Orqa miya kontuziyasi shikastlanishining sichqoncha modelida poli(pro{1}} estradiol)ning o'tkir dozaga bog'liq neyroprotektiv ta'siri

Abstrakt

17 -Estradiol (E2) tizimli qoʻllanganda orqa miya shikastlanishining klinikgacha boʻlgan modellarida neyroproteksiyani taʼminlaydi. Ushbu tadqiqotning maqsadi poli(pro-E2) plyonkali biomateriallardan foydalangan holda E2 ni shikastlangan orqa miyaga uzoq vaqt davomida mahalliy darajada qo'llash edi.

Odamlar orqa miya jarohatlari haqida ko'proq bilib olishlari bilan biz uning odamlarning jismoniy va ruhiy salomatligiga ta'sirini tushuna boshlaymiz. Orqa miya shikastlanishi ko'plab salbiy oqibatlarga olib kelishi mumkin bo'lsa-da, xayriyatki, ularning xotiraga ta'sirini nazorat qilish mumkin.

Avvalo, orqa miya shikastlanishi nima ekanligini aniqlab olishimiz kerak. Orqa miya miyadan tananing turli qismlariga ko'rsatmalarni uzatish uchun mas'ul bo'lgan umurtqa pog'onasida himoyalangan nervdir. Agar orqa miya shikastlangan bo'lsa, tananing ba'zi qismlari miya bilan yaxshi aloqani yo'qotadi, natijada ta'sirlangan oyoq-qo'l harakati, sezuvchanlik va avtonom nazorat.

Orqa miya shikastlanishi, ayniqsa, orqa miya jarohati bilan og'rigan bemorlarni reabilitatsiya qilishning dastlabki bosqichlarida odamlarning xotirasiga ma'lum ta'sir ko'rsatishi mumkin. Orqa miya shikastlanishi odamning diqqatini, ish xotirasini va hissiy ishlov berish qobiliyatini yomonlashishiga olib kelishi mumkin, bu esa insonning xotira qobiliyatiga ta'sir qiladi.

Biroq, bu salbiy ta'sirlar asta-sekin pasayadi, chunki bemorlar reabilitatsiya davosidan o'tadilar. Bemorlar xotira o'yinlari va boshqa kognitiv treninglarda ishtirok etish orqali xotirasini yaxshilashlari mumkin. Shu bilan birga, jismoniy reabilitatsiya ham tananing motor va hissiy funktsiyalarini tiklashga yordam beradi va shu bilan hissiy va kognitiv funktsiyalarni yaxshilaydi.

Biz orqa miya jarohati bilan og'rigan bemorlarni reabilitatsiya davolashda faol ishtirok etishga va jismoniy va ruhiy salomatlikni yaxshilash uchun reabilitatsiya mashg'ulotlarini davom ettirishga undashimiz kerak. Iltimos, ishoning, to'g'ri bilish va operatsiyadan keyingi davolanish yordamida bemorlar orqa miya shikastlanishining xotiraga ta'sirini engib, faol hayot kechirishda davom etishlari mumkin. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche xotira va o'rganish uchun juda muhim bo'lgan atsetilxolin va o'sish omillari darajasini oshirish kabi neyrotransmitterlar muvozanatini ham tartibga solishi mumkin. Bundan tashqari, Cistanche, shuningdek, qon oqimini yaxshilaydi va kislorod yetkazib berishni rag'batlantiradi, bu esa miyaning etarli darajada oziqlanishi va energiya olishini ta'minlaydi va shu bilan miya hayotiyligi va chidamliligini oshiradi.

Xotirani yaxshilash uchun bilish qo'shimchalarini bosing

Katta yoshli erkak sichqonlarda orqa miya kontuziv shikastlanishidan so'ng, poli (pro-E2) plyonkalar subdural tarzda implantatsiya qilindi va neyroproteksiya jarohat va implantatsiyadan 7 kun o'tgach, immunohistokimyo yordamida baholandi. Ushbu tadqiqotlarda poli (pro-E2) plyonkalar yallig'lanish reaktsiyasiga ta'sir qilmasdan, neyroproteksiyani biroz yaxshilagan. shikastlangan nazoratchilar bilan solishtirganda.

