Buyrak almashtirish terapiyasi talab qilinadigan bemorlarda oksidlovchi stress ko'rsatkichi sifatida trombotsitlar kam va boy plazmadagi ksantin oksidoreduktaza faolligi

Mavhum fon: Ksantin oksidoreduktaza(XOR) - bu purinlar almashinuvida ishtirok etadigan gidroksilaza fermenti. XOR faolligi har xil bo'lishi mumkin: homodimer oqsili ikki xil izoform XD (antioksidant) va XO (prooksidant) ga aylanishi mumkin. Oksidativ stress va yallig'lanish bilan birga keladisurunkali buyrak kasalligi(CKD), dializ va buyrak transplantatsiyasi trombotsitlar faollashishiga olib keldi. Ushbu tadqiqot qo'llaniladigan buyrakni almashtirish terapiyasining ksantin oksidoreduktaza va uning izoform faolligiga ta'sirini aniqlashga qaratilgan.

Materiallar va usullar: Tadqiqot guruhi 4 guruhga bo'lingan 117 bemordan iborat edi: gemodializ - 30 bemorlar, peritoneal dializ - 30 bemorlar, buyrak transplantatsiyasi bemorlar - 27 va konservativ davo {{5} } bemorlar. Nazorat guruhi 30 nafar sog'lom ko'ngillilardan iborat edi. Natijalar: O'rganilgan guruhlar ichida trombotsitlar kam plazmasida (PPP) XOR faolligida sezilarli farqlar aniqlandi (p=0.001). PPPdagi barcha oksidoreduktaza izoformlarining buyrakni almashtirish terapiyasi turi o'rtasida bog'liqlik mavjud edi (p.<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thesurunkali buyrak kasalligining sababiPPPdagi XD va XO faoliyatidagi farqlarda ham o'z aksini topdi.

Xulosa: XOR va uning izoformalarining faolligiga CKD bilan og'rigan bemorlarda qo'llaniladigan buyrak o'rnini bosuvchi terapiya turi, bemorlarning yoshi, dializ davomiyligi, CKD sabablari va rivojlanish bosqichi sezilarli darajada ta'sir qiladi.

Kalit so'zlar: ksantin oksidoreduktaza, trombotsitlar, buyrakni almashtirish terapiyasi,Surunkali buyrak kasalligi, Antioksidant fermentlar

CISTANCHE QANCHA VA QANCHA KETADI?

Fon

Ksantin oksidoreduktaza (XOR) purinlar almashinuvida ishtirok etadigan gidroksilaz fermentidir. Gipoksantinning ksantinga va ksantinning siydik kislotasiga (UA) oksidlanishini katalizlaydi. XOR faolligi har xil bo'lishi mumkin: gomodimer oqsili ikki xil izoformaga aylanishi mumkin. Ksantin dehidrogenaza (XD) asosan sog'lom to'qimalarda ifodalanadi va ksantin oksidaza (XO) translatsiyadan keyingi XD modifikatsiyasi, oksidlanish sistein qoldiqlari, shuningdek cheklangan proteoliz natijasida hosil bo'ladi, jarohatlar paytida hujayralar va to'qimalarda dominant rol o'ynaydi [1-3] ]. Qayd etilgan izoformlarning faoliyati bir-biriga qarama-qarshidir [4]. XOR NAD+ ishtirokida degidrogenaza, molekulyar kislorod bilan esa oksidaza sifatida ishlaydi. XORning antioksidantdan oksidantga tez aylanish qobiliyati, masalan, bakterial yoki zamburug'li infektsiyalarda foydali bo'lgan, to'qimalarning har xil turlari shikastlanishida, tez tug'ma immunitetning muhim elementidir.

Ksantin dehidrogenaza (XDO) va kislorodning reaksiya oraliq moddalari ham NAD+, ham O2 bilan reaksiyaga kirishishi mumkin, lekin NAD+ ga nisbatan yuqoriroq yaqinlikni ko‘rsatadi [6]. Ushbu oraliq izoform ajratilmagan, ammo uning faolligini aniqlash XD ning XO ga o'zgarishini kuzatishni osonlashtiradi [7].

