MRNK vaktsinasi STINGga bog'liq o'smaga qarshi immunitetni keltirib chiqaradi

Abstrakt

Lipidli formulali RNK vaktsinalari kasallikning oldini olish va davolash uchun keng qo'llaniladi, ammo ularning ta'sir qilish mexanizmi va bunday harakatlarga hissa qo'shadigan individual komponentlar hali ham aniqlanmagan. Bu erda biz protamin/mRNK yadrosi va lipid qobig'idan tashkil topgan terapevtik saratonga qarshi vaktsina sitotoksik CD8+ T hujayralari javoblarini rag'batlantirish va o'simtaga qarshi immunitetni vositachilik qilishda juda kuchli ekanligini ko'rsatamiz. Mexanik jihatdan, mRNK yadrosi va lipid qobig'i dendritik hujayralardagi I turdagi interferonlar va yallig'lanish sitokinlarining ifodasini to'liq rag'batlantirish uchun kerak. Interferon-b ekspressiyasini stimulyatsiya qilish faqat STINGga bog'liq va mRNK vaktsinasining o'smaga qarshi faolligi nuqsonli Sting geni bo'lgan sichqonlarda sezilarli darajada buziladi. Shunday qilib, mRNK vaktsinasi STINGga bog'liq o'smaga qarshi immunitetni keltirib chiqaradi.

Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi

1.Kirish

SARS-CoV-2 infektsiyasining oldini olish uchun mRNK vaktsinalarining jadal rivojlanishi va butun dunyo bo'ylab qo'llanilishi sog'liqni saqlashda mRNKga asoslangan dori vositalarining kuchini ko'rsatdi1,2. Katta molekulyar og'irligi va manfiy zaryadi tufayli mRNK molekulalari sutemizuvchilar hujayralariga samarali kirish uchun etkazib berish vositalariga joylashtirilishi kerak. Nanometr o'lchamdagi etkazib berish vositalariga qadoqlash, shuningdek, mRNK molekulalarini fermentativ buzilishdan himoya qilishning afzalliklariga ega. Lipid nanopartikullari4, lipopolipleks (LPP)5, liposoma-protamin-RNK (LPR)6, RNK lipopleks (RNK-LPX)7 va virusga o'xshash vaktsina zarralari (VLVP) kabi maqsadga muvofiq bir nechta etkazib berish platformalari ishlab chiqilgan. )8. Har bir platforma o'ziga xos tuzilish va tarkibga ega bo'lsa-da, ko'pchilik transport vositalarida mRNKni qadoqlash va mRNK molekulalarining endosomalardan qochishini osonlashtiradigan ionli lipid molekulasi mavjud. Profilaktik vaktsinalarning muvaffaqiyati bilan, mRNK terapevtiklari, ehtimol, hammasi bo'lmasa-da, ko'pchilik kasalliklarni davolash uchun ishlatilishi mumkinligi haqida umumiy tushuncha mavjud9e12. Darhaqiqat, mRNKga asoslangan saratonga qarshi terapevtik vaktsinalar ko'p yillar davomida o'rganilgan13,14. Klinik tadkikotlardagi so'nggi yutuqlar, shuningdek, tanlangan saraton bemorlarida qo'llash imkoniyatlarini ko'rsatdi15e17. Yordamchi molekulalar18e20 bilan tayyorlangan peptidli saraton vaktsinalaridan farqli o'laroq, mRNK vaktsina zarralari o'z-o'zidan adjuvant sifatida ham xizmat qilishi mumkin21.

Misol uchun, erkin va protaminli kompleksli mRNKni o'z ichiga olgan ikki komponentli mRNK asosidagi saratonga qarshi vaktsina, shuningdek, to'lovga o'xshash retseptor 7 (TLR7) signalini faollashtirishi mumkin22. Biroq, yalang'och mRNKning o'tkir tug'ma immun toksikligi bo'yicha tashvish ortib borayotganligi sababli, ko'pchilik tadqiqotchilar va kompaniyalar TLRs23 tomonidan tug'ma tan olinmaslik uchun o'zgartirilgan RNKdan foydalanmoqda. Binobarin, lipid komponentlari mRNK vaktsina zarrachasida adjuvant faollikni oshirishda muhim rol o'ynaydi, afzallik bilan TLR bo'lmagan signalizatsiyani faollashtiradi. Lipid bilan tuzilgan, manfiy zaryadlangan RNK-LPX bo'yicha yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda 1{11}} di-oktadesenil-3-trimetilamoniy (DOTMA, kationik lipid)/dioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE, ba'zi bir yordamchi lipid aniqlangan) dan tashkil topgan. yallig'lanishga qarshi sitokinlar sekretsiyasini tartibga solishda interleykin 1 (IL1)-interleykin 1 retseptorlari antagonisti (IL{18}}ra) o'qining faollashishi va monositlarda ikki bosqichli yallig'lanish yo'lini faollashtirishning muhim roli24. Qizig'i shundaki, ALC-0315 (ionlashtirilgan lipid), 12-distearoil-sn-glisero{29}}fosfokolin (DSPC, yordamchi lipid) bilan tayyorlangan LNP asosidagi BNT162b2 bo'yicha yaqinda o'tkazilgan yana bir tadqiqot. , polietilen glikol-2000-N, N-di tetradesil asetamid (PEG2000-DTA) va xolesterin I-toifa interferonga bog'liq MDA5 signalini faollashtirishning asosiy rolini ko'rsatdi, lekin ikkalasini ham rag'batlantirishda TLR yoki yallig'lanishni emas. COVID{35}} vaktsinasining tug'ma va moslashuvchan immuniteti25. Ushbu tadqiqotlar o'zgaruvchan lipid molekulalaridan tashkil topgan etkazib berish platformalari vaktsina faolligi uchun turli xil signal uzatish yo'llariga tayanishi mumkinligini ko'rsatadi. Shunday qilib, mRNK terapevtikasini yanada takomillashtirish uchun asosiy molekulalar va ularning kombinatsiyalarining funktsiyasini to'liq o'rganish muhimdir.

Hozirgi tadqiqotda biz saratonga qarshi terapevtik vaktsinadagi individual komponentlarning funktsional rolini o'rganish uchun tajribalar o'tkazdik. mRNK vaktsina zarrasi (MVP) katyonik lipid, yordamchi lipid, pegillangan lipid va xolesterindan iborat lipid qobig'iga o'ralgan protamin/mRNK yadrosidan iborat (1A-rasm). Zaryadlangan lipidning qo'shilishi maqsadli RNKni etkazib berishni osonlashtirishi ko'rsatildi26 va dioleoiletil fosfatidilxolin (EDOPC) va dioleoil-3- trimetilamonyum propan (DOTAP) bu maqsadda sinovdan o'tgan kationik lipidlardan ikkitasi,55. Biz mRNK yadrosi, mRNKsiz vosita va butun MVP tomonidan interferon-b (IFN-b), IL{7}}b va o'simta nekrozi omili-a (TNF-a) ekspressiyasini stimulyatsiya qilishni tekshirdik va bunday faoliyatni TLR7, mitoxondrial antiviral signalizatsiya (MAVS, IPS-1 deb ham ataladi), IFN genlarining stimulyatori (STING) va IFN-b (TRIF) signalini induktsiya qiluvchi TIR-domenini o'z ichiga olgan adapter bilan bog'ladi. Keyinchalik, IFN-b va TNF-a ifodasini rag'batlantirishda yadrodagi protamin va qobiqdagi katyonik lipidning rolini o'rganib chiqdik. Nihoyat, biz yovvoyi tipdagi va gen nokautli sichqonlarda MVP dan o'smaga qarshi immun javoblarini solishtirdik.

