Arabidopsisdagi RPX1 ning inaktivatsiyasi homoterpen DMNTning to'planishi orqali Plutella Xylostella ga qarshilik ko'rsatadi.

Abstrakt

Lepidopteran ekin zararkunandasi Plutella xylostella Brassica yetishtirishda jiddiy cheklovlarni keltirib chiqaradi. Bu erda biz RPX1 ning Arabidopsis thalianadagi ushbu zararkunandaga qarshi turishdagi yangi roli (P. xylostella ga qarshilik) haqida xabar beramiz. rpx1-1 mutant P. xylostella lichinkalarini qaytaradi va rpx1-1 mutant bilan oziqlanishi lichinkalarning oʻrta ichakchasidagi peritrofik matritsa tuzilishiga jiddiy zarar yetkazadi va shu bilan lichinkalarning oʻsishi va pupatsiyasiga salbiy taʼsir qiladi. Ushbu qarshilik himoya birikmalarining, shu jumladan monoterpen (3E)-4,8-dimetil-1,3,7-nonatrien (DMNT) to'planishi natijasida yuzaga keladi, bu PENTATSICLIC TRITERPENE SNTHASE 1 (PEN1) ni kodlaydi. asosiy DMNT biosintetik fermenti. P. xylostella infestatsiyasi va yaralanishi RPX1 oqsilining degradatsiyasini keltirib chiqaradi, bu esa hasharotlar infestatsiyasiga tez javob berishi mumkin. RPX1 inaktivatsiyasi va PEN1 haddan tashqari ifodasi o'simliklar o'sishi uchun salbiy o'zaro bog'liqlik bilan bog'liq emas, lekin P. xylostella infestatsiyasi mavjudligida yovvoyi turga qaraganda ancha yuqori urug' ishlab chiqarishga ega. Ushbu tadqiqot P. xylostella ga qarshi o'simliklar molekulyar naslchilik uchun yangi strategiyani taklif qiladi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

  KALİT SO'ZLAR

zararkunandalarga chidamlilik, ikkilamchi metabolizm, uchuvchi emissiya

1|KIRISH

Hasharotlar zararkunandalari nafaqat hosildorlikni pasaytiradi, balki ekinlar sifatiga ham ta'sir qiladi (Johnson & Züst, 2018; Wu va boshq., 2016; Zhao va boshq., 2016). Ular orasida olmosli kuya Plutella xylostella keng tarqalgan va zararli lepidopteran zararkunandasi bo'lib, gulkaram va karam kabi xochga mixlangan ekinlar bilan oziqlanadi va katta iqtisodiy yo'qotishlarga olib keladi. Hozirgi vaqtda qishloq xo'jaligini boshqarishda agrokimyoviy (masalan, pestitsidlar) yordamida zararkunandalarga qarshi kurash juda muvaffaqiyatli va keng qo'llanilmoqda, ammo bu yondashuv atrof-muhitning potentsial ifloslanishi va inson salomatligiga tahdidlar tufayli muammoli bo'lib qolmoqda (Shakeel va boshq., 2017). O'simliklarni etishtirishga muqobil yondashuv zararkunandalarga chidamliligi yuqori bo'lgan, masalan, Bacillus thuringiensis (Jouzani va boshq., 2017) yoki boshqa heterolog entomotoksik oqsillarning o'simlik ifodasida (Duglas, 2018) genetik jihatdan yaratilgan ekinlardan foydalanishdir. Qishloq xoʻjaligida P. xylostella bilan kurashishning yangi yondashuvlarini aniqlash boʻyicha keng koʻlamli ishlar amalga oshirildi; ammo, samarali genlar, tabiiy pestitsidlar va chidamli germplazma cheklanganligicha qolmoqda (Chjou va Jander, 2021). Hasharotlar zararkunandalari bilan doimiy qurollanish poygasi orqali o'simliklar hasharotlar hujumiga qarshi kurashish uchun turli qobiliyatlarni rivojlantirdilar. Shunga ko'ra, o'simliklar javob sifatida benzoksazinoidlar (Handrik va boshq., 2016; Varsani va boshq., 2019), metil benzoat (Feng & Zhang, 2017) va serotonin (Lu va boshq., 2018) kabi himoya metabolitlari majmualarini sintez qiladi. zararkunandalarning shikastlanishi. Yasmon kislotasi (JA), shuningdek, "yara gormoni" deb ham ataladi, hasharotlar infestatsiyasi bilan boshlangan turli xil jarohatlarga qarshi ta'sirlarda markaziy rol o'ynaydi (Lortzing va Steppuhn, 2016). Ko'payib borayotgan dalillar JA salitsil kislotasi (SA) va etilen kabi boshqa fitohormonlar bilan sinergik va/yoki antagonistik tarzda ishlashini ko'rsatmoqda (Costarelli va boshq., 2020; Ma va boshq., 2019). To'g'ridan-to'g'ri himoya qilishdan tashqari, hasharotlar hujumidan zarar ko'rgan o'simliklar o'txo'rlarning tabiiy dushmanlarini o'ziga tortadigan turli uchuvchan birikmalarni chiqaradi (Gols, 2014). Ushbu murakkab uchuvchi aralashmalardan gomoterpen birikmalari (3E) -4,8-dimetil-1,3,7-nonatrien (DMNT) va (E, E) -4,8,12-trimetil-1,3,7, 11-tridekatraen (TMTT) Arabidopsis (Li va boshq., 2010; Sohrabi va boshq., 2015), guruch (Li va boshq., 2018), makkajo'xori (Gouinguené va boshq., 2005) kabi ko'plab o'simlik turlarida xabar berilgan. Richter va boshq., 2016) va paxta (Liu va boshq., 2018). Bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, DMNT o'simlik bilan o'simlik aloqasi paytida o'txo'rlarga qarshi himoyani keltirib chiqaradigan signal molekulasi sifatida ishlaydi (Arimura va boshq., 2000; Meents va boshq., 2019). Misol uchun, chaynash hasharotlari zarar etkazgandan so'ng, ba'zi shirin kartoshkalar DMNT chiqaradi, bu esa qo'shni shirin kartoshka o'simliklarida proteaz inhibitörünün tizimli ravishda indüksiyasini keltirib chiqaradi va ularni hasharotlar uchun hazm bo'lmaydi (Meents va boshq., 2019). Xuddi shunday natijalar choy o'simliklarida ham kuzatilgan (Jing va boshq., 2020). Yaqinda biz DMNT hasharotlarning o'rta ichakchasidagi peritrofik matritsa (PM) to'sig'ini buzish orqali P. xylostella lichinkalarini o'ldirishda rol o'ynashini aniqladik (Chen va boshq., 2021).

Yuqori o'simliklarda DMNT va TMTT biosintez yo'llari teskari genetika va biokimyoviy tahlillar orqali yaxshi tavsiflangan. Makkajo'xori tarkibida DMNT va TMTT (E)-nerolidol va (E, E)-geranil linalolning ikkita P450 monooksigenaza, CYP92C5 va CYP92C6 tomonidan oksidlanish parchalanishidan hosil bo'ladi (Richter va boshq., 2016). Paxtada ikkita CYP geni (GhCYP82L1 va GhCYP82L2) (E)-nerolidolni DMNTga va (E, E)-geranil linaloolni TMTT ga aylantirish uchun javobgardir (Liu va boshq., 2018). Arabidopsis ildizlarida DMNT C30 triterpen diol prekursoridan, kannabidioldan, ildizga xos CYP705A1 geni tomonidan kodlangan sitoxrom P450 monooksigenaza tomonidan katalizlanadi (Sohrabi va boshq., 2015). Model organizm sifatida xamirturushdan foydalangan holda olib borilgan tadqiqot kannabidiolning kannabidiol sintaza PEN1 (Xiang va boshq., 2006) tomonidan 2,3-oksidosqualendan ishlab chiqarilganligi va uning ifodasi CYP705A1 (Sohrabi va boshqalar) bilan sinergik bog'liqligi haqida dalillarni taqdim etdi. ., 2015). Shunga qaramay, DMNT biosintezidagi asosiy genlarning regulyatsiyasi asosan noma'lumligicha qolmoqda. Ushbu tadqiqotda tasvirlangan RPX1 geni eukaryotik boshlash omili 4E (eIF4E) genlar oilasining a'zosi bo'lgan yangi qopqoqni bog'lovchi oqsilni (CBP) kodlaydi. O'simliklarda eIF4E oilasi eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E va nCBP dan iborat bo'lib, ular qopqoqqa bog'liq mRNK tarjimasini boshlashda muhim rol o'ynaydi (Rhoads, 2009). eIF4E oilasi a'zolari kartoshkaning hosildorligi va sifatiga ta'sir qiluvchi eng zararli patogen bo'lgan Y (PVY) kartoshka virusiga retsessiv qarshilik ko'rsatishning asosiy manbalari hisoblanadi va eIF4E1 geniga qaratilgan CRISPR-Cas9 texnologiyasidan foydalanish Solanum tuberosumning kartoshka virusi Y qarshilik spektrini kengaytiradi. (Lucioli va boshqalar, 2022). Xuddi shunday, CRISPR/Cas9 vositachiligida kassava eIF4E izoformlari nCBP-1 va nCBP-2 ni tahrirlash manok jigarrang chiziq kasalligidan kelib chiqqan simptomlarning zo'ravonligi va chastotasini kamaytiradi (Gomez va boshq., 2019). Bundan tashqari, Arabidopsisdagi tadqiqotlar nCBP etishmovchiligi o'simlik viruslarining hujayradan hujayraga harakatini cheklashda rol o'ynashini ko'rsatadi (Keima va boshq., 2017). Shunga qaramay, nCBPlarning o'txo'rlarni himoya qilishdagi funktsiyasi haqida xabar berilmagan. Bu erda biz P. xylostella ga o'simliklarning chidamliligida muhim rol o'ynaydigan Arabidopsis geni RPX1 ni funktsional xarakterlash uchun integral yondashuvdan foydalanamiz. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, RPX1 ning ishdan chiqishi differensial ravishda ifodalangan genlar (DEG) va birikmalarning to'planishiga olib keladi. Yuqori tartibga solinadigan genlardan biri PEN1 bo'lib, u DMNT biosintezi uchun kalit hisoblanadi. Rpx1 mutantining infestatsiyasi va DMNT to'planishi P. xylostella ning PM tuzilishiga ta'sir qiladi va lichinkalarning rivojlanish nuqsonlari va o'limini keltirib chiqaradi. Qo'shimcha dalillar shuni ko'rsatadiki, P. xylostella infestatsiyasi va yaralanishi RPX1 oqsilining parchalanishiga olib keladi, bu esa o'z navbatida o'simliklarning hasharotlarga chidamliligiga olib kelishi mumkin.

