Kesilgan SARS-CoV-2 Spike Protein S1 subunitini o'z ichiga olgan adenovirus vaktsinasi sichqonlarda o'ziga xos immun reaktsiyaga olib keladi

Abstract:Samarali va xavfsiz koronavirus kasalligi 2019 (COVID-19) vaktsinasini ishlab chiqish hozirgi sharoitdan kelib chiqqan holda og'ir o'tkir respirator kasallik koronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemiyasini boshqarishda hal qiluvchi yondashuv hisoblanadi. Ushbu tadqiqotda biz kesilgan S1 oqsilini kodlay oladigan optimallashtirilgan SARS-CoV-2 spike genining (2043 bp, S1 deb ataladigan) qisqartirilgan segmentini ishlab chiqardik. Protein sichqonlarda SARS-CoV-2 ga qarshi samarali immunizatsiyaga olib kelishi mumkinligini aniqlash uchun sinovdan o'tkazildi. S1 oqsilining mavjudligi immunofluoresans va Western blotting bilan tasdiqlangan. S1 gen fragmenti (Ad-S1) bo'lgan adenovirus vaktsinasi sichqonlarga 4 hafta davomida to'rt marta mushak ichiga kiritildi. SARS-CoV-2 S1 proteini gumoral immuniteti barcha emlangan sichqonlarda namoyon boʻldi. Immunizatsiyalangan sichqonlardan olingan sarum in vitroda ajoyib antiinfeksiya faolligini ko'rsatdi. Ad-S1 bilan emlanganidan keyin sichqonlarda SARS-CoV-2 ga qarshi mustahkam gumoral immun javob kuzatildi, bu adenovirus vaktsinasi SARS-CoV-2 va boshqa genetik jihatdan farq qiluvchi vaktsinalarni ishlab chiqishda yordam berishi mumkinligini ko'rsatdi. viruslar.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Kalit so'zlar: SARS-CoV-2; vaksinalar; adenovirus vektori; S1 geni; immunitet

1.Kirish

Koronavirus kasalligi 2019 (COVID-19) koʻpincha koʻp aʼzolar yetishmovchiligi va yuqori oʻlim koʻrsatkichlari [1] bilan bogʻliq boʻlib, butun dunyo boʻylab jamoat xavfsizligiga katta tahdid soladi. 2022-yil 15-iyul holatiga koʻra, COVID{5}} pandemiyasi butun dunyo boʻylab davom etmoqda, Jahon sogʻliqni saqlash tashkiloti (JSST) maʼlumotlariga koʻra, 557.917.904 ta tasdiqlangan holatlar, jumladan, 6.358.899 oʻlim qayd etilgan. Bundan tashqari, 2022-yil 11-iyul holatiga koʻra, jami 12.130.881.147 vaktsina dozasi qoʻllanilgan. Shu sababli, yangi koronavirus (nCoV) vaktsinalarini loyihalash va ishlab chiqish katta ahamiyatga ega va global sogʻliqni saqlashning ustuvor yoʻnalishlaridan biridir. S proteini SARS-CoV-2 og'ir o'tkir respirator kasallik koronavirus 2 (SARS-CoV-2) ning xost hujayralariga kirishida asosiy omil hisoblanadi [2,3]. Protein xost retseptorlari bilan bog'lanadi va virusning xost hujayralariga muammosiz kirishiga imkon beradi [4]. N-bog'langan glikanlar trimer yuzasidan chiqib ketadi va S proteinini keng bezatadi, S oqsilining katlanishiga, gumoral immunitetga va xost hujayralari proteasini qayta ishlashga ta'sir qiladi [5]. SARS-CoV-2 S oqsili N-bog'langan glikan zichligi boshqa inson patogen koronavirusi keltirib chiqaradigan S oqsillariga qaraganda pastroqdir [6]. Shuning uchun S oqsili yuqori immunogen bo'lishi mumkin va antikorlarni neytrallashning asosiy maqsadi hisoblanadi. S proteini uchta strukturaviy domenga ega, ular orasida S1 domeni eng muhim S protein sirt antijenidir [4]. Katta rekombinant oqsillarni ishlab chiqarish qiyinligi (oqsil S ning hujayradan tashqari sohasi taxminan 1300 aminokislota) va infektsiyaning antikorga bog'liq kuchayishi (ADE) xavfi tufayli S1 (taxminan 700 aminokislotalar) va uning retseptorlari bilan bog'lanish sohasi. (RBD, 200 ga yaqin aminokislotalar) koronavirusga qarshi vaktsina uchun eng jozibali potentsial maqsadlar sifatida keng tarqalgan [7,8]. Inson adenovirusi serotipi 5 (HAdV-C5) asosiy virusologiyada gen terapiyasi va vaktsinani yuborish vektori sifatida keng qo'llaniladi [9]. HAdV-C5 tabiiy xilma-xillikka ega va ko'pchilik xostlarni parazitlashtirishi mumkin, bu hayvonlar tajribalarini rivojlantirish uchun asosdir. HAdV-C5 dan tuzilgan replikatsiya va replikatsiya nuqsonlari bo'lgan rekombinant adenovirus vektorlari vaktsinani etkazib berish va gen terapiyasida keng qo'llanilgan [9,10]. Hozirgi vaqtda adenoviruslar o'tkir respiratorli infektsiyalarga qarshi vaktsina sifatida tasdiqlangan va bunday vaksinalar, masalan, bezgak va OIVga qarshi ko'plab sinovlar o'tkazilgan-1 [9]. Ushbu maqolada biz SARS-CoV-2 inson replikatsiyasi yetishmaydigan adenovirus vektor vaktsinasi va uni tayyorlash va qo'llashni tasvirlaymiz. Ushbu tadqiqotda adenovirus vaktsinasi quyidagicha tuzilgan: vektor E1 va E3 delektsiyasi bilan inson replikatsiyasi nuqsonli adenovirus HAdV-C5, skelet plazmidi pBHGlox∆E1,3Cre bilan rekombinant adenovirus, qadoqlash hujayra liniyasi HEK293 edi, maqsadli gen SARS-CoV-2 ning kesilgan S1 protein geni edi. Vaktsinadagi S1 oqsilining ifodasi Western blot va immunofluoresans tahlillari bilan aniqlangan. Spike asosidagi vaktsina nomzodlari tomonidan qo'zg'atilgan immunitet reaktsiyalarining sifatini aniqlash uchun emlashdan keyingi antikor reaktsiyasi batafsil o'rganildi. Vaktsinaning immunitetga bo'lgan foydasi bog'lovchi antikor testi (ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili [ELISA]) va neytrallash antikorlari testi bilan baholandi. Bizning topilmalarimiz S1 oqsiliga asoslangan COVID-19 vaksinalari va davolash usullarini ishlab chiqish va baholash uchun asos bo‘lib xizmat qiladi.