Cistanche tubulosa-Antitumorning foydalari

2. Materiallar va usullar

2.1. Materiallar

1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-etilfosfokolin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfatidil-etanolamin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- [amino(polietilen glikol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoil-3-trimetilammoniy-propan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) (850375) Avanti Polar Lipids, Inc.dan sotib olindi. Birmingem, AL, AQSH). Xolesterin (C8667) Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh) olingan. Reagentlar DSPE-PEG2k uchun 2 mg/ml, xolesterin va DOPC uchun 10 mg/mL va EDOPC, DOPE va DOTAP uchun mos ravishda 20 mg/ml konsentratsiyada etanolda eritildi. Protamin sulfat (P4020) Sigma Aldrichdan olingan. Ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) va lyusiferaza (Luc-mRNA) (L-7204) ni kodlovchi mRNK molekulalari sotib olingan. TriLink Biotechnologies (San-Diego, CA, AQSh). RNazsiz suv (W0805-010) GeneDEPOT (Baker, TX, AQSH) dan olingan. TLR7 agonisti imiquimod (tlrimq) va Sting agonisti 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) Invivogen (San-Diego, CA, AQSh) mahsulotlari edi. Lipofektamin 2000 (11668019) va Quant-iT™ RiboGreen™ RNK tahlillari to'plami (R11490) Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, AQSH) dan sotib olingan. Rekombinant sichqoncha GM-CSF (554586) BD Biosciences kompaniyasidan (San-Diego, CA, AQSh) xarid qilingan. 500 Protein tashuvchisi inhibitori kokteyli (00-4980-93) Invitrogen mahsuloti edi. Cytofix/Cytoperm to'plami (AB_2869010) BD Biosciences'dan xarid qilingan. EasySep™ Sichqoncha T hujayra izolyatsiyasi to'plami (19851) STEMCELL Technologies, Inc. (Vankuver, BC, CAN) dan olingan. Quyidagi antikorlar BioLegenddan (San-Diego, CA, AQSH) olingan: anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) va anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) va anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) va anti-IFN-g-PE (554412) BD Biosciences kompaniyasidan edi. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) ImmuDex (Fairfax, VA, AQSh) dan xarid qilingan. IL-1b (EM2IL1B) va TNF-a (BMS607-3) uchun ELISA to'plamlari Invitrogen'dan, CCL5 (DY478) va IFN-b (DY8234) uchun ELISA to'plamlari R&D Systems'dan olingan , Inc. (Minneapolis, MN, AQSh). Western blot tahlili uchun antikorlar, jumladan anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) va anti-GAPDH (5174) Cell Signaling Technology, Inc.dan (Danvers, MA, AQSH) sotib olingan.

1-rasm mRNK zarralarini tayyorlash va tavsiflash. (A) Vaktsina zarrachalarini tayyorlashning sxematik ko'rinishi. (B) Agaroz gel elektroforezi shuni ko'rsatadiki, mRNK molekulalari mRNK/protamin bilan 1:1 dan 1:2 nisbatda tayyorlangan namunalardagi namuna yuklash qudug'ida saqlanib qolgan. (CeF) mRNK vaktsina zarralarini (MVP) inkapsulyatsiya foizi, polidisperslik indeksi, zeta potentsiali va o'lchamiga asoslangan tavsifi. (G) MVP2 zarralarining vakili TEM tasvirlari, masshtab paneli Z 50 nm. (H) DC2.4 xujayralari 16 soat davomida eGFP-MVPs bilan davolash qilinganidan keyin eGFP ifodasi foizi. (I) eGFP ifodalovchi DC2.4 xujayralarining lyuminestsent tasviri, masshtab paneli Z 400 mm. (J) 16 soat davomida lusiferaza kodlovchi mRNK bilan qoplangan MVPlar bilan ishlangan BMDClarda bioluminesansning miqdoriy tahlili. (K) PBS, mRNKsiz vosita, mRNK/protamin yadrosi yoki mRNK-kapsullangan MVP2 bilan ishlov berilgan BMDClarning hayotiyligidagi o'zgarishlar. Davolash konsentratsiyasi mRNK-ekvivalent edi. Ma'lumotlar o'rtacha SEM (n Z 3) sifatida taqdim etiladi. *P <0,05; **P <0,01.

2.2. Hujayra chiziqlari va hujayra madaniyati

DC2.4 sichqon dendritik hujayra liniyasi ATCC (Manassas, VA, AQSh) dan olingan va 10% homila sigir zardobi (FBS) va 1% penitsillin-streptomitsinni o'z ichiga olgan RPMI-1640da yetishtirilgan. Sichqoncha melanomasi hujayra liniyasi B16-OVA doktor Kennet Rokdan, Dana-Farber saraton institutidan (Boston, MA, AQSh) sotib olingan. B16-OVA hujayralari 10% FBS va 1% penitsillin-streptomitsin bilan toʻldirilgan DMEMda yetishtirildi. Sichqoncha yo'g'on ichak adenokarsinomasi hujayra liniyasi MC38 ATCCdan sotib olindi. Hujayralar OVA ifodasi bilan ishlab chiqilgan va DMEMda 10% FBS va 1% penitsillin-streptomitsin bilan o'stirilgan. Hujayra madaniyati 5% CO2 bilan 37 C da saqlanadi.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

2.3. mRNK vaktsinasi zarrachalarini tayyorlash

Barcha mRNK vaktsina zarralari organik faza va suvli fazani aralashtirish orqali Precision Nanosystems, Inc. (Vancouver, BC, CAN) kompaniyasining NanoAssemblr Benchtop mikrofluidik asbobi yordamida tayyorlangan. Organik fazani tayyorlash uchun EDOPC (20 mg / ml), DOPE (20 mg / ml), xolesterin (10 mg / ml) va bis-DSPE-PEG2k (2 mg / ml) etanolda eritildi va 34 ° C da aralashtirildi. :30:35:1 M nisbati 9 ml/min oqim tezligi bilan. Suvli fazali mRNK yadrosini tayyorlash uchun mRNK protamin sulfat bilan 1:1 (w/w) nisbatda mikrofluidik asbobda 9 ml/min oqim tezligida aralashtirildi. 20 C da 20 daqiqa inkubatsiyadan so'ng, mRNK vaktsina zarralarini hosil qilish uchun suvli fazali mRNK yadrosi organik faza bilan aralashtirildi. 20 daqiqadan so'ng, vaktsina zarralari suspenziyasi Amicon ultra santrifüj filtriga (MWCO 30 kDa) o'tkazildi va 9- etanol kontsentratsiyasini 25% dan 2,5% gacha suyultirish uchun molekulyar darajadagi suv qo'shildi. Keyin zarracha suspenziyasi 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) 4 C da santrifüjlash orqali konsentratsiyalangan. Osmotik bosimni sozlash uchun konsentrlangan mahsulotga teng hajmdagi 2 PBS qo'shilgan.

2.4. Jelni kechiktirish tahlili

mRNK/protamin yadrosi birinchi marta gel retardatsiyasi bilan tahlil qilindi. Qisqacha aytganda, 0,5 mg mRNK o'z ichiga olgan mRNK/protamin yadrosi 1 TBE eritmasidagi 1% agaroz jeli qudug'iga yuklandi va elektroforez 120 V da 30 daqiqa davomida amalga oshirildi (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNK bantlari Gelred (Biotium, Hayward, CA) bilan bo'yalgan va GelDoc tizimi (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.) bilan aniqlangan.

2.5. mRNK vaktsina zarralarining xarakteristikasi

Hajmi taqsimoti va zeta potentsiali yorug'likning dinamik tarqalishi Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, AQSH) bilan o'lchandi. Kapsülleme tezligi Quant-iT™ RiboGreen™ RNK tahlil to'plami yordamida aniqlandi. Qisqacha aytganda, 0,5 mg mRNK o'z ichiga olgan vaktsina zarralari namunasi TriseEDTA buferi (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) bilan 2% Triton-X100 bilan yoki bo'lmasdan suyultirildi. {10}}quduq plitasi. 37 C da 10 daqiqa inkubatsiyadan so'ng har bir quduqqa RiboGreen qo'shildi va floresan intensivligi o'lchandi. Kapsülleme samaradorligi tenglamada ko'rsatilganidek hisoblab chiqilgan. (1): Vaktsina zarralarining transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) ilgari tasvirlangan protsedura9 asosida amalga oshirildi.