2|MATERIALLAR VA USULLAR

2.1|O'simlik materiallari va o'sish sharoitlari

Arabidopsis urug'lari Nottingem Arabidopsis fond markazidan (NASC, http://Arabidopsis.info/) buyurtma qilingan. Urug'lar sirt sterilizatsiya qilingan, Murashige va Skoog (MS) muhitiga ekilgan va 3 kun davomida qisqa kunlik fotoperiod (8 soat yorug'lik, 16 soat qorong'i) ostida o'sish kamerasida 5 daraja qatlamlangan. Keyin ular issiqxonada uzoq kunlik fotoperiyodda (16 soat yorug'lik, 8 soat qorong'i) normal o'simlik parvarishi bilan 22 darajaga o'tkazildi.

2.2|Tanlov (afzallik) va tanlovsiz tajribalar va bioassaylar

P. xylostella tuxumlari Henan Jiyuan Baiyun kompaniyasidan sotib olindi (Mushuk: HJB004, 2009 yilda ishlab chiqilgan, boshqariladigan muhitda ilmiy tadqiqotlar uchun ko'paytirildi) va 26 daraja, 16 soat yorug'lik / 8 soat qorong'ilikka o'rnatilgan o'sish kamerasida inkubatsiya qilindi. Tanlov tajribalari uchun biz 3 haftalik Arabidopsis o'simliklarini (8 yovvoyi va mutant o'simliklar) shisha probirkaning har bir uchiga ulangan sinov tanklariga o'tkazdik va qolgan eksperimental bosqichlar yuqorida aytib o'tilganidek amalga oshirildi ( Chen va boshqalar, 2021). To'rtinchi bosqichli lichinkalar ishlatilgan va har bir eksperimental replikatsiyaga 15 ta lichinka kiritilgan.

Tanlovsiz tajriba uchun 3 haftalik yovvoyi va mutant o'simliklar bir xil sonli 15 s-insta P. xylostella lichinkalarini o'z ichiga olgan alohida va yarim ochiq Petri idishlariga ko'chirildi. Keyingi qadamlar yuqorida tavsiflanganidek bajarildi (Chen va boshq., 2021).

Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi

2.3|P. xylostella ga qarshi chidamli Arabidopsis mutantlarini skrining qilish

Biz P. xylostalle qarshilik skriningi uchun Arabidopsisning 179 T-DNK kiritish mutantlarini to'pladik. Mutantlar MS muhitida o'stirildi va uzoq kunlik o'sish sharoitida (22 daraja, 16 soat yorug'lik / 8 soat qorong'i) P7 qozonlariga (hajmi: 7 × 7 sm) ko'chirildi. Mumkin bo'lgan atrof-muhit ta'siridan qochish uchun biz har kuni idishlarni ko'chirdik va aylantirdik. Mutantlarni dastlabki skrining qilish uchun biz har bir mutantni ikkita idishda o'stirish orqali ikkita replikatsiya o'rnatdik, bunda Col-{7}} o'simliklar nazorat sifatida. Transplantatsiyadan keyingi 2 haftalik o'sishdan so'ng, barcha mutantlar yuqorida aytib o'tilganidek, ularni Col-0 bilan solishtirish orqali uchinchi bosqich P. xylostella lichinkalarini afzal ko'rish sinovidan o'tkazildi. Col-{10}} lichinkalari uchun turli xil afzalliklarni ko'rsatgan mutantlar nomzodga chidamli yoki sezgir mutantlar sifatida ko'rib chiqildi va keyingi eksperimental tekshirish va funktsional tadqiqotlar uchun tanlandi.

2.4|Plazmid tuzilishi va gen transformatsiyasi

RPX1pro: RPX1 konstruksiyasi uchun RPX1 genomik kodlash hududi 1,6 kb yuqori oqim va 1 kb quyi oqim ketma-ketligi bilan Col-0 dan olingan genomik DNKdan PCR bilan kuchaytirildi. Yig'ilgan DNK fragmenti pGreenII-0179 vektoriga klonlandi va floral daldırma usuli yordamida rpx1-1 mutantiga aylantirildi (Clough & Bent, 1998). RPX1pro yaratish uchun: RPX1-GFP, RPX1 promotori (1,6 kb), kodlash hududi va 1 kb 3' tarjima qilinmagan ketma-ketliklar Col-{25}} genomik DNKdan PCR bilan kuchaytirildi. GFP fragmenti GFP ketma-ketliklarini o'z ichiga olgan plazmiddan kuchaytirildi. Ushbu DNK fragmentlari kesish va bog'lash usuli yordamida pGreenII-0179 vektoriga yig'ildi va keyin rpx1-1 mutantiga aylantirildi. 35Spro: RPX1-FLAG konstruksiyasi uchun RPX1 kodlash ketma-ketliklari Col-0 mRNK dan teskari transkripsiya qilingan cDNA dan PCR bilan kuchaytirildi. PCR fragmenti infuzion usuli (Clontech) yordamida pCambia1300-FLAG vektoriga klonlandi va Col-0 ga aylantirildi. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SINTAZA 1) va 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SINTAZASI 1): Ushbu genlarning kodlash ketma-ketligi Col-0 cDNA dan PCR bilan kuchaytirildi va pLG-Vektorga bog'landi. PEN1 ga yo'naltirilgan sun'iy mikroRNK (amiR) ilgari ta'riflanganidek ishlab chiqilgan (Schwab va boshq., 2006), shablon sifatida pRS300 plazmidi yordamida kuchaytirilgan va pCambia1300m vektorining o'zgartirilgan versiyasiga bog'langan. Barcha primer ketma-ketliklari Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlarda keltirilgan: S1-jadval.

2.5|P. xylostella lichinkalarida glutation s-transferaza (GST) va sitoxrom P450 (CYP450) faolligini tahlil qilish

Ikkinchi davr P. xylostella lichinkalari Col-0 yoki rpx1-1 ko'chatlari bilan 72 soat davomida oziqlangandan so'ng, ular to'planib, suyuq azotda mayda kukunga aylantirildi. Tahlillar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, mushuk: A004) va CYP450 faollik tahlili to'plamlari (Beijing Huabaitai Biology Company, mushuk: P450) yordamida amalga oshirildi. Har bir tahlil uchta biologik replikatsiyaga ega edi va har bir replikatsiya 30 ta P. xylostella lichinkalaridan iborat edi.

2.6|Smurf tahlillari

Uch haftalik Col-0 yoki rpx1-1 ko'chatlari ikkinchi davr P. xylostella lichinkalarini oziqlantirish uchun ishlatilgan. Tahlil ilgari tavsiflanganidek, kichik o'zgarishlar bilan amalga oshirildi (Chen va boshq., 2021). Oltita biologik replikatsiya ishlatilgan va har bir replikatsiyada 15 ta P. xylostella lichinkalari mavjud edi.

2.7|Lichinkalarning PM tuzilishini mikroskopik kuzatish

Lichinka PM tuzilishining anatomiya tahlili va lichinka ichakning kerosin kesma tahlili ilgari tasvirlanganidek amalga oshirildi (Chen va boshq., 2021).

2.8|Gen ekspressiyasini tahlil qilish va transkriptom sekvensiyasi (RNK-seq)

Col-{0}} va rpx1-1 ko'chatlari uzoq kunlik o'sish sharoitida (16 soat yorug'lik, 8 soat qorong'i) 22 daraja haroratda o'stirildi. Ikki haftalik Col-0 va rpx1-1 ko'chatlari transkriptomlar ketma-ketligi uchun ishlatilgan. Har bir namunada uchta biologik nusxa mavjud. Jami RNK RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, katalog raqami: DP441) yordamida chiqarildi. Birinchi zanjirli cDNKlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq One-Step RT tizimi (Takara Bio) yordamida teskari transkripsiya orqali sintez qilindi. qRT-PCR Roche Light Cycler 480 asbobida Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S1 jadvalida keltirilgan genga xos primerlar bilan amalga oshirildi. RNK-seq kutubxonalarini qurish va tartiblash Illumina HiSeq platformasida Biomarker (Pekin, Xitoy) yordamida amalga oshirildi. Nihoyat, biz differentsial ifoda tahlilini o'tkazish uchun edgeR dan foydalandik (muhim farq chegarasi belgilandi:|log2foldchange|1 dan katta yoki unga teng, p <0,05). Col-0 va rpx1-1 uchun uchta biologik replikatsiya amalga oshirildi va differentsial tarzda ifodalangan genlar S1 ma'lumotlar to'plamida keltirilgan.

2.9|Arabidopsisda DMNT va DMNT- 2 H ning ekstraktsiya va gaz xromatografiyasi va massa spektrometriyasi (GC-MS) tahlili

DMNT ekstraktsiyasi va tahlili ilgari tavsiflanganidek, kichik o'zgarishlar bilan amalga oshirildi (Sohrabi va boshq., 2015). Tahlillarda DMNTni olish va o'lchash uchun 2 g 3 haftalik Arabidopsis ko'chatlari ishlatilgan.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|DMNTni tayyorlash va tavsiflash

DMNT ilgari tavsiflanganidek, kichik o'zgarishlar bilan sintez qilingan (HJ Huang & Yang, 2007). Qisqacha aytganda, teflon bilan qoplangan magnit aralashtirgich bilan jihozlangan 500 ml dumaloq tubli kolba 1 g (6,48 mmol) allil spirti va 50 ml diklorometan bilan zaryadlangan. Eritma kuchli aralashtirildi va 3,6 g faol marganets dioksidi bilan ishlov berildi, so'ngra reaktsiya tugaguniga qadar har 2-3 soatda 1-2 g oksidlovchi qo'shildi. Keyin mahsulot ixtiyoriy reaktsiya orqali kerakli birikma hosil qilish uchun ishlatilgan. DMNT ning tuzilishi va tozaligi 1 H yadro magnit rezonansi (NMR) va 13C NMR spektroskopik yondashuvlari bilan tasdiqlangan.

2.11|P. xylostella ni DMNT bilan davolash

Tahlillar bir nechta teshiklari bo'lgan shaffof plastik plyonkalar bilan qoplangan Petri idishlarida o'tkazildi. DMNT kerosin moyida (Sigma-Aldrich) kerakli dozaga (2,5 nmol/L-25 mkmol/L) suyultirildi va matnda ta'riflanganidek em-xashak ichiga yuborildi. Barcha tahlillar oltita biologik replikatsiyada amalga oshirildi, har bir replikatsiya 15 lichinkadan iborat. Lichinkalarning o'sishi fotografik hujjatlar bilan qayd etilgan. Nazorat sifatida bir xil hajmdagi kerosin moyi erituvchisi yuborilgan em-xashak ishlatilgan.