Chiqarilgan E2 dozasini oshirish uchun poli(proE2) plyonkalarga bog'lanmagan E2 ni qo'shish orqali bolusni chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar ishlab chiqarildi.

Biroq, shikastlangan nazorat elementlari bilan solishtirganda, bolus chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar jarohatdan keyin 7 yoki 21 kun ichida neyroproteksiyani sezilarli darajada kuchaytirmadi yoki yallig'lanishni cheklamadi. E2 ning terapevtik dozalarini aniqroq chiqaradi.

KIRISH

Orqa miya travmatik shikastlanishi (SCI) har yili Qo'shma Shtatlarda 18000 dan ortiq odamga ta'sir qiladigan zaif holat bo'lib, SHning global tarqalishi esa millionda 236 dan 1009 gacha bo'lishi taxmin qilinmoqda.2

SCI bilan kasallangan bemorlarda og'ir nevrologik nuqsonlar, jumladan, sezuvchanlik yo'qolishi, ichak/quviq funktsiyasining buzilishi va falaj kuzatiladi.3,4 Orqa miyaga birlamchi ta'sir shikastlanish joyida neyronlarning o'limiga olib keladi, bu esa astrositlar va makrofaglar ishtirokidagi bir necha ikkilamchi shikastlanish kaskadlari bilan yanada kuchayadi. .

Vaqt o'tishi bilan bu astrositlar glial chandiq hosil qiladi, bu esa aksonlarning lezyon chetidan tashqariga kengayishiga to'sqinlik qiladi.5 Hozirgacha SCIni davolash uchun FDA tomonidan tasdiqlangan neyroprotektiv dorilar mavjud emas.

Bir necha o'n yilliklar davomida olib borilgan tadqiqotlar ikkilamchi shikastlanish natijasida neyronlarning yo'qolishini oldini olish va/yoki aksonal regeneratsiyani rag'batlantirish, natijada yo'qolgan funktsiyani tiklashga olib keladigan biomolekulalarni tizimli boshqarishga qaratilgan. jinsiy gormon, 17 -estradiol (E2).

E2 administratsiyasi yallig'lanishni kamaytirish, 7-9 glial hujayralar reaktivligini yumshatish, 10 oksidlovchi stressni cheklash, 11-14 va glutamat sabab bo'lgan eksitotoksik neyronlarning o'limini yumshatish orqali markaziy asab tizimiga keng foyda keltiradi.15 E2 turli xil kemiruvchilar modellarida funktsional tiklanishni yaxshilaydi, SCI. 16,17 Qizig'i shundaki, E2 ning ko'p dozali tizimli qo'llanilishi, faqat bitta dozani olgan hayvonlarga qaraganda, funktsional tiklanishni tezlashtiradi18,19.

E2 ko'p dozali rejimlar orqali funktsional tiklanishni yanada samaraliroq ta'minlaganligi sababli, bizning maqsadimiz E2 ning ko'p dozalari/tizimli in'ektsiyalaridan kelib chiqadigan muammolarni chetlab o'tish uchun shikastlanish joyida E2 ni barqaror ravishda chiqarish edi (maqsaddan tashqari ta'sirlarning oldini olish uchun).

Shu maqsadda biz poli(prodrug) biomaterial strategiyasidan foydalandik, unda mahalliy dori (E2) avval reaktiv allil guruhlari bilan funksionallashtirildi, so‘ngra yuqorida ta’riflanganidek, egiluvchan oligo-(etilen glikol) ditiol bilan fotointisiyalangan tiol-en radikal qo‘shilishi orqali polimerlashtirildi. .20 Biz yuqori molekulyar og'irlikdagi polimer zanjirlarini oldik, ular polimer ichida takrorlanuvchi birlik sifatida E2prodrugdan iborat.