2.6. Hayvonlar

Hayvonlarning barcha operatsiyalari Xyuston Metodist kasalxonasining Hayvonlarni parvarish qilish va foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (protokol raqami AUP06200042). Sichqonlar Milliy salomatlik instituti va Amerika hayvonlarni parvarish qilish laboratoriyasi assotsiatsiyasining me'yoriy standartlariga to'liq javob beradigan muhitda joylashtirilgan. Yovvoyi turdagi C57BL/6J sichqonlari va genetik jihatdan ishlab chiqilgan sichqonlar, jumladan Tlr7 /, Sting /, Mavs / va Trif / sichqonlari Jekson laboratoriyasidan sotib olingan.

2.7. Sichqoncha suyak iligidan olingan dendritik hujayralarni (BMDC) yaratish

Suyak iligi hujayralari femur va tibiadan to'liq RPMI 1640 bilan yuvildi. Qizil qon tanachalari ACK lizis buferi bilan parchalandi va yetilmagan suyak iligi hujayralari RPMI 1640 da 20 ng/ml rekombinant sichqon GM-CSF bilan to'ldirilgan 110 ga yetishtirildi. 5% CO2 bilan 37 C da kun. Hujayra madaniyati muhiti 3, 6 va 8-kunlarda yangilandi va yopishmagan dendritik hujayralar 10-kuni to'plandi.

2.8. Sitokinlar va kimyokinlarni o'lchash

BMDClar 24-quduq plastinkasiga 5  105 hujayralar zichligida ekilgan. 1 soatlik joylashishdan so'ng hujayralar 1 mg/ml imikimod, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml mRNK ekvivalenti) vaktsina zarralari yoki nazorat bilan ishlov berildi. Hujayra madaniyati muhiti 24 soatdan keyin yig'ildi va TNF-a, CCL5, IFN-b va IL{11}}b darajalari ishlab chiqaruvchi tomonidan tavsiya etilgan protseduralarga rioya qilgan holda ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) to'plamlari yordamida o'lchandi.

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

2.9. DC transfeksiyasi, DC etukligi va stimulyatsiyasi bo'yicha tahlillar

DC2.4 xujayralari in vitroda to'g'ridan-to'g'ri transfeksiya samaradorligini tahlil qilish uchun 24-quduq plastinkasida 2.5 105 hujayra/quduqqa ekilgan. Hujayralar 1 mg mRNK/mL yakuniy konsentratsiyasida eGFP- yoki lusiferaza kodlovchi mRNK-kapsullangan zarrachalar bilan ishlov berildi. Hujayralar 24 soatdan keyin yig'ib olindi, PBS eritmasida 2% FBS bilan yuvildi va BD LSR II oqim sitometri (LSR II, BD Biosciences, San-Xose, CA) bilan oqim sitometriyasini tahlil qilish uchun qo'llanilishidan oldin xuddi shu eritmada qayta suspenziya qilindi. . DC kamolotini va antigen taqdimotini in vitro o'lchash uchun BMDClar 2.5  105 hujayra/quduqqa 24-quduq plastinkasiga ekilgan va 24 soat davomida 1 mg/ml OVA-MVP bilan ishlov berilgan. BMDC'lar 30 daqiqa davomida CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 va CD{21}} uchun DC kamolotiga, antigen taqdimoti uchun esa anti-H{23}}Kb (SIINFEKL) antikorlari bilan bo'yalgan. In vivo jonli rag'batlantiruvchi kuchni aniqlash uchun C57BL/6J sichqonlari oyoq tagida sichqoncha uchun 10 mg OVA-MVP bilan bir marta emlandi va drenajlangan popliteal LN 24, 48 va quyidagi hujayra sirt belgilari: CD11c, MHC I, CD11b, B220 yig'ildi. , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Oqim sitometriyasi T hujayralarining faollashuvi va proliferatsiyasini tahlil qiladi

In vivo jonli ravishda T hujayralarining faollashuvini o'lchash uchun sichqonlar 10 mg OVA-MVP bilan bir marta emlangan va popliteal LNlar 24 yoki 48 soatda izolyatsiya qilingan. T hujayralari quyidagi antikorlar bilan bo'yalgan: CD45, CD3, CD4, CD8 va CD69. Antigenga xos T hujayralarini aniqlash uchun o'smalar, taloq va popliteal limfa tugunlari ikkinchi emlashdan 5 kun o'tgach yig'ib olindi. Toʻqimalar bir hujayrali suspenziyalar hosil qilish uchun qayta ishlandi va hujayralar ishlab chiqaruvchining koʻrsatmalariga muvofiq T hujayralariga xos antikorlar va OVA257e264-MHCI dekstrameri bilan boʻyaldi. Hujayra ichidagi IFN-g darajasini o'lchash uchun popliteal LN va o'smalardan ajratilgan 2  106 splenotsitlar yoki hujayralar 55 mmol/L b-merkaptoetanol va protein1 tashuvchisi inhibitori bilan to'la RPMI 1640 muhitida 10 mg/ml OVA257e264 peptid bilan stimulyatsiya qilindi. 18 soat davomida kokteyl. Hujayralar yig'ib olingan va T hujayralariga xos antikorlar bilan bo'yalgan. Cytofix/Cytoperm to'plami bilan fiksatsiya va o'tkazuvchanlikdan so'ng, hujayralar anti-IFN-g antikori bilan bo'yalgan va BD LSR II oqim sitometrida (BD Biosciences) tahlil qilish uchun qo'llanilgan. T hujayralari proliferatsiyasini o'lchash uchun T hujayralari sichqonchani T hujayralarini izolyatsiya qilish to'plami yordamida OT-I transgen sichqonlarining taloqlaridan ajratilgan. Ular 37 C da 10 daqiqa davomida 200 mg/ml BSA o'z ichiga olgan RPMI 1640 da 1 mmol/L CFSE bilan bo'yalgan. CFSE etiketli T hujayralari 5 hajmli sovuq to'liq RPMI 1640 bilan ikki marta yuvilgan. Shu bilan birga, etuk BMDClar bilan ishlov berilgan. T xujayrasi izolyatsiyasidan 24 soat oldin 2 mg / ml OVA mRNK-kapsullangan MVP. T hujayralari tayyor bo'lgach, BMDC va T hujayralari 72 soat davomida 1: 5 (DC: T) nisbatida birgalikda o'stirildi. Hujayralar yig'ildi va T hujayralari uchun sirt antikorlari bilan bo'yaldi, proliferatsiya BD LSR II oqim sitometri (BD Biosciences) yordamida sinovdan o'tkazildi va tahlil qilindi. Barcha oqim sitometriyasi natijalari FlowJo v10 dasturi (Ashland, OH, AQSh) bilan tahlil qilindi.

2.11. Tirik sichqonlarda protein ifodasini kuzatish

BALB/c sichqonlari 10 mg Luc mRNK-kapsullangan MVP bilan oyoq yostig'iga in'ektsiya yo'li bilan davolandi. Ular 6, 12, 24 yoki 48 soatdan keyin sichqonchaga 30 mg RediJect D-luciferin intraperitoneal AOK qilingan va bioluminesans Xenogen IVIS{9}} tasvirlash tizimi (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton,) bilan o'lchangan. MA, AQSh).

2.12. ELISpot tahlili

IP filtr plitalari 5{19}} ml 35% etanol bilan oldindan yuvilgan va etanol bug'lanishidan oldin PBS bilan 3 marta yaxshilab yuvilgan. Keyinchalik plitalar bir kechada 4 C haroratda anti-IFN-g tutilishiga qarshi antikorlar bilan qoplangan. Plitalar 37 C da 2 soat davomida 55 mmol/L b-merkaptoetanolni o'z ichiga olgan RPMI 1640 to'liq muhiti bilan bloklandi. Har bir quduqqa hujayralar (1  105 splenotsitlar, popliteal LN dan 1  105 hujayralar) ekildi va 10 mg/ml OVA257e264 peptid bilan 36 soat davomida rag'batlantirildi. Media tashlab yuborildi va hujayralar PBST (0,05% Tween 20 ni o'z ichiga olgan PBS) bilan 4 marta va PBS bilan ikki marta yuvildi. Yakuniy yuvishdan so'ng, anti-IFN-g aniqlovchi antikor qo'shildi va qorong'ida xona haroratida 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Plitalar PBST bilan 4 marta va PBS bilan ikki marta yuvildi va avidin-HRP qo'shildi va qorong'ida xona haroratida yana 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, plitalar yuqorida aytib o'tilganidek, yana PBST va PBS bilan yuvildi va 50 ml AEC substrati qo'llanildi va nuqta reaktsiyasi kuzatildi. Dog'lar paydo bo'lganda, reaktsiya AEC substratini tashlab, uni ikki marta distillangan suv bilan 5 marta yuvish orqali to'xtatildi. Bir kechada havoda quritilganidan so'ng, plitalar CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Klivlend, OH, AQSh) yordamida skanerdan o'tkazildi va tahlil qilindi.