2.12|Arabidopsis ko'chatlarida JA va SA tarkibini o'lchash

Tahlillar Nanjing Convinced-test Technology kompaniyasi tomonidan o'tkazildi. Ikki haftalik Col-{0}} va rpx1-1 ko'chatlari nazorat sifatida zararlanmagan ko'chatlar bilan 15 s-instar P. xylostella lichinkalari bilan zararlangan. Biz barcha o'simliklar zararlanganligini ta'minlash uchun infestatsiya guruhining har bir o'simlikiga ikkita lichinka joylashtirdik. 24 soatdan keyin o'simlik namunalari yig'ildi va JA va SA ni aniqlash uchun suyuq azotda tez muzlatildi. Namunalar suyuq azotda mayda kukun holiga keltirildi va izopropanol-suv-xlorid kislota ekstraksiya eritmasi bilan ekstraksiya qilindi, so'ngra 8 ul deyterlangan salitsil kislotasi (D-SA) va dihidroyasmon kislotasi (2HJA) (1 ug) qo'shildi. /ml har biri) ichki standartlar sifatida. Keyin diklorometan qo'shildi va eritma rotatorda 30 daqiqa davomida yaxshilab aralashtirildi. Pastki organik faza 13,{{1{20}}} rpm 5 daqiqa davomida santrifüjlash orqali olingandan so'ng, azot bilan quritilgan, metanolda qayta eritilgan (0) .1% chumoli kislotasi), so'ngra 13,000 g haroratda 10 daqiqa santrifüjlanadi. Nihoyat, supernatant 0,22 mkm organik filtr membranasi orqali filtrlandi va massa spektrometriyasi (HPLC-MS/MS) bilan birgalikda yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi orqali tahlil qilindi. Barcha ekstraksiya bosqichlari 4 darajada amalga oshirildi. JA va SA ning identifikatsiyalari maqsadli moddalarning eng yuqori vaqti va mos keladigan ionlarning massa-to-zaryad nisbati (m/z) asosida aniqlandi. JA va SA miqdorini aniqlash ichki standart egri chiziqlardan olingan chiziqli regressiya tenglamasi yordamida o'rnatildi. Ichki standart egri chizig'ini olish uchun erituvchi sifatida metanol (0,1% chumoli kislotasi) yordamida 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 va 200 ng/ml gradientli SA va JA standart eritmalari tayyorlandi. va yakuniy kontsentratsiyasi 20 ng/ml bo'lgan ichki standart eritmalar haqiqiy uchastkaga qo'shildi. Lineerlik anomaliyalari standart egri chiziqlar tenglamalaridan olib tashlandi. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Arabidopsisda DMNT tashish tahlili

DMNT DMSOda eritildi va glyukozasiz MS muhitiga qo'shildi. Uch haftalik Arabidopsis o'simliklari sinov naychalariga o'tkazildi va ularning ildizlari DMNT yoki DMSO (nazorat) bilan MS muhitiga botirildi. Kontaminatsiyani oldini olish uchun probirkalar ikki qavatli parafilm bilan qoplangan va plyonkada kichik teshik qilingan, bu orqali o'simlik ildizlari keyingi o'sish uchun MS muhitiga joylashtirilgan. 24 soatdan keyin davolash qilingan o'simliklarning ildizlari olib tashlandi va ularning barglari P. xylostella ni oziqlantirish uchun ishlatildi, so'ngra lichinkalarning omon qolishi va pupatsiya tezligi tahlil qilindi. Xuddi shu tajriba nazorat sifatida 2 H etiketli DMNT yoki DMSO ni o'z ichiga olgan o'sish muhiti bilan takrorlandi. 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng barglar yig'ildi va GC-MS tahlili uchun qayta ishlandi. DMNT ning DMNT muhitidan havo qismlariga uchib ketishi va kuzatuv kontaminatsiyasiga olib kelishi ehtimolini istisno qilish uchun xuddi shu tarzda nazorat guruhi tashkil etilgan, ammo o'simlik ildizlari nam paxta bilan ko'milgan va DMNT muhitiga botirilmagan. 24 soatdan so'ng, havo qismlari GC-MS yordamida keyingi bioassay yoki DMNT aniqlash uchun yig'ib olindi.

Cistanche tubulosa foydalari- immunitet tizimini mustahkamlash

2.14|P. xylostella infestatsiyasi va yaralarni davolashdan keyin Arabidopsisda RPX1 ning protein ekstraktsiyasi va immunoblotting tahlili

Biz transgenik RPX1pro: RPX1‐GFP va 35Spro: RPX1‐FLAG Arabidopsis ko‘chatlari: P. xylostella infestatsiyasi va yaralanishi uchun ikki turdagi davolashni o‘rnatdik. Lichinkalar bilan zararlanish uchun biz 2 hafta davomida Arabidopsis ko'chatlarini o'stirdik va ularni ikkinchi davr lichinkalariga berdik (har bir ko'chatga kamida bitta lichinka qo'ying), 15-120 daqiqadan so'ng lichinkalar olib tashlandi va zararlangan ko'chatlar tanlab olindi va yig'ib olindi. keyingi tajribalar. Yarani taqlid qilish uchun biz Arabidopsisning har bir bargida teshik hosil qilish uchun 1 ml shpritsning ignasini ishlatdik. 15-120 daqiqa o'sishdan so'ng, ko'chatlar yig'ib olinadi.

P. xylostella bilan zararlangan oʻsimliklar RPX1 degradatsiyasiga olib kelishi mumkinligini aniqlash uchun biz 15−120 daqiqa davomida Col‐0 koʻchatlarini P. xylostella bilan zararlashtirdik va uning transgen oʻsimliklardagi RPX1‐GFPga taʼsirini sinab koʻrdik. Barcha namunalar suyuq azotda kukun holiga keltirildi va keyin teng miqdorda zararlangan va zararlanmagan Col-0 bir xil miqdordagi RPX1-GFP to'qimalari bilan alohida aralashtirildi va eritmada 4 daraja haroratda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, aralash santrifüj qilindi va supernatant immunoblotting tahliliga duchor bo'ldi. Vestern blot tahlili uchun jami oqsillar oqsil ekstraktsiyasi buferi [50 mmol/L Tris-HCl pH8,0, 2,5 mmol/L EDTA pH8,0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL (IGPAL) bilan ekstraksiya qilindi. v/v), 10% glitserin (h/v), 7% 2-merkaptoetanol (v/v), 1 mmol/l PMSF va 1 x proteinaz inhibitori kokteyli (Roche)]. Keyin protein ekstrakti GFP (Roche, suyultirish: 1/1000) va FLAG (Abcam, suyultirish: 1/2000) ga qarshi antikorlar bilan PAGE ajratish va immunoblotting tahlili uchun ishlatilgan. Tasvirlar Tanon 5200 xemiluminesans tahlil tizimi yordamida olingan.

3|NATIJALAR

3.1|Arabidopsis rpx1 mutantining P. xylostella ga chidamliligi yaxshilandi

P. xylostella qarshiligida ishtirok etadigan genlarni aniqlash uchun biz 179 ta Arabidopsis mutantlarini to'pladik va ularni boshqariladigan issiqxonada o'stirdik. Transplantatsiyadan ikki hafta o'tgach, biz har bir mutant va yovvoyi turdagi Col-0ga javoban uchinchi bosqich P. xylostella lichinkalarini afzal ko'rish testini o'tkazdik. Ushbu skrining tajribasida 15 mutant lichinkalar afzalligiga turli ta'sir ko'rsatdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) va ulardan biri ushbu tadqiqot uchun tanlangan va rpx1-1 (P. xylostella ga qarshilik) sifatida belgilangan. RPX1 yangi qopqoqni bog'lovchi oqsilni (nCBP) kodlaydi (Ruud va boshq., 1998). T-DNK qo'shilgan mutant SALK_131503 edi va RPX1 gen ifodasi yovvoyi turdagi Col-0 bilan solishtirganda sezilarli darajada pasaygan (1a-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S1a-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: jadval. S1). Yaqin atrofga ekilganida, rpx1-1 o'simliklari yovvoyi o'simliklarga nisbatan P.xylostella lichinkalari tomonidan sezilarli darajada pastroq zarar ko'rsatdi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S1b-rasm).

1-rasm RPX1 ni faolsizlantirish Arabidopsisdagi Plutella xylostella ga qarshilik ko'rsatadi. (a) RPX1 ning gen tuzilishi (At5g18110). To'q sariq rangli qutilar eksonlarni, qattiq chiziqlar esa intronlar va tarjima qilinmagan hududlarni bildiradi. rpx1‐1 deb nomlangan SALK_131503 ga T-DNK qo'shilishi to'rtinchi ekzonda joylashgan. (b) P. xylostella lichinkalari rpx1‐ 1 bilan solishtirganda yovvoyi turdagi Col‐0 va RPX1 toʻldiruvchi liniyalari (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1, RPX1com) tomon harakatlanadi. (c) Col‐ ni solishtirish 0, rpx1‐1 va RPX1com barglari P. xylostella bilan zararlangan. (d) P. xylostella lichinkalari yovvoyi turdagi Col-0 va RPX1com liniyalari bilan solishtirganda, lichinkaning bo'yi, hajmi va rangi bo'yicha rpx1‐1 tomonidan qattiq ta'sirlangan. (e, f) rpx1-1 bilan oziqlangan P. xylostella lichinkalari yovvoyi turdagi Col-0 va RPX1com liniyalariga nisbatan yuqori o'lim (e) va pastroq pupatsiya (f) ko'rsatkichlarini ko'rsatadi. (g, h) rpx1-1 o'simliklari bilan oziqlangan P. xylostella lichinkalari glutation S-transferaza (GST, g) va sitoxrom P450 (CYP450, h) faolligini oshirdi, RPX1com bilan oziqlangan lichinkalarda esa faollik ulardan farq qilmadi. Col-0 bo'yicha. (b, e–h) da maʼlumotlar oʻrtacha ± sem koʻrinishida berilgan. Har bir muolajadagi turli harflar sezilarli farqni koʻrsatadi (bir tomonlama dispersiya tahlili, b, g, h, n {{ uchun n=3 36}} uchun e, f).