Gidrolitik degradatsiyadan so'ng, polimer asta-sekin E2 ni atrofdagi muhitga chiqaradi. U erdan chiqarilgan yagona boshqa qo'shimcha mahsulotlar karbonat angidrid va oligo(etilen glikol) (oEG) (1-rasm). Plyonkalar yoki mikrofiberlarga ishlab chiqarilgan poli(pro-E2) zanjirlari in vitroda nanomolyar kontsentratsiyalarda E2 ni bir necha oydan yillargacha chiqarishi mumkin. .20

Ushbu poli(pro-E2) iskalalardan chiqarilgan E2 biofaoldir va bu iskala neyronlarni vodorod peroksiddan kelib chiqadigan oksidlovchi stressdan himoya qilish orqali in vitro neyrotrofizm va neyroproteksiyaga yordam beradi. Bu erda biz poli(pro-E2) plyonkalarni jarohatdan so'ng darhol kontuziya SCI ning murin modelida qo'lladik va ularning in vivo neyroprotektiv qobiliyatini baholadik.

Bizning boshlang'ich poli(pro-E2) plyonka dizayni yallig'lanish reaktsiyasiga ta'sir qilmasdan jarohat joyida neyroproteksiyani keskin oshirdi (jarohatdan keyin 7 kun). Poli(pro-E2) filmlar kuniga nanogramma E2 chiqarganligi sababli, biz boshqa chiqarish strategiyasini ishlab chiqdik, unda unboundE2 poli(pro-E2) matritsasiga kiritilgan. Biz bog'lanmagan E2 ning bolus chiqarilishi qo'shimcha neyroprotektiv foyda keltirishi mumkinligini taxmin qildik.

Poly(pro-E2) plyonkalar E2 ni yorilish bilan chiqaradi, so'ngra past konsentratsiyalarda polimerdan E2 doimiy ravishda chiqariladi. Immunohistologik bo'yash jarohatlar joyida mavjud bo'lgan neyronlar, astrositlar va makrofaglar/mikrogliyalarni o'tkir (jarohatdan 7 kun keyin) va surunkali (jarohatdan keyin 21 kun keyin) SCI dan keyin, bu bolusni chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar mavjudligida baholadi.

NATIJALAR VA MUHOKAMA

Poly(pro-E2) plyonkalar nanomolyar konsentrasiyalarda E2 ni chiqaradi, dorsal ildiz ganglionidan neyronlarning o'sishiga yordam beradi va in vitro neyronlarni vodorod peroksid sabab bo'lgan oksidlovchi stressdan himoya qiladi.20 Bu erda taqdim etilgan tadqiqot poli(pro-E2) qobiliyatini aniqlashga qaratilgan. kontuziya SCI ning murin modeli yordamida in vivo neyroproteksiyani ta'minlash uchun filmlar.

Voyaga etgan erkak sichqonlarda o'rtacha kontuziya SCI qo'zg'atildi va jarohatdan so'ng darhol poli(pro-E2) plyonkalar to'g'ridan-to'g'ri shikastlanish ustiga joylashtirildi (2A-rasm). Implantatsiyadan keyin poli(pro-E2) plyonkalar joyida qolishiga ishonch hosil qilish uchun jarohatlangan hayvonlarning orqa miyasiga rodamin B yuklangan poli(pro-E2) plyonkalar joylashtirildi. Implantatsiyadan etti kun o'tgach, orqa miya to'plangan va yorug'lik mikroskopi yordamida tasvirlangan (2B-rasm). Barcha hayvonlarda implantatsiya qilingan rodamin B yuklangan poli(pro-E2) plyonkalar implantatsiya protokolini tasdiqlovchi joy sifatida qoldi.

Poli(pro-E2) plyonkalarning neyroproteksiyani ta'minlash va yallig'lanishni yumshatish qobiliyatini sinash uchun o'murtqa kontuzyon jarohatidan so'ng poli(pro-E2) plyonkalar (rodamin Bsiz) implantatsiya qilindi va orqa miya jarohati va implantatsiyadan 7 kun o'tgach yig'ildi. Omurilikdagi neyronlar va makrofaglarni ko'rish uchun uzunlamasına bo'laklar (qalinligi 10 mkm) kesilib, markazda shikastlanish epitsentri atrofida joylashgan va immuno-belgilangan (3-rasm).