2.13. Western blot tahlili

Yovvoyi turdagi Mavs KO yoki Sting KO sichqonlaridan olingan BMDClar to'plangan va hujayralar proteaza va fosfataza inhibitörleri bilan to'ldirilgan RIPA hujayra lizis buferida lizing qilingan. Hujayra lizatidagi oqsil kontsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami bilan o'lchandi. Protein namunalari natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) bilan ajratildi va poliviniliden diflorid (PVDF) membranasiga o'tkazildi. MAVS va STING ifodasi membrana anti-MAVS yoki anti-STING antikori bilan 1:2000 suyultirishda inkubatsiya qilingandan so'ng, SuperSignal West Pico va Femto Chemiluminescent Substrate bilan immunodetatsiyadan so'ng aniqlandi. STING yo'lining faollashuvini o'lchash uchun yovvoyi turdagi sichqonlardan olingan BMDClar 2 soat davomida belgilangan konsentratsiyada transport vositasi yoki OVA mRNK-kapsullangan MVP bilan ishlov berildi. Hujayralar parchalandi va anti-TBK1 va antifosfo-TBK1 antikorlari bilan 1:2000 suyultirishda Western blot tahliliga o'tkazildi.

2.14. Antitumor tahlili

Sichqoncha oʻsimtasi modellari 2  105 hujayra B16-OVA melanoma hujayralari yoki 5  105 MC38-OVA hujayralarini sichqonchaning teri ostiga 6 dan {{5} gacha boʻlgan chap qanotga inokulyatsiya qilish orqali hosil qilingan. }haftalik urg'ochi C57BL/6J sichqonlari. Sichqonlar tasodifiy davolash guruhlariga ajratildi va ikki marta 7 kunga ajratilgan 10 mg OVA MVP yoki oyoq panelidagi nazorat bilan davolandi. O'simta o'sishi har 2 kunda kuzatilgan. O'simta hajmi tenglamaga muvofiq hisoblab chiqilgan. (2):

Sichqonlar ikkinchi emlashdan 5 kun o'tgach evtanizatsiya qilindi va o'sma to'qimalarining og'irligi qayd etildi.

2.15. Statistik tahlil

Barcha natijalar o'rtacha SEM sifatida taqdim etiladi. Statistik ma'lumotlar bir tomonlama ANOVA testi bilan bir nechta guruhlarni taqqoslash uchun Tukeyning tuzatishi va ikki guruhli taqqoslash uchun juftlashtirilmagan ikki dumli t-testi yordamida baholandi. Ma'lumotlar GraphPad Prism v8.0.2 dasturi yordamida tahlil qilindi. P < 0.{{10}}5 statistik ahamiyatga ega deb hisoblandi (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P <0,005; ****P <0,001).

3. Natijalar

3.1. MVP dendritik hujayralardagi (DC) mustahkam mRNK ifodalanishiga vositachilik qiladi.

Biz yadro qobig'i vaktsina zarralarini ikki bosqichli mikro-suyuqlik yondashuvida tayyorladik (1A-rasm), va DClarda yuqori barqarorlik, yuqori hujayrali qabul qilish va yuqori ekspresyon potentsialiga ega vaktsina zarrachasini yig'ish uchun nanopartikuldagi individual komponentlarni tizimli ravishda baholadik. Jel elektroforezi mRNK-protamin nisbati 1 yoki undan past bo'lganida barqaror mRNK yadrosi hosil bo'lishi mumkinligini aniqladi (1B-rasm). Surrogat marker sifatida eGFP-kodlovchi mRNKdan foydalanib, biz 34% EDOPC/30% DOPE/35% xolesterin/1% DSPEPEG2k molyar nisbatdagi lipid tarkibi ideal inkapsulyatsiya tezligini va eng yaxshi ifoda samaradorligini ta'minlashini aniqladik (1-jadval, Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlar rasm. S1AeS1D). Zaryad nisbatini o'zgartirish kapsülleme tezligini, polidisperslik indeksini yoki zarrachalarning sirt zaryadini sezilarli darajada o'zgartirmadi (2-jadval, 1CeE-rasm); ammo, natijada zarrachalar hajmi 70 va 80 nm o'rtasida bo'lgan nisbati 12 va 16 o'rtasida bo'lgan bo'lsa, 120e130 nm diametri nisbatan bir marta nisbati (Fig. 1F va G) tushib ketdi. Eng yaxshi ifoda 12 zaryad nisbati bo'lgan MVP2 bilan ishlov berilgan DC2.4 hujayralarida aniqlandi (1H va I-rasm). Xuddi shunday naqsh zarralar mRNK kodlovchi lusiferaza bilan tayyorlanganda kuzatilgan va dozaga bog'liq ifoda aniqlangan (1J-rasm). mRNK-kapsullangan zarralar istalgan barqarorlikni namoyish etdi, chunki ular liyofilizatsiya yoki muzlashdan keyin faolligini yo'qotmadi (S1E va S1F-rasm). Bundan tashqari, suyak iligidan olingan dendritik hujayralar (BMDC) faqat mRNK yadrosi, mRNK molekulalarisiz tayyorlangan avtomobil zarrasi yoki mRNK o'z ichiga olgan MVP2 (1K-rasm) bilan davolash qilinganidan keyin sitotoksiklik yo'q edi. Shunday qilib, MVP2 eng yaxshi ifoda potentsialini namoyish etdi. U tadqiqotdagi barcha keyingi tajribalar uchun ishlatilgan va matnning qolgan qismida MVP sifatida belgilangan. MVP zarralari in vivo jonli ravishda mRNK molekulalarini samarali yetkazib bera oldi va tana vaznining o'zgarishiga asoslangan mRNK-kapsullangan MVP dan aniqlangan toksiklik yo'q edi (S1GeS1I-rasm).