P. xylostella infestatsiyasiga rpx1-1 qarshilik mexanizmini aniqlash uchun biz afzal va tanlovsiz testlarni o'tkazdik. Imtiyozli tajribalarda P. xylostella lichinkalari 10–6{{11} dan keyin Col‐0 va rpx1‐1 koʻchatlaridan teng masofada shisha probirka markaziga joylashtirildi. } min, rpx1‐1 tomonidagilarga qaraganda Col‐0 tomonida sezilarli darajada ko'proq lichinkalar to'plangan (1b-rasm). Tanlovsiz tajribalarda biz Col-0 va rpx1-1 ko'chatlarini P. xylostella lichinkalariga alohida oziqlantirdik va Col-0 rpx1-1 mutantiga qaraganda ko'proq barg to'qimalarini yo'qotganini kuzatdik (1c-rasm). RPX1 kuzatilgan qarshilik uchun sababchi gen ekanligini tasdiqlash uchun biz RPX1-1 mutantiga RPX1 ning komplementatsiya konstruksiyasini kiritdik. Ushbu RPX1 to'ldiruvchi liniyalari (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1, RPX1com) P. xylostella infestatsiyasiga moyil bo'lib, afzal ko'rgan va tanlovsiz testlar (1b,c-rasm) bilan aniqlangan, bu RPX1 Arabidopsisga chidamliligi bilan bog'liqligini ko'rsatadi. P. ksilostella.

3.2|P. xylostella lichinkalarining o'sishiga rpx1-1 mutatsiyasi salbiy ta'sir qiladi.

P. xylostella ning rpx1-1 mutantlari bilan oziqlantirishga fiziologik javobini tekshirish uchun biz Col-0, rpx1-1 va RPX1com liniyalarining 3 haftalik o'simliklari bilan oziqlangandan keyin lichinkalarning rivojlanishini tekshirdik. Rpx1-1 o'simliklari bilan oziqlangan lichinkalar tana o'lchami jihatidan jiddiy buzilgan rivojlanishni ko'rsatdi. Lichinkalarning tana rangi ham Col‐0 oʻsimliklari bilan oziqlangan lichinkalarnikidan farq qiladi. Biroq, RPX1com ko'chatlari bilan oziqlangan lichinkalarda bunday o'zgarishlarni kuzatmadik (1d-rasm). Keyingi fenotipik tahlillar shuni ko'rsatdiki, rpx1-1 bilan oziqlangan P. xylostella lichinkalari Col-0 yoki RPX1com bilan oziqlanganlarga qaraganda ancha yuqori o'lim va pupatsiya ko'rsatkichlari past bo'lgan (1e, f-rasm). Bundan tashqari, rpx1‐1 bilan oziqlangan lichinkalar GST va CYP450 ning yuqori fermentativ faolligini ko'rsatdi, ular organ yoki to'qimalarning shikastlanishi uchun biomarkerlar (Cheng va boshq., 2018; Mikstacki va boshq., 2015) Col-0 va RPX1com (1g,h-rasm), bu lichinka to'qimalarining rpx1-1 bilan oziqlanishi natijasida yaralanishi mumkinligini ko'rsatadi.

3.3|P. xylostella lichinkalarining oʻrta ichaklari rpx1-1 oʻsimliklari bilan oziqlangandan keyin shikastlanadi.

Biz rpx1-1 bilan oziqlangan lichinkalar o'simlik to'qimalarini kamroq iste'mol qilishini va yovvoyi turdagi Col-0 bilan oziqlanganlarga qaraganda ancha kam najas chiqarishini kuzatdik; shuning uchun biz rpx1-1 bilan oziqlangan lichinkalarning hazm bo'lishiga ta'sir qilishi mumkinligini taxmin qildik. Rpx1‐1 bilan oziqlangan lichinkalarning ichaklarida oqma borligini tekshirish uchun biz “Smurf testi”ni oʻtkazdik. Yovvoyi turdagi Col-0 va RPX1com liniyalari bilan oziqlangan lichinkalar bo'yoqni defekatsiya qilgan va lichinkalar tanasida vizual ravishda hech qanday bo'yoq qolmagan, rpx1-1 bilan oziqlangan lichinkalar esa bo'yoqning sezilarli miqdorini saqlab qolgan. o'rta ichak va uning atrofidagi to'qimalar va lichinkalar ko'k rangga aylandi (2a-rasm). Moviy ("Smurf") va normal ("Smurf" yo'q) lichinkalarining miqdoriy tahlili shuni ko'rsatdiki, rpx1-1 o'simliklarining oziqlanishi yovvoyi turdagi Col-{{ bilan oziqlanganlarga nisbatan "Smurf" ni uch baravar ko'proq namoyon qilgan. 14}} yoki RPX1com (2b-rasm). Ushbu natijalar rpx1-1 bilan oziqlantirish lichinkalarning o'rta ichaklarida shikastlanishga va yuqori o'tkazuvchanlikka olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi.

3.4|P. xylostella ning peritrofik matritsasi rpx1-1 ko'chatlarini oziqlantirishda shikastlanadi.

Biz stereomikroskop ostida strukturaviy tahlil qilish uchun Col‐{0}}, rpx1‐1 va RPX1com ko'chatlari bilan oziqlangan lichinkalardan peritrofik matritsani (PM) keyin ajratib oldik va ajratib oldik. Col‐0 va RPX1com bilan oziqlangan lichinkalarning buzilmagan va oʻsimtali PM bilan solishtirganda, rpx1‐1 bilan oziqlangan lichinkalar zararlanish xususiyatlarini koʻrsatib, ingichka, boʻshashgan va uzluksiz edi (2c-f-rasm). PM ning zararlanish xususiyatlarini qo'shimcha tasdiqlash uchun biz lichinka namunalarining ko'ndalang qismlarini oldik. Gematoksilin-eozin (HE) bilan bo'yash natijalari Col-0 bilan oziqlangan lichinkalarning PM qatlami qalin va buzilmaganligini va PM va o'rta ichak epidermal hujayralari o'rtasida ekoperitrofik bo'shliq (ES) mavjudligini aniqladi (2-rasm). Bundan farqli o'laroq, rpx1-1 bilan oziqlangan lichinkalarning o'rta ichakchasidagi PM jiddiy buzilgan va ichak tarkibi ichak devoriga yaqin edi (es yo'q, 2h-rasm). Lichinkalar RPX1com ko'chatlari bilan oziqlanganda, ularning PM va ES sezilarli darajada o'zgarmagan (2i,j-rasm). Bu natijalar RPX1 nokdaunining P. xylostella lichinkalarining PM ga zarar yetkazishini tasdiqlaydi.

3.5|Rpx1-1da DMNT tarkibining to'planishi P. xylostella lichinkalariga qarshilik ko'rsatadi.

RPX1 ning ishdan chiqishi Arabidopsis metabolitlarini qayta shakllantirishi va P. xylostella lichinkalariga qarshilik ko'rsatishiga olib keladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz rpx1‐ 1 va yovvoyi turdagi Col‐ 0 o'simliklaridan chiqarilgan uchuvchan organik birikmalarni (VOC) solishtirdik. To'rtta VOC (Geksanol, 3-etil-5metil, Oktans, 2,6-dimetil, Nonan, 2,6-dimetil va DMNT) rpx1-1 va Col-0 o'rtasida differentsial ravishda to'plangan (3a-rasm). P. xylostella qarshiligida rpx1-1 ning molekulyar mexanizmini qo'shimcha ravishda ajratish uchun biz RNK-seq tahlilini o'tkazdik. Col‐0 bilan solishtirganda, rpx1‐1 mutant 211 ta differentsial ifodalangan genlarni (DEG) ko'rsatdi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S1 ma'lumotlar to'plami). KEGG boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, bu DEGlar 20 dan ortiq turli xil metabolik yo'llarga, jumladan seskiterpenoid va triterpenoid biosintezi, alfa-linolenik kislota metabolizmi va tirozin almashinuvi yo'llariga tegishli (3b-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S2-jadval). Shunisi e'tiborga loyiqki, eng sezilarli darajada boyitilgan yo'l seskiterpenoidlar va triterpenoidlarning biosintezi bo'lib, u uchta DEG dan iborat: At4g15340, At5g42600 va At5g48010 (3b-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S2a-c-rasm). At4g15340 2,3-oksidosqualenni arabidiolga aylantiruvchi va CYP705A1 orqali bioaktiv DMNT sinteziga olib keladigan oksidosqualen siklaza PEN1 ni kodlashi xabar qilingan (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi va boshq.,). At5g42600 mineral biosintezning asosiy komponenti bo'lgan mineral sintaza 1 (MRN1) ni kodlaydi. At5g48010 talianol biosintezida ishtirok etadigan talianol sintaza (THAS) fermentini kodlaydi. Marneral va talianol o'simliklar rivojlanishini ta'minlashda ishtirok etishi haqida xabar berilgan (Field & Osbourn, 2008; Go va boshq., 2012) (Yordamchi ma'lumot: S3-rasm). Biz MRN1 (35Spro: MRN1) va THAS (35Spro: STHport) ni haddan tashqari ifodalovchi transgen Arabidopsis ko'chatlari bilan oziqlantirish orqali P. xylostella ning afzalligi, o'lim va pupatsiya tezligini o'rganish orqali MRN1 va THAS ning hasharotlarga chidamliligidagi potentsial rollarini o'rgandik. Ma'lumot: S4a,b-rasm). Ikki transgen va yovvoyi turdagi Col-0 o'rtasida sezilarli farq aniqlanmadi (qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S4c-n-rasm), bu rpx1-1 ning hasharotlarga chidamliligi bu ikki genga bog'liq emasligini ko'rsatadi.

