Melanosoma biogenezini, ko'chirish va degradatsiyasini tartibga solish orqali yangi peptid aralashmasining oqartiruvchi ta'siri 1-qism

ANTRACT

Peptidlar - peptid bog'lari bilan bog'langan aminokislotalarning qisqa zanjirlari. Ular kosmetika sanoatida samarali va biomoslashuvchan faol moddalar sifatida keng qo'llaniladi. Ushbu tadqiqotda biz yangi peptid aralashmasini ishlab chiqdik va uning melanotsitlar va keratinotsitlarga pigmentatsiyaga qarshi ta'sirini aniqladik. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, peptid aralashmasi melanotsitlarda melanogenezning asosiy omili bo'lgan mikroftalmiya bilan bog'liq transkripsiya omilini tartibga solish orqali melanosoma biogenezini inhibe qilgan. Va biz peptid aralashmasi keratinotsitlardagi fagotsitoz bilan bog'liq retseptor bo'lgan proteaz bilan faollashtirilgan 2 retseptorini kamaytirish orqali melanosomani qabul qilishni inhibe qilganini kuzatdik. Bundan tashqari, peptid aralashmasi otofagiya tizimini faollashtirdi, natijada keratinotsitlarda o'tkazilgan melanosomalarning degradatsiyasi sodir bo'ldi. Ko'p maqsadli peptid aralashmasining pigmentatsiyaga qarshi ta'siri inson terisi ekvivalenti modelida (MelanoDerm) baholandi. Epidermal qatlamdagi melanin tarkibi peptid aralashmasini topikal davolash orqali sezilarli darajada kamaydi, bu uni yangi kosmetika materiali sifatida qo'llash mumkinligini ko'rsatadi.oqlashfunktsiyasi.

Tegishli tadqiqotlarga ko'ra,cistancheoddiy o't bo'lib, u "hayotni uzaytiradigan mo''jizaviy o't" deb nomlanadi. Uning asosiy komponentisistanozid, bu antioksidant, yallig'lanishga qarshi va immunitet funktsiyasini rag'batlantirish kabi turli xil ta'sirga ega. Cistanche va o'rtasidagi mexanizmterini oqartirishning antioksidant ta'sirida yotadicistancheglikozidlar. Inson terisida melanin oksidlanishi natijasida hosil bo'laditirozintomonidan katalizlanaditirozinaza, va oksidlanish reaktsiyasi kislorod ishtirokini talab qiladi, shuning uchun organizmdagi kislorodsiz radikallar melanin ishlab chiqarishga ta'sir qiluvchi muhim omilga aylanadi. Cistanche tarkibida antioksidant bo'lgan va tanadagi erkin radikallarning paydo bo'lishini kamaytiradigan sistanozid mavjud.melanin ishlab chiqarishni inhibe qiladi.

Oqartirish uchun Cong rong Cistanche-ni bosing

Ko'proq so'rang:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Kalit so'zlar

Autofagiya ·Melanosoma ·Mikroftalmiya bilan bog'liq transkripsiya omili ·PAR{1}}· Peptid