3.2. MVP in vitro va in vivo antigen taqdimotini va T hujayra faollashuvini samarali tarzda induktsiya qiladi

Biz mRNK yadrosi, mRNKsiz vosita va OVA mRNK bilan qoplangan MVP ni tayyorladik va ularni DC kamolotini va antigen taqdimotini sinab ko'rish uchun qo'lladik (2A-rasm). MVP bilan davolash qilingan BMDC'lar CD40, CD80 va CD 86 kabi DC kamolot belgilarining dozaga bog'liq haddan tashqari ifodalanishini ko'rsatdi (2BeD-rasm). mRNKsiz vosita yoki mRNK-kapsullangan MVP bilan davolash MHC I haddan tashqari ko'payishini keltirib chiqardi (2E-rasm), bu ta'sir mRNK kompleksi emas, balki vosita bilan bog'liqligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, MVP bilan davolash natijasida anti-SIINFEKL-MHCI antikori (2F-rasm) bilan aniqlangan OVA257e264 antigen epitop-MHC I kompleksi (SIINFEKL-MHC I) hujayra yuzasida namoyon bo'ldi, bu antigenni samarali qayta ishlash va BMDClar tomonidan taqdim etilishini namoyish etdi. . Bundan tashqari, MVP bilan ishlov berilgan BMDC larning B3Z, OVA257e264 epitopini maxsus taniydigan CD8+ T hujayra liniyasi yoki OVA257e264-maxsus T hujayrasini ifodalovchi OT-I sichqonchasi taloqidan ajratilgan T hujayralari bilan birgalikda inkubatsiya qilish. retseptorlari, IL{26}} sekretsiyasini qo'zg'atdi, natija faqat transport vositasi yoki faqat mRNK/protamin yadrosi bilan ishlov berilgan DC bilan birgalikda qo'shilgan T hujayralarida kuzatilmadi (2G-rasm). Oqim sitometriyasi tahlili MVP bilan birgalikda inkubatsiyadan so'ng 32,5% proliferativ CD8+ T hujayralarini aniqladi (2H va I-rasm). OVA mRNK-kapsullangan MVP zarralari sichqonlarni intradermal in'ektsiya yo'li bilan davolash uchun ham qo'llanilgan. Drenajli limfa tugunlari hujayralarini tekshirish birinchi 48 soat davomida klassik DC (CD8+ DC, CD11b+ DC, CD103+ DC) va plazmatsitoid DC (pDC) oʻrtasida CD{34}} ifodasining barqaror oʻsishini aniqladi, bu DC stimulyatsiyasini koʻrsatadi. yetilish (2J-rasm). Davolash, shuningdek, limfa tugunlarida CD8+ T hujayralarining boyitilishiga yordam berdi, bu esa CD69+CD8+ T hujayralari populyatsiyasining sezilarli darajada ko'payishiga olib keldi (2K va L-rasm), bu davolash T hujayralarining faollashuvini ko'rsatadi. T-hujayra faollashuvini aniqlash uchun MVP bilan davolashdan 3, 5 yoki 7 kun o'tgach drenajlovchi limfa tugunlaridagi hujayralarni to'pladik va hujayralar OVA257e264 antigen peptid bilan sinovdan o'tkazilgandan so'ng ELISpot tahlillarini o'tkazdik (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot S2-rasm). MVP bilan davolash IFN-g ajraladigan hujayralarda katta sakrashga olib keldi, faollik 5-kuni eng yuqori (2M-rasm). Ushbu natijalar MVP bilan davolashdan so'ng mustahkam DC stimulyatsiyasini, antigen taqdimotini va T-hujayra faolligini ko'rsatdi.

1-jadval eGFP-kodlovchi mRNK bilan qoplangan nanozarrachalar tarkibi.

2-jadvalMVP ning lipid tarkibi va zaryad nisbatizarralar.

3.3. MVP kolorektal shish va melanomaning sichqon modellarida kuchli o'smaga qarshi immunitetni keltirib chiqaradi.

MVP MC38 yo'g'on ichak saratoni va B16 melanomasi bo'lgan sichqonlarni davolash uchun qo'llanilgan. Ikkala modelda ham OVA mRNK bilan qoplangan MVP bilan davolash ikki marta o'simta o'sishini teri ostiga to'liq to'sib qo'ydi; solishtirganda, eGFP mRNK bilan qoplangan MVP yoki vosita bilan davolash faqat o'simta o'sishiga aniqlangan inhibitiv ta'sir ko'rsatmadi (3AeD-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot S3-rasm). Limfa tugunlarida CD4 dan CD8 ga siljish naqshiga muvofiq (2-rasm), biz OVA mRNA bilan qoplangan MVP bilan davolash qilingan sichqonlarning o'smalarida CD8+/CD4+ T hujayralari nisbatining oshishini kuzatdik (3E-rasm). Bundan tashqari, biz OVA mRNK-kapsullangan MVP bilan davolash qilingan sichqonlarda taloq, limfa tugunlari va o'smalarida IFN-gþCD8+ T hujayralarida yuqori darajalarni aniqladik, lekin faqat transport vositasi yoki GFP mRNK-kapsullangan MVP bilan emas (3FeH-rasm, qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot). S4-rasm). Bundan tashqari, OVA mRNK-kapsullangan MVP davolash guruhidagi o'smalarda OVA257e264-MHCI dekstramer-musbat CD8+ T hujayralarida sezilarli o'sish kuzatildi, bu antigenga xos CD8+ T hujayralarining ko'payishini ko'rsatadi (3I-rasm). Taloq va limfa tugunlaridan ajratilgan hujayralar bilan ELISpot tahlili T-hujayra faollashuvida qo'shimcha yordam berdi (3JeM-rasm).

3.4. MVP STINGga bog'liq signalizatsiyani faollashtirish orqali tug'ma immunitet reaktsiyalarini rag'batlantiradi

Biz mRNK yadrosini, mRNKsiz vositani va mRNK kapsulalangan MVPni BMDC ni davolash uchun I IFN turi va yallig'lanishli sitokin ifodasini stimulyatsiya qilish uchun mas'ul bo'lgan asosiy omillar va yo'llarni aniqlash uchun qo'lladik. Qizig'i shundaki, MVP IFN-b sekretsiyasini qo'zg'atishda Tlr7 agonisti imiquimod kabi kuchli edi va faqat vosita IFN-b sekretsiyasini rag'batlantirishda faollik ko'rsatdi, garchi uning kuchi MVP kabi yuqori emas edi; ammo, faqat mRNK yadrosi IFN-b sekretsiyasini rag'batlantirishda samarasiz edi (4A-rasm). Natija shuni ko'rsatdiki, IFN-b ifodasini maksimal darajada oshirish uchun mRNK va avtomobildagi komponentlar kerak edi. Shu bilan birga, imiquimod va transport vositasi TNF-a va IL{8}}b ifodasini targ'ib qilishda o'xshash faollikni ko'rsatdi, MVP esa ulardan biriga qaraganda ancha kuchliroq edi (4B va C-rasm). Odatda NF-kB va IFN tartibga soluvchi omillar bilan bog'liq bo'lgan sitokin bo'lgan CCL5 ifodasi imiquimod, faqat transport vositasi yoki MVP bilan davolash qilingan hujayralarda teng darajada rag'batlantirildi (4D-rasm). TLR7, MAVS, STING va TRIF asosiy signal uzatish yo'llarining asosiy omillari bo'lib, ular virusli RNKga va shikastlangan DNK28e30 ga hujayra javoblariga vositachilik qiladi. Biz Tlr7, Mavs, Sting yoki Trif gen nokauti (KO) bo'lgan sichqonlardan BMDC'larni yaratdik va IFN-b va TNF-a ifodasini tekshirish uchun mRNK yadrosi, mRNKsiz vosita yoki mRNK kapsulalangan MVP bilan davolangan hujayralar.

Shakl 2 MVP tomonidan immun javoblarni rag'batlantirish. (A) mRNK/protamin yadrosi, mRNKsiz vosita va to‘liq MVP ning sxematik ko‘rinishi. (BeD) 24 soat davomida OVA-MVP bilan davolangandan so'ng BMDClarning etukligi. (E va F) MHC I ifodasi va 24 soat davomida OVA-MVP bilan davolashdan so'ng BMDClarda OVA257e264 antigen epitopi-MHC I kompleksi. (G) B3Z yoki OT-I T hujayralari bilan birgalikda inkubatsiya qilingan davolash qilingan BMDClarning IL-2 darajasi. (H va I) Proliferativ T hujayralarining oqim sitometriyasi tahlili. T hujayralarining vakillik xromatogrammalari ko'rsatilgan. (J) in vivo MVP davolashdan so'ng DC kamolotga. C57BL/6J sichqonlari OVA-MVP bilan davolandi va popliteal limfa tugunlaridagi DClar tahlil qilindi. (K va L) T hujayralari populyatsiyasini tahlil qilish. C57BL / 6J sichqonlari transport vositasi yoki OVA-MVP bilan davolandi va popliteal limfa tugunlaridagi T hujayralari oqim sitometriyasi bilan tahlil qilindi. (M) ELISpot tahlili. C57BL / 6J sichqonlari OVA-MVP bilan davolandi va limfa tugunlari ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plandi. Izolyatsiya qilingan hujayralar IFN-g-ekspressiv hujayralarni o'lchash uchun qo'llanildi. Ma'lumotlar o'rtacha SEM (n Z 3) sifatida taqdim etiladi. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P <0,001; ns, muhim emas.