2-rasm RPX1 inaktivatsiyasi lichinkaning o'rta ichakchasidagi peritrofik matritsa (PM) tuzilishiga zarar etkazadi. (a) Col‐{2}}, rpx1‐1 va RPX1com chiziqlari bilan oziqlangan lichinkalarning tasviri boʻyoq saqlanishini koʻrsatadi, bu ularning Smurf multfilmi qahramoni kabi koʻk koʻrinishidan dalolat beradi. (b) Natijalarning miqdori (a) da ko'rsatilgan. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi; turli harflar sezilarli farqni bildiradi (bir tomonlama dispersiya tahlili, n=6). (c–f) Col‐0 (c), rpx1‐1 (d) va RPX1com liniyalari (e, f) bilan oziqlangan lichinkalarning PM ultrastrukturasi. E'tibor bering, Col‐{11}} va RPX1com bilan oziqlangan lichinkalarning PM si to'la va buzilmagan, lekin rpx1‐1 bilan oziqlangan lichinkalarning PM qismi ba'zi hududlarda ingichka, nozik va uzluksizdir. (g–j) Ko‘ndalang kesim va gematoksilin-eozin bilan bo‘yash Col‐0 (g), rpx1‐1 (h) yoki RPX1com (i, j) chiziqlari bilan oziqlangan lichinkalardan PM ning zararlanishini ko‘rsatadi. [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

KEGG tahlilida terpenoid biosintezini boyitish (3b-rasm) va rpx1-1da aniqlangan DMNTning differentsial to'planishi (3a-rasm) DMNT o'simliklarning P. xylostella ga chidamliligi bilan bog'liq bo'lgan birikmalardan biri bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi. Col-0 da GC-MS tahlili orqali DMNTni zo'rg'a aniqlagan oldingi hisobotlarga o'xshash (Liu va boshq., 2018; Sohrabi va boshq., 2015), Biz zararlanmagan kol-0da DMNTning iz miqdorini aniqlay oldik (4a,b-rasm). Aksincha, DMNT darajalari rpx1‐1 da yuqori darajada boyitilgan (~8 ng/g) va RPX1com liniyalari Col‐{25}} zavodlarida boʻlgani kabi DMNTning juda past darajasini koʻrsatdi (4-rasm). Bundan tashqari, P. xylostella infestatsiyasidan keyin DMNT darajasi rpx1‐1 da (~20 ng/g) oshdi, bu Col‐0 va RPX1com liniyalaridagidan yuqori (4-rasm) . Biz o'zgartirilgan usul yordamida DMNTni in vitro sintez qildik (Chen va boshq., 2021). Oldingi kuzatishlarga muvofiq (Chen va boshq., 2021), DMNT P. xylostella o'sishini bostirdi, buni afzal ko'rish (2,5 mkmol/L) va tanlovsiz ishlash (0,25-25 mkmol/L) bilan tasdiqlanadi. Yordamchi ma'lumotlar: S5a,b-rasm). Bundan tashqari, HE bo'yash natijalari nazorat lichinkalarining PM ning qalin va buzilmaganligini ko'rsatdi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S5c-rasm), 48 soat davomida 2,5 mkmol/L DMNT bilan ishlov berilgan lichinkalarning PM ba'zi hududlarda ingichka va uzluksiz bo'lgan (qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: Shakl S5d). Birgalikda olib borilgan xulosalarimiz shuni ko'rsatadiki, rpx1-1 mutatsiyasi Arabidopsisdagi P. xylostella lichinkalarini o'ldirishga yordam beradigan DMNT to'planishiga olib keladi. JA va SA o'simlikning ikkilamchi metabolitlari bo'lib, ular biotik stress bilan chambarchas bog'liq. Ushbu moddalar rpx1-1 ning hasharotlarga chidamliligiga hissa qo'shadimi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz P. xylostella bilan zararlanishdan oldin va keyin Col-0 va rpx1-1 ning JA va SA darajasini tekshirdik. Davolash qilinmagan sharoitlarda rpx1-1 va Col-0 o'simliklari o'rtasida JA va SA darajalarida sezilarli farq yo'q edi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S6-rasm) va P. xylostella bilan zararlangandan keyin 24 soatdan keyin ikkala gormonning darajasi sezilarli darajada oshdi. . Ta'kidlash joizki, infektsiyadan so'ng, SA tarkibi rpx1-1da Col-0 bilan solishtirganda sezilarli darajada past bo'lgan, JA tarkibi esa Col-0ga qaraganda rpx1-1da ancha yuqori edi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S6-rasm).

3-rasm. Col-0 va rpx1-1 o'rtasida differensial ravishda boyitilgan uchuvchi birikmalar va gen ekspressiyasini taqqoslash. (a) Col-0 va rpx1-1 dagi differentsial boyitilgan uchuvchi birikmalar gaz xromatografiyasi-mass spektrometriyasi (GC-MS) usuli bilan aniqlandi. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi; yulduzchalar sezilarli farqni bildiradi (*p < 0.05, **p < 0.01, ikki dumli juftlashtirilmagan t-test). (b) Col-0 va rpx1-1 ning transkriptomik tahlili. Col-0 va rpx1-1 mutantlari o'rtasidagi turli xil ifodalangan genlardan yo'lni boyitishning KEGG tahlili. Bitta boyitilgan yo'l (qizil o'q) sesquiterpenoid va triterpenoid biosintezi bilan bog'liq va rasmda ko'rsatilganidek, uchta gendan iborat. [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

3.6|RPX1 PEN1 ga bog'liq holda DMNT to'planishini tartibga soladi

PEN1 ning rpx1-1 tartibga solinadigan DMNT to'planishiga qo'shgan hissasini o'rganish uchun biz sun'iy miRNK (PEN1amiR) o'z ichiga olgan konstruktsiyani yaratdik va uni rpx1-1 mutantlariga aylantirdik. Shuningdek, biz PEN1 haddan tashqari ifoda konstruktsiyasini yaratdik, u Col-0 (35pro: PEN1/Col-{{10}}) ga aylantirildi. Gen ifodasi tahlili shuni ko'rsatdiki, PEN1 PEN1amiR/rpx1-1 da rpx1-1 bilan solishtirganda yiqitilgan (4-7 marta) va 35Spro: PEN1 Col-0 bilan solishtirganda haddan tashqari ifodalangan (~2,5 marta) (5a-rasm). Ushbu transgenik liniyalarda RPX1 ning ifodalanishiga PEN1 ni nokaut yoki haddan tashqari ekspressiya ta'sir qilmagan (5b-rasm). P. xylostella bilan 6-24 soat davomida zararlanganda, PEN1 ifodasi Col-0 va rpx1-1 da sezilarli darajada o'sdi va 24 soatdan keyin rpx1-1 da PEN1 ifodasi ancha yuqori bo'ldi (5-rasm). . Keyinchalik, Col-0, rpx1-1, PEN1amiR/rpx1-1 va 35Spro: PEN1/Col-{{50}} da DMNT tarkibini o'lchadik. P. xylostella infestatsiyasisiz, rpx1-1 Col-0 (5d,e,f,k,l-rasm) va PEN1 rpx1-1da (PEN1amiR) sun'iy mikroRNK tomonidan yiqilganda ko'ra ko'proq DMNT ishlab chiqardi. /rpx1-1), DMNT darajalari pastga tushirildi, bu rpx1-1ga qaraganda ancha past darajani ko'rsatdi (5d,g,h,m,n-rasm). Lichinkalar bilan zararlangandan so'ng, Col-0 va rpx1-1 ko'chatlaridagi DMNT darajalari sezilarli darajada ko'tarildi, ammo PEN1amiR/rpx1-1 ko'chatlarida DMNT darajasi induktsiya qilinmadi va rpx1-1dagidan ancha past edi (5d-rasm, g, h, m, n), PEN1 RPX1 tomonidan boshqariladigan DMNT biosintezida muhim rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi, qo'shimcha ma'lumotda ko'rsatilgan: S3-rasm. Shunga mos ravishda, DMNT 35Spro: PEN1/Col-0 ko'chatlarida yuqori darajada to'plangan (5d, i, j, o, p-rasm).

4-rasm RPX1 ning yo'qolishi dimetil-1,3,7-nonatrien (DMNT) to'planishini oshiradi. (a) Col-0, rpx1-1 va RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1) qatorlarida DMNT ning gaz xromatografiyasi-mass spektrometriyasi (GC-MS) tahlili. DMNT standarti pastki qismida ko'rsatilgan. (b) Col-0, rpx1-1 va RPX1com-dan olingan DMNTning umumiy ion xromatografiyasi (TIC). (c) DMNT tarkibi rpx1-1 mutantida ortadi, lekin RPX1com transgen o'simliklarida yovvoyi turdagi darajaga qaytadi. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi; turli harflar sezilarli farqni bildiradi (bir tomonlama dispersiya tahlili, n=3). [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

3.7|PEN1 rpx1-1 da P. xylostella ni o'ldirishga yordam beradi

PEN1 nokdatu RPX1 inaktivatsiyasi natijasida kelib chiqqan DMNT to'planishini susaytirishi mumkinligini hisobga olib (5-rasm), biz uning biologik rolini ko'rsatish uchun PEN1 nokdatu va transgenik Arabidopsisning haddan tashqari ekspressiyasida bioassaylar o'tkazdik. Biz P. xylostella lichinkalari Col-0 bilan solishtirganda amiR-PEN1/rpx1-1 o'simliklarini afzal ko'rmaganligini aniqladik (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S7-rasm). Shu bilan birga, PEN1-amiR/rpx1-1 bilan oziqlangan P. xylostella lichinkalari rpx1-1ga qaraganda ancha past o‘lim va yuqori pupatsiya ko‘rsatkichlarini ko‘rsatdi, 35Spro: PEN1/Col-0 bilan oziqlangan lichinkalar esa o‘lim darajasi va pupatsiyasining pastligini ko‘rsatdi. stavkalari Col-0 bilan oziqlanganidan ko'ra (6a,b-rasm). Ushbu natijalarga muvofiq, keyingi "Smurf testi" va transektsiya tajribalari PEN1-amiR/rpx1-1 rpx1-1 bilan oziqlangan lichinkalarga nisbatan normal va buzilmagan ichak va PMga ega ekanligini ko'rsatdi (6c,d,g,h-rasm), va PEN1 ning haddan tashqari ifodalanishi P. xylostella lichinkalarining oʻrta ichak va PM lariga jiddiy zarar yetkazgan (6c,d, i,j-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, PEN1 nokdatu RPX1 inaktivatsiyasi natijasida yuzaga keladigan lichinkalar o'sishiga salbiy ta'sirni bostirishi mumkin va shu bilan P. xylostella lichinkalariga rpx{29}}induktsiya qilingan toksik ta'sirda muhim rol o'ynaydi.

3.8|DMNT Arabidopsisning ildizlaridan havo qismlariga o'tadi 

PEN1 asosan Arabidopsis ildizlarida ifodalanganligi xabar qilingan (AC Huang va boshq., 2019; Sohrabi va boshq., 2015) (Yordamchi ma'lumot: S8a-rasm), bu rpx1-1 havo qismlari ko'rsatgan natijalardan farq qiladi. PEN1-ga bog'liq holda P. xylostella toksikligi (6-rasm). Shuning uchun biz muqobil gipotezani shakllantirdik: o'simliklar DMNTni asosan ildizlarda sintez qiladi va uni havo qismlariga olib boradi, bu erda u hasharotlarga qarshilik ko'rsatadi. Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz ikkita DMNT transport tahlilini o'tkazdik. Birinchi tahlilda (7a-rasm) biz 3- 3-haftalik Arabidopsis ko‘chatlarining ildizlarini nazorat sifatida DMSO dan foydalanib, tarkibida 2,5 mkmol/L DMNT bo‘lgan suyuq o‘sish muhitida inkubatsiya qildik. 24 soat davomida kultivatsiyadan so'ng biz Arabidopsis barglarini kesib tashladik va ularni P. xylostella lichinkalariga taklif qildik. DMSO nazorati bilan solishtirganda, DMNT bilan ishlov berilgan o'simliklarning barglari nazoratga qaraganda sezilarli darajada yuqori lichinkalar o'limiga va pupatsiya tezligiga olib keldi (7b, c-rasm). DMNT transportining keyingi mustaqil tasdiqlanishini maqsad qilgan ikkinchi tajribada biz DMNT ni 2 H bilan belgiladik va suyuq o'simlik o'sadigan muhitga DMNT- 2 H qo'shdik. 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng, DMNT-2 H barglarda yuqori darajada boyitilgan (7d-i-rasm). DMNT ning suyuq o'sish muhitidan havoga uchib ketishi va o'simlik havo qismlarini ifloslanishi ehtimolini istisno qilish uchun biz parallel nazoratni o'rnatdik, bu 7a-rasmdagi kabi amalga oshirildi, faqat Arabidopsis ildizlari suyuqlikka botirilmagan. o'sish muhiti. Natijalar o'simliklarning havo qismlarida DMNT- 2 H aniqlanmaganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha ma'lumot: S8b, c-rasm). Shunday qilib, biz DMNT hosil bo'lgan ildizdan Arabidopsis barglariga o'tishi va zararkunandalarning o'limiga olib kelishini taklif qilamiz.