KIRISH

Melanin teri hujayralarini zararli tashqi omillardan, jumladan ultrabinafsha (UV) nurlar, mayda chang va turli xil kimyoviy birikmalardan himoya qilish uchun epidermisning bazal qatlamida joylashgan melanotsitlar tomonidan ishlab chiqariladi [1]. Keratinositlardan asosan ultrabinafsha nurlanishi bilan ajralib chiqadigan omillar, jumladan alfa-melanotsitlarni ogohlantiruvchi gormon (MSH), adrenokortikotrop gormon, ildiz hujayra omili, endotelin 1, gepatotsitlar o'sish omili, asosiy fibroblast o'sish omili va granulotsit-makrofaglar koloniyasini rag'batlantiradi. melanotsitlar va melanin yuzasidagi har bir retseptor melanosoma [2-7] deb ataladigan lizosoma bilan bog'liq organellada ishlab chiqariladi. Ushbu omillar orasida MSH pro-opiomelanokortindan olingan kichik peptid gormonidir. -MSH ning melanokortin 1 retseptorlari bilan bog'lanishi protein kinaz A (PKA) ni faollashtiradigan siklik adenozin monofosfat (cAMP) darajasini oshiradi [8,9]. Keyin PKA cAMPga javob beruvchi elementni bog'lovchi oqsilni (CREB) fosforlaydi va mikroftalmiya bilan bog'liq transkripsiya faktorining (MITF) transkripsiyasi fosfo-CREB [10] tomonidan qo'zg'atiladi. MITF melanogenezning asosiy fermentlari bo'lgan tirozinaza, tirozinaza bilan bog'liq protein 1 (TYRP1) va dopaxrom tautomeraza (Dct yoki TYRP2) uchun transkripsiya omili sifatida ishlaydi va ularning ekspressiyasini keltirib chiqaradi [11]. Pishgan melanosoma dendrit uchi tomon harakatlanadi va bu jarayonda Rab27a, Melanofilin va Miyozin Va dan iborat melanosoma motorli oqsil kompleksi rol o'ynaydi [12-14]. Rab27a, Miyozin Va va aktin uchun bog'lovchi domenlarga ega bo'lgan melanofilin bir vaqtning o'zida melanosoma yuzasida Rab27a va aktin filamenti bilan o'zaro ta'sir qiluvchi miyozin Va bilan bog'lanadi. Ushbu motor oqsillarini yig'ish melanosomani aktin filamenti [15- 19] bo'ylab dendrit uchlariga o'tkazish uchun talab qilinadi. Keyinchalik, melanotsitlarning dendrit uchlaridan qo'shni keratinotsitlarga o'tkaziladigan melanosomalar va birlashtirilgan melanosomalar keratinotsitlarning perinuklear sohasida joylashadi [20,21]. Melaninning to'g'ri shakllanishi hujayralarni normal himoya qilish uchun muhim bo'lsa-da, melaninning haddan tashqari ishlab chiqarilishi giperpigmentatsiyani, jumladan melazma, sepkillar va quyosh lentigosini keltirib chiqaradi, bu esa ruhiy stress va yomon hayot sifatiga olib kelishi mumkin [22,23]. Shunday qilib, terining tirnash xususiyati, allergiya qo'zg'alishi va kanserogenez kabi nojo'ya ta'sirlarsiz qoniqarli oqartiruvchi vositalarni ishlab chiqish talablari mavjud va turli xil oqartirish mexanizmlariga qaratilgan ko'plab tadqiqotlar o'tkazildi [24,25].

Peptidlar aminokislotalarning qisqa zanjirlari, oqsilning eng kichik birligi bo'lib, ular bir-biri bilan peptid bog'lari bilan bog'langan. So'nggi paytlarda kosmetika va farmatsevtika sanoatida faol moddalar sifatida peptidlar bo'yicha keng qamrovli tadqiqotlar va ishlanmalar, chunki ularning yuqori biologik muvofiqligi va oqsilni taqlid qilish qobiliyati [26,27].

Biz peptidlar kutubxonamizni tekshirib chiqdik va melanin sintezi, migratsiyasi va transferini inhibe qilishga, shuningdek melanosoma degradatsiyasini rag'batlantiruvchi faollikka ta'sir qiluvchi to'rtta peptid topdik. Keyinchalik, ushbu tadqiqot bir xil molyar nisbatga ega to'rtta peptidni o'z ichiga olgan peptid aralashmasining oqartiruvchi faolligini o'rganishga qaratilgan.

USULLARI

Materiallar

Peptid sintezida ishlatiladigan 2-CTC qatroni BeadTech (Seul, Koreya) dan xarid qilingan. Fmoc-aminokislotalar, gidroksibenzotriazol (HOBt) va N, N, N´, N'-tetrametil-O-(1H-benzotriazol- 1-il)uroniy geksafluorofosfat (HBTU) CS Bio Co.dan sotib olindi. San-Fransisko, Kaliforniya, AQSh). Sintezda ishlatiladigan reagentlar, jumladan, dimetilformamid (DMF), N, N-diizopropiletilamin (DIEA), piperidin, trifloroasetik kislota (TFA), tioanizol, fenol, etan ditiol (EDT), triizopropilsilan (TIS) va dietil efir, Daejung Chemical & Metal Co., Ltd. (Seul, Koreya) dan sotib olingan.

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) melanotsitlar va homila sigir zardobi (FBS) uchun kukun Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, AQSH), suyuq DMEM muhiti va penitsillin/streptomitsin Welgene Inc. (Gyeongsan, Koreya) dan sotib olindi. . Natriy bikarbonat, natriy gidroksid, arbutin, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT), 3,{{ 7}}dihidroksi-L-fenilalanin (LDOPA), tripsin va rapamisin Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSH), Solvable esa PerkinElmerdan (Waltham, MA, AQSH) sotib olindi. Rab27A, Melanophilin, MITF, Tyrosinase va Actinga qarshi antikorlar Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, AQSH) dan va Beclin-1, LC3, p62, p-CREB va p-ERK1/2 ga qarshi antikorlar sotib olingan. Cell Signaling Technology (Danvers, MA, AQSh) dan sotib olingan. Primer sintezi Cosmo GENETECH (Seul, Koreya) da amalga oshirildi va keyinchalik tajribada foydalanildi (1-jadval).