3-rasm MVP dan o'simtaga qarshi faollik. (A) MC{2}}OVA o'simtasi o'sishini inhibe qilish. Ayol C57BL/6J sichqonlari teri ostiga 5  105 MC38-OVA o'simta hujayralari/sichqonchani 0 kunida emlangan va PBS nazorati, transport vositasini boshqarish, GFP-MVP yoki OVA-MVP bilan davolash qilingan. 3 va 1 kunlar0. (B) B16-OVA o'simtasi o'sishini inhibe qilish. Ayol C57BL/6J sichqonlari teri ostiga 2  105 B16-OVA o'simta hujayralari/sichqonchani 0} kunida emlangan va PBS nazorati, avtomobil nazorati, GFP-MVP yoki OVA-MVP bilan davolash qilingan. 3 va 1-kunlarda0. (C va D) 17-kundagi B16-OVA o'smalarining tasviri va og'irligi. (E) Davolanishdan keyingi sichqonlarning o'smalarida T hujayralari populyatsiyasi. (FeH) taloq, limfa tugunlari (LN) va davolashdan keyingi sichqonlarning o'smalarida IFN-gþCD8+ T hujayralari. (I) Davolanishdan keyingi sichqonlarning shishlarida OVAga xos CD8+ T hujayralari. (JeM) Davolanishdan keyingi sichqonlarning taloq va LN hujayralarining ELISpot tahlilining tasvirlari va miqdoriy tahlili. Ma'lumotlar o'rtacha SEM (n Z 5) sifatida taqdim etiladi. *P < 0.05; **P <0,01; ***P <0,005; ****P <0,001.

BMDC'lardagi Mavs va Stingning KO holati Western blot tahlili bilan tasdiqlangan (Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot rasm. S5A). Ajablanarlisi shundaki, Sting KO IFN-b sekretsiyasi bo'yicha ogohlantiruvchi faollikni faqat avtomobildan ham, MVPdan ham yo'q qildi (4E-rasm), bu MVP STING orqali I toifadagi IFN ifodasini faollashtirganini ko'rsatadi. Fikrni qo'llab-quvvatlash uchun biz tankni bog'laydigan kinaz 1 (TBK1) (S5B-rasm), odatda STING faoliyati31 bilan bog'liq bo'lgan kinazning fosforillanishini aniqladik. Bundan tashqari, bu yo'l TLR7 signalizatsiyasidan mustaqil edi, chunki imiquimod bilan davolash qilingan hujayralarda IFN-b ifodasi buzilmagan (4E-rasm). Taqqoslash uchun, Trif yoki Mavs KO MVP tomonidan ilgari surilgan IFN-b ifodasiga minimal ta'sir ko'rsatdi. Kutilganidek, imiquimod Tlr7 KO dan olingan BMDClarda IFN-b sekretsiyasini rag'batlantirishda samarasiz edi; ammo, Tlr7 KO MVP dan ogohlantiruvchi ta'sirga salbiy ta'sir ko'rsatdi (4E-rasm). Qizig'i shundaki, TNF-da xuddi shu muolajalardan olingan sekretiyada boshqa profil kuzatildi. Sting, Trif yoki Tlr7 ning nokauti MVP tomonidan stimulyatsiya qilingan sitokin ekspressiyasiga minimal ta'sir ko'rsatdi. Boshqa tomondan, Mavs nokauti faqat transport vositasi yoki MVP bilan ishlov berilgan hujayralardagi TNF-a darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (4F-rasm). Natija shuni ko'rsatadiki, MAVS MVP bilan davolashda DClarda TNF-a ifodasining asosiy regulyatori hisoblanadi.

3.5. MVP IFN-I va yallig'lanish sitokinlarining sekretsiyasini rag'batlantirish uchun STING va MAVS yo'llarini rag'batlantiradi.

Avtomobildagi STING va MAVS signalizatsiyasini rag'batlantirish uchun mas'ul bo'lgan komponentlarni aniqlash uchun biz asosiy komponentlarni almashtirish yoki o'tkazib yuborish orqali transport vositalari va MVPlarni tayyorladik va ularni BMDClarni davolash uchun qo'lladik. Sting agonisti siklik GMP-AMP (cGAMP) IFN-b sekretsiyasini rag'batlantirishda ijobiy nazorat bo'lib xizmat qildi. Avtomobildagi katyonik lipid EDOPC ni boshqa musbat zaryadlangan lipid DOTAP bilan almashtirish IFN-b sekretsiyasini butunlay yo'q qildi. Taqqoslash uchun, transport vositasidan va MVPdan ogohlantiruvchi ta'sir protamin bilan yoki protaminsiz saqlanib qoldi va bunday ogohlantiruvchi faollik buzilmagan Sting geniga bog'liq edi (4G-rasm). Qizig'i shundaki, lipid qobig'ining alohida komponentlari, shu jumladan EDOPC bilan davolash qilingan BMDC'lar kuchli IFN-b sekretsiyasini rivojlantirmadi (qo'llab-quvvatlovchi ma'lumot 6-rasm). Shunday qilib, EDOPC STING faollashuvi uchun zarur bo'lgan va uning faoliyati lipid nanopartikulyar (ya'ni, transport vositasi yoki MVP) shakllanishiga bog'liq. EDOPC yoki DOTAP bilan tayyorlangan avtomobil va MVP, shuningdek, yovvoyi turdagi va Mavs KO sichqonlaridan olingan BMDCSni davolash uchun qo'llanildi va hujayra o'sishi muhitida TNF darajalari aniqlandi. Kutilganidek, EDOPC ni DOTAP yoki DOPC bilan almashtirish avtomobil va MVP ning ogohlantiruvchi harakatlarini bartaraf etdi. Bundan tashqari, TNF-a darajasi Mavs KO hujayralarida yovvoyi turdagi hujayralarga nisbatan sezilarli darajada kamaydi, lekin kamaymadi (4H-rasm), bu MVP-rag'batlantiruvchi TNF-a ifodasini vositachilik qilishda qo'shimcha omillar ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi.

3.6. STING yo'li MVP vositachiligida o'simtaga qarshi immunitet reaktsiyalari uchun zarurdir

Yovvoyi turdagi va nokautli sichqonlarga OVA mRNK kapsulalangan MVP bilan ishlov berildi va DC kamolotga erishish va T hujayralarining ko'payishi tekshirildi. Sting KO CD80+ va CD{2}}+ DC hujayralari va CD69+ T hujayralarining foizini sezilarli darajada kamaytirdi (5AeD-rasm). ELISpot tahlili Sting KO sichqonlarining taloq va limfa tugunlarida MVP ning bir xil dozasi bilan davolash qilinganidan keyin yovvoyi turdagi sichqonlarga nisbatan sezilarli darajada kamaygan IFN-g hosil qiluvchi hujayralarni aniqladi (5EeH-rasm). Mavs KO ning ta'siri minimal edi, chunki CD44+CD8+ xotira T hujayralari, OVA257e264-MHCI dekstramer-musbat CD8+ T hujayralari yoki limfa tugunlaridagi IFN-g ishlab chiqaruvchi hujayralar soni yovvoyi bilan solishtirganda kuzatilmadi. sichqonlar turi (5IeL-rasm). Natija MVP tomonidan qo'zg'atilgan yallig'lanish sitokin ifodasida MAVSdan tashqari qo'shimcha omillar ham ishtirok etishi mumkinligi haqidagi tushunchani mustahkamlaydi. Yovvoyi turdagi va Sting KO sichqonlari B16-OVA o‘simtalarini emlash uchun qo‘llangan, sichqonlarga esa PBS nazorati yoki OVA mRNK-kapsullangan MVP bilan ishlov berilgan. Emlangan sichqonlardan olingan limfa tugunlari va o'simta namunalarida oqim sitometriyasi tahlili Sting KO sichqonlarida IFN-g hosil qiluvchi CD8+ T hujayralari sonining sezilarli darajada kamayganini aniqladi (6A va B-rasm). Natijada, Sting KO sichqonlarida faqat qisman inhibisyon bilan solishtirganda, MVP bilan davolash qilingan yovvoyi turdagi sichqonlarda o'simta o'sishi butunlay inhibe qilindi (6C-rasm).