5-rasm PEN1 rpx1-1da dimetil-1,3,7-nonatrien (DMNT) to'planishida muhim rol o'ynaydi. (a) Col-0, rpx1-1 da PEN1 ifodasi tahlili, rpx1-1 fonida PEN1 ni nokdastlash (PEN1-amiR/rpx1-1) va PEN1 haddan tashqari ifodasi (35Spro:PEN1/Col-{{2{{) 22}}}}) qatorlar. (b) RPX1 ifodasi Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 va 35Spro:PEN1/Col-0. (c) PEN1 ifodasi Col-0 va rpx1-1 da Plutella xylostella infestatsiyasi tomonidan qo'zg'atilgan. (d) Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 va 35Spro:PEN1/Col-0 o'rtasidagi DMNT to'planishini taqqoslash. (e-j) Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) dan chiqadigan uchuvchi moddalarning gaz xromatografiyasi-mass-spektrometriyasi (GC-MS) tahlili va 35Spro: PEN1/ Col‐0 (i, j) qatorlar. (k–p) Col-0 (k), rpx1-1 (l), PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) va 35Spro dan olingan DMNT TIC: PEN1/Col-0 (o, p) qatorlari , (e–j) dagi ma'lumotlarga mos keladi. (a-d) da ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi; turli harflar sezilarli farqni bildiradi (bir tomonlama dispersiya tahlili, n=3). [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

3.9|RPX1 P. xylostella infestatsiyasi va yaralarni davolash bilan buziladi

Biz P. xylostella lichinkalari bilan zararlangan rpx1-1 va Arabidopsis ko'chatlarida PEN1 ifodasi ko'tarilganligini ko'rsatdik (5a, c-rasm), bu RPX1 lichinkalar infestatsiyasiga ham javob berishi ehtimolini oshirdi. Ushbu bashoratni tasdiqlash uchun biz RPX1 ning P. xylostella infestatsiyasiga potentsial javobini tekshirdik. Gen ekspressiyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, RPX1 turli to'qimalarda ifodalangan (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S9a-rasm), lekin 6-24 soat lichinkalar infestatsiyasiga sezilarli javob bermagan (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S9b-rasm). Shuning uchun biz RPX1pro: RPX1-GFP transgen o'simliklaridagi RPX1 oqsil darajasini immunoblotting yordamida tekshirdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, lichinkalar infestatsiyasisiz RPX1-GFP 0-12{{40}} daqiqa davomida barqaror edi; aksincha, 15 daqiqa davomida lichinkalar bilan zararlangandan so'ng, RPX1-GFP parchalana boshladi; 120 daqiqadan so‘ng RPX1-GFP oqsili doimiy ravishda boshlanish vaqtining taxminan 6% gacha pasaydi (8a-rasm, qo‘llab-quvvatlovchi ma’lumot: S10a-rasm). Nazorat sifatida, GFP transgenini o'z ichiga olgan Arabidopsis ko'chatlarida GFP lichinka bilan zararlangandan keyin nisbatan barqaror edi (8b-rasm). GFP yorlig'ining RPX1 barqarorligiga ta'sirini istisno qilish uchun biz lichinkalar bilan zararlanish tajribalarini o'tkazish uchun FLAG yorlig'i (35Spro: RPX1-FLAG) bilan transgenik RPX1 o'simliklarini yaratdik, bu RPX1-FLAG lichinkalar tomonidan ham parchalanishi mumkin bo'lgan izchil natijalarni ko'rsatdi. RPX1-GFP ga o'xshash infestatsiya (8c-rasm). Hasharotlarning zararlanishi ko'pincha o'simliklarning yaralanishiga olib keladi va jismoniy zarar o'txo'r hasharotlarning oziqlanish jarayonini qisman taqlid qilishi mumkin. Yaralanish RPX1 degradatsiyasiga olib kelishi mumkinligini ko'rsatish uchun biz igna yordamida o'simlik barglarida jarohatni taqlid qilish uchun teshiklar hosil qildik va RPX1-GFP 30 daqiqalik davolashdan so'ng parchalanishini aniqladik (8d-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S10b-rasm). P. xylostella bilan zararlanganda RPX1 degradatsiyasining sababini yaxshiroq tushunish uchun biz RPX1-GFP transgen o'simliklarining to'qimalarini P. xylostella tomonidan 15-120 daqiqa davomida zararlangan Col-0 bilan birga 15 daqiqa davomida eritmada inkubatsiya qildik. , yoki Col-0 infestatsiyasiz to'qimalar. Immunoblotting tahlili shuni ko'rsatdiki, oldindan yuqtirilgan Col-0 bilan inkubatsiya qilingan namunalardagi RPX1-GFP darajasi infektsiyalanmagan Col-0 bilan inkubatsiya qilinganidan ancha past bo'lgan (8e-rasm), bu P. xylostella infestatsiyasi Col-0da ba'zi omillar yoki signallarni keltirib chiqarganligini ko'rsatdi. bu RPX1 degradatsiyasiga olib kelishi mumkin.

3.10|rpx1-1 mutatsiyasi o'simliklarning rivojlanishi va ko'payishida afzalliklarni beradi

O'txo'rlarga xos bo'lgan himoya reaktsiyalarining umumiy xususiyati zararkunandalarga chidamlilik va o'simliklarning o'sishi va ko'payishi o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikdir (Li va boshq., 2018). RPX1 lokusudagi genotip bunday almashinuvlarga duchor bo'ladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz Col-{{10}} va rpx1-1 mutantlarida urug' ishlab chiqarishni solishtirdik. P. xylostella infestatsiyasi boʻlmaganda, har bir oʻsimlikdan olingan urugʻ hosili ikki genotip oʻrtasida oʻxshash boʻlgan (Qoʻshimcha maʼlumot: S11-rasm). Aksincha, 3 haftalik rpx1-1 va Col-{17}} o'simliklarni 15 s-instar P. xylostella bilan zararlanishiga bor-yo'g'i 72 soat davomida ta'sir qilish Col-0 ning yakuniy urug' hosildorligini uch baravar kamaytirdi, holbuki rpx1-1 da urug' hosildorligiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. Bundan tashqari, RPX1com urug'ining hosildorligi Col-0 ga o'xshash edi, lekin rpx1-1nikidan ancha past, bu RPX1 inaktivatsiyasi lichinkalar bilan zararlanganda urug' ishlab chiqarishda afzalliklarga ega ekanligini ko'rsatadi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S11-rasm). Shuningdek, biz 35Spro: PEN1 transgenik Arabidopsisda urug‘ yetishtirishni baholadik va PEN1 ning haddan tashqari ifodalanishi lichinkalar bilan zararlangan va zararlanmagan sharoitlarda yuqori urug‘ hosildorligini ko‘rsatdi (Qo‘llab-quvvatlovchi ma’lumot: S11-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, rpx1-1 mutatsiyasi va undan yuqori PEN1 ifodasi P. xylostella ga qarshilik ko'rsatadi, odatda bog'liq o'sish almashinuvi bo'lmasa, RPX1 va PEN1 ning hosildorlikni yaxshilashga qaratilgan molekulyar naslchilik dasturlarida potentsialini ta'kidlaydi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

4|MUHOKAZA

Zararkunandalar agrotexnika hosildorligi va sifatini keskin pasaytiradi, bu o'simliklarni himoya qilishni fermerlar va selektsionerlar uchun ustuvor va uzoq muddatli vazifaga aylantiradi. Ushbu tadqiqotda biz ekinlarning muhim lepidopteran zararkunandasi P. xylostellaga yuqori qarshilik ko'rsatgan Arabidopsis mutant rpx1‐1 ni aniqladik. Bizning tahlilimiz shuni ko'rsatdiki, rpx1-1 mutatsiyasi yuqori PEN1 transkript darajasiga, DMNT to'planishiga va zararkunandalarga qarshi o'simliklarning chidamliligini oshirishga olib keldi. Biz, shuningdek, RPX1 oqsili lichinkalar infestatsiyasi va yaralarni davolash orqali parchalanishi mumkinligini ko'rsatdik.

6-rasm PEN1 rpx1-1 ning Plutella xylostellaga chidamliligini oshiradi. (a, b) PEN1-amiR transgeni rpx1-1 ning P. xylostella infestatsiyasiga chidamliligini sezilarli darajada engillashtiradi, 35Spro: PEN1 esa qarshilik ta'sirini kuchaytiradi, bu P. xylostella lichinkalarining o'lim (a) va pupatsiya (b) tezligida ko'rsatilgan. . (c) Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 va 35Spro bilan oziqlangan lichinkalarning vakillik tasvirlari: PEN1 koʻchatlarida boʻyoq saqlanib qolgan, bu ularning Smurf multfilmi kabi koʻk koʻrinishidan dalolat beradi. xarakter. (d) (c) da ko'rsatilgan tasvirlarning miqdoriy natijalari. (e–j) Ko‘ndalang kesim va gematoksilin-eozin bilan bo‘yash Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g,) bilan oziqlangan lichinkalardan PM ning zararlanishini ko‘rsatadi. h) va 35Spro: PEN1 ko'chatlari (i, j). Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi; Har bir muolajadagi turli harflar (a, b, d) (bir tomonlama dispersiya tahlili, n=6) boʻyicha sezilarli farqni koʻrsatadi. [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

Tanlovsiz testlarda rpx1-1 mutant P. xylostella infestatsiyasiga sezilarli qarshilik ko'rsatdi (1c-rasm). Aksincha, rpx1-1 o'simliklari bilan oziqlangan P. xylostella lichinkalari jiddiy salbiy rivojlanish azoblarini ko'rsatdi (1d, e-rasm). Ushbu fenotiplar RPX1 ning inaktivatsiyasi bilan bog'liq, chunki RPX1 komplementatsiya liniyalari (RPX1com) yovvoyi turdagi Col-0 kabi sezgirdir (1c-e-rasm), bu RPX1 zararkunandalarga chidamliligi bilan bog'liq degan xulosani tasdiqlaydi. Lichinkalarni o'ldirishdan tashqari, rpx1-1 mutant lichinkalarning rivojlanishiga, shu jumladan pupatsiyaga uzoq muddatli ta'sir ko'rsatdi (1f-rasm), bu zararkunandalarning ko'payishini kamaytirishga olib keldi.

