Inson OCT2/MATEda apikal kesish stressini kuchaytirgan organik kation tashilishi1-Madin-Darbining transfeksiyalangan it buyrak hujayralari siliar sezgini o'z ichiga oladi

Qo'shimcha ma'lumot uchun:emily.li@wecistanche.com

Aishvarya Jayagopal, Pol R. Brakeman, Piter Soler, Nikolas Ferrell, Uilyam Fissell, Deanna L. Kroetz va Shuvo Roy

Bioinjeneriya va terapevtik fanlar (AJ, PS, DLK, SR) va pediatriya (PRB) bo'limlari,

Kaliforniya universiteti San-Fransisko (UCSF), San-Fransisko, Kaliforniya;

va tibbiyot bo'limi, Nefrologiya bo'limi, Vanderbilt universiteti tibbiyot markazi, Nashville, Tennessi (NF, WF)

ANTRACT

Faol transport orqalibuyrakproksimal tubulalar dori-darmonlarni yo'q qilishda muhim rol o'ynaydi. Giyohvand moddalarni ishlab chiqishda, taxminlarbuyrakchiqarilishi dozani aniqlash uchun zarurdir. Buyrakning fiziologik qarindoshlarini ko'paytiruvchi buyrak bioreaktorlari, masalan, oqimdan kelib chiqadigan kesish stressi, hozirgi in vitro modellarga qaraganda, in vivo jonli dori harakatini yaxshiroq bashorat qilishi mumkin. Ushbu tadqiqotda biz Madin-Darby iti tomonidan 4-(4-(dimetilamino)-stiril)-N-metil piridiniy yodidning (ASP plyus) faol tashilishida kesish stressining rolini o'rgandik.buyrakhujayralarekzogen tarzda inson organik kation tashuvchisi organik kation tashuvchisi 2 (OCT2) va ko'p dori va toksin ekstruziya oqsili 1 (MATE1) ni ifodalaydi. Uzluksiz vosita perfuziyasi ostida parallel plastinkada o'stirilgan hujayralar inulin uchun yuqori to'siq bilan qattiq mono qatlam hosil qildi. Kesish kuchlanishining ortib borayotgan darajasiga javoban (0.2-2 din/sm), hujayralar ASP plus ning tashishida mos ravishda ortib, 2 marta maksimal 4.2-baravar ortishga erishdi. statik sharoitda yetishtirilgan hujayralar bilan solishtirganda din/sm². Ushbu transport imipramin bilan inhibe qilingan, bu esa kesish stressi sharoitida faol transport mavjudligini ko'rsatadi. 2 din/sm² siljish stressiga duchor bo'lgan hujayralar, shuningdek, transfektsiyalangan odamlar va endogen OCT2 (mos ravishda 3.7- va 2.0-katta) RNK ifodasining o'sishini ko'rsatdi. Ammoniy sulfat yordamida kiprikchalarni olib tashlash statik sharoitlarda ASP plus transportiga taʼsir qilmay, 0,5 din/sm² tezlikda ASP plus transportida kesishning taʼsirini yoʻq qildi. Ushbu natijalar kesish stressi organik kationlarning faol tashilishiga ta'sir qilishini ko'rsatadibuyrakquvurliepiteliya hujayralari siliyaga bog'liq holda.

Cistanche buyraklar faoliyati uchun yaxshi

Kirish

Optimal dori nomzodlarini tanlash uchun klinikadan oldingi usullardagi katta yutuqlarga qaramay, dori-darmonlarni ishlab chiqish uzoq va qimmat jarayon bo'lib qolmoqda, bu bozorda sotiladigan yangi molekulyar ob'ektlarning juda past hosildorligiga ega (Watkins, 2011). Klinikadan oldingi modellarning asosiy kamchiligi odamlarda klirens va toksiklikni bashorat qilishning mumkin emasligidir. Klinikadan oldingi tadqiqotlarda muvaffaqiyatli bo'lgan dori vositalarining taxminan 30 foizi kutilmagan klirens qiymatlari yoki toksiklik natijasida odamlarda muvaffaqiyatsizlikka uchraydi (Kola va Landis, 2004).

Buyrak in vitro hujayra madaniyatini modellashtirish uchun ayniqsa muhim maqsaddir, chunki u barcha dorilarning uchdan biridan ko'prog'ini va ko'pchilik metabolitlarni yo'q qilish uchun javobgardir (Morrissey va boshq., 2013). Thebuyrakproksimal tubula ishlab chiqish jarayonida giyohvand moddalarni sinash uchun muhimdir, chunki u giyohvand moddalarni iste'mol qilishning ko'p faol transportini amalga oshiradi va toksik shikastlanishga ayniqsa sezgir (Giacominiet al., 2010). Thebuyraktubulaapikal yuzasi bo'ylab filtrat oqadigan epiteliy hujayralarining bir qavati. Naychali epiteliyning tagida bazal membran yotadi va qo'shni peritubulyar kapillyarlar suv va salomlarning qayta so'rilishini ta'minlaydi. Proksimal tubula mikro muhiti, xususan, suyuqlik kesish stressi va apikobazal onkotik gradientlar an'anaviy hujayra madaniyati usullari bilan to'liq takrorlanmaydi. In vivo jonli fiziologiyani ushlaydigan epitelial hujayra bioreaktorlari in vitro tahlillari natijasida olingan klirens va toksiklik bashoratlarining aniqligini oshirishi mumkin (Pfaller va Gstraunthaler, 1998; Astashkina va boshq., 2012).

O'sib borayotgan dalillar shuni ko'rsatadiki, proksimal tubula hujayralari morfologiyasi va funksionalligi o'sish muhitiga qarab o'zgarishi mumkin, masalan, o'sish yuzasining g'ovakliligi, har ikki tomonning suyuqlik ta'siri va/yoki suyuqlikning kesishishi. Essig va Friedlander (2003), shuningdek, bizning laboratoriyamiz (Ferrell va boshq. 2010) tomonidan olib borilgan oldingi ishlar proksimal tubula hujayralarining apikal aktin sitoskeletida quvurli suyuqlik oqimining qayta tuzilishini ko'rsatdi (Ferrell va boshq., 2010) . Keyinchalik, bir nechta tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, kesish stressi ko'plab qabul qilish va oqim tashuvchilarning ifoda darajasiga va lokalizatsiyasiga ta'sir qiladi, shu jumladan natriy-vodorod antiporter 3. Na/K-ATPaz, glyukoza tashuvchilar, epitelial natriy kanali va endotsitoz retseptorlari, megalin va tubulin (Duan va boshq., 2010; Raghavan va boshq., 2014; Jansen va boshq..2016; Ernandez va boshq., 2018). Boshqa ishlar shuni ko'rsatdiki, quvurli bioreaktor tizimidagi kesish oqimi yo'naltiriladi va uzayadi.buyrakquvurlioqim yo'li bo'ylab hujayralar (Venzac va boshq. 2018). In vitro dalillar shuni ko'rsatadiki, sitoskeletal struktura va transport funktsiyasidagi ba'zi o'zgarishlar, ehtimol, siliyaning mexanosensor funktsiyasi bilan bog'liq (Overgaard va boshq. 2009; Raghavan va boshq.. 2014); ammo, bir nechta tadqiqotlar buyrak hujayralarida dori tashuvchilarga kesish stressining ta'sirini ko'rib chiqdi. Bundan tashqari, turli xil kesish tezligining hujayralar faoliyatiga ta'siri haqida juda kam narsa ma'lum, ayniqsa kesish stressiga doimiy ta'sir qilish bilan. Ko'pgina tadqiqotlar bitta siljish kuchlanish tezligini ko'rib chiqdi va faqat qisqa muddatli (1-6 soat) tajribalar o'tkazdi, bu esa kesishning haqiqiy ta'siri va mikromuhitdagi keskin o'zgarishlarga hujayra stress javobini ajratishni qiyinlashtirdi (Duan). va boshq.2010; Jang va boshq.2013: Maggiorani va boshq.2015).

Bu erda siljish kuchlanishining bosqichma-bosqich darajalariga ta'sirini tekshirish uchun mikrosuyuq bioreaktor ishlatilgan.buyrakproksimal tubula hujayralari dori tashuvchilari organik kation tashuvchisi 2 (OCT2) va ko'p dori va toksin ekstruziya oqsili 1 (MATE1). Biz apikal siljish kuchlanishining kuchayishi organik kationlarni tashish va tashuvchining ekspressiyasini oshirishga olib kelishini va siliyalarning kesish stressiga bu hujayrali javobda ishtirok etishini ko'rsatamiz.

Materiallar va uslublar

Qurilmani ishlab chiqarish va yig'ish. Biz avvalroq hujayralarning apikal tomoni bo'ylab sozlanishi balandlikdagi suyuqlik oqimi yo'lini va bazal tomonda statik rezervuarni ta'minlaydigan parallel plastinka bioreaktori uchun dizaynimizni nashr etgan edik (Brakeman va boshq., 2016). Bu erda taqdim etilgan ish uchun biz avvalgi dizaynimizni bir vaqtning o'zida to'rtta biologik sharoitni sinab ko'rish imkonini beradigan to'rtta alohida oqim yo'li bilan multiplekslangan qurilma yaratishga moslashtirdik (1-rasm). Har bir qurilma uchta qatlamdan iborat: 5-ml apikal rezervuarli taglik, Snapwell qo'shimchasini ushlab turish uchun o'rta plastinka (Costar, Corning, Corning, NY) 1,12 sm² hujayra maydoni va yuqori plastinka o'z ichiga oladi. a 1- dan 2- ml gacha bazolateral rezervuar. Plitalar

avtoklavda sterilizatsiya qilish uchun polisulfondan ishlov berilgan. Suyuqlik bo'linmalarini yopish uchun har bir plastinka orasiga 500- dan 1000- um gacha bo'lgan lazer bilan kesilgan silikon qistirmalari va kanal balandligini aniqlash uchun apikal tomonga o'rnatilgan. Bioreaktor vintlar yordamida yig'ilgan. Media suv ombori va pufakchali tuzoq o'rnatilgan ustun edi. Kirish va rozetkalar tikanli ulagichlar yordamida ichki diametri 1,{6}} mm bo'lgan Masterflex LS14 silikon trubasiga ulangan (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Suyuqlik oqimi va shuning uchun apikal kesish stressi peristaltik nasos (Cole Parmer) tomonidan o'rnatildi va nazorat qilindi.

Hujayra madaniyati va oqimi. Bo'sh vektor yoki bir juft qabul qilish va oqim tashuvchisi (hOCT2/hMATE1) (Konig va boshq..2011) bilan transfektsiyalangan MDCK hujayralari doktor Martin Fromm (Erlangen, Germaniya) tomonidan taqdim etilgan va 10 foiz homila sigir zardobi (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) va 1 foiz penitsillin-streptomitsin (UCSF hujayra madaniyati zavodi) bilan Erlning muvozanatli tuz eritmasi (UCSF Hujayra madaniyati zavodi) bilan minimal zarur muhit. Ikki marta transfektsion hujayralar uchun vositaga mililitr gigromitsin (UCSF hujayra madaniyati vositasi) va 100 mg/soat ml genetiksin (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) besh yuz mikrogramm qo'shildi. Oqim tajribalari uchun hOCT2/hMATE1 MDCK hujayrasi Snapwell qo'shimchalarining (Corning) pastki tomoniga 300,000 hujayra/quduq(250,000 hujayra/sm") zichlikda qoplangan, birlashgunga qadar statik sharoitda o'stirilgan. Apikal muhit oqimi 7 kun davomida kerakli siljish kuchlanishiga erishilgunga qadar 0,1 dan 1-6mlmingacha oshirildi va tajribadan oldin 72 soat davomida barqaror qoldirildi. Hujayralar statik sharoitda nazorat elementlari bilan bir xil vaqt davomida yetishtirildi. .

Immunofluoresans. Hujayralar 4 foizli paraformaldegid (Thermo Fisher Scientific) bilan mahkamlangan, 0,1 foiz Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) bilan o'tkazuvchan qilingan va sigir zardobidagi albumin (Sigma-Aldrich) bilan bloklangan. Keyinchalik ular Alexa 488 etiketli zonula occludens-1 sichqoncha monoklonal antikorining (Life Technologies, Carlsbad, Kaliforniya) 1:50 suyultirilishi yoki birlamchi atsetillangan -tubulin sichqoncha monoklonal antikori (Life Technologies) bilan 60 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin a-tubulin antikori bilan ishlov berilgan hujayralar F-aktinni bo'yash uchun ikkilamchi 561 sichqonchaga qarshi echki antikori (Life Technologies) va phalloidin (Thermo Fisher Scientific) bilan inkubatsiya qilindi. Tasvirlash Nikon (Tokio, Yaponiya) spektral konfokal mikroskop yordamida 40x moyli ob'ektiv yordamida amalga oshirildi.

To'siqning ishlashi. Inulin, 5000 Da polimer, glomerulyar filtratsiya tezligining taniqli belgisi bo'lib, in vivo jonli ravishda proksimal tubulaning oqishi belgisidir (Sohtell va boshqalar, 1983):

FITC etiketli inulin (Sigma-Aldrich) apikal muhitga qo'shildi va qurilmalar orqali oqishiga ruxsat berildi. Namunalar bazal rezervuardan har 24 soatda to'plangan va Genios Pro lyuminestsent plastinka o'quvchi (Tecan, Mannedorf, Shveytsariya) yordamida inulin tarkibi tahlil qilingan. Hujayra monoqatlamining to'siq funktsiyasi apikal va bazal bo'limlarda o'lchangan inulin darajasidan 1-eq. bilan tavsiflanganidek hisoblab chiqilgan. Bu erda Kapital - apikal bo'linmadagi inulin konsentratsiyasi va C Mal - bazal bo'linmadagi kontsentratsiya. Inulin oqishi bazal (donor) bo'limidagi kontsentratsiyani 24 soatdan keyin hujayra maydoniga bo'lingan holda hisoblab chiqilgan.

ASP plus Transport. Transduktsiya qilingan tashuvchi genlar, ilgari tasvirlanganidek, transport tajribasidan 24 soat oldin 10 mM Na-butirat (Sigma-Aldrich) bilan induktsiya qilingan (Konig va boshq., 2011). Zarur bo'lganda, hujayralar inhibitor (500 mkM imipramin yoki 1 mM simetidin (Sigma-Aldrich)) bilan bazal tomondan 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra 25 mkM 4-（4-dimetilamino）- qo'shildi. stiril-N-metil piridiniy (ASP plus) (Life Technologies) va 1 soat davomida inkubatsiya. Namunalar apikal va bazal muhitdan olingan. Keyin hujayralar uch marta muzli sovuq fosfat-buferli sho'r suv bilan yuvildi va ASP plyus to'planishi va tashishini o'lchash uchun lizing qilindi. Tashish tajribalari bir vaqtning o'zida siljish stressi ostidagi hujayralar ustida o'tkazildi va statik sharoitda o'stirildi. ASP plyus kontsentratsiyasi Genios Pro floresan plastinka o'quvchi (Tecan) da 485 nm qo'zg'alish to'lqin uzunligida va 590 nm emissiya to'lqin uzunligida hisoblangan.

Protein miqdorini aniqlash. Hujayralar kecha davomida silkitilganda 1 foizli SDS-10 M NaOH lizis buferi bilan parchalandi. Protein tarkibi standart Pirs BCA protein tahlili to'plami (Thermo Fisher) yordamida o'lchandi. Zarur bo'lganda, protein tarkibi hujayra o'sishi maydoniga normallashtirildi.

RNK ifodasi. RNK hujayralardan RNeasy RNK ekstraktsiya to'plami (Qiagen, Hilden, Germaniya) yordamida olingan va cDNK skript to'plami (Bio-Rad, Hercules, CA) yordamida yaratilgan. cDNK odam va it OCT2 va MATE1 ni aniqlash uchun ishlatilgan va It P-glikoproteini (P-GP) Fast Realtime PCR asbobida (Applied Biosystems) Tagman tahlili va zondlar (Applied Biosystems) yordamida miqdoriy teskari transkriptaza-polimeraza zanjiri reaktsiyasi orqali. Ribosomal protein S18 (RS-18) uy nazorati sifatida ishlatilgan. Kesish kuchlanishining transporter ifodasiga ta'siri RS -18 ga nisbatan ifodalangan transporter darajalari yordamida 4ACt usuli yordamida tahlil qilindi (Peters va boshq. 2007; Schmittgen va Livak, 2008). P-GP tashuvchining ifodasiga siljish stressining global ta'sirining o'lchovi sifatida ishlatilgan.

Desiliatsiya. Hujayralar qo'shilish uchun o'stirildi va keyin ASP plus transportini o'lchashdan oldin 24 soat davomida 30 mM ammoniy sulfat (Fluka AG) yo'qligida yoki mavjudligida inkubatsiya qilindi (Oxergard va boshqalar 2009). Kiprikchalarning mavjudligi bu yerda aytib o'tilganidek, a-tubulinni ko'rish orqali aniqlangan.

Statistika. Barcha tajribalar har bir eksperimentda kamida ikkita texnik takrorlash bilan uch nusxada amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalanadi va quti va mo'ylovli chizmalar sifatida grafiklanadi. Statistik tahlillar juftlashtirilmagan bir tomonlama yoki ikki tomonlama dispersiya va P-qiymati yordamida amalga oshirildi.<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Natijalar

Hujayra morfologiyasi va to'siq funktsiyasi. Immunofluo tomonidan quyi oqimda joylashtirilgan hujayralarning yaqinda tahlili statik va oqim sharoitida hujayralar orasidagi qattiq birikmalarda joylashgan zonula occludens-1 oqsili bilan bir xil mono qatlam hosil bo'lishini aniqladi (2-rasm, A–C). Jami oqsil miqdorini aniqlashda siljish kuchlanishiga javoban monoqatlamning har kvadrat santimetriga protein miqdori 1.6-baravar ortgani ko‘rsatilgan (2D-rasm). Keyinchalik, biz inulinning monoqatlam bo'ylab proksimal tubula oqishi belgisi bo'lgan o'tkazuvchanligini o'lchadik. Qurilmalar 7 kun davomida 2 din/sm2 siljish stressi ostida 7 kun davomida 97,9 foiz 6 1, 42 foiz to‘siqni ishlash tezligini saqlab qoldi (2E-rasm), natijada inulinning 6-kuni 6-kunida oxirgi oqish tezligi paydo bo‘ldi. {15}},13–0, kuniga 69 mg/sm2.

Kesish kuchlanishining organik kationlarni tashishga ta'siri. OCT2 va MATE1 ning avtomatik lyuminestsent substrati bo'lgan ASP plus ning tashilishi 1 soat davomida turli siljish kuchlanish darajalarida (0.2-2 din/sm²）) o'lchandi. Ekzogen ravishda hOCT2 va hMATE1 ni ifodalovchi MDCK hujayralari 2 din/sm² kesish stressiga javoban ASP plyus transportida 4.2-baravar ko'payganini ko'rsatdi, bu ham hujayra to'planishi (3A-rasm) va hujayralararo transportning o'lchovlarida aks ettirilgan (3-rasm). 3B). Kesish kuchlanishining ASP plyus to'planishi yoki hujayralararo transportga ta'siri 0.5 va 2 din/sm² kesish stressi ostida o'xshash edi. Faol ASP plyus transportining ko'payganligini aniqlash uchun 0.2 din/sm kesish stressiga duchor bo'lgan hujayralar tomonidan ASP plyusning o'tkazilishi 500 umM imipramin, OKT bilan yoki oldindan davolashsiz o'lchandi{{20} } va MATE{21}}maxsus inhibitori. ASP plyus tashish imipramin tomonidan 60,3 foiz ± 15,8 foiz statik sharoitda 47,6 foiz ± 19,7 foiz bilan solishtirganda kesish stressi sharoitida inhibe qilingan (Fig.3C).

Ushbu kuzatuvni yanada chuqurroq tushunish uchun kesish stressining inson OCT2 (transfektsion), it OCT2 (endogen) va itning P-GP (endogen) ifodasiga ta'siri 72 soat davomida turli darajadagi kesish ta'siriga duchor bo'lgan hujayralarda o'lchandi. 7 kun davomida kesishning sekin tezlashishi (4-rasm). Statik sharoitda yetishtirilgan hujayralar bilan solishtirganda, kesish ta'siriga uchragan MDCK hujayralari transfektsiyalangan inson va endogen OCT2 (mos ravishda 3,{9}} va 2,{11}}kattagacha) ko'payganligini ko'rsatdi, bu sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. transfektsion MATE1 yoki endogen P-GP ifodasi bo'yicha.

Kiliyaning Shearga javob berishdagi roli. Tasvirlash shuni ko'rsatdiki, ikki marta transfektsiyalangan MDCK hujayralari ham statik, ham oqim sharoitida siliyani ifodalaydi (5-rasm, A va E). Hujayralarga 30 mM ammoniy sulfat 24 soat davomida ta'sir qilish kiprikchalarning to'liq yo'qolishiga olib keldi (5-rasm, C va G). Muhimi shundaki, epitelial hujayralardagi hujayra-membrana birikmalarida zich birikma oqsillarini biriktiruvchi F-aktinning tasviri bilan o'lchanadigan desiliatsiya hujayra-membrananing birikmalariga qo'pol ta'sir ko'rsatmadi (5-rasm, D va HD (Stivenson va Begg). 1994). Bu tasvirlarda F-aktin bo'yalishining biroz qalinlashishi kuzatilgan bo'lsa-da, bu izchil topilma emas edi va shuning uchun biz bu ta'sirni miqdoriy jihatdan aniqlamadik. Desiliatsiya statik sharoitda ekilgan hujayralar tomonidan tashishga hech qanday ta'sir ko'rsatmadi. 0,5 din/sm² siljish ta'siriga uchragan hujayralardagi ASP plyus tashishda kesish stressining ta'sirini yo'q qildi (6-rasm).

Munozara

Buyrak inson organizmida giyohvand moddalarni yo'q qilishda markaziy rol o'ynaydi. In vitro dori vositalarini sinash uchun buyrak fiziologiyasining murakkabligini, ayniqsa suyuqlik oqimiga nisbatan aniq taqlid qilish muhimdir. Suyuqlik oqimidan kelib chiqadigan siljish stressi hujayra morfologiyasi va ion tashuvchilarga in vitro ta'sir ko'rsatishi ko'rsatilgan, ammo dori tashuvchilarga ta'siri haqida juda kam narsa ma'lum (Duan va boshq., 2010; Ferrell va boshq., 2012; Jansen va boshq., 2016) . Bundan tashqari, oldingi tadqiqotlarning aksariyati faqat qisqa muddatli kesishning ta'sirini o'lchagan (1-6 soat), bu siljish stressi ta'sirini boshqa hujayrali stress reaktsiyalaridan to'liq ajratib qo'yishi dargumon (Duan va boshq.. 2010; Jang va boshq. 2013; Maggiorani va boshq..2015). Ushbu tadqiqotlarda biz suyuqlik oqimidan doimiy (7 kunlik) kesish stressining dori vositalarini tashishga ta'siriga e'tibor qaratdik.buyrakquvurlihujayralar in vivo.

Dori tashuvchilarning doimiy siljish stressiga qanday munosabatda bo'lishini tushunish, buyraklar tomonidan in vivo jonli ravishda dori bilan ishlash bo'yicha in vitro prognozlarini yaxshilashi mumkin. To'g'ri ishlab chiqilgan in vitro buyrak modellari klinikadan oldingi testlarni standartlashtirishi va dori etishmovchiligini kamaytirishi mumkin.

Ushbu ishda OCT2 va MATE1 tomonidan organik kationlarni tashishda barqaror siljish stressining ta'sirini aniqlash uchun parallel plastinka mikrosuyuq bioreaktor ishlatilgan.buyraktubulahujayra chizig'i. Ushbu tadqiqotlar uchun bir nechta hujayra chiziqlari ko'rib chiqildi, jumladan, Hopfer guruhidagi inson proksimal tubula hujayralari (Orosz va boshq, 2004) va RPTECs (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser va boshq., 2008), lekin ikki marta transfektsiyalangan hOCT2/hMATE1 MDCK hujayralari bir necha sabablarga ko'ra ushbu tadqiqot uchun eng to'g'ri tanlov deb hisoblangan. Birinchidan, MDCK xujayralari doimiy ravishda transwell qo'shimchalariga mustahkam ulanishni namoyish etadi, bu esa ularga suyuqlik oqimining dastlabki kuchlanishiga bardosh berishga imkon beradi. Ikkinchidan, bu hujayralar qattiq monoqatlamlarni hosil qiladi, bu esa oqishning oldini oladi va marker substratlarining hujayralararo tashishini o'rganish uchun zarurdir. Nihoyat, tashuvchilarning ekzogen ifodasi faol transportni va buzilishlarning ta'sirini yaxshilashga imkon beradi.

Past oqim bilan joylashtirilgan hujayralar birlashuvchi monoqatlamni hosil qildi va hujayraning periferiyasiga mahkam bog'langan oqsilni lokalizatsiya qildi. Ular, shuningdek, inulin o'tkazuvchanligi bilan o'lchanadigan yuqori to'siq funktsiyasini saqlab qolishdi. Epiteliya hujayralarining suyuqlik va oqsil oqishini oldini oladigan mono qatlam hosil qilish qobiliyati tubulaning to'g'ri ishlashi uchun juda muhimdir. Bu erda MDCK hujayralari orqali oqish kuniga 1 ug/sm² dan kam bo'lgan va inson hujayralari orqali sezilarli darajada past bo'lgan. Biz ilgari inson buyrak hujayralari monoqatlamlarida kuniga 10-20 ug/sm² inulin oqishi borligini ko'rsatgan edik (Brakeman va boshq., 2016), bu hOCT2/hMATE1 MDCK hujayralari mustahkam monoqatlam hosil qilgan degan xulosani tasdiqlaydi.

ASP plyusning tashilishi hOCT2/hMATE1 MDCK hujayralarida statik nazorat bilan solishtirganda 72 soat davomida turli darajadagi kesish stressiga duchor bo'lganida sezilarli darajada oshdi. ASP plyus OCT2 (SLC22A2) tomonidan qabul qilinadi va MATE1 (SLC47A1) tomonidan chiqariladi, ikkita organik kation tashuvchisi, ular birgalikda ishlashni osonlashtiradi.buyrakmetformin va sisplatin kabi tez-tez ishlatiladigan dorilarning sekretsiyasi (Biermann va boshq. 2006; Wittwer va boshq. 2013). Kesish kuchlanishining shunga o'xshash ta'siri proksimal tubula ion tashuvchilari uchun qayd etilgan. Kesish stressining kuchayishiga javoban albuminni qabul qilish, ion reabsorbtsiyasi, megalin va tubulin ifodasi va funktsiyasining oshishi qayd etilgan (Overgaard va boshq.. 2014). Himoyasizlikbuyrakproksimal tubula hujayralarini kesish stressi, shuningdek, apoptozning kamayishi va o'tkir sisplatin toksikligidan tezroq tiklanishi va organik anionlarni tashishning kuchayishi bilan bog'liq (Jang va boshq.2013). Proksimal tubulada suyuqlik oqimidan kelib chiqadigan kesish stressi doimo mavjud