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Munozara

Joriy tadqiqotda biz o'simtaga qarshi immunitet reaktsiyalarini rag'batlantirish bo'yicha MVPdagi individual komponentlarning funktsional rollarini muntazam ravishda o'rganib chiqdik. Hujayra asosidagi tadqiqotimiz mRNK molekulalari va MVPdagi RNKsiz vosita uning IFN-b va bir qator yallig'lanish sitokinlarini, shu jumladan IL-1b va TNF ifodasini targ'ib qilishda to'liq faolligi uchun zarurligini aniq ko'rsatdi. -dendritik hujayralardagi a. Bunday sitokinlar dendritik hujayralarni faollashtirishda va vaktsina vositasida o'smaga qarshi immunitetda muhim rol o'ynashi ko'rsatildi20. Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, sitokin ishlab chiqarishni rag'batlantirish tug'ma immunitetni sezishda ishtirok etadigan bir qator asosiy signal uzatish yo'llariga, shu jumladan STING va MAVS vositachiligiga bog'liq. STING IFN-b ifodasi uchun zarur bo'lsa-da, MAVS asosan TNF-a ifodasini tartibga solishda ishtirok etadi (6D-rasm). MVP vositachiligida o'simtaga qarshi immunitetga STING signalining ahamiyati T-hujayra faolligining pasayishi va natijada Sting KO sichqonlarida o'simta o'sishini inhibe qilishning buzilishi bilan namoyon bo'ladi. Bu natija STING faollashuvi sitotoksik T xujayrasi vositachiligida o'smaga qarshi immunitetni aniqlashi haqidagi boshqa hisobotlarga mos keladi32. MAVS virusli infektsiyaga javoban RIG-I-retseptorlari (RLR) signalizatsiyasida asosiy vositachi hisoblanadi. Ushbu yo'lning faollashishi yallig'lanish reaktsiyalarining kaskadiga olib keladi33. MAVS signalizatsiyasi yallig'lanish sitokinlarini, shu jumladan TNF-a ifodasini tartibga solishda katta rol o'ynashini hisobga olsak, Mavs KO sichqonlarida T hujayralarining faolligi buzilmasligi qiziq. Mumkin bo'lgan sabab shundaki, bunday sitokinlarning MVP tomonidan stimulyatsiyasi bir nechta yo'llar orqali amalga oshiriladi va MAVS yo'lining buzilishi sezilarli ta'sir ko'rsatish uchun sitokin ekspressiyasini etarlicha past darajaga tushirmaydi. Shu bilan bir qatorda, MAVS signalizatsiyasining yo'qolishi boshqa yo'llar bilan qoplanadi. MVP vaktsinasining ta'sir qilish mexanizmini yanada tushunish uchun ushbu yo'llarni aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab qilinadi. Garchi TLR7 an'anaviy ravishda mRNK terapevtikasi bilan bog'langan bo'lsa-da21, TLR7 signalizatsiyasi MVP faolligi vositachiligida katta rol o'ynamaydi. Joriy tadqiqotda to'liq metillangan mRNK molekulalarini qo'llash TLR7 signalini kamroq ahamiyatli qilgan bo'lishi mumkin. RNK metilatsiyasi TLR23 tomonidan tan olinishini bostirishi yaxshi isbotlangan. TRIF TLR3/7/8 signalizatsiyasi uchun kalit adapter oqsilidir28. Trifning nokauti MVP faoliyatiga ham ta'sir qilmaydi, bu yuqoridagi TLRlar, shu jumladan TLR7 MVPga uyali javoblarni vositachilik qilishda katta rol o'ynamaydi degan tushunchani kuchaytiradi. Saratonga qarshi vaktsinani ishlab chiqishda bir nechta Sting agonistlari qo'llanilgan, shu jumladan siklik dinukleotidlar va kichik va katta molekulyar birikmalar34e37. Bunday Sting agonistlari vaktsinani tayyorlash jarayonida tashqi yordamchi moddalar sifatida qo'shilishi kerak, bu esa vaktsina tarkibiga yana bir murakkablik qatlamini qo'shadi. Bundan tashqari, tashqaridan qo'shilgan Sting agonisti mRNK kompleksidan ajralib chiqqandan so'ng, istalmagan salbiy ta'sirga olib kelishi mumkin. Taqqoslash uchun, bizning MVP o'z-o'zidan yordamchi vosita bo'lib xizmat qiladi va saratonga qarshi vaktsina kontekstida ishlaydi, chunki vaktsinaning alohida tarkibiy qismlaridan hech biri, shu jumladan EDOPC ham sitokin ifodasini kuchaytira olmaydi. Qizig'i shundaki, katyonik fosfolipid EDOPC ni fosfolipid bo'lmagan DOTAP bilan almashtirib bo'lmaydi, u ham musbat zaryadlangan. Ushbu ikki kationik lipidlar orasidagi farqning potentsial mexanizmini taxmin qilish qiziq. Shu bilan birga, lipid molekulasi komponentining boshqa xususiyatlari, masalan, hidrofobiklik nanozarrachaning umumiy funktsiyasiga va uning nuklein kislotalar uchun etkazib berish samaradorligiga chuqur ta'sir qilishi mumkinligi hujjatlashtirilgan. Shunday qilib, to'liq ishlaydigan mRNK vaktsinasini tayyorlash uchun tegishli molekulalarni tanlashda ehtiyot bo'lish kerak. Xulosa qilib aytganda, biz mRNK asosidagi kuchli terapevtik saraton vaktsinasini ishlab chiqdik va ularning funksionalligi bilan vaktsinada alohida komponentlar ajratdik. Uning ta'sir mexanizmi profilaktik va terapevtik aralashuvlar uchun ishlatiladigan boshqa mRNK platformalaridan ancha farq qiladi. Joriy tadqiqotdan olingan bilimlar, albatta, kelajakda qo'shimcha mRNK terapevtiklarini rivojlantirishga yordam beradi.

4-rasm MVP tomonidan tug'ma immun javoblarni rag'batlantirish. (AeD) 24 soat davomida 1 mg/ml imiquimod, 1 mg/ml mRNK-ekvivalent yadro, transport vositasi yoki MVP bilan ishlov berilgan BMDClar. IFN-b, TNF-a, IL{7}}b va CCL5 darajalari Elishay bilan o'lchandi. (E va F) IFN-b va TNF - yovvoyi turdagi va gen nokaut (KO) sichqonlaridan olingan BMDClarning ifodasi. BMDClar 24 soat davomida ko'rsatilgan reagentlar bilan ishlov berildi. IFN-b va TNF-a Elishay bilan o'lchandi. (G) Yovvoyi turdagi va Sting nokautli sichqonlardan olingan BMDClarda IFN-b. BMDC'lar 2{27}} mg/ml cGAMP, 1 mg/ml mRNK-ekvivalent yadro, vosita yoki MVP bilan 24 soat davomida davolandi. Avtomobil (DOTAP): EDOPC ni DOTAP bilan almashtirish orqali tayyorlangan; transport vositasi (protaminsiz): protaminni tashlab ketish orqali tayyorlangan. ND: aniqlanmaydi. (H) TNF-a yovvoyi turdagi va Mavs nokaut sichqonlaridan olingan BMDClarda. BMDC'lar 24 soat davomida 1 mg / ml mRNK-ekvivalent yadro, vosita yoki MVP bilan ishlov berildi. Avtomobil (DOTAP): EDOPC ni DOTAP bilan almashtirish orqali tayyorlangan; transport vositasi (DOPC): EDOPC ni DOPC bilan almashtirish orqali tayyorlangan. Ma'lumotlar o'rtacha SEM (n Z 3) sifatida taqdim etiladi. ***P < 0.005; ****P <0,001; ns, muhim emas.

Shakl 5 Sting va Mavs nokaut sichqonlarida o'smaga qarshi immunitet reaktsiyalari. (AeD) Sting nokautli sichqonlarda DC va T hujayralari faollashuvining kamayishi. Yovvoyi turdagi va Sting nokautli sichqonlarga OVA mRNK-kapsullangan MVP bilan ishlov berildi va limfa tugunlari DC va T hujayralarini o'lchash uchun 48 soatdan keyin to'plandi. (EeH) Sting nokautli sichqonlarning taloq va limfa tugunlarida IFN-g-ekspressiv T hujayralarining kamayishi. Dog'larning tasvirlari ham, miqdoriy tahlillar ham ko'rsatiladi. (IeL) Mavs nokaut sichqonlarida T hujayralari faoliyatiga ta'sir qilmaydi. Yovvoyi turdagi va Mavs nokautli sichqonlarga PBS nazorati yoki OVA mRNK-kapsullangan MVP bilan ishlov berildi va limfa tugunlari CD44+CD8+ xotira T hujayralari (I), OVA257e264-MHCI dekstramer-musbat CD8+ o‘lchash uchun 48 soatdan keyin to‘plandi. T hujayralari (J) va IFN-g hosil qiluvchi hujayralar soni (K va L). Ma'lumotlar o'rtacha SEM sifatida taqdim etiladi (n Z 3 yoki 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P <0,001; ns, muhim emas.