Neyron mavjudligini baholash uchun bo'limlar NeuN uchun belgilandi va bo'yashning miqdoriy tahlili poli(pro-E2) plyonkalar plyonka implantlarini olmagan shikastlangan nazoratchilarga nisbatan shikastlanish epitsentri atrofidagi NeuN musbat maydonni sezilarli darajada oshirganligini ko'rsatdi (3A-rasm; p.=0.0002). NFH (neyrofilament og'ir zanjiri) yordamida aksonlarni qo'shimcha bo'yash implantatsiya qilingan poli(pro-E2) plyonkalarning o'tkir neyroprotektiv ta'sirini ham aniqladi (3B-rasm; p=0.0017).

Biz neyroproteksiyadagi bu o'zgarish shikastlanish joyidagi apoptozning (kaspaza 3) o'zgarishi bilan bog'liq emasligini kuzatdik (qo'llab-quvvatlovchi rasm S1; p=0.9966). Faollashtirilgan makrofaglarni (CD68) bo'yash ham hech qanday aniqlanmadi. poli(pro-E2) plyonka bilan ishlov berilgan hayvonlar va ishlov berilmagan hayvonlar o'rtasida sezilarli farqlar (3C-rasm; p= 0.7207).

Birgalikda, poli(pro-E2) plyonkalar yallig'lanish reaktsiyasini o'zgartirmasdan, neyroproteksiyani keskin oshiradi. faollashgan makrofaglar egallagan maydon) (3-rasm).

Yallig'lanishning kamaymasligi E2 ning yallig'lanishga qarshi va neyroprotektiv dozalari bir-biridan farqli ekanligini va hozirgi kino formulasi bilan erishilmaganligini ko'rsatishi mumkin. va kuchliroq neyroprotektiv javobni yoqing.

E2 ning keskin dozasini oshirish uchun poli(pro-E2) plyonkalar o'zgartirildi, shunda bolus E2 chiqarilishi implantatsiyadan so'ng darhol paydo bo'ladi. E2 ning bolus chiqarilishidan so'ng, polimer degradatsiyasi avvalgidek bir xil konsentratsiyada E2 ni chiqaradi. Yuqorida tavsiflangan tajriba, bu bolusni chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar yordamida takrorlandi va neyroproteksiya va yallig'lanish jarohatdan keyingi 7 kun ichida (dpi) baholandi.

Biroq, qo'shimcha foyda o'rniga, bolus-relizlovchi poli(pro-E2) plyonkalar shikastlangan, ishlov berilmagan nazorat elementlariga nisbatan NeuN musbat maydonini sezilarli darajada oshirmadi (4A-rasm; p=0.6770). Bolusni chiqaradigan poli(proE2) plyonkalar CD68 ifodasini oshirdi, ammo o'sish statistik jihatdan farq qilmadi (p= 0.1780).

GFAP (astrositlar) va Iba1 (mikrogliya) ifodasi ortishi hisobiga bolus-ajraladigan poli(pro-E2) plyonkalar mavjudligida glial reaktivlik va mikroglial yallig'lanishning ortib borish tendentsiyalari ham kuzatildi; ammo, bu o'sishlar jarohatlangan, davolanmagan nazoratlarda kuzatilganidan statistik jihatdan katta emas edi (mos ravishda p=0.3233 va p=0.3053). Birgalikda bolus chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar neyroproteksiyani kuchaytirdi va astrositlar reaktivligi va makrofag/mikrogliya mavjudligi dastlab taxmin qilinganidek kamaymadi.

Shikastlangan, davolanmagan hayvonlar va jarohatlangan, bolus-ajraladigan poli(proE2) plyonka bilan ishlov berilgan hayvonlar o'rtasidagi farq o'tkir, 7 dpi vaqt nuqtasida kuzatilmaganligi sababli, poli(pro-E2) plyonkalar qo'shimcha tekshirish uchun surunkali vaqt nuqtasi tanlangan. E2 ni uzoq muddatga chiqarishi mumkin.20 Yuqorida tavsiflangan tajriba bolus-releasingpoly(pro-E2) plyonkalar bilan takrorlandi, lekin hayvonlar 21 dpi da surunkali baholandi (5-rasm).