2. Materiallar va usul

2.1. Hujayralar va hayvonlar

Ushbu tadqiqotda HEK293 va Vero E6 maymun buyrak hujayralari liniyalari ishlatilgan. Ikkala hujayra liniyasi Dulbekkoning o'zgartirilgan Eagle muhitida (DMEM) 2% homila sigir zardobida (FBS) va 1% penitsillin va streptomitsin bilan 37 ° C da 5% CO2 va to'yingan namlik bilan o'stirildi. Yigirmata ayol C57BL/6 sichqonlari (6-8 hafta) Zhejiang provintsiyasidagi Zhejiang hayvonlar eksperimental markazidan sotib olindi. Sichqonlar tasodifiy ikkita guruhga bo'lingan, har bir guruhda 10 sichqon bor. Bir guruh SARS-CoV-2 boshoq oqsilini (Ad{16}}S) ifodalovchi Ad5 vektori bilan immunizatsiya qilindi (100 mkl intraperitoneal in'ektsiya), ikkinchisi esa nazorat sifatida PBS (100 mkl intraperitoneal in'ektsiya) bilan. Virusning umumiy miqdori 5 × 109 VP edi Barcha sichqonlar D0/D14 mushak ichiga in'ektsiya bilan immunizatsiya qilindi [11,12]. D14 da 100 mkl periferik qon olindi, sarum ajratildi va qon to'planganidan ikki soat o'tgach ikkinchi in'ektsiya qilindi. D28 da qon retro-orbital ponksiyon orqali to'plangan va sarum ajratilgan. Bog'lovchi antikorlar har bir qon to'planganidan 3 kun o'tgach, neytrallashtiruvchi antikorlar har bir qon to'plamidan 7 kun o'tgach va sitokinlar ikkinchi qon to'plamidan 7 kundan keyin aniqlandi. Barcha sichqonlar evtanizatsiya qilindi; barcha testlar "Xitoy Xalq Respublikasining eksperimental hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha yo'riqnoma" ga qat'iy muvofiq o'tkazildi va Zhejiang Shuren universiteti axloqiy kengashi tomonidan tasdiqlangan.

2.2. Vaksinalar

Ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha SARS-CoV-2 shtammlari roziligi bilan COVID-19 bemorlaridan toʻplangan. Yuqumli kasalliklar diagnostikasi va davolash bo'yicha davlat asosiy laboratoriyasi SARS-CoV-2 ga qarshi adenovirus vaktsinasini (Vero hujayra, WuHan shtammi, GISAID raqami: EPI_ISL_415711) ishlab chiqdi va keyin vaktsina biologik xavfsizlik darajasiga (BSL) mos keladigan sharoitda ishlab chiqarilgan. Vaksina spetsifikatsiyasi 0,5 ml/doza boʻlib, tarkibida Tris, NaCl, qamish shakar, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, mutlaq etanol va SARS-CoV-2 S1 oqsili mavjud.

2.3. Rekombinant adenovirus konstruktsiyasi

SARS-CoV-2 S1 oqsillari ketma-ketligi (QRU91950.1 raqami) PubMed'dan olingan. Gen degeneratsiyasiga ko'ra, sutemizuvchilar hujayralarini ifodalash uchun mos bo'lgan optimallashtirilgan kodon nukleotidlar ketma-ketligi SARS-CoV-2 S1 oqsili tomonidan kodlangan mahsulot oqsilining aminokislotalar ketma-ketligi o'zgarishsiz qolgan degan asosga asoslanib ishlab chiqilgan. Umumiy uzunligi 2043 bp edi. 50 prekursor ketma-ketligi to'qima plazminogen faollashtiruvchisi (tPA) bilan sintez qilindi va SARS-CoV-2 S1 aminokislota 2–688 va tPA prekursor ketma-ketligini kodlovchi ketma-ketlik bog'landi. Boshlanish kodoni oldiga Kozak ketma-ketligi va SpeI cheklash joyi qo'shildi va XbaI cheklash joyi tugatish kodonidan keyin qo'shildi. Yuqoridagi genlarning nukleotidlar ketma-ketligi sintetik genning klonlangan plazmidini olish uchun Sangon Biotech tomonidan pUC18 ga sintez qilindi va klonlandi. Sintezlangan S1 gen ketma-ketligi va vektor pDC316 SpeI va XbaI cheklash endonukleazlari bilan hazm qilindi. Maqsadli fragment va vektor jeldan olindi va plazmid hosil qilish uchun ulandi. SARS-CoV-2 plazmidi AdMax adenovirus tizimi skelet plazmidi pBHGloxd∆E1 va 3Cre bilan HEK293 hujayralarini birgalikda transfeksiya qilish orqali qadoqlandi. Birlamchi virus eritmasi qayta-qayta muzlatish-eritish va santrifüjlashdan so'ng olingan va blyashka tozalashdan keyin virus kuchaytirilgan va madaniyatlangan.

Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Adenovirus titrini aniqlash

Sog‘lom HEK293 xujayralari tanlab olindi va 5.{2}} × 105 hujayra/ml hujayra suspenziyasini tayyorlash uchun qayta suspenziya qilindi, u 24-quduq plastinkasiga (1 ml/quduqqa) ekilgan. ) va 5% CO2 muhitida 37 ◦C da yetishtiriladi. Namuna ketma-ket o'n marta suyultirildi va suyultirilgan namuna (0,1 ml) 1{27}}-5 dan 1{40}}-8 hujayradan iborat bo'lgan 24-quduq plastinkasiga emildi. . Keyin plitalar 48 soat davomida 5% CO2 bilan 37 ◦C da infektsiyaga duchor bo'ldi. Keyinchalik, madaniy muhit olib tashlandi, oldindan sovutilgan metanol (0,5 ml) qo'shildi va namunalar 20 daqiqa davomida -20 ◦C da o'rnatildi. Fiksatsiyadan so'ng, namunalar fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS) bilan yuviladi va 1 soat davomida 37 ° C da 1% sigir sarum albumini (BSA, 0,2 ml) bilan bloklanadi. Keyinchalik, birlamchi (Sichqoncha Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) va ikkilamchi (Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) antikorlari qo'shildi va PBS 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. yuvish uchun ishlatilgan. Inkubatsiyadan so'ng, yangi tayyorlangan ishchi eritma (0,2 ml) qo'shildi va xona haroratida 5-10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin ishchi eritma tashlandi, namunalar PBS bilan yuvildi va yana PBS (1 ml) qo'shildi. Mikroskopik maydondagi ijobiy hujayralarning o'rtacha soni (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) hisoblab chiqildi, bu erda ko'rish sohasida 5-50 musbat hujayradan iborat gradient tanlangan va hisoblash uchun kamida beshta maydon tasodifiy tanlangan. . Quduq plitasining 24-har bir qudug'idagi ko'rish maydonlari soni hisoblab chiqilgan. Keyin virus titri quyidagi formula (1) bo'yicha hisoblab chiqilgan:

2.5. Haqiqiy vaqtda PCR

Virusli infektsiyadan keyin HEK293 hujayra mRNK ifodasini aniqlash uchun biz TRIzol operatsion ko'rsatmalariga (Invitrogen, Waltham, MA, AQSh) muvofiq oraliq RNKni ajratib oldik. Jami RNK TRIzol yordamida ekstraksiya qilindi va qoldiq DNKni yo'q qilish uchun RQ1 RNazsiz DNase I (Promega, Madison, WI, AQSh) bilan qayta ishlandi. Komplementar DNK (cDNK) ekstraksiya qilingan RNKning teskari transkripsiyasi yoʻli bilan PrimerScript™ RT reagent toʻplamidan gDNK Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Yaponiya) yordamida olingan. DNK fragmentlari maqsadli genning (S1) maxsus primerlari P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) va P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​bilan yaratilgan. Gen ichki nazorat (GAPHD) sifatida P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) va P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) primerlari bilan kuchaytirildi.

2.6. Western Blot

Hujayra lizati va supernatant natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) bilan ajratildi va keyin poliviniliden ftorid (PVDF) membranalariga o'tkazildi. Blotlar Western blot tasvirlash uskunasi (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSH) yordamida tasvirlangan. Qisqacha aytganda, membranalar TBST ga o'tkazildi (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0.5 mL], 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween. -20) 5% yog'siz quruq sut kukuni bilan va xona haroratida rangsizlantiruvchi shaykerda 1 soat davomida chayqatiladi. Tajriba va nazorat guruhlari membranalari yopishtiruvchi eritmadan olib tashlandi va asosiy antikor bilan inkubatsiya qilindi: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antikor (1:5000, kat. #40591- T62, Sino Biological, Pekin, Xitoy)] xona haroratida. Birlamchi antikorlar chayqatildi va 4 ◦C da rangsizlantiruvchi shakerda bir kechada inkubatsiya qilindi. Blot TBST eritmasi bilan yuvildi va ikkilamchi antikor [echkining quyonga qarshi immunoglobulini G (IgG) H&L (HRP) (1:10,000, kat. #ab6721, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya)] bilan 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Yuvib bo'lgandan so'ng, dog'lar LumiBest ECL Substrate eritmasi to'plami (kat. #4AW011-100, 4A Biotech) bilan 1 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin tasvirlagichda kuzatildi.

2.7. Immunofloressensiya tahlili

HEK293 xujayralari (3 × 106/quduq) 12-quduq plitalariga ekilgan. 48 soatdan keyin hujayralar S1 genini (Ad-S1) o'z ichiga olgan adenovirus bilan kasallangan. 48 soatdan keyin muhit aspiratsiya qilindi va hujayralar bir marta 2% BSA o'z ichiga olgan PBS bilan yuvildi va 15 daqiqa davomida -20 ° C da 15 daqiqa davomida oldindan sovutilgan metanol bilan fiksatsiya qilindi. PBSda 2% BSA bilan uchta yuvishdan so'ng, hujayralar 10 daqiqa davomida 0,5% Triton X-100 bilan o'tkazuvchanlikka ega bo'ldi. Keyin hujayralar 2 ml 2% BSA bilan 1 soat davomida bloklandi, blokirovka qiluvchi eritma tashlandi va hujayralar PBS bilan uch marta yuvildi. Keyinchalik, har bir quduqqa 2 ml asosiy antikor [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antikor (1:2000, kat. №40591-T62, Sino Biological)] qo'shildi va xona haroratida 1 soat yoki kechasi 4 ◦C davomida inkubatsiya qilinadi. Keyin namuna uch marta 2% BSA bilan 5 daqiqa davomida yuviladi. Keyin har bir quduqqa 2 ml ikkilamchi antikor [echkiga qarshi quyon IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. #550037, ZenBio)] qo'shildi va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, namunalar har bir chayishda 5 daqiqa davomida 2% BSA bilan uch marta yuvildi. Har bir quduqqa 40,6-diamidino{45}}fenilindol (DAPI) eritmasi (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, kat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, AQSh) qo‘shildi. va qorong'ida 10 daqiqa davomida reaksiyaga kirishdi. Tahlil EVOS™ M7000 tasvirlash tizimi (kat. #AMF7000, Invitrogen) yordamida kuzatildi.