Peptid sintezi

Imkoniyati 0,84 mmol/g bo'lgan CTC qatroni DMF erituvchisi bo'lgan reaktorda shishish reaktsiyasiga duchor bo'ldi. Keyin reaktorga 2 ekvivalent Fmoc-C terminali aminokislota va 2,5 ekvivalent DIEA ekvivalenti DMFga qo'shildi va yana 2 soat davomida reaksiyaga kirishdi. Reaksiyaning tugashi Kaiser test kiti (Sigma-Aldrich) bilan tasdiqlandi va qatron DMF bilan yuvildi. Fmoc yuvilgan qatronga ikki marta 20% piperidin/DMF qo'shib olib tashlandi. Reaksiyaning tugashi Kaiser test kiti bilan tasdiqlandi va qatronlar DMF bilan yuvildi. Keyinchalik, C terminalidagi aminokislotalarning N terminali yo'nalishi bo'yicha quyidagi jarayon takrorlandi. DMFga 2 ekvivalent Fmoc-aminokislota, 2 ekvivalent HBTU, 2 ekvivalent HOBt va 2,5 ekvivalent DIEA qo'shgandan so'ng, reaksiya 2 soat davomida amalga oshirildi. Reaksiyaning tugashi Kaiser test kiti bilan tasdiqlandi va qatronlar DMF bilan yuvildi. Fmoc yuvilgan qatronga ikki marta 20 foiz piperidin/DMF qo'shib, aminokislotadan chiqarildi. Reaksiyaning tugashi Kaiser test kiti bilan tasdiqlandi va qatronlar DMF bilan yuvildi. Pep-3 holatida ferul kislotasi konjugasiyasi quyidagi protsedura orqali amalga oshirildi. DMFga 2 ekvivalent Ferul kislotasi, 2 ekvivalent HBTU, 2 ekvivalent HOBt va 2,5 ekvivalent DIEA qo'shilgandan so'ng, reaktsiya 2 soat davomida amalga oshirildi. Reaksiyaning tugashi Kaiser test kiti bilan tasdiqlandi va qatronlar DMF bilan yuvildi. Yakuniy sintez tugagandan so'ng, peptidni qatrondan ajratish uchun parchalanish eritmasi (TFA: H2O: Ohioans ole: fenol: EDT: TIS=81.5: 5: 5: 5: 2,5: 1) qo'shildi. . Keyin peptid dietil efir yordamida cho'ktirildi va besh marta yuvildi. Keyinchalik oxirgi peptid mahsulotini qayta tiklash uchun quritish amalga oshirildi.

Sintezlangan peptidning tozaligi HPLC (Thermo Fisher Scientific/U{0}}) tahlili bilan aniqlandi va u mobil fazada {{ 1 ml/min oqim tezligida UV 214 nm da aniqlandi. C18 (Agilent, Pursuit XRs, 250 × 4,6 mm, 5 m, 100Å) ustuni yordamida suvda 5}},1 foiz TFA/asetonitrilda 0,1 foiz TFA.

Molekulyar og'irlikni aniqlash uchun LC-MS/MS (AB SCIEX, 3200 Q-trap) tahlili o'tkazildi va u MS/MS tomonidan {{7) oqim tezligida aniqlandi. Mobil fazada }},25 ml/min 0, C18 (Agilent, Pursuit XRs, 100 × 2,0 mm, 5 m, 100Å) ustunidan foydalangan holda suvdagi 1 foiz chumoli kislotasi/asetonitril gradientidagi 0,1 foiz chumoli kislotasi . MS/MS tahlil shartlariga ESI pozitiv rejimi, Manba/gaz: CUR=20, CAD=Yuqori, IS=5500, TEM=350, GS1=50 kiradi. , GS2=50/Murakkab DP=50–80, EP=10, Idoralar=10–50 va CES=1–10 (2-jadval).