Orqa miya yuqorida aytib o'tilgan bir xil turdagi hujayralar uchun belgilangan. Tahlildan so'ng, shikastlangan, davolanmagan hayvonlarga nisbatan bolus chiqaradigan poli(pro-E2) plyonka bilan implantatsiya qilingan hayvonlarda NeuN maydoni ulushining ortishi tendentsiyasi kuzatildi (5A-rasm;=0.0897-bet) .Bundan tashqari, bolus chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar ishlov berilmagan, shikastlangan hayvonlar nazorati ma'lumotlari bilan solishtirganda CD68 va GFAP ifodasining maydoni ulushini kamaytirgan tendentsiyalar kuzatildi (rasm 5B, C; p=0.0859 va p.=0.2780).

Biroq, tendentsiyalarning hech biri statistik jihatdan farq qilmadi. Boshqa tomondan, bolus chiqaradigan poli(pro-E2) bilan davolash qilingan hayvonlardan olingan Iba1 etiketli toʻqima boʻlimlari davolanmagan, shikastlangan nazoratlar maʼlumotlari bilan solishtirganda koʻproq ifodalanganligini koʻrsatdi (p < 0.0001). Bizning oldingi ishimiz shuni koʻrsatadiki, poli(pro) -E2) 15 mm × 15 mm qoplamali plyonkalar kuniga taxminan 266 ng E2 chiqaradi,20 bu erda ishlatiladigan plyonkalardan (1 mm × 1,8 mm) kuniga taxminan 2 ng E2 ni tashkil qiladi. Bolusni chiqaradigan poli(pro-E2) plyonkalar implantatsiyadan so'ng qo'shimcha 40 ug bog'lanmagan E2 ni chiqaradi.

Kemiruvchilarning SCI modellarida E2 dan foydalanishga qaratilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, past dozali estrogen (10 ug / kg) vena ichiga yuborilganda reaktiv gliozni susaytiradi va yallig'lanish hodisalarini susaytirish, apoptozni inhibe qilish va angiogenezni kuchaytirish bilan birga neyroproteksiyani ta'minlaydi.21 Aksincha, yuqori, tizimli estrogenga ega. salbiy ta'sirlar, jumladan, chuqur tomir trombozi va saratonning ko'payishi22,23 va erkaklarda ayollik jismoniy xususiyatlarining rivojlanishi. Bu diqqatga sazovordir, chunki E2 tadqiqotlarining aksariyati E2 ni tizimli ravishda tomir ichiga yoki qorin bo'shlig'iga yuborishga qaratilgan.

E2 ning yuqori dozalarini tizimli ravishda qo'llash bilan bog'liq xavfsizlik muammolarini hisobga olgan holda, nojo'ya ta'sirlarning oldini olish uchun shikastlangan orqa miyaga mahalliy etkazib berish uchun E2 kontsentratsiyasini optimallashtirish muhimdir. Bugungi kunga qadar faqat bitta tadqiqot E2 (2,5 ug yoki 25 ug) ni fokusli etkazib berish uchun nanopartikullardan foydalangan holda biomaterialdan E2 ni yetkazib berdi. Nanozarrachalardan ajralib chiqish SCI kontuziyasining kalamush modelida yallig'lanishni tez sur'atda kamaytirdi.9 Bizning ma'lumotlarimizda (4 va 5-rasmlar) statistik jihatdan ahamiyatli javobning yo'qligi biz o'murtqa shnurga mahalliy ravishda etkazib berayotgan E2 miqdoridagi nomutanosiblik bilan bog'liq bo'lishi mumkin. toomuch E2 (40 ug) o'tkir, juda kam (2 ng) esa surunkali ravishda chiqariladi.

Ushbu ma'lumotlardan biz kuzatayotganimiz kamtarona tendentsiyalar bo'lsa-da, ushbu tadqiqot in vivo neyroproteksiyani rivojlantirish uchun E2 dozasining ahamiyatini ta'kidlaydi. E2 ning dastlabki dozasini kamaytirish va poli(pro-E2) biomaterialining degradatsiya kinetikasini sozlash bu muammoni bartaraf etishga yordam beradi va potentsial ravishda yaxshi neyroprotektiv natijalarni beradi.