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S proteini (1 µg/ml) kecha davomida 96-quduq plastinkalarida (100 µL/quduq) 0 bilan qoplangan. 05 M bikarbonat buferi. PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween-20 bilan yuvilgandan so'ng, 1000 ml) besh marta, blokirovka qiluvchi eritma qo'shildi va 37 ◦C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Sarum namunasi suyultirildi va har bir quduqqa qo'shildi (100 µL/quduq). 37 ◦C da 1 soat inkubatsiyadan so'ng namunalar besh marta PBST bilan yuvildi. Birlamchi antikor [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antikor (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] qo'shildi va 1 soat davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra namunalar besh marta PBST bilan yuvilgan, so'ngra 37 ◦C da 1 soat davomida xren peroksidaza bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikor [echkiga qarshi quyon IgG H&L (HRP) (1:10,000, kat. #ab6721, abcam)] va beshta inkubatsiya qilingan. PBST bilan yuviladi. 3, 30, 5 va 50-tetrametilbifenil angidridni 5 minut qo‘shgandan so‘ng reaksiya 2 M sulfat kislota bilan to‘xtatildi. Optik zichlik 450 nm va 630 nm da ferment yorlig'i (Molecular Devices, SpectraMax 190) tomonidan o'lchandi va keyin standart egri chiziqqa o'rnatildi.

Cistanche tubulosa foydalari- immunitet tizimini mustahkamlash

2.9. Sitokinlarni aniqlash 

Plastinka (kat. #T-k15048D-1, MSD) 150 mkL/quduq yuvish buferi bilan uch marta yuvildi va har bir quduqqa 50 mkl tayyorlangan namuna qo‘shildi. Keyin plastinka yopishtiruvchi plastinka muhri bilan yopilgan va xona haroratida 2 soat davomida chayqalgan holda inkübe qilingan. Keyin plastinka uch marta 150 µL/quduq yuvish buferi bilan yuvildi va har bir quduqqa 25 µL aniqlovchi antikor eritmasi qo‘shildi. Plastinka yana yopilgan va xona haroratida 2 soat chayqalgan holda inkubatsiya qilingan. Keyinchalik, plastinka kamida 150 µL/quduq yuvish buferi bilan uch marta yuvildi; Har bir quduqqa 150 µL 2 × Read bufer T (MSD) qo‘shildi va plastinka MSD asbobida tahlil qilindi.

2.10. Neytrallashtiruvchi antikor

2.10.1. Pseudovirus neytrallash tahlili

Sichqoncha zardobini neytrallash faolligi vesikulyar stomatit virusi psevdovirus tizimi (VSV) yordamida sinovdan o'tkazildi. Sarum 56 ◦C da {0}},5 soat davomida suv hammomida inaktivatsiya qilindi va keyin kerakli diapazonga ketma-ket suyultirildi. HEK293 xujayralari 96-quduq plastinkasiga qo'yildi. Suyultirilgan sarum 1:1 nisbatda 200 CCID50 (hujayra madaniyatining 50 foizini yuqtirishi mumkin bo'lgan virus dozasi)/100 mkl virus suspenziyasi bilan aralashtirildi va CO2 inkubatoriga (37 ± 1 ◦C) joylashtirildi. 2 soat. Keyin har bir quduqqa 0,5% penitsillin-streptomitsin qo‘sh antikorini o‘z ichiga olgan 100 mkL virusga xizmat ko‘rsatish eritmasi qo‘shildi va neytrallangan aralash har bir quduqqa 100 mkL bo‘lgan hujayralarni o‘z ichiga olgan 96-quduq plastinkasiga ekildi, bunda ikkita takroriy quduq mavjud. har bir suyultirish. Shu bilan birga, normal hujayra nazorati o'rnatildi va hujayralar CO2 inkubatorida (37 ± 1 ◦C) 96 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin 200 CCID50/100 µL virus eritmasi 10-1~10-3 gacha suyultirildi. 96-Quduq plastinkasidagi hujayra madaniyati muhiti tashlab yuborildi, har bir quduqqa 150 mkl virusni saqlash eritmasi qo'shildi va virus eritmasi suyultirilishi 10-1~{{33} konsentratsiyada emlandi. } 96-quduq plitasining quduqlariga (har bir quduq uchun 50 µL). Har bir suyultirish 8 ta quduqda takrorlandi; bir vaqtning o'zida oddiy hujayra nazorati o'rnatildi, undan keyin 96 soat davomida madaniyat o'tkazildi. Hujayra CPEdagi o'zgarishlar teskari mikroskop ostida kuzatildi. Oddiy hujayra nazoratida sitopatik o'zgarishlar bo'lmasligi kerak va ijobiy nazoratda CPE o'zgarishi bo'lishi kerak. Neytrallashning so'nggi nuqtalari (zardobdagi suyultirishlar logarifmlarga aylantirilgan) CPEni kuzatish orqali hisoblab chiqilgan. Seronegativ/ijobiy mezon ijobiy/salbiy mezon sifatida 1:12 edi,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Jonli neytrallash tahlili

Sichqoncha zardobini neytrallash faolligi jonli neytrallash testi bilan baholandi. Suyultirilgan sarum SARS-CoV-2 bilan aralashtirildi va 37 ◦C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Aralash Vero E6 hujayralarini yuqtirish uchun 96-quduq plastinkasiga qo'shildi. 37 ◦C da 72- soat inkubatsiyadan so'ng, virusning sitopatik ta'siri (CPE) ×40 kattalashtirish ostida kuzatildi va neytrallash titri (virus infektsiyasini zararsizlantirish uchun zarur bo'lgan 50% sarum suyultirishning o'zaro nisbati) hisoblab chiqildi. Yuqoridagi protseduralarning barchasi 3-darajali biologik xavfsizlik muhitida amalga oshirildi.