Hujayra madaniyati

Ushbu tajribada ishlatiladigan B16F10 melanoma hujayralari ATCC (Manassas, VA, AQSh) dan sotib olingan. B16F10 xujayralari 10 foiz issiqlik bilan inaktivlangan FBS, 1 foiz penitsillin/streptomitsin va 1,5 g/l natriy bikarbonat o'z ichiga olgan DMEM muhitida 37 daraja haroratda va 5 foiz CO2 sharoitida inkubatsiya qilindi.

HaCaT keratinotsitlari CLS (Eppelheim, Germaniya) dan sotib olingan. HaCaT hujayralari 10 foiz issiqlik bilan inaktivlangan FBS va 1 foiz penitsillin/streptomitsinni o'z ichiga olgan DMEM muhitida 37 daraja haroratda va 5 foiz CO2 sharoitida inkubatsiya qilindi.

Hujayra hayotiyligi

B16F10 xujayralari 48-quduq plastinkasiga 8 × 103 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 3 kun davomida 2 foizli FBS o'z ichiga olgan muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Inkubatsiyadan so'ng, har bir quduqda 20 l 4 mg / ml MTT 4 soat davomida davolandi va muhit olib tashlandi. Keyinchalik, formazanni eritish uchun hujayralar 500 l DMSO bilan ishlov berildi. Absorbans spektrofotometr yordamida 570 nm da o'lchandi (Molecular Devices, San-Xose, CA, AQSh).

Melanin tarkibini tahlil qilish

B16F10 xujayralari 6-quduq plastinkasiga 5 × 104 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 3 kun davomida 2 foizli FBS o'z ichiga olgan muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Melanin ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun 100 ng / ml -MSH birgalikda davolandi va 200 M arbutin ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan. Hujayralar to'plangan va 200 l 1 M NaOH bilan ishlov berish orqali lizislangan va 490 nm da lizat uchun absorbans spektrofotometr bilan o'lchangan.

Tirozinaza faolligi testi

B16F10 xujayralari 6-quduq plastinkasiga 5 × 104 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 3 kun davomida 2 foizli FBS o'z ichiga olgan muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Melanin ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun 100 ng / ml-MSH birgalikda davolandi va 200 M arbutin ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan. Lizatni yig'ish uchun har bir quduqqa 200 l lizis buferi (Sigma-Aldrich) bilan ishlov berildi. BCA to'plami (Thermo Fisher Scientific) yordamida oqsil miqdori aniqlangandan so'ng, har bir guruhdan 90 g protein 20 l 10 mM L-DOPA bilan 96- quduq plastinkasida 30 daqiqa davomida 37 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Aralashmaning 475 nm oralig'ida absorbsiyasi spektrofotometr bilan o'lchandi.

Melanosoma izolyatsiyasi

B16F1{{10}} xujayralari 6-quduq plastinkasiga 5 × 104 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Hujayralar melanin sintezini qo'zg'atish uchun 72 soat davomida 100 ng / ml-MSH bilan ishlov berildi va tripsin / EDTA bilan ishlov berish orqali yig'ib olinadi. Keyin hujayralar 10 ml 0,25 M sukroz (10 mM HEPES buferida) bilan yuvildi va 10 ml 0,25 M sukroz eritmasida qayta suspenziya qilindi. Keyinchalik, suyuq azot bilan muzlatilgandan so'ng, eritish 37 darajada amalga oshirildi, bu 10 marta takrorlandi. 1,{19}} g 10 daqiqa davomida santrifüjlangandan so'ng, supernatant yig'ildi va 45 daqiqa davomida 20,630 g va 4 darajada santrifüj qilindi. Keyinchalik, pellet DPBS bilan qayta suspenziyaga duchor bo'ldi va ishlatishdan oldin -80 darajada saqlanadi.

Melanosomani qabul qilish testi

HaCaT xujayralari 6-quduq plastinkasiga 1 × 105 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 1 soat davomida sarumsiz muhitda peptid aralashmasi bilan ishlov berildi va 40 soat davomida izolyatsiya qilingan melanosomalar bilan ishlov berildi. Hujayralar 200 l 1 M NaOH bilan ishlov berish orqali parchalandi va 490 nm da lizat uchun absorbans spektrofotometr bilan o'lchandi. Bundan tashqari, Fontana-Masson bo'yoq to'plami (ScyTek Laboratories, Logan, UT, AQSh) yordamida melanosomani bo'yash amalga oshirildi va hujayralar tasvirlari yorug'lik mikroskopi bilan aniqlandi.