Ushbu tadqiqot faqat erkaklarda o'tkazilgan bo'lsa-da, ushbu biomaterial uchun haqiqiy translatsiya potentsialini o'rnatish uchun ushbu poli(pro-E2) plyonkalarning ikkala jinsdagi ta'sirini baholash juda muhimdir. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, SCIdan keyin ayollarda estrogen darajasining ortishi erkaklarnikiga nisbatan ularning funktsional natijalarining yaxshilanishiga qisman javobgar bo'lishi mumkin.24Ayollarda estrogen mavjudligi ko'payganligi sababli, estrogendan foydalanadigan har qanday biomaterial strategiyasi ushbu ortib borayotgan darajani hisobga olishi va materialni o'zgartirishi kerak. Erkak va ayollar uchun berilgan doza bir xil bo'lishini ta'minlash uchun kinetikani shunga mos ravishda chiqaring.

USULLARI

Poly(pro-E2) filmlar ishlab chiqarish.

Poli(pro-E2) polimer P1 sintez qilingan va yuqorida batafsil tavsiflanganidek tavsiflangan.20 Jel o'tkazuvchanlik xromatografiyasiga (GPC) ko'ra, polimerning o'rtacha molekulyar og'irligi MW ~ 80 kDa va dispersligi Đ ~ 3 ga teng. Poli(pro-E2) plyonkalar polimerni xloroformda (5 wt %/wt; polimer/xloroform) eritib, eritmani 15 mm × 15 mm shisha qoplamalarga (har bir qoplama uchun 100 mkL eritma) to'kib tashlash orqali ishlab chiqarilgan. vakuum ostida bir kechada quriting (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Bog'lanmagan E2 bilan poli(pro-E2) plyonkalarni yaratish uchun plyonkalar tomchilatib quyishdan oldin polimer eritmasiga (0,0625 wt %/wt; E2/xloroform) bog'lanmagan E2 (Abcam, Kembrij, MA) qo'shish orqali ishlab chiqarilgan. eritmani qoplamlarga surting. Implantatsiya qilishdan oldin plyonkali plyonkalar ultrabinafsha (UV) nurlanish yordamida 30 daqiqa davomida sterilizatsiya qilindi va plyonkalar steril bioxavfsizlik shkafida qopqoqlardan tozalandi. Keyin poli(pro-E2) plyonkalar quyida ta'riflanganidek, kattalar sichqonchasiga implantatsiya qilish uchun mos bo'lgan 1 mm × 1,8 mm bo'laklarga bo'lingan.

Orqa miya kontuziyasi shikastlanishi va poli(pro-E2) plyonkalarni implantatsiya qilish.

Barcha jarrohlik va operatsiyadan keyingi parvarishlash muolajalari Rensselaer PolytechnicInstitute va Ogayo shtati universiteti hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitalari (IACUC) tomonidan tasdiqlangan. Kontuziya SCI qo'zg'atish uchun Jekson Laboratoriyasidan sotib olingan katta yoshli C57BL/6 sichqonlari (10- dan 12- haftagacha) qorin bo'shlig'iga in'ektsiya bilan behushlik qilindi. ketamin (80 mg/kg) va ksilazin (10 mg/kg). Hayvonlarning orqa yuzlari qirqib olingan va 70% etanol va betadin yordamida aseptik tarzda tayyorlangan.

Hayvonni 37 daraja haroratda ushlab turilgan isitish yostig'iga qo'ygandan so'ng, umurtqa pog'onasini ochish uchun teri va mushak qatlamlari ochildi va orqa miyani ochish uchun torakal to'qqizinchi (T9) umurtqasida dorsal laminektomiya qilindi. Ushbu darajada Infinite Horizons impaktori (Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY) yordamida o'rtacha (75 kdyn) kontuziya SCI qo'zg'atildi.

Gemostaza erishilgandan so'ng, dura ochildi (2-rasm) va dura ostiga va orqa miya ustiga poli(pro-E2) plyonka yoki bolus chiqaradigan poli(pro-E2) plyonka (1 mm × 1,8 mm) qo'yildi. shikastlanish joyi. Nazorat hayvonlarida dura ochildi, lekin poli(pro-E2) plyonkalar implantatsiya qilinmadi. Keyin mushak qatlamlari steril tikuvlar yordamida yopildi va teri steril metall yara qisqichlari yordamida yopildi.