7-rasm Dimetil-1,3,7-nonatrien (DMNT) Arabidopsis ildizlaridan barglarga o'tadi. (a) Arabidopsis ko'chatlari yordamida DMNT transport tahlilining tasviri. DMNT Murashige va Skoog suyuq muhitida eritildi. 24-soatlik kulturadan soʻng ildizlar kesilib, barglari Plutella xylostella lichinkalarini boqish uchun oʻlim va pupatsiya darajasini baholash uchun ishlatildi. (b, c) DMNT, ildizlardan barglarga ko'chiriladi, natijada P. xylostella lichinkalarining o'lim darajasi (b) va pupatsiya (c) past bo'ladi. (d-f) 2 H-belgilangan DMNT (DMNT- 2 H) ildizdan barglarga ko'chiriladi. DMNT-2 H suyuq MS muhitida (a) dagi kabi 24 soat davomida eritildi va keyin barglar GC-MS tahlili uchun yig'ib olindi (e). DMSO nazorat sifatida ishlatilgan (d). DMNT- 2 H standarti mos yozuvlar uchun ko'rsatilgan (f). (g-i) (d-f) da ko'rsatilgan tashish tahlillari paytida olingan DMNT- 2 H TIC. Ma'lumotlar o'rtacha ± sem sifatida taqdim etiladi, (b, c) n=6, p-qiymatlari sezilarli farqni ko'rsatish uchun gistogramma ustunlari yonida ko'rsatilgan (ikki dumli juftlashtirilmagan t-test). E'tibor bering, transport tahlillari uchun qo'shimcha boshqaruv elementlari qo'shimcha ma'lumotlarga kiritilgan: S8-rasm. [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

Bundan tashqari, imtiyozli testlar yovvoyi turdagi Col-{0}} va rpx1-1 mutantlari turli uchuvchi birikmalar chiqarishi mumkinligini ko'rsatdi; ulardan biri DMNT bo'lib, zararkunandalarga qarshi samarali kurashadi (1b, 3a-rasmlar, Yordamchi ma'lumotlar: S5a-rasm). Yuqoridagi natijalarga asoslanib, biz rpx1-1da DMNT to'planishi hasharotlar zaharlanishining sabablaridan biri ekanligini taklif qilamiz. JA va SA signalizatsiya yo'llari hasharotlarga chidamlilikda ishtirok etishi haqida xabar berilgan (Costarelli va boshq., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). Ushbu tadqiqotda, hasharotlarni oziqlantirishdan 24 soat o'tgach, Col-0 va rpx1-1 mutantlarida JA va SA ning miqdori oshdi va rpx1-1 da SA tarkibining o'sishi Col-0 ga qaraganda ancha past bo'ldi. JA tarkibidagi o'sish ancha yuqori bo'ldi (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S6-rasm), bu JA va SA rpx1‐1 ning P. xylostella ga chidamliligida ham muhim rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi. Shuning uchun biz rpx1-1 ning bevosita va bilvosita ta'siri Arabidopsisning hasharotlarga qarshi chidamliligini oshirishni taklif qilamiz.

8-rasm RPX1 oqsilining parchalanishi Plutella xylostella infestatsiyasi va yaralarni davolash bilan bog'liq. (a) RPX1pro dan RPX1‐GFP: RPX1‐ GFP transgen oʻsimliklari P. xylostella bilan zararlanganda 15−120 daqiqa davomida parchalanadi. (b) (a) uchun nazorat sifatida 35Spro dan GFPning o'zi: GFP transgen o'simliklari lichinkalar bilan zararlanganda degradatsiyani ko'rsatmaydi. (c) 35Spro dan RPX1 bayrog'i: RPX1 bayrog'i transgen o'simliklar lichinkalar bilan zararlanganda buziladi. (d) RPX1pro dan RPX1-GFP: RPX1-GFP transgen o'simliklari 15−120 minut jarohatni davolashda parchalanadi. (e) RPX1pro dan RPX1-GFP: RPX1-GFP transgen o'simliklari to'qimalar 15−120 daqiqa davomida P. xylostella bilan zararlangan Col-0 o'simliklarining to'qimalari bilan eritmada inkubatsiya qilinganida buziladi. Immunitetni blokirovka qiluvchi chiziqlar ostidagi qiymatlar ImageJ yordamida aniqlangan nisbiy oqsil miqdorini ko'rsatadi. Ushbu tajribalarning barchasi kamida uch marta takrorlangan va vakillik natijalari ko'rsatilgan. Mustaqil transgen liniyalari bilan ko'proq eksperimental ma'lumotlar Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlarda ko'rsatilgan: S10-rasm. [Rangni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

Biz PEN{0}} vositachiligida DMNT to‘planishi o‘simliklarning P. xylostella ga chidamliligidagi RPX1 funksiyalariga qanday hissa qo‘shishini ko‘rsatuvchi bir qancha dalillarni taqdim etamiz. PEN1, seskiterpenoid va triterpenoid biosintez yo'liga tegishli asosiy gen, RPX1, PEN1 va DMNT o'rtasidagi aloqani ta'minlovchi rpx1-1 mutantidan olingan RNK-seq ma'lumotlarining KEGG tahlili natijasida aniqlandi (3b-rasm). , 2015). Zararkunanda lichinkalarini o'ldiradigan qo'zg'atuvchi birikmalardan biri sifatida DMNTni qo'llab-quvvatlash uchun DMNT rpx1-1 mutantlarida Col-0ga qaraganda ko'proq to'plangan (3a-rasm), lekin RPX1com liniyalaridagi daraja Col-0 ga qaytarildi ( 4a–c-rasm). Bundan tashqari, kimyoviy sintezlangan DMNT P. xylostella lichinkalarini qaytarishi va o'ldirishi mumkin (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S5a, b-rasm), bu rpx1‐1 natijalariga mos keladi (1b,e-rasm). Bundan tashqari, PEN1-ni haddan tashqari ifodalovchi transgen o'simliklar Col-0dagi DMNTning to'rt barobaridan ko'prog'ini ishlab chiqardi va P. xylostella ga rpx1-1 kabi qarshilik ko'rsatdi (5d, i, j, o, p va 6-rasm).

Muhimi, rpx1‐1dagi PEN1 transkript darajasini pasaytirish DMNT biosintezini bloklaydi (5d,g,h,m,n-rasm) va P. xylostella infestatsiyasiga moyil bo‘lgan P. xylostella lichinkalarini o‘ldirish ta’sirini engillashtiradi (6a,b-rasm). ). Ushbu birlashtirilgan natijalar PEN1 mutatsiyasi zararkunandalarga chidamlilikda RPX1 inaktivatsiyasi funktsiyasini bostirishi mumkinligini ko'rsatadi. RPX1 lezyoni PEN1 ko'pligini keltirib chiqaradi (5a-rasm), shunga qaramay, RPX1 PEN1 ni qanday aniq tartibga soladi va DMNT biosinteziga vositachilik qiladi, qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. RPX1 eIF4E oilasiga mansub yangi qopqoqni bog'lovchi oqsil sifatida bashorat qilinganligi sababli (Rhoads, 2009; Ruud va boshq., 1998), RPX1 PEN1 ga mRNK barqarorligi yoki oqsillarni tarjima qilish samaradorligiga ta'sir qilish orqali ta'sir qilishi mumkin, bu muhim bo'ladi. kelajakdagi o'rganish mavzusi. Bundan tashqari, shuni ta'kidlash kerakki, DMNT darajalari rpx1-1 mutantida P. xylostella infestatsiyasi tomonidan hali ham yuqori darajaga ko'tarilishi mumkin (5d-rasm), bu RPX1 dan mustaqil ravishda DMNT to'planishini tartibga soluvchi boshqa yo'llar bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. DMNT Arabidopsis (Sohrabi va boshq., 2015), paxta (Liu va boshq., 2018) va makkajo'xori (Richter va boshq., 2016) kabi keng turdagi o'simlik turlarida aniqlangan. Bundan tashqari, u yirtqichlarni jalb qilish orqali o'txo'r zararkunandalarga qarshi bilvosita himoya qiladi va o'simliklar zararkunanda tahdidlarini yo'q qilishga imkon beradi (Kappers va boshq., 2005; Li va boshq., 2010; Li va boshq., 2018). Biz yaqinda u P. xylostella lichinkalarini daf qilishi va o'ldirishi mumkinligi haqida xabar bergan edik, bu lichinkaning o'rta ichakchasidagi PMga zarar etkazishi mumkin (Chen va boshq., 2021). Bu erda biz lichinkalar rpx1-1 yoki PEN1 haddan tashqari ifodalangan ko'chatlar bilan oziqlanganda, PM tuzilishi jiddiy shikastlanishi mumkinligini aniqladik (2c-j va 6i,j-rasm). Ushbu natijalar biz ilgari tasvirlab bergan DMNT bilan davolash tajribalari natijalariga mos keladi (Chen va boshq., 2021), bu yana rpx1-1da DMNT to'planishi zararkunandalarning itarish va o'limiga hissa qo'shadigan omillardan biri bo'lishi mumkinligi haqidagi taklifni qo'llab-quvvatlaydi. RPX1 eIF4E genlar oilasiga tegishli (Rhoads, 2009) va o'simlik viruslarining hujayradan hujayraga harakatlanishida ishtirok etadi (Keima va boshq., 2017). Biroq, DMNT to'planishi o'simliklardagi viruslarga qarshilik bilan bog'liqmi yoki yo'qmi, noaniq qolmoqda. PEN1 ayniqsa Arabidopsis ildizlarida ifodalanadi, u erda DMNT biosintezini katalizlaydi (Sohrabi va boshq., 2015).