2.11. Statistik tahlil

Statistik tahlillar SPSS 26 dan foydalangan holda ikki namunali t-testi orqali amalga oshirildi. p-qiymatlari 0.05 dan kam yoki unga teng bo'lsa, ahamiyatli deb topildi. Markaziy tendentsiya geometrik o'rtacha titr (GMT) bilan o'lchandi.

3. Natijalar

3.1. Rekombinant adenovirus konstruktsiyasi

To'g'ri kiritilgan pAdeno-CMV-S1 rekombinant adenovirus shuttle plazmidi olindi; uning struktura diagrammasi 1-rasmda ko'rsatilgan. Rekombinant adenovirus tarkibida E1/E3 hududi bo'lmagan HAdV-C5 genomi mavjud edi. HEK293 hujayralarida shuttle plazmid va sitoskeleton plazmid transfeksiyasi natijasida olingan rekombinant adenovirus vektorining sxematik diagrammasi 1-rasmda ko'rsatilgan.

3.2. Rekombinant adenovirusning xarakteristikasi

Nishon genni o'z ichiga olgan rekombinant plazmid PCR orqali aniqlandi (gel elektroforez natijalari uchun 2A-rasmga qarang). Bu takroriy tajriba edi. Primer ketma-ketliklar MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag va S1-R acaataagtagggactgggtc edi va ketma-ketlik dizaynga mos kelishini tasdiqladi. Hujayralardagi SARS-CoV-2 S1 ifodasi Western blotting (2B-rasm) va bilvosita immunofluoresans (2C-rasm) yordamida aniqlandi. Tarmoq rangi (~ 75 kDa) Western blotting tomonidan aniqlandi va kutilgan tarmoqli pozitsiyasiga mos keldi. Transkripsiya darajasida S1 ning in vitro ifodasi PT-PCR tomonidan aniqlandi. Natijalar HEK{12}} hujayralarida S1 mRNK ifodasi nazorat guruhidagiga qaraganda ancha yuqori ekanligini ko‘rsatdi.

Shakl 1. Rekombinant adenovirus vaktsinasini qurish va eksperimental strategiya. (A) pAdeno-CMV-S1 maqsadli gen S1ni o'z ichiga olgan rekombinant adenovirus plazmididir. pBHGlox∆E1,3Cre - adenovirus skelet plazmidi. pBHGlox∆E1,3Cre va pAdeno-CMV-S1 QIAGEN plazmid ekstraksiya to'plami (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Pekin, Xitoy) bilan ekstraksiya qilindi. Transfeksiyadan bir kun oldin HEK293 xujayralari 25 sm2 hujayra madaniyati kolbasiga o'tkazildi. Madaniyat muhiti antibiotiklarsiz 5% FBS o'z ichiga olgan DMEM edi. Ikkinchi kuni hujayralarning 60-80% tanlab olindi va hujayralarga transfeksiya eritmasi qo'shildi. 7 kunlik transfeksiyadan so'ng hujayralar qirib tashlandi, santrifüj qilindi, supernatant tashlandi va hujayralar PBS bilan reanimatsiya qilindi. Hujayralar −80 ◦C va 37 ◦C da qayta-qayta muzlatilgan-eritilgan. Santrifüjdan so'ng, supernatantda asosiy virus eritmasi mavjud edi. Rekombinant adenovirus shtammi tozalandi, kuchaytirildi va keyingi ishlovdan so'ng olindi va Ad-S1 deb belgilandi. Vaktsina keyingi tadqiqotlar uchun sichqonlarga mushak ichiga kiritildi. (B) Emlash va qon olishning tasvirlangan vaqt shkalasi.

3.3. Adenovirus titri

Ushbu tajribada beshta mikroskopik maydonda o'rtacha oltita musbat hujayra hisoblangan va quduqdagi virus 108 marta suyultirilgan. Materiallar va usul bo'limida tavsiflangan formulaga asoslanib, adenovirus titri 4,74 × 1011 blyashka hosil qiluvchi birlik (pfu) / ml ni tashkil etdi (2D-rasm).

3.4. Emlashdan keyingi hujayra immuniteti

Sinov davrida sarum sitokinlarida (p 0.05 dan kam yoki teng) statistik jihatdan muhim o'zgarishlar bo'ldi, bu asosan keratinotsitlar kimyoatrakanti/inson o'sishi bilan boshqariladigan onkogen (KC/GRO) kontsentratsiyasini ko'rsatdi. kamaydi va IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} konsentrasiyalari kamayadi. } va TNF- ortdi, IL-6 kontsentratsiyasi sezilarli darajada o'zgarmadi (3-rasm).

2-rasm. Rekombinant HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 oqsilini aniqlash va adenovirus titrini aniqlash. (A) S1 maqsadli gen bilan rekombinant plazmidni PCR bilan aniqlash. (B) SARS-CoV ning Western blot aniqlanishi-2. Eksponensial o'sish HEK293 hujayralari 48 soat davomida SARS-CoV-2 bilan yuqtirildi, so'ngra hujayra oqsili ekstraksiya qilindi va SDS-PAGE orqali ajratildi. SARS-CoV-2 ifodasi quyonlarga qarshi echki IgG bilan Western blotting bilan tasdiqlangan. (C) Ad-S1 (yashil) bilan zararlangan HEK{18}} hujayralarining immunofluoresans mikroskopiyasi. Yadrolarni bo'yash uchun hujayralar 40, 6-diamidino- 2-fenilindol (DAPI) bilan bo'yalgan. Masshtab satri 1000 mkm. (D) Blyashka tahlili o'lchash uchun ishlatilgan. Mikrografiklar 10-5, 10-6, 10-7 va 10-8 suyultirish (chapdan oʻngga).

Shakl 3. Ad-S1 1/2-toifa sitokinlarning, 1-toifa interferonlarning va boshqa sitokinlarning plazma darajasini o'zgartirgan. Natijalar birinchi emlashdan 7 kundan keyin sichqonlardan qon olish orqali aniqlandi. Ma'lumotlar quti va mo'ylovli scatterplots sifatida taqdim etiladi. Har bir doira bitta shaxsni ifodalaydi. p-qiymatlari ikki namunali t-test yordamida hisoblangan.

