodalangan genlarni aniqlash uchun R paketi edgeR dan foydalandik
3.7. Differensial ifodalangan genlarni aniqlash
Birlashtirilgan yig'ilish ifoda darajalarini hisoblab chiqadigan va ikki shart o'rtasidagi kuzatilgan o'zgarishlarning statistik ahamiyatini tekshiradigan Cuffdiffga yuborildi. Biz mos ravishda BTx623 va SC{2}}E uchun mock va flg22 va mock vs. chitin o'rtasidagi shartlarni solishtirdik. Differensial ravishda ifodalangan genlar 0.001 p-qiymati chegaralari yordamida ekstraksiya qilindi. Vulqon uchastkalari mos ravishda flg22 yoki xitin bilan ishlov berilgan BTx623 va flg22 yoki xitin bilan ishlangan SC{12}}E sharoitlarida gen ekspressiyasining o'zgarishi ahamiyatini ko'rsatish uchun R paketi (ggplot2 V3.3.0) yordamida tuzilgan. −log10 (p-qiymati) ga teng yoki uchdan katta bo'lgan gen nuqtalari DEG deb hisoblanadi. Har bir uchastkada log2 (qatlam{17}}o'zgarishi) noldan katta bo'lgan gen nuqtalari yuqori tartibga solinadigan genlar edi, aks holda ular genlarni pastga regulyatsiya qilgan.
3.8. PCA syujeti
Har bir jo'xori liniyasining uchta biologik replikatsiyasining gen ekspressiyasi qiymatlari va har bir MAMP bilan davolash o'rtasidagi munosabatni tekshirish uchun R paketlari (ggfortify V{0}}.4.10, ggplot2 V3) yordamida asosiy komponent tahlili (PCA) uchastkalari yaratildi. .3.0). Har bir nuqta asl xususiyat maydonidan (gen ifodasi) dastlabki ikkita asosiy komponentga xaritalashdan keyingi holatni ifodalaydi. Xuddi shu holatga tegishli nuqtalar bir joyga to'planishga moyil
3.9. DEG issiqlik xaritasi
1 O'simlikshunoslik va texnologiya va biokimyo bo'limi, CS Bond hayot fanlari markazi, Missuri universiteti, Kolumbiya, MO 65211, AQSh; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)
2 Elektrotexnika va kompyuter fanlari bo'limi, CS Bond Life Sciences markazi, Missuri Universiteti, Kolumbiya, MO 65211, AQSh; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)
3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu
4 O'simlikshunoslik tadqiqot bo'limi, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, AQSh
* Correspondence: staceyg@missouri.edu