Turli kasalliklarda sarum XOR faolligi keng o'rganilgan. Ushbu fermentga qiziqishning sababi uning ta'sirining dualizmidir: antioksidantlarni ishlab chiqarish qobiliyati va boshqa tomondan, reaktiv kislorod turlarini yaratish. XOR faolligining oshishi virusli gepatit, yuqumli mononuklyoz, otoimmün kasalliklar, pnevmoniya, shizofreniya va II turdagi diabet kabi patologik sharoitlarda sodir bo'ladi. XOR faolligining oshishi buyrak yoki jigar transplantatsiyasidan keyin bemorlarning qon zardobida ham kuzatiladi [8]. XORni kodlovchi gen buyraklarning kamolotiga va buyraklardagi adipogenezga javobgar bo'lishi va epiteliya hujayralarining mezenxima to'qimalariga aylanishini oldini olishi mumkinligi ko'rsatilgan. Biroq, bizning eng yaxshi ma'lumotlarimiz tufayli, buyrakni almashtirish terapiyasidan o'tayotgan bemorlarda trombotsitlarga boy plazma (PPP) va trombotsitlarga boy plazma (PRP) da XOR faolligini o'rganadigan nashr etilgan hisobotlar mavjud emas. Bemorlarning ushbu guruhida XOR faolligining ahamiyati surunkali buyrak kasalligi (KBH), dializ va buyrak transplantatsiyasi bilan birga keladigan oksidlovchi stress va yallig'lanish tufayli yuzaga keladigan trombotsitlar faollashuvining kuchayishi bilan bog'liq. Bundan tashqari, dializ va organ transplantatsiyasi paytida to'qimalar va qon tomirlari shikastlanadi, trombotsitlar esa yallig'lanish jarayonining boshlang'ich bosqichlarida va davolanishda faol ishtirok etib, to'qimalar shikastlangan joyga etib boradigan birinchi hujayralardir [10].

PRP va PPP turli trombotsitlar kontsentratsiyasiga ega bo'lgan qon plazmasining fraktsiyalari. PRP va PPP ning trombotsitlar tarkibi mos ravishda trombotsitlar / ml va trombotsitlar / ml ni tashkil qiladi. PPP va PRP odamlarning butun qonini turli xil santrifüj tezliklarda qayta-qayta santrifüjlash va yuvish orqali olinadi [11, 12].

PPP antikoagulyatsion qonning sentrifugalash qo'shimcha mahsuloti sifatida trombotsitlar kontsentratsiyasi oddiy qonga qaraganda pastroqdir. PPP ning asosiy komponentlari fibrinogen, fibronektin va trombindir. PPP ning biologik ta'siri gemostaz va koagulyatsiyada ishtirok etadi, hujayra biriktiruvchi vektor sifatida ishlaydi va fibroblastlar va epiteliya hujayralarining mitozini rag'batlantiradi [13]. PPP trombotsitlarda PRP kabi konsentratsiyalanmagan bo'lsa-da, PPP ham hujayra o'sishi va omon qolishi mumkinligi ko'rsatildi. PPP yarani davolash bilan bog'liq hujayra funktsiyalarini rag'batlantiradi va hujayralar migratsiyasini va fibroblastlarning ko'payishini tezlashtiradi [14, 15]. Trombotsitlarga boy plazma normal plazmaga qaraganda ko'proq konsentrlangan trombotsitlarga ega (taxminan 150-400 × 103 hujayra / dL). Bu adabiyotda PRPning eng keng tarqalgan ta'riflaridan biridir [16]. Bugungi kunga qadar cheklangan tadqiqotlar surunkali buyrak kasalligi bilan og'rigan bemorlarda XOR va uning trombotsitlarga boy yoki kam plazmadagi izoform faolligini tavsifladi. Tan va boshqalar. reaktiv kislorod turlari (ROS) tomonidan zararlangan hujayralar (surunkali buyrakni almashtirish terapiyasi holatida) plazmadagi ferment darajasining oshishiga olib keladigan XOR izoformlarining "oqishini" ko'rsatdi [17]. Bu mexanizm PPP bilan solishtirganda trombotsitlardagi XOR va uning izoformlarining past faolligini tushuntiradi. Shuning uchun, PPP va PRPdagi oksidoreduktazalarning faolligi katta qiziqish uyg'otadi, chunki ular har kuni sodir bo'ladigan hujayra jarayonlarini ochishga yordam berishi mumkin. Bunday tekshiruvlar bemorlarning ushbu guruhidagi oksidlovchi stressning og'irligini bilvosita ta'kidlashi mumkin.

Berry va boshqalar. Shuningdek, ksantin oksidoreduktaza jigarda, ingichka ichakda, sut bezlari va endotelial hujayralarda tarqalishini ta'riflang. Hujayra osti lokalizatsiya usullari sitoplazmada ham, hujayra membranalarida ham ksantin oksidoreduktaza mavjudligini ko'rsatdi. Ular, shuningdek, plazma ksantin oksidazreduktaza hujayra membranalaridan ksantin oksidoreduktaza soyalanishi yoki sitoplazmadan oqishi tufayli bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Plazma tarkibidagi trombotsitlar va boshqa qon hujayralarida ferment faolligini farqlash uchun PPP va PRPda XOR faolligini sinab ko'rishimizning sabablaridan biri bu. Antioksidant fermentlarning faolligiga asoslanib, buyrakni almashtirish terapiyasining qaysi turi bemorni oksidlovchi stressga kamroq ta'sir qilishini ham aniqlashimiz mumkin. XORning ikki tomonlama tabiati tufayli buyrakni almashtirish terapiyasining turi va XOR izoformlarining faolligi o'rtasidagi bog'liqlikni tushunish buyrakni almashtirish terapiyasi turini tanlashda juda qiziqarli va foydali bo'lishi mumkin.