3.5. Anti-SARS-CoV-2 S1 antikorlarini immunizatsiyadan keyin aniqlash

Elishay aniqlashicha, birinchi va ikkinchi Ad-S1 yuborilgan sichqonlarda SARS-CoV-2-o'ziga xos antikorlari mavjud, ammo nazorat adenovirus kapsidi yoki PBS eritmasi (Ad/PBS) kiritilgan sichqonlarda emas (4A-rasm). IgG titrlari 1:210 va 1:212 boʻlgan Ad-S{10}}vaksinatsiyalangan sichqonlarda mos ravishda birinchi va ikkinchi emlashdan ikki hafta oʻtib aniqlandi. Emlashdan keyingi 28 kun ichida suyultirish titri (D28, GMT 2297.4) D14 (GMT 378.9)dagidan 6.1-baravar yuqori edi.

Shakl 4. Ad-S1 sichqonlarda antikorlarning yuqori titrlarini (A) va neytrallash faolligini (B, C) keltirib chiqardi. (A) Ad-S immunizatsiyalangan sichqonlardan SARS-CoV-2-maxsus IgG ning ELISA1-. (B) Ad-S1-immunlangan sichqonlarning zardobidagi psevdovirus faolligini tahlil qilish. (C) Ad-S1-immunlangan sichqonlar zardobining neytrallash faolligini tahlil qilish

3.6. Neytrallashtiruvchi antikor tahlili

Vero E6 hujayralarining SARS-CoV-2 sinovi immunizatsiya qilingan sichqon zardobida neytrallashtiruvchi faollikni aniqlash imkonini berdi (4B, C-rasm). SARS-CoV{{1{27}}}} ga qarshi Ad-S{7}}immunlangan Vero E6 hujayralarining D14 va D28 neytrallanish titrlari mos ravishda 1:24,3 va 1:26,3 ni tashkil etdi. Pseudovirus tahlili jonli virus tahlili natijalariga o'xshash natijalarni berdi, neytrallash titrlari mos ravishda D14 va D28 da 1:28,1 va 1:29,6 gacha. D28 psevdovirusini zararsizlantirish titri (GMT 769.0) D14 (GMT 283.7) dan 2.7-baravar yuqori edi.

4. Munozara

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 gacha<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Ushbu tadqiqotda biz SARS-CoV-2 S1 subunitini o'z ichiga olgan rekombinant adenovirus SARS-CoV-2 vaktsinasini yaratdik va uni Ad-S1 deb belgiladik. Marketing uchun tasdiqlangan CanSinoBIO kabi [28], biz ushbu vaksinada HAdV-C5 dan foydalandik. Adenovirus rekombinant gen terapiyasida va vaktsina vektori sifatida keng qo'llaniladi. Biroq, HAdV-C5 ning seropozitiv darajasi oddiy populyatsiyada 75-80% ni tashkil qiladi [29]. Bu shuni anglatadiki, HAdV-C5 vektorlariga qarshi saqlashdan oldingi immunitet emlashdan kelib chiqadigan immunitetni sezilarli darajada kamaytiradi. Birlashgan Qirollikdagi Oksford universitetida ishlab chiqilgan ChAdOx1 nCoV-19 shimpanze adenovirus vektoridan foydalanadi, aksincha, odamlarda seropozitivlik darajasi pastroq va ijobiy bo'lsa, odatda pastroq zardobdagi antikor titrini ko'rsatadi [30] . Shu sababli, adenovirusga qarshi emlashning himoya samaradorligini oshirish uchun oldindan mavjud bo'lgan immunitetdan qochib qutula oladigan adenovirus vektorlarini o'rganish mumkin. Ushbu tadqiqotda emlashdan oldin va keyin sichqonlarning sarum holati Elishay va neytrallash testlari bilan aniqlandi va emlashga nomzodlar uchun gumoral immunitetni tasdiqladi. Sichqonlarga vaktsinani mushak ichiga yuborishdan keyin ishlab chiqarilgan sarum Vero E6 hujayralarini in vitro SARS-CoV-2 infektsiyasidan samarali himoya qildi (4-rasm). Shuningdek, biz ikkinchi emlashdan keyin sichqonlarda kuchliroq immun javob va yaxshi himoyani aniqladik (4-rasm). Bizning eksperimental natijalarimiz asosiy eksperimental natijalarga o'xshaydi.