Sichqonlarga teri ostiga 2 ml steril fiziologik eritma yuborildi va ularning kataklariga qaytarildi va bir kechada 37 darajaga qadar qizdirilgan slaydga joylashtirildi. To'g'ri hidratsiyani ta'minlash va infektsiyalarning oldini olish uchun sichqonlarga jarohatdan keyingi dastlabki 5 kun davomida har kuni 1-2 ml steril sho'r suv va Gentotsin (1 mg / kg) teri ostiga yuborildi (dpi). Tajribalar davomida siydik pufagi kuniga ikki marta qo'lda ekspress qilingan. Barcha hayvonlar oziq-ovqat va suvga ad libitum ruxsati bilan 12-soatlik yorug'lik-qorong'u tsiklda an'anaviy sharoitlarda joylashtirildi.

To'qimalarni yig'ish.

Belgilangan terminal vaqti 7 yoki 21 dpi nuqtalarida sichqonlarga ketamin/ksilazinning o'ldiradigan dozasi (1,5 × jarrohlik dozasi) yuborildi va 0.1 Mpfosfat-buferli fiziologik eritma (PBS; pH 7,4) bilan transkardial ravishda perfuziya qilindi. keyin 4% paraformaldegid (PFA; pH 7.4). Orqa miya shnurlari olib tashlandi, 4% PFAda 2 soat davomida fiksatsiya qilindi va keyin kechada 0.2M fosfat tamponiga (PB; pH 7.4) o'tkazildi.

Orqa miya 30% saxarozada 48 soat davomida 4 gradusda kriyoprotektoriya qilindi va keyin dorsal ustunlar yuqoriga qaragan holda shikastlanish joyi atrofida joylashgan 10 mm segmentlarga o'ralgan. Ushbu bo'limlar Tissue-Tek optimal kesish harorati muhitiga (VWR International, Radnor, PA) o'rnatilgan va quruq muzda tez muzlatilgan. Barcha orqa miya 10 mkm masofada Microm HM505E kriyostatida bo'linib, ColorFrost Plus slaydlariga (Thermoscientific, Slayd) joylashtirilgan. Waltham, MA) va keyin immuno-bo'yoq uchun ishlatilgunga qadar -20 darajada saqlanadi.

Immunogistokimyo va miqdoriy aniqlash.

Slaydlar slaydni qizdirgichda 1 soat davomida eritildi va keyin 0.1 MPBSda 3 marta yuvildi. Endogen peroksidaza faolligi slaydlarni RT da 15 daqiqa davomida metanolda suyultirilgan 6% H2O2 da inkubatsiya qilish orqali so'ndi. 0.1 M PBS da 3 marta yuvilgandan soʻng, boʻlimlar 4% BSA va 0.1% Triton X-100 bilan 0.1 M PBS da 1 marta inkubatsiya qilindi. h keyin birlamchi antikorlarning 4 daraja yoki RT da bir kechada inkubatsiyasi (1-jadval).

Slaydlar RT da 1 soat davomida tegishli biotinillangan ikkilamchi antikorlar (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) bilan inkubatsiya qilindi. Bog'langan antikorni ko'rish uchun slaydlar 1 soat davomida Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) bilan inkubatsiya qilindi va 10 daqiqa davomida ImmPACT3,3′-diaminobenzidin (DAB) yoki Vektor SG substrati (Vector Laboratories) bilan ishlab chiqilgan.

Bu qismlar 70% va 90% etanolda 2 × 2 daqiqa ketma-ket inkubatsiyalar orqali suvsizlandi, 100% etanolda 2 × 3 minut, keyin Histoclearda 3 × 3 daqiqa davom etdi va nihoyat Permount (ThermoFisher Scientific) bilan qoplangan. Miqdoriy tahlil uchun shikastlangan orqa miyadan 100 mkm masofada joylashgan har bir hayvon uchun oltita bo'lim ishlatilgan.

Immunobeled bo'limlari AxioCamdigital kamera va AxioVision 4.8.2 versiyasi (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germaniya) va 5 × ob'ektiv bilan jihozlangan Axioplan 2 tasvirlash mikroskopi yordamida tasvirlangan.