Materiallar va usullar

Axloqiy ma'qullash va rozilik

Shetsin shahridagi Pomeraniya tibbiyot universitetining bioetik komissiyasi o'tkazilgan tadqiqotni tasdiqladi (KB-0012/36/11 yo'q). Barcha ishtirokchilar, shu jumladan nazorat guruhidagi sog'lom ko'ngillilar tadqiqotning maqsadi va ko'lami haqida ma'lumotga ega bo'ldilar va namunalarni topshirishga va natijada olingan ma'lumotlarni nashr etishga rozilik berdilar.

O'quv guruhi

147 ishtirokchi bor edi: 30 nafar sog'lom ko'ngillilar nazorat guruhi (NK) va Szczecin shahridagi Pomeraniya tibbiyot universitetining Nefrologiya, Transplanetologiya va ichki kasalliklar klinikasiga tashrif buyurgan surunkali buyrak kasalligi (CKD) bo'lgan 117 bemor. Bemorlar olgan muolajalari asosida 4 guruhga bo'lingan: gemodializdan oldin va keyin 30 bemor (HD A va HD B): 30 bemor peritoneal dializ (PD); 27 bemor buyrak transplantatsiyasidan oldin va keyin (operatsiyadan 5-7 kun o'tgach) (TE, TE A); 30 nafar bemor konservativ davo (KT) oldi (CKD 2-5 bosqich). Sinov va nazorat guruhlarida jinsi, yoshi, dializ davomiyligi, surunkali buyrak kasalligining sababi va bosqichi, kreatinin kontsentratsiyasi 1 va 2-jadvallarda keltirilgan.

Namunalar

Barcha tadqiqot ishtirokchilaridan qon namunalari (K2EDTA (8 ml), 3,8% trinatriy sitrat (9: 1; v / v) va sarum (8 ml)) olingan. Gemodializ qilingan bemorning qoni ularning arteriovenoz oqmasidan olingan; boshqa barcha ishtirokchilar uchun periferik venipunktura qo'llanildi. Namunalar gemodializ bilan og'rigan bemorlardan oldin (HD A) va nasos to'xtatilgandan keyin (HD B) taxminan 10 daqiqadan so'ng olingan. Transplantatsiya qilingan bemorning qoni transplantatsiyadan oldin (TE) va operatsiyadan 5-7 kun o'tgach (TE A) to'plangan. TE guruhiga jalb qilingan bemorlar ushbu tadqiqotda gemodializ yoki peritoneal dializ bilan og'rigan bemorlar guruhiga kirmagan. Ular butun Polshadan transplantatsiya qilish uchun malakali bemorlar edi. Buyrak transplantatsiyasi bilan og'rigan bemorlarning ko'pchiligi oldindan moddaalizatsiyadan o'tgan. K2EDTA va pıhtılaşmış qon namunalari mos ravishda plazma va sarum olish uchun 2600 rpm tezlikda 10 daqiqa davomida 20 darajada santrifüj qilindi. Trombotsitlarga boy plazma (PRP) va trombotsitlar kam bo'lgan plazma (PPP) olish uchun sitrat bilan to'plangan qon 20 daraja haroratda 10 daqiqa davomida 1100 aylanish tezligida santrifüj qilindi. Olingan PRP yangi naychaga o'tkazildi va 6000 rpm tezlikda 10 daqiqa davomida 20 daraja santrifüj qilindi: trombotsitlar kam plazma (PPP) alohida naychaga o'tkazildi; trombotsitlar pelleti ikki marta yuvildi va Tyroda tamponida (pH7.4) suspenziya qilindi. Plazma, sarum, PPP va PRP tahlillar o'tkazilgunga qadar -80 daraja muzlatilgan. Gemodializ bilan og'rigan bemorlarda geparinning XOR faolligiga mumkin bo'lgan ta'sirini bartaraf etish uchun geparinni yuborishdan oldin va o'rtacha 4-5 soat davom etgan dializdan keyin (geparinning yarimparchalanish davri - 4 soat) qon to'plangan.