Shakl 6 Stingga bog'liq o'smaga qarshi immunitet. (A va B) Yovvoyi tipdagi va B{5}}OVA o'smalari bo'lgan Sting nokaut sichqonlaridan keyin limfa tugunlari va o'simta to'qimalarida IFN-g-ekspressiv T hujayralari tahlili OVA mRNK-kapsullangan MVP bilan davolash qilindi. Sichqonlar 3 va 10 kuni davolandi, 15-kuni esa limfa tugunlari va o'smalar yig'ildi. Yagona hujayralar oqim sitometriyasi bilan tahlil qilindi. (C) Yovvoyi va Sting nokautli sichqonlarda o'simta o'sishini inhibe qilish. Sichqonlarga 3 va 1-kunlarda PBS nazorati yoki MVP bilan ishlov berildi0. Ma'lumotlar o'rtacha SEM (n Z 5) sifatida taqdim etiladi. *P <0,05; ****P <0,001; ns, muhim emas. (D) DClarda sitokin ishlab chiqarishga olib keladigan signal uzatish yo'llarining MVP stimulyatsiyasining sxematik ko'rinishi. IFN-b ifodasini rag'batlantirish faqat STING tomonidan vositachilik qilsa-da, TNF-a va IL{19}}b ifodasini vositachilik qiluvchi MAVS kabi bir qancha omillar mavjud.

Ma'lumotnomalar

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ va boshqalar. mRNK-1273 SARS-CoV-2 vaktsinasining koʻr faza tugagandan soʻng samaradorligi. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A va boshqalar. BNT162b2 Covid-19 vaktsinasining uchinchi dozasi xavfsizligi va samaradorligi. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. RNK terapevtikasi uchun uyali to'siqlarni bartaraf etish. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Gen terapiyasini ta'minlash uchun lipid nanopartikulyar tizimlar. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP va boshqalar. Lipopolyplex mRNK asosidagi emlashning o'simtaga qarshi immunitetini kuchaytiradi. Biomateriallar 2017;125:81e9.

6. Vang Y, Su HH, Yang Y, Xu Y, Chjan L, Blancafort P va boshqalar. Maqsadli saraton geni terapiyasi uchun herpes simplex virusi 1 timidin kinazni kodlaydigan o'zgartirilgan mRNKni tizimli etkazib berish. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC va boshqalar. Dendritik hujayralarga tizimli RNK etkazib berish saraton immunoterapiyasi uchun antiviral mudofaadan foydalanadi. Tabiat 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L va boshqalar. Saraton kasalligini davolash uchun virusga taqlid qiluvchi mRNK vaktsinasi. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNK vaktsinalari vaktsinologiyada yangi davr. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L va boshqalar. CAR T hujayralari yurak shikastlanishini davolash uchun in vivo ishlab chiqariladi. Fan 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garsia F, Leal L. mRNK vaktsinalari davrida OIVning funktsional davolanishiga umid bormi? Viruslar 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T va boshqalar. Eksperimental otoimmün ensefalomielitni davolash uchun yallig'lanishsiz mRNK vaktsinasi. Fan 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. Saraton immunoterapiyasi uchun mRNK vaktsinasi. Mol saratoni 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K va boshqalar. Saraton immunoterapiyasida mRNK: antigen manbasidan tashqari. Mol saratoni 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M va boshqalar. Shaxsiylashtirilgan RNK mutanom vaktsinalari saratonga qarshi poli-spesifik terapevtik immunitetni safarbar qiladi. Tabiat 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M va boshqalar. RNK vaktsinasi nazorat nuqtasi inhibitori bilan davolangan melanomada immunitetni qo'zg'atadi. Tabiat 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C va boshqalar. Yangi tashxis qo'yilgan glioblastoma uchun faol shaxsiylashtirilgan emlash sinovi. Tabiat 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA va boshqalar. Saraton immunoterapiyasi. Dendritik hujayrali emlash melanoma neoantigeniga xos T hujayralarining kengligi va xilma-xilligini oshiradi. Fan 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S va boshqalar. Neoantigen vaktsinasi Ib glioblastoma sinovida intratumoral T hujayralari javoblarini hosil qiladi. Tabiat 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Chjan J, Li J, Liu H va boshqalar. Zarrachali terapevtik vaktsina yordamida o'smaga qarshi immunitetni sinergik faollashtirish. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. mRNK vaktsinasi adjuvantligining tug'ma tuyg'usini yaratish. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J va boshqalar. Ikki faollikka ega messenjer RNK asosidagi vaktsinalar muvozanatli TLR-7-bog'liq adaptiv immun javoblarni keltirib chiqaradi va o'smalarga qarshi faollikni ta'minlaydi. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Toll-like retseptorlari tomonidan RNK tan olinishini bostirish: nukleozid modifikatsiyasining ta'siri va RNKning evolyutsion kelib chiqishi. Immunitet 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L va boshqalar. IL-1 va IL{3}}ra RNK vaktsinalariga yallig'lanish reaktsiyasining asosiy regulyatorlari hisoblanadi. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Li A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Skott MKD, Trisal M va boshqalar. PfizerBioNTech BNT162b2 vaktsinasiga tug'ma va adaptiv immunitet mexanizmlari. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Lipid nanozarrachalarida yordamchi lipidlarni zaryadlangan muqobillar bilan almashtirish taloq va o'pkaga maqsadli mRNK yetkazib berishni osonlashtiradi. J Boshqarish relizi 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA va boshqalar. Saratonni davolash uchun kichik aralashuvchi RNK: etkazib berishdagi to'siqlarni bartaraf etish. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. I-toifa interferon reaktsiyasi va saraton kasalligining tug'ma immunitetini sezish. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. DNK shikastlanishidan keyin mitotik progressiya mikroyadrolarda naqshni aniqlash imkonini beradi. Tabiat 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S va boshqalar. DNK shikastlanishi mikroblarga qarshi tug'ma immunitetni oshirish uchun sitozolik DNK sensori STING orqali I turdagi interferon tizimini ishga tushiradi. Immunitet 2015;42:332e43.

31. Chjan Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikaz DDX41 dendritik hujayralardagi STING adapteri vositachiligida hujayra ichidagi DNKni sezadi. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH va boshqalar. Terapevtik STING faollashuvining kattaligi CD8+ T xujayralari vositasida o'smaga qarshi immunitetni aniqlaydi. Hujayra vakili 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. RIG-I va MDA5 ning naqshni aniqlash va signalizatsiya mexanizmlari. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E va boshqalar. STING agonisti tomonidan ishlab chiqarilgan saraton vaktsinalari PD-1 blokadasiga chidamli o'smalarni davolashi mumkin. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE va boshqalar. O'simta mikro muhitida STING ning to'g'ridan-to'g'ri faollashishi o'smaning kuchli va tizimli regressiyasiga va immunitetiga olib keladi. Hujayra vakili 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Xan J va boshqalar. Geterotsiklik lipidlar bilan mRNK vaktsinalarini etkazib berish STING vositachiligida immun hujayra faollashuvi orqali o'smaga qarshi samaradorlikni oshiradi. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Vang H, Vang Z, Cai H, Lu Z, Li Y va boshqalar. Saraton immunoterapiyasi uchun STING faollashtiruvchi nano vaktsina. Nat Nanotexnol 2017;12:648e54.

38. Vang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Kationik o-almashtirilgan fosfatidilxolin hosilalarining ikkilik aralashmalarining transfeksiya faolligi: hidrofobik yadro jismoniy xususiyatlarni va DNKni etkazib berish samaradorligini kuchli modulyatsiya qiladi. Biophys J 2006; 91: 3692e706.