SARS-CoV-2 tadqiqoti davom etar ekan, bir nechta tadqiqotlar SARS-CoV-2 infektsiyasidan kelib chiqqan sitokin bo'roni T-hujayra ishlab chiqarishga ta'sir qilishi va bemorlarga uzoq muddatli immunitetni saqlab qolishini qiyinlashtirishi mumkinligini ko'rsatdi. SARS-CoV-2 [31]. Shuning uchun, Ad-S1 sichqonlarda T-hujayra vositachiligidagi immunitetni keltirib chiqarishi mumkinligini aniqlash kerak. Natijalarimiz Ad-S1 guruhida IFN- va IL{14}} kontsentratsiyasining ortishi va IL{15}} konsentratsiyasining kamayganligini ko'rsatdi, bu sichqonlarda vaktsina tufayli Th1 hujayralarining omon qolishi va o'sishini ko'rsatadi. Eksperimental guruhda Th1 hujayralari tomonidan IL-12, IL-10 va TNF sekretsiyasi biroz oshdi. Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, Ad-S1 sichqonlarda Th1-tarafsil T-hujayra javobini samarali ravishda qo'zg'atgan [32]. IL-5 ortishi Th2 hujayralari ham immun javobda ishtirok etishini va ma'lum ta'sir ko'rsatishini ko'rsatdi. Eksperimental guruhdagi KC/GRO kontsentratsiyasi PBS nazorat guruhi bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaydi, bu yallig'lanish reaktsiyasini bostirgan va vaktsina yon ta'sirini biroz nazorat qilish imkonini beruvchi neytrofil kimyotaksisining kamayishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Bu immunitet tanqisligi bo'lgan odamlar uchun, masalan, keksalar yoki kimyoterapiya o'tayotgan bemorlar uchun foydali bo'ladi. Li M. va boshqalar. [29] vektor sifatida Ad68 dan foydalangan holda adenovirus vaktsinasini ishlab chiqdi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, SARS-CoV-2 ning in vivo neytrallashtiruvchi faolligi BALB/c sichqonlari mushak ichiga immunizatsiya qilinganidan keyin ikki hafta ichida aniqlanishi va keyin o'sishda davom etishi va neytrallash antikor titri (PRNT ID50) sakkizda 957,3 ga yetganini ko'rsatdi. haftalar. Ayni paytda, Liu J. va boshqalarni o'rganishda. [33], vektor sifatida AdC6 va AdC68 ishlatadigan vaktsinalar ishlab chiqilgan; immunizatsiyadan keyin ham bog'lovchi, ham neytrallashtiruvchi antikor reaktsiyalari dozadan 14 kun o'tgach hosil bo'ldi, IgG titri 7108 (geometrik o'rtacha titr, GMT; AdC6) va 5489 (GMT, AdC68). Pseudovirus neytrallash tahlilining neytrallash titri 50 (NT50) 125 (GMT, AdC6) va 67 (GMT, AdC68) edi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Ushbu tadqiqotda Ad-S1 bilan emlangan sichqonlarda IgG titrlari mos ravishda 1:1010 va 1:122 bo'lib, birinchi va ikkinchi emlashdan ikki hafta o'tib Elishay tomonidan aniqlangan. Ad-s1 ning suyultirish titri emlashdan keyin 14 kun ichida 378,9 (GMT) va 28 kundan keyin 2297,4 (GMT) ni tashkil etdi. Neytrallash antikorlari testida Ad-S1 bilan immunizatsiya qilingan Vero E6 hujayralari in vitro jonli SARS-CoV-2 virusiga qarshi D14 va D28 da mos ravishda 1:24,3 va 1:26,3 neytrallanishni ko'rsatdi. D14 va D28 da psevdovirusning neytrallash titrlari mos ravishda 283,7 (GMT) va 769,0 (GMT) ni tashkil etdi. Shunday qilib, ushbu tadqiqotdagi vaktsina sichqoncha modelidagi immun javob nuqtai nazaridan samaraliroq bo'ldi.

Eksperimental sharoitlarning cheklanganligi sababli biz eksperimental sichqonlarning taloq immun hujayralarini ferment bilan bog'langan immunosorbent nuqta (ELISpot) tahlilini o'tkazmadik. Bundan tashqari, sichqonlarda SARS-CoV-2 hujumidan himoya qilish tajribalarini jismoniy himoya laboratoriyasining cheklovlari tufayli amalga oshirib bo'lmadi. Biroq, biz vaktsina sichqoncha modellarida yuqori samaradorlikka ega ekanligini va ideal zaxira vaktsina shtammi sifatida foydalanish mumkinligini aniqladik. Bundan tashqari, SARS-CoV-2 ga qarshi vaksinaga nomzodlarning immunogenligi, xavfsizligi va samaradorligi qoʻshimcha hayvonlar modellarida (masalan, quyonlar, primatlar, rakunlar, itlar) tekshirilishi kerak, chunki sichqoncha modellari inson immunologik xususiyatlarini toʻliq takrorlamasligi mumkin. Xususiyatlari.

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

5. Xulosalar

Adenovirusga qarshi vaktsina bo'yicha klinikadan oldingi tadqiqotlarimizdan olingan ma'lumotlar vaktsinaning etarli darajada xavfsizligi va samaradorligini ko'rsatdi. Shuning uchun bu SARS-CoV-2 infektsiyasiga qarshi istiqbolli va amalga oshirilishi mumkin bo'lgan profilaktik vaktsina bo'lishi mumkin.