Melanosoma degradatsiyasi testi

HaCaT xujayralari 6-quduq plastinkasiga 1 × 105 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Ular 48 soat davomida sarumsiz muhitda izolyatsiya qilingan melanosomalar bilan oldindan ishlov berildi va qo'shimcha ravishda 72 soat davomida peptid aralashmasi bilan ishlov berildi. Ijobiy nazorat sifatida bir mikromol rapamisin ishlatilgan. Hujayralar 200 l 1 M NaOH bilan ishlov berish orqali parchalandi va 490 nm da lizat uchun absorbans spektrofotometr bilan o'lchandi. Bundan tashqari, melanosomani bo'yash Fontana-Masson bo'yoq to'plami yordamida amalga oshirildi va hujayralar tasvirlari yorug'lik mikroskopida aniqlandi.

Gen ifodasini tahlil qilish (RT-PCR)

B16F10 xujayralari 6-quduq plastinkasiga 5 × 104 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 3 kun davomida 2 foizli FBS o'z ichiga olgan muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Melanin ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun 100 ng / ml-MSH birgalikda davolandi va 200 M arbutin ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan. RNK RNK ekstraksiya to'plami (Qiagen, Germaniya) yordamida hujayralardan ajratilgan va cDNK sintezi RT-PCR premiksi (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Koreya) yordamida amalga oshirilgan. PCR premiksi (iNtRON Biotechnology) va har bir gen uchun primerlar bilan reaksiya aralashmasi tayyorlangandan so'ng, PCR PCR mashinasi (Eppendorf, Germaniya) yordamida amalga oshirildi. Keyinchalik, mRNK ifoda naqshlari agaroz jel elektroforezi bilan aniqlandi.

HaCaT xujayralari 6-quduq plastinkasiga 3 × 105 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 1 soat davomida sarumsiz muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi va qo'shimcha ravishda 16 soat davomida 4U tripsin bilan ishlov berildi. Hujayralar yig'ildi va RT-PCR yuqorida tavsiflangan tarzda amalga oshirildi.

Protein ifodasini tahlil qilish (Western blotting)

B16F10 xujayralari 6-quduq plastinkasiga 5 × 104 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 1 kun davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 3 kun davomida 2 foizli FBS o'z ichiga olgan muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Melanin ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun 100 ng / ml -MSH birgalikda davolandi va 200 M arbutin ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan. Hujayralar lizis buferi bilan parchalandi va BCA to'plami yordamida protein miqdori aniqlandi. Yigirma mikrogram protein 8 foizli poliakrilamid jelda ajratildi va elektroforetik yo'l bilan poliviniliden ftorid membranalariga o'tkazildi. Membranalar 0,5 foiz Tween 20 (PBS-T) bilan PBSda 5 foizli yog'siz sutda bloklangan. Bloklash eritmasida suyultirilgan birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya kechada 4 daraja haroratda amalga oshirildi va PBS-T bilan yuvildi. Tegishli ikkilamchi antikorlar blokirovka qiluvchi eritmalarda suyultirildi va xona haroratida 1 soat davomida membranalar bilan inkubatsiya qilindi, so'ngra PBS-T bilan yuvildi. Membranalar G'arbiy aniqlash reagenti (Elpis Biotech, Daejeon, Koreya) orqali Gel Doc (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSH) orqali tasvirlangan.

p-CREB va p-ERK tahlili uchun B16F10 xujayralari 6-quduq plastinkasiga 3 × 105 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 1 kun davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 2 foizli FBS o'z ichiga olgan muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Kuluçka muddati p-CREB tahlili uchun 30 minut va p-ERK tahlili uchun 10 minut. Melanin ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun 100 ng / ml -MSH birgalikda davolandi va 200 M arbutin ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan. Western blotting yuqorida aytib o'tilganidek, izolyatsiya qilingan oqsillar yordamida amalga oshirildi.

HaCaT xujayralari 6-quduq plastinkasiga 3 × 105 hujayra/quduq zichligida ekilgan va 16 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin ular 3 kun davomida sarumsiz muhitda peptid aralashmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Ikki yuz nanogramm rapamisin ijobiy nazorat sifatida 3 soat davomida davolandi. Western blotting yuqorida aytib o'tilganidek, izolyatsiya qilingan oqsillar yordamida amalga oshirildi.