Bo'limlarning har biridagi ijobiy piksellar soni MIPAR tasvirni tahlil qilish dasturidan (MIPAR, Uortington, OH) foydalanib, har bir bo'lim uchun foiz musbat maydon ulushini hisoblash uchun hisoblangan. Har bir dog' uchun har bir hayvon uchun oltita bo'lakning o'rtacha foiz ijobiy maydoni hisoblab chiqilgan va xabar qilingan.

Statistik tahlil.

Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida xabar qilinadi. Statistik tahlil GraphPad Prism 9 Statistik Dasturi (GraphPad Software, San-Diego, CA) yordamida amalga oshirildi. Tajribalarda har bir guruhda kamida ikkita turli xil hayvonlardan kelib chiqqan 5-6 ta hayvonlar ishlatilgan. Nazorat va poli(pro-E2) film guruhlari o'rtasidagi farqni tekshirish uchun Talabaning t-testi (3, 4 va 5-rasmlar) ishlatilgan. Muhimlik p 0 dan kam yoki unga teng.05 da aniqlandi.

Qo'shimcha material

Qo'shimcha materiallar uchun PubMed Central veb-versiyasiga qarang.

MAQDAT

Mualliflar Venmin Layga sichqonchani operatsiya qilishda yordam bergani uchun minnatdorchilik bildiradilar.

Moliyalashtirish

Bu ish Kreyg H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) va Paralyzed Veteransof America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) MKG va NIH R01 (Grant NS092754) va Nyu-York shtat omurilik shikastlanishini ko'rib chiqish kengashi R2G2G institutsional ko'mak oldi. Hayvonlarning barcha ishlari NINDS Grant P30NS104177 tomonidan qo'llab-quvvatlangan Ogayo shtati universiteti Neyrologiya bo'limi jarrohlik yadrosi yordamida amalga oshirildi.

ADABIYOTLAR

(1). Omurilik shikastlanishi milliy statistik markazi. (2020) Orqa miya shikastlanishi faktlari va raqamlari bir qarashda, Birmingemdagi Alabama universiteti, Birmingem, AL.

(2). Cripps RA, Li BB, Wing P, Weerts E, MacKay J, and Brown D (2011) Travmatik orqa miya shikastlanishi epidemiologiyasi bo'yicha global xarita: shikastlanishning oldini olish uchun tirik ma'lumotlar omboriga. Orqa miya. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Orqa miya shikastlanishi - o'tmish, hozirgi va kelajak. Spinal CordMedicine jurnali 30, 85-100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ va Wilson DA (2010) Omurilik shikastlanishi bo'lgan shaxslarning tibbiy ishtirokidagi salbiy sog'liq sharoitlarini shtat bo'ylab tekshirish. J. Orqa miya med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J va Miller JH (2004) Glial chandiqdan tashqari regeneratsiya. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK va Banik NL (2013) Orqa miya shikastlanishi: Hozirgi terapiya, kelajakdagi davolanish va asosiy fan chegaralarini ko'rib chiqish. Neyroxem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, andBeyer C (2018) Estrogen omurilik shikastlanishidan keyin mahalliy yallig'lanish ifodasini va faollashuvini susaytiradi. Mol. Neyrobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Li JY, Choi HY, Ju BG va Yune TY (2018) Estrogen mikrogliya va astrositlar faollashuvini inhibe qilish orqali orqa miya shikastlanishidan keyin kelib chiqqan neyropatik og'riqni engillashtiradi. Biochim. Biofizika. Acta, Mol. Asos Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, and Banik N (2015) Sichqoncha orqa miya shikastlanishidagi nanozarracha estrogen plazma, miya omurilik suyuqligi va to'qimalarda tez yallig'lanishga qarshi ta'sirlarni keltirib chiqaradi. Neyrotravma 32 (18), 1413-1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Rey SK, and Banik NL (2010) Surunkali omurilik shikastlanishini jarohatdan keyingi estrogen bilan davolash kalamushlarda tayanch-harakat funktsiyasini yaxshilaydi. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H va Akaike A (2001) Madaniyatli kortikal neyronlarda estrogen tomonidan nongenomik antiapoptotik signal uzatish. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK va Banik NL (2003) estrogen orqa miya shikastlanishini davolashda neyroprotektiv agent sifatida. Ann. NY akad. Sci. 993,125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com