Trombotsitlar kam plazma va trombotsitlarda ksantin oksidoreduktaza faolligi

Aniqlashlar Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P spektrofotometri yordamida amalga oshirildi. Yo'qolib ketish o'zgarishlari 340 nm (XD) va 302 nm (XDO, XO) da 5 daqiqa davomida 30 daraja haroratda qayd etilgan. Enzimatik faollik siydik kislotasi va NADH hosil bo'lishi (A340 va A302 ning ortishi) sifatida o'lchandi va mU × mL-1 (millilitr uchun milliunit) bilan ifodalangan. Reaksiyaning dastlabki tezligini hisobga olgan holda fermentativ faollik hisoblangan. Siydik kislotasi hosil bo'lishi 302 nm (XDO va XO izoformalari) da o'lchandi, chunki u erda uning absorbsiyasi hali ham yuqori, NAD + kontsentratsiyasining o'zgarishi esa hissa qo'shmaydi. NADH+ H+ e340=6.22× 103 [L∙mol−1 sm−1 ] uchun so‘nish koeffitsienti NADH+ H+ ksantin oksidoreduktaza izoformalarining faolligini hisoblash uchun ishlatilgan: e302=2,30×103 [ L∙mol−1 sm−1 ] [7, 19–22].

1-jadval. Tadqiqotda qatnashgan gemodializ (HD), konservativ davo qilingan peritoneal dializ (PD), buyrak transplantatsiyasi (TE) va nazorat guruhi (C) ning umumiy xususiyatlari (o'rtacha ± SD)

P * - HD, PD va CKD guruhlari o'rtasidagi farqlar uchun statistik ahamiyatga ega, sifatli o'zgaruvchilar uchun TE va C aniq Fisher testi; miqdoriy o'zgaruvchilar uchun - bir tomonlama ANOVA va; P ** - HD, PD va CKD guruhlari o'rtasidagi farqlar uchun statistik ahamiyatga ega va miqdoriy o'zgaruvchilar uchun sifatli o'zgaruvchilar uchun TE aniq Fisher testi bir tomonlama ANOVA yoki; DM - diabetik nefropatiya; HA - gipertenziya; GIK - buyrakning glomerulyar yallig'lanishi; ADPKD - irsiy autosomal dominant polikistik buyrak kasalligi; NS - statistik jihatdan ahamiyatli farqlar yo'q.

2-jadval. Buyrak transplantatsiyasidan oldin va keyin konservativ davo qilingan gemodializ (B - HD dan oldin, A - keyin), peritoneal dializ (PD) bilan buyrak transplantatsiyasidan oldin va keyin (TE B va TE A) va nazorat guruhi (NK) ning umumiy xususiyatlari o'rganish (o'rtacha ± SD)

P * - HD A, HD B, PD va CKD guruhlari o'rtasidagi farqlar uchun statistik ahamiyat, miqdoriy o'zgaruvchilar uchun TE va C - Kruskal Uollis ANOVA, bir tomonlama ANOVA yoki Student's t-testi P ** - HD A o'rtasidagi farqlar uchun statistik ahamiyatga ega , Kruskal Uollisning ANOVA miqdoriy o'zgaruvchilari yoki ANOVA bir tomonlama tahlili uchun HD B, PD va CKD va TE guruhlari Kt / V - dializ indeksi (t vaqtida K klirensi bilan tozalangan V hajm ulushi) NS statistik jihatdan ahamiyatli munosabatlar topilmadi.

Statistik tahlil Tarqatishlarni baholash uchun KS testi (Kolmogorov-Smirnov) qo'llanildi, bu ba'zi o'zgaruvchilarda (PRPda XD va XDO izoformlarining faolligi) parametrlarning noan'anaviy taqsimlanishini ko'rsatdi. Miqdoriy ma'lumotlarni tahlil qilish uchun aniq Fisher va Chi-kvadrat testlaridan foydalanilgan. Bir o'zgaruvchan tizimlar uchun Student's t-test va ANOVA tahlilidan foydalanib, normal taqsimotga ega bo'lgan o'zgaruvchilar holatida bog'langan (juftlangan) va bog'lanmagan (juftlanmagan) o'zgaruvchilar o'rtasidagi farqlar baholandi. Oddiy bo'lmagan taqsimotlarga ega o'zgaruvchilar bo'lsa, parametrlar orasidagi farqni baholash uchun Kruskal-Uollis ANOVA tahlili, shuningdek, juftlashtirilmagan ma'lumotlar uchun Mann-Whitney U parametrik bo'lmagan test yoki juftlashtirilgan ma'lumotlar uchun Wilcoxon testi o'tkazildi. O'rganilayotgan parametrlar o'rtasidagi munosabatlarning ko'p omilli bahosini aniqlash uchun chiziqli ko'p regressiya modeli ishlatilgan. Natijalarning statistik tahlili Statistica 12 (StatSoft) yordamida amalga oshirildi.