Gallik kislotasi bilan konjugatsiyalangan peptid formulasining (Gal2-Pep) antioksidant va qarishga qarshi potentsiali
May 04, 2023
Teri erta qarishga juda moyiltashqi stress tufayli, shuning uchun ushbu tadqiqotda peptid formulasi (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) TPPTTP peptidi va gallini birlashtirib sintez qilingankislota (GA). Barcha peptidlar qattiq fazali peptid yordamida 2-xlorotritilxlorid qatronida sintez qilindi.sintez (SPPS) va elektrosprey ionizatsiyasi (ESI) / kvadrupol-vaqtda tahlil qilingan.flflight (Q-TOF) tandem massa spektroskopiyasi (MS) tizimi. Dastlab, Gal2–Pep 100 konsentratsiyasidan past toksiklikni ko'rsatmadimkeratinotsitlar uchun 88 foiz hujayra omon qolish darajasi bilan M vafibroblastlar. Thereaktiv kislorod turlariGalning (ROS) tozalash faoliyati2–Pep faqat GA bilan solishtirganda ancha barqaror edi; va xonada to'rt hafta o'tgachharorat, uningROSni tozalash faoliyati50 foizdan yuqoriligicha qoldi. Bundan tashqari, peptid formulasi,Gal2–Pep, shuningdek, CCD-1064Sk.da elastazni inhibe qiluvchi ta'sir ko'rsatdifibroblasthujayralar. RT-qPCR natijalariga asoslanib, ushbu tadqiqotda Gal2–Pep PGC ifodasini oshirdi-1a uchunoldini olishoksidlovchi stress, va uning salohiyati sifatida tasdiqladiqarishga qarshi vositatomonidanifodasini oshirishI turdagi kollagenva tomonidanmatritsa metalloproteinaz-1 (MMP1) ifodasini kamaytirish. Thetopilmalar Olingan ma'lumotlar ushbu tadqiqotda sintez qilingan peptid formulasidan foydalanish mumkin degan fikrni kuchaytiradi.tabiiy antioksidantvaqarishga qarshi vositauning kosmetik ilovalari uchun.
Cistanche Anti-aging mahsulotlari haqida ko'proq ma'lumot olish uchun shu yerni bosing
1.Kirish
Terining qarishikeratinotsitlar va brolarning hujayra bo'linishining asta-sekin kamayishi va oxir-oqibat to'xtashi natijasida yuzaga keladi.teri ichidagi portlashlar. Hujayralar sonining kamayishi bilan teridagi ajinlar paydo bo'ladi, natijada hujayradan tashqari matritsaning denaturatsiyasi quruqlikka va elasning yo'qolishiga olib keladi.teridagi tirnash xususiyati.1 Hujayra ichidagi mitoxondriyal DNKning shikastlanishiva oqsil sintezi tezligining pasayishi ham sodir bo'laditerining qarishi jarayonida.2 Teri qarishining ikkita asosiy yo'li borultrabinafsha (UV) ta'siri bilan ichki va tashqi yo'llar
ning asosiy haydovchisitashqi qarish. UV nurlari terining asosiy qismlari bilan reaksiyaga kirishadilipidlar, oqsillar va nuklein kislotalarni o'z ichiga olgan holda, hujayralarga olib keladigan reaktiv kislorod turlarini (ROS) hosil qiladi.o'lim.3–5 Haddan tashqari ROS darajalari ham parchalanishga olib keladi vakollagen yoki elastin zanjirlarining g'ayritabiiy bog'lanishi va kollagenni parchalaydigan MMP-1 kabi matritsali metalloproteinazalarning (MMP) ifodalanishini rag'batlantiradi, bu esa terining ajinlanishiga olib keladi vaterining qarishini tezlashtirish.6,7 Shuning uchun, olib tashlash uchun antioksidant terapiyaROS va mitoxondrial potentsialni faollashtirish terini qarishdan himoya qilish uchun foydalidir.
ROSga qo'shimcha ravishda elastazning yo'qolishida muhim rol o'ynayditerining elastikligi, bu muhim oqsil bo'lgan elastinni parchalaydihujayradan tashqari matritsa.8 Elastin, sezilarli darajada elastik orqaga qaytish tufaylixususiyatlari teriga elastiklik beradi, elastaz esa mavjudelastin va boshqa oqsillarni parchalash qobiliyati.8 Shuning uchun, inhibisyonelastaz fermenti orqali terining sarkması uchun asosiy strategiya bo'lishi mumkin terining elastikligini yo'qotishning oldini olish.