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Ushbu tadqiqotda izchil ravishda biz ildizlarda yuqori PEN1 ifodasini va barglarda juda past ifodani aniqladik (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S8a-rasm). Biz rpx1-1 mutantining barglari P. xylostella lichinkalari uchun zaharli ekanligini kuzatdik (1-rasm), bu DMNTning to'planishi va barglardagi zararkunandalarga chidamliligini oddiygina PEN1 ifodasi bilan izohlab bo'lmaydi. Ma'nosi shundaki, biz DMNTni o'simlik ildizlaridan havo qismlariga olib o'tish mumkinligini aniqladik, buni DMNT transport tahlillari va ildizlarida DMNT-2 H bilan inkubatsiya qilingan o'simliklardan barg ekstraktining GC-MS tahlili ko'rsatdi (7-rasm). Ushbu birikma o'simliklar ichida qanday tashilishi noma'lum va bu qo'shimcha tadqiqotlar uchun mavzu bo'lishi mumkin. O'simliklar turli yo'llar bilan hasharotlar hujumiga toqat qilish va ularga qarshi kurashish qobiliyatiga ega. Bu yerda RPX1pro: RPX1‐GFP va 35Spro: RPX1‐FLAG transgen oʻsimliklarining immunoblotting tahlilini oʻtkazish orqali biz P. xylostella yuqtirganda RPX1 oqsili tezda parchalanishi mumkinligini aniqladik (8a,c-rasm, qoʻllab-quvvatlovchi maʼlumot: S10a-rasm), holbuki , mRNK ifodasi darajasida RPX1 ta'sirlanmagan (qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S9b-rasm). Hozirgi vaqtda RPX1 oqsili qanday parchalanishi noaniq bo'lib qolmoqda, ammo bizning ma'lumotlarimiz birinchi navbatda oqsil parchalanish mexanizmi yaralanish signalizatsiya yo'llarida ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatdi (8d-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S10b-rasm).

Bundan tashqari, P. xylostella oldindan yuqtirgan Col-0 turli o'simliklarda RPX1-GFP degradatsiyasini keltirib chiqardi (8e-rasm), bu P. xylostella infestatsiyasi o'simliklarda signallarning to'planishiga olib kelishi mumkin, bu esa, o'z navbatida, RPX1 degradatsiyasi. Kelajakda signallarning kimligini aniqlash qiziqarli bo'ladi. RPX1 degradatsiyasining bu xususiyati o'simliklar uchun muhim bo'lib, bu DMNT to'planishiga olib kelishi va zararkunandalarning shikastlanishiga tez javob berishi mumkin (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S3-rasm). O'simliklarning zararkunandalarga chidamliligini oshirish ko'pincha fitnes hisobiga keladi. Arabidopsisda rpx1-1 mutatsiyasining qarshilik kuchayishiga (1-rasm) va yuqori urug' ishlab chiqarishiga olib kelishini kuzatish (qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot: S11-rasm) sezilarli o'zgarishlarsiz zararkunandalarga chidamliligi yuqori bo'lgan muhandislik ekinlari uchun istiqbolli yo'lni taklif qiladi. Masalan, CRISPR-Cas9 orqali genomni tahrirlash ekinlarni yaxshilash uchun kuchli vositadir (Yang va boshq., 2017), bu RPX1 ga mutatsiyalarni kiritish imkonini beradi va uni turli ekinlarga qo'llash imkoniyatlarini kengaytiradi.

ADABIYOTLAR

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, V. va Takabayashi, J. (2000) O't o'simliklari tomonidan qo'zg'atilgan uchuvchi moddalar Lima loviya barglarida himoya genlarini keltirib chiqaradi. Tabiat, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Vang, C., Tao, Z. va boshqalar. (2021) Uchuvchi DMNT hasharotlarning o'rta ichakchasidagi peritrofik matritsa to'sig'ini buzish orqali o'simliklarni to'g'ridan-to'g'ri Plutella xylostella dan himoya qiladi. eLife, 10, e63938.

Cheng, X., Xu, J., Li, J., Chen, J., Vang, H., Mao, T. va boshqalar. (2018) Ipak bezining shikastlanishi va phoxim ta'siri ostida Bombyx mori ning detoksifikatsiya qiluvchi fermentlar bilan bog'liq genlariga transkripsiyaviy javob. Kimyosfera, 209, 964–971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Gulli sho'ng'in: Arabidopsis thaliana ning agrobakteriya vositachiligida o'zgarishi uchun soddalashtirilgan usul. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. va boshqalar. (2020) O'txo'r hayvonlarni oziqlantirish natijasida hosil bo'lgan salitsil kislotasi hasharotlar hujumiga qarshi yasmonik kislota vositachiligidagi o'simliklarning himoyasini antagonizatsiya qiladi. Zavod signalizatsiyasi va xatti-harakati, 15, e1704517.

Duglas, AE (2018) hasharotlar zararkunandalariga chidamliligini oshirish strategiyalari. O'simliklar biologiyasining yillik sharhi, 69, 637-660.

Feng, Y. va Zhang, A. (2017) Gulli xushbo'y hid, metil benzoat samarali yashil pestitsiddir. Ilmiy hisobotlar, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Turli o'simliklardagi operonga o'xshash gen klasterlarini metabolik diversifikatsiyadan mustaqil ravishda yig'ish. Fan, 320, 543–547.

Go, YS, Li, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK va boshqalar. (2012) Arabidopsisda o'sish va rivojlanish uchun muhim bo'lgan mineral sintazani aniqlash. The Plant Journal, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Multitrofik doirada hasharotlarga qarshi bevosita va bilvosita kimyoviy himoya. O'simlik, hujayra va atrof-muhit, 37, 1741-1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K. va boshqalar. (2019) Kassava eIF4E nCBP-1 va nCBP-2 izoformlarini bir vaqtning o'zida CRISPR/Cas9 vositachiligida tahrirlash manokok jigarrang chiziq kasalligi belgilarining og'irligi va tarqalishini kamaytiradi. O'simliklar biotexnologiyasi jurnali, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Uchta parazit arilarning makkajo'xori (Zea mays), paxta (Gossypium herbaceum) va sigirdan tırtıllar tomonidan qo'zg'atilgan uchuvchi moddalarga antenna elektrofiziologik javoblari. (Vigna unguiculata). Kimyoviy ekologiya jurnali, 31, 1023–1038.

Handrik, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. va boshqalar. (2016) Makkajo'xori tarkibida 8-O-metillangan benzoksazinoid himoya birikmalarining biosintezi. O'simlik hujayrasi, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. va boshqalar. (2019) Ixtisoslashgan metabolik tarmoq Arabidopsis ildiz mikrobiotasini tanlab modulyatsiya qiladi. Fan, 364, eau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Julia-Kocienski olefinatsiyasida BT-sulfon yordamida moenocinol va uning analoglarini sintez qilish. Tetraedr harflari, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, V., Gao, T., Vu, Y., Chjan, N., Zhao, M. va boshqalar. (2020) CYP82D47 tomonidan katalizlangan o'txo'r hayvonlar tomonidan qo'zg'atilgan DMNT qo'shni choy o'simliklarining JA ga bog'liq o'txo'rlarga chidamliligini oshirishda muhim rol o'ynaydi. O'simlik, hujayra va atrof-muhit, 44, 1178–1191.

Jonson, SN & Züst, T. (2018) Iqlim o'zgarishi va hasharotlar zararkunandalari: qarshilik behuda emasmi? O'simlikshunoslik tendentsiyalari, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: yangi atrof-muhit xususiyatlari va yangiliklari bilan muvaffaqiyatli insektitsid. Amaliy mikrobiologiya va biotexnologiya, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Terpenoid metabolizmining genetik muhandisligi Arabidopsisga tansoqchilarni jalb qiladi. Fan, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara-Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N. va boshqalar. (2017) nCBP eIF4E izoformasining etishmasligi Arabidopsis thalianadagi uch gen blokli oqsillarni kodlaydigan o'simlik virusining hujayradan hujayraga harakatini cheklaydi. Ilmiy hisobotlar, 7, 39678.

Li, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. va Tholl, D. (2010) O'txo'rlar tomonidan qo'zg'atilgan va gulli monoterpen uchuvchi moddalar Arabidopsisda bitta P450 fermenti (CYP82G1) tomonidan biosintezlanadi. . Milliy Fanlar Akademiyasi materiallari, 107, 21205–21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Xu, L., Machado, RAR va boshqalar. (2018) Donli ekinlarda shira va tırtıl qarshilik o'rtasidagi metabolik almashinuvning konvergent evolyutsiyasi. Ilm-fan yutuqlari, 4, eat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, V., An, X., Chjan, Q., Chjan, H. va boshqalar. (2018) DMNT va TMTT biosintezida ishtirok etadigan Gossypium hirsutumning ikkita P450 fermentini aniqlash va funktsional tahlil qilish. O'simliklar biotexnologiyasi jurnali, 16, 581–590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) O'simliklardagi jasmonat signalizatsiyasi o'simlik-hasharotlarning o'zaro ta'siri ekologiyasini shakllantiradi. Hasharotlar fanidagi hozirgi fikr, 14, 32-39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Vang, L., Tan, Y., Huang, J. va boshqalar. (2018) Guruchning serotonin biosintezini bostirish orqali hasharotlar zararkunandalariga chidamliligi. Tabiat o'simliklari, 4, 338-344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) eIF4E1 genining CRISPR-Cas9 yo'nalishi Solanumning kartoshka virusi Y qarshilik spektrini kengaytiradi. tuberosum L. cv. istak. Mikrobiologiyadagi chegaralar, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. va Miao, X. (2019) Guruchdagi pirsing so'ruvchi hasharotlarga etilen va yasmon kislotasi yo'llarining javoblari o'rtasidagi yangi o'zaro bog'liqlik. Yangi fitolog, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW va boshqalar. (2019) Uchuvchi DMNT tizimli ravishda shirin kartoshka (Ipomoea batatas) o'simliklarining barglarida jasmonatdan mustaqil to'g'ridan-to'g'ri o'txo'rlarga qarshi himoyani keltirib chiqaradi. Ilmiy hisobotlar, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska-Banaszak, O., Skrzypczak-Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Glutation S-transferaza umumiy behushlikda toksiklik ko'rsatkichi sifatida: genetika va biokimyoviy funktsiya. Klinik anesteziya jurnali, 27, 73-79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: yangi oila a'zolari, yangi majburiy sheriklar, yangi rollar. Biologik kimyo jurnali, 284, 16711–16715.

Rixter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG va boshqalar. (2016) Zea maysda uchuvchi gomoterpenlar DMNT va TMTT ishlab chiqarish uchun biosintetik yo'llarning tavsifi. O'simlik hujayrasi, 28, 2651-2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Arabidopsis thalianadan yangi qopqoqni bog'laydigan oqsilni aniqlash va tavsiflash. Biologik kimyo jurnali, 273, 10325–10330.