Teri ekvivalentini tahlil qilish

Teri ekvivalenti yordamida peptid aralashmasining oqartiruvchi ta'sirini tekshirish uchun lipozoma namunasi quyidagicha tayyorlandi. Peptid aralashmasi distillangan suvda 2,000 g/ml konsentratsiyada eritildi va pH 7 ga o'rnatildi. 0.22-m gözenek o'lchamli filtr yordamida filtrlangandan so'ng, 1 foiz. vodorod fosfatidilkolin tampon 10 foiz nisbatda aralashtiriladi. Nano oʻlchamdagi lipozoma namunasi Mikrofluidizator yordamida 75-m hujayradan 1,000 barda besh marta oʻtkazish orqali tayyorlangan.

MelanoDerm MEL{0}}B (MatTek Corporation, Ashland, MA, AQSH) 2 hafta davomida haftasiga uch marta 2,000 g/ml peptid aralashmasini o'z ichiga olgan 25 l yoki 50 l liposoma bilan lokal ravishda davolandi. To'qimalarni nazorat qilish uchun bir xil hajmdagi vosita qo'llanildi. Davolash qilingan teri ekvivalentlari DPBS bilan yuvildi va melanotsitlarning morfologiyasini tekshirish uchun yorug'lik mikroskopiyasi o'tkazildi. Keyinchalik, melanin ishlab chiqarishni tahlil qilish uchun teri ekvivalentlari 30 daqiqa davomida -80 darajada muzlatilgan va xona haroratida eritilgan. To'qimalarning namunalari 30 daqiqa davomida 1 foizli natriy bikarbonat bilan inkubatsiya qilindi va quritildi. 300 l eritma bilan ishlov berilgandan so'ng, namunalar bir kechada 95 daraja haroratda qoldiriladi va keyin xona haroratida sovutiladi. 490 nm da to'qima ekstraktining absorbsiyasi spektrofotometr bilan o'lchandi.

Gistologiya orqali to'qimalarda melanin tarqalishini kuzatish uchun barcha namunalar 24 soat davomida 4 foizli fosfat tamponlangan formalinda o'rnatildi. Ruxsat etilgan namunalar parafinga solingan va mikrotom yordamida 5-m bo'laklarga kesilgan (Leica Biosystems, Wetzlar, Germaniya). Parafin bo'laklari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Fontana-Masson Stain Kit yordamida bo'yalgan va yorug'lik mikroskopiyasi amalga oshirilgan.

Statistika

Ushbu tadqiqotda o'tkazilgan tajribalar uch yoki undan ko'p marta takrorlangan. Ma'lumotlarning statistik ahamiyati Student's t-testi orqali tekshirildi. Olingan qiymatlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida ifodalangan va p-qiymati 0.05 dan kichik bo'lganda statistik ahamiyatga ega deb hisoblangan.

NATIJALAR

Peptid aralashmasi B16F10 hujayralarida MSH tomonidan qo'zg'atilgan melanin sintezi va tirozinaz faolligini inhibe qiladi.

Peptid aralashmasining hujayra hayotiyligiga ta'sirini aniqlash uchun B16F10 melanoma hujayralari va HaCaT keratinotsitlari 10, 50, 100 va 200 M konsentratsiyalarda peptid aralashmasi bilan ishlov berildi va MTT tahlili o'tkazildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, peptid aralashmasi umumiy davolash konsentratsiyasida sitotoksik emas va keyingi tajribalar yuqoridagi konsentratsiya oralig'ida o'tkazildi (1A-rasm).

Peptid aralashmasining melanin sinteziga inhibitiv ta'sirini aniqlash uchun B16F10 hujayralari melanin ishlab chiqarish stavkalarini solishtirish uchun 10, 50, 100 va 200 M konsentratsiyalarda davolandi. Natijalar peptid aralashmasi bilan melanin ishlab chiqarishning dozaga bog'liq bo'lishini ko'rsatdi. Inhibisyon stavkalari 10 M ning eng past konsentratsiyasida 3 foizni va 200 M ning eng yuqori konsentratsiyasida 26 foizni tashkil etdi (1B-rasm).

Tirozinaza melanin sintezidagi asosiy fermentlardan biridir. Tirozinaza faolligi tahlili peptid aralashmasining melanogenez inhibitiv ta'siri tirozinaza regulyatsiyasi tufayli yuzaga kelganligini tekshirish uchun amalga oshirildi. Natijalar B16F10 hujayralarida peptid aralashmasi tomonidan tirozinaza faolligini sezilarli darajada inhibe qilishini ko'rsatdi. Inhibisyon stavkalari 10 M eng past konsentratsiyasida 8 foizni va eng yuqori 200 M konsentratsiyasida 33 foizni tashkil etdi (1C-rasm).

Batafsil maʼlumot soʻrang: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501