Ushbu tadqiqotda biz birlashtirgan yangi materialni ishlab chiqdikperoksisoma proliferatori bilan faollashtirilgan retseptorlari gamma koaktivatori1-alfa (PGC-1a) - olingan peptid TPPTTP va gallik kislotasi (GA)qarishga qarshi kosmetikadan foydalanish uchun. GA turli meva va sabzavotlarda, jumladan uzum, pomidor va yashil choyda topilgan, antioksidant va antibakterial xususiyatlarga ega bo'lgan fitokimyoviy moddadir. effboshqalar.9 GA kosmetika va oziq-ovqat sanoatida qo'llanilsa-da, bu foydali effva hokazo, uning formulasi beqaror bo'ladi.10 Biz shunday ishlab chiqdik (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) PGC ga bogʻlash orqali GA barqarorligini oshirish uchun-1a- TTPTTP olingan peptid.
Ushbu tadqiqotda biz (galloil) sintez qildik.2–KTPPTTP (Gal2– Pep) gallik kislota bilan konjugatsiyalangan peptid formulasi va tasdiqlanganantioksidant va qarishga qarshi vosita sifatida uning salohiyati.
2. Materiallar va usullar
2.1. Materiallar
Dulbecco tomonidan o'zgartirilganEagle's Medium (DMEM), penitsillin/streptomitsin, homila sigir zardobi (FBS), fosfat-buo'no'rnatildisho'r suv (PBS) va tripsin Gibco (Carls
yomon, CA). Gidroksibenzotriazol (HOBt), diizopropil karbodiimid (DIC), 1,8-diazabitsiklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diizopropiletilamin (DIEA), gallik kislota vaN-suksinil-tri-alanil-pnitroanilid Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO) olingan.LAminokislotalarni hosil qiladi (Fmoc-Lys (Boc)–OH% 2c Fmoc-Thr (tBu)–OH va Fmoc-Pro–OH) Bead-Tech kompaniyasidan sotib olingan (Seul,Koreya).
2.2. Peptidlar va gallik kislotasi bilan bog'langan peptidlarning sintezi
Barcha peptidlar 2-xlorotritilxlorid qatronida (200) sintez qilingan.mmol shkalasi, almashtirish qiymati¼ 1,46 mmol g 1) HOBt yordamida–DIC vositachiligida qattiq fazali peptid sintezi (SPPS).
SPPS usuli yordamida peptid sintezi engil modifikasiya bilan amalga oshirildioldingi tadqiqotlarga ishora qiluvchi kationlar.11–13 2-xlorotritilxlorid (CTC) qatroni dixloroda shishgan
metan (DCM, 8 ml) 30 daqiqa. Qatronlar bilan yuvilgandimetilformamid (DMF). Barcha reaktsiyalar xona haroratida amalga oshirildi. Fmoc bilan himoyalangan aminokislota hosilalari (2 ekvivalent(Ekviv.), uchunFibirinchi biriktirilgan aminokislota yoki 5 ekviv., boshqa aminokislotalar uchun) DMF a da DIEA (biriktirilgan aminokislota uchun 5 ekviv.) yoki HOBt/DIC (6 ekviv./5 ekviv.) bilan birlashtirilgan.fterDMFda 2 foiz (v/v) DBU yordamida Fmoc himoyasini bekor qilish (vaqtiga 2 marta, 2 minut, 8 ml). Va barcha qadamlar DMF bilan 5 marta yuvildi. Yakuniy gallik kislota lizin biriktirilgan peptidlar bilan birlashtirildi.Gallik kislotaning birikishidan so'ng, qatron bo'ldiayuvilgan, yuvilgan,va yuqori vakuum ostida quritiladi. Bo'linish eritmasi (TFA:deionizatsiyalangan [DI] suv: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v foiz ) 2 soat davomida davolandi.xom peptidlarni olish uchun. Xom peptidlar cho'ktirildi va sovuq dietil efir bilan uch marta yuvildi.
Analitik teskari fazali yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi(RP-HPLC) Waters 2695 Separationsda o'tkazildiCapcell Pak C18 ustunli modul (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Mobil bosqich H.da 0,05 foiz TFAdan iborat edi2O (mobil faza A) va asetonitrilda 0.05 foiz TFA (mobil faza B).
Elutsiyaga mobil telefonlar uchun chiziqli gradient yordamida erishildiB fazasi 5 foizdan 65 foizgacha, a da 30 minut ichidaoqim tezligi 1.0 ml min 1. Peptid cho'qqilari 230 nm to'lqin uzunligida aniqlandi. Yarim tayyorlovchi RP-HPLC Gemini RP-C18 bilan Waters HPLC tizimida (Pump 600E, UV detektori-484) o'tkazildi.ustun (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Mobil bosqich H.da 0,05 foiz TFAdan iborat edi2O (mobil faza A)va asetonitrilda 0.05 foiz TFA (mobil faza B). Elutsiyaga B ning mobil fazasi uchun chiziqli gradient yordamida erishildi15 daqiqada 7 foizdan 22 foizgachaloqim tezligi 10 ml min 1. Thepeptid cho'qqilari 230 nm to'lqin uzunligida spektrofotometrik tarzda aniqlandi.
Sintezlangan peptidlar suvda 5 foizli chumoli kislotada eritildi va elektrosprey ionlashda (ESI) tahlil qilindi.to'rt kutupli vaqtlight (Q-TOF) tandem massa spektroskopiyasi(MS) tizimi (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Namunalar bilan jihozlangan Q-TOF tizimiga AOK qilingana da nano-spray manbailstavkasi 1mL min 1. ESI ionimanba parametrlari quyidagicha edi: ion purkash kuchlanishi 1,5 kV, parda gazi 10 psi va qobiq gazi 5 psi. Spektrlarto'liq skanerlash rejimi va MS/MS oralig'ida to'planganm/z
100–Spektr uchun 25 ms to'planish vaqtida 1200 Da.To'qnashuv energiyasi 10 dan 80 gacha ko'tarildi. Natijadama'lumotlar Analyst TF yordamida olinganBuyum va avtomatikcentroid tomonidan 80 foiz minimal cho'qqi bilan tayinlangan, shovqinni 10 foizga kamaytirish, 3 foizlik pol bilan o'rtacha deizotoplash, shovqinni kamaytirish va silliqlash yo'q. Sintezlangan peptidlar aniqlandining ommaviy bardoshliligi bilan 0.05 Da va MS/MS toleransi yordamida qoʻlda tartiblangan % 7b% 7b0}}.01 Da.
2.3. Hujayra madaniyati va yashash qobiliyatini tahlil qilish
Inson, kattalar, past kaltsiy, yuqori harorat (HaCaT) hujayralariva CCD-1064Sk (oddiy inson terisifibroblast) hujayralari mavjud ediDMEMda 10 foiz FBS va 1 foiz penitsillin bilan yetishtiriladi/streptomitsin. Hujayralar 37 da inkubatsiya qilindi C 5 foiz CO bilan namlangan havo kamerasida2.Hayotiylikni tahlil qilish uchun hujayralarni hisoblash to'plami-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Pekin, Xitoy) ishlatilgan. HaCaT va CCD-1064Sk hujayralari96-quduq mikroplyonkalariga (5 103 har bir quduqda hujayralar) va 37 da inkubatsiya qilinadi C 5 foiz CO ichida2 24 soat davomida. Keyin madaniyatlar sintezlangan peptidlar yoki GA ning turli konsentratsiyasiga ta'sir qildi va 37 da inkubatsiya qilindi. C 5 foiz CO ichida2 24 soat davomida. Hujayra hayotiyligikeyinchalik ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq CCK-8 yordamida o'lchandi.
2.4. Antioksidant faolligini aniqlash
2.4.1. DPPH tahlili.Sintezlanganning antioksidant faolligipeptidlar va GA DPPH tahlili yordamida individual ravishda baholandi. DPPH tahlillari avval xabar qilinganidan keyin amalga oshirildi
kichik modifikatorlar bilan metodologiyakation.12,14–16 Birinchidan, 0.12 mg ml 1 DPPH eritmasi metanolda, keyin 100 dan tayyorlanganmL DPPH eritmasi va 100mSintezlangan peptidlarning L yoki GA turli konsentratsiyalarda ({0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM va 1) aralashtiriladi.mM) 96-quduq mikroplyonkalarida. Orbital silkituvchi inkubatordaaralashmalar 30 daqiqa davomida 37 da reaksiyaga kirishdi C va 100 aylanish / minyorug'lik. Keyin absorbans 517 nm da o'lchandi va antioksidant quvvati hisoblab chiqildi.
2.4.2. ROSni tozalash faoliyati.
Hujayra ichidagi ROSni tozalash faoliyati 20,70-diklorofluoresein diasetat to'plami yordamida baholandi.(DCF-DA, Abcam, AQSh). HaCaT xujayralari 96-quduq mikroplastinkalariga (5 103 har bir quduqda hujayralar) va 37 da inkubatsiya qilinadi C 24 soat davomida.Aftinkubatsiyadan so'ng, madaniyatlar sintezlangan peptidlar yoki GA (100) ta'siriga duchor bo'ldi.mM) va 37 da inkubatsiya qilingan C 24 soat davomida. Keyin hujayralar 10 ga ta'sir qildimM DCF-DA eritmasi va 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi. Aftinkubatsiyadan so'ng, eritma PBS bilan yuviladi. Thehujayralar qo'zg'alishda mikroplate o'quvchi yordamida tahlil qilindi va
emissiya to'lqin uzunligi mos ravishda 485 nm va 530 nm.
1-rasmning kvadrupol-vaqtidan foydalangan holda peptidlarning sintetik bosqichi va ketma-ketligini tasdiqlashparvoz(Q-TOF) massa spektrometriyasi: (a) batafsil sintetik protsedura (b) TPPTTP, (c) galloil–TPPTTP va (d) (galloil)2–KTPPTTP.
2.5. Mitoxondriyal membrana potentsialini tahlil qilish
Mitoxondriyal uchun JC{0}} bo'yoq (Thermo Fisher, AQSH) ishlatilgan.membrana salohiyati (MmP) tahlili. CCD-1064Sk va HaCaT xujayralari 96-quduq mikroplastinkalariga ekilgan (5) 10 3quduqdagi hujayralar)
va 37 da inkubatsiya qilinadi C va 5 foiz CO da2 24 soat davomida. Aftinkubatsiya,madaniyatlar sintezlangan peptidlarning turli konsentratsiyasiga ta'sir ko'rsatdi va 37 da inkubatsiya qilindi. C 5 foiz CO ichida2 24 soat davomida.CCD-1064Sk va HaCaT hujayralariga JC-1 boʻyoq qoʻshildi.ishlab chiqarish a Yakuniy konsentratsiya 10mM. After 10 daqiqa inkubatsiya, hujayralar ikki marta 37 bilan yuvildi C PBS. Yashil va qizilfloresansVarioskan LUX yordamida o'lchandiMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, AQSH).ta'sir (lMasalan)/emissiya (lEm) 475/530 nm va alMasalan/lEm475/mos ravishda 590 nm.
2.6. Elastazni inhibitiv faollik tahlili
CCD-1064Sk hujayralari 6-quduq plastinkalariga ekilgan va 37 da inkubatsiya qilingan. C 5 foiz CO ichida2 24 soat davomida. Keyin madaniyatlar 100 kontsentratsiyasiga ta'sir qildimSintezlangan peptidlarning M yoki GA va 37 da inkubatsiya qilinadi C 5 foiz CO ichida2 24 soat davomida. Hujayralar dPBS bilan ikki marta yuvildi va biz har bir hujayrani hujayra qirg'ichidan foydalanib yig'dik. Aer qo'shish 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) bilan 0,1 foiz Triton-X yig'ilganhujayralar, hujayralar ultrasonikator tomonidan homogenlashtirildi. Gomogenlashtirilgan eritma 3000 aylanish tezligida 20 daqiqa davomida santrifüj qilindiva 4 C. Keyin, after supernatant, oqsil miqdorini olish-kation BCA protein tahlili yordamida amalga oshirildi. Har biri uchun proteinda namuna tarqatildiFikonsentratsiyasi 100 ga tengmgmL 1, vaN-suksinil-tri-alanil-p-nitroanilid qo'shilganyakuniy konsentratsiyasi 1,6 mM va 36 da reaksiyaga kirishdi C 1 soat davomida.Keyin, absorbans 405 nm da mikroplata o'quvchi yordamida o'lchandi.
2.7. RT-qPCR
CCK-1064Sk hujayralarida qarishga qarshi markerlarning mRNK darajalariRT-qPCR yordamida baholandi. Umumiy RNK TRIzol reagenti (Life Technologies, Carlsbad, CA) yordamida to'plangan va teskari
PrimeScript RT reaktiv to'plami (Takara BioInc., Kusatsu, Yaponiya). CFX96 tizimi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) va iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora)
tories) RT-qPCR uchun ishlatilgan.b-Aktin I turdagi kollagen, MMP-1 va PGC-1 mRNK darajasini normallashtirish uchun ishlatilgan.a.
2.8. Statistik tahlil
Ma'lumotlar o'rtacha ko'rsatkich sifatida taqdim etiladi dan standart og'ishuchta mustaqil o'lchov va Student yordamida tahlil qilingant-testlar, a bilanp < 0.05 considered to be a signifarq qila olmaydi.
Ko'proq so'rang:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