Ma'lumotnomalar

1. Trougakos, IP; Stamatelopulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastrit, E.; Pavlakis, GN; Dimopulos, MA SARS-CoV-2ning hayot aylanishi, patofiziologiyasi va COVID-19 klinik asoratlariga qaratilgan ratsionallashtirilgan davolash usullari haqida tushuncha. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, oyning TS geni: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 yangi koronavirus spike oqsili. J. Klin. Patol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheynin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. SARS-CoV-2 Spike S1 intranazal ma'muriyati tomonidan sichqonlarda o'pka saratonining regressiyasi. Saraton 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Qadam, SB; Suxramani, GS; Bishnoy, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemiya koronavirusi: Molekulyar va strukturaviy tushunchalar. J. Asosiy mikrobiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Koronavirus SARS-CoV-2 spike oqsilining strukturaviy xususiyatlari: Emlash maqsadlari. Hayot fanlari. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Devorlar, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, V.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glikan qalqoni va kriyoelektron mikroskopda kuzatilgan koronavirus boshoq oqsilining epitopini niqoblash. Nat. Tarkibi. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Vang, Y.; Vang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 COVID-19 subunit vaksina antijeni sifatida RBDdan ustundir. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Teoharidlar, TC; Conti, P. SARS-CoV-2 spike oqsilidan xabardor bo'ling: ko'zga ko'rinadiganidan ham ko'proq narsa bor. J. Biol. Regul. Homeost. Agentlar 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Vang, V.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, V. Inson adenovirusi turi 5 yoki Yaqin Sharq respirator sindromi koronavirusining spike oqsilini tashuvchi 41 vektorga asoslangan vaktsinalar bilan bitta immunizatsiya natijasida yuzaga kelgan sichqonlarda tizimli va shilliq qavat immuniteti. Immunologiya 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Terapevtik yondashuvlar uchun zamonaviy inson adenovirus vektorologiyasi. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. COVID-19 vaktsinalarining samaradorligi va xavfsizligi: tizimli tahlil. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Chji 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Klemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, Bosh vazir; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabo, SL; Bhorat, QE; va boshqalar. SARS-CoV-2 ga qarshi ChAdOx1 nCoV-19 vaktsinasining (AZD1222) xavfsizligi va samaradorligi: Braziliya, Janubiy Afrika va Buyuk Britaniyada to'rtta randomizatsiyalangan nazorat ostida sinovlarning oraliq tahlili. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Chjan, X.; Chjan, Y.; Chen, K. Tasdiqlangan COVID{1}} vaktsinalarining turli mutantlarga qarshi himoya samaradorligi tahlili. Old. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, tibbiyot fanlari doktori; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Guner, HR; Azap, A.; Axan, S.; Kose, ¸S.; Erdinch, F.; Akalin, EH; Tabak, Ö.F.; va boshqalar. Faollashtirilgan butun virionli SARS-CoV-2 vaktsinasining (CoronaVac) samaradorligi va xavfsizligi: Turkiyada ikki marta ko'r, randomizatsiyalangan, platsebo-nazorat qilinadigan, 3-bosqich sinovining oraliq natijalari. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Sya, S.; Chjan, Y.; Vang, Y.; Vang, X.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, V.; Vu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Faollashtirilgan SARS-CoV -2 vaktsinasining xavfsizligi va immunogenligi, BBIBP-CorV: randomizatsiyalangan, ikki marta ko'r, platsebo-nazorat qilinadigan, 1/2 fazali sinov. Lancet infektsiyasi. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Vang, J.; U, P.; Li, C.; Fang, X.; Vang, C.; Chjao, X.; Huang, E.; va boshqalar. Kattalardagi COVID-19 ga qarshi rekombinant tandem-takroriy dimerik RBD asosidagi oqsil subunit vaktsinasining (ZF2001) xavfsizligi va immunogenligi: ikkita randomizatsiyalangan, ikki marta koʻr, platsebo-nazorat qilinadigan, 1 va 2-bosqich sinovlari. Lancet infektsiyasi. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Hindistonning DNK COVID vaktsinasi dunyoda birinchi bo'lib ko'proq keladi. Tabiat 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Vayskopf, D.; Ramires, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sazerlend, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; va boshqalar. T-hujayralarining SARS-CoV-2 Koronavirusiga COVID-19 bilan kasallangan odamlarda va ta'sir etmagan shaxslarda javob berish maqsadlari. Hujayra 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Quyosh, V.; Deng, Y.; Bao, L.; Chju, Q.; Chjan X.; Chjen Y.; Geng, C.; va boshqalar. SARS-CoVga qarshi kuchli zararsizlantiruvchi antikorlar-2 Rekonvalesent bemorlarning B hujayralarining yuqori o'tkazuvchanlikdagi bir hujayrali ketma-ketligi bilan aniqlangan. Hujayra 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 vaktsinalari: holat hisoboti. Immunitet 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Syao, X.; Yao, Y.; Liu, X.; Xu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; va boshqalar. Yangi DNK va oqsil birikmasi COVID-19 vaktsina formulasi rezus-makakalarda SARS-CoV-2 dan toʻliq himoya qiladi. Emerg. Mikroblar yuqtiradi. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; U, Y.; Chjou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. SARS-CoV ning boshoq oqsili – vaktsina va terapevtik rivojlanish uchun maqsad. Nat. Rev. Mikrobiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. SARS-CoV-2 ning N-terminal kesilgan nukleokapsid oqsili faollashtirilgan SARS-CoV-2 ning immunogenligini baholashda butun nukleokapsid oqsilidan yaxshiroq serologik marker sifatida. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greni, AJ; Loes, AN; Gentlar, LE; Krouford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD. SARS-CoV-2 mRNK-1273 vaktsinasi ko'proq RBDga yo'naltirilgan neytrallanishni keltirib chiqaradi, ammo RBD ichida kengroq antikorlarni bog'laydi. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RCD; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; va boshqalar. O'tkir SARS-CoV-2 infektsiyasiga uyali va serologik javoblarni baholash retseptorlarni bog'lovchi sohaning funktsional ahamiyatini ko'rsatadi. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. U, Y.; Chjou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, V.; Farzan, M.; Jiang, S. SARS-CoV spike oqsilining retseptorlari bilan bog'langan domeni juda kuchli neytrallashtiruvchi antikorlarni keltirib chiqaradi: subunit vaktsinani ishlab chiqish uchun ta'sir. Biokimyo. Biofizika. Res. Kommun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Vu, K.; Li, X.; Chen, V.; Qin, Y.; va boshqalar. COVID-19 pandemiyasi davrida virusli vektorli vaktsinani ishlab chiqish va qoʻllash. Mikroorganizmlar 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Chju, FK; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Xou, LH; Li, JX; Yang, BF; Vang, L.; Vang, WJ; va boshqalar. 18 yosh va undan katta yoshdagi sog'lom kattalardagi rekombinant adenovirus turi-5-vektorli COVID-19 vaktsinasining immunogenligi va xavfsizligi: randomizatsiyalangan, ikki marta ko'r, platsebo-nazorat qilinadigan, 2-bosqich sinovi. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Chjou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, X.; Vang, P.; va boshqalar. Shimpanze adenovirusiga asoslangan vaktsina bilan bir dozali emlash SARS-CoV-2 infektsiyasiga qarshi barqaror va himoyalangan immunitetni keltirib chiqaradi. Old. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Chjou, D. Yangi vaktsina vektorlarini ishlab chiqish: Shimpanze adenoviral vektorlari. Hum. Vaktsinalar Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Bukau, J.; Fermer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechokka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; va boshqalar. Bcl-6-COVIDda T follikulyar yordamchi hujayralar va germinal markazlarni ekspressiya qilish-19. Hujayra 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Rixter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- va IL{2}} in vivo hosil qilingan Th17 ni Th1/Th17 hujayralariga aylantirish uchun sinergiyalanadi. Yevro. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Chjuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Vang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; va boshqalar. Shimpanze adenoviral vektorlari bilan heterolog prime-boost immunizatsiya SARS-CoV-2 infektsiyasiga qarshi kuchli va himoya immunitetni keltirib chiqaradi. Hujayra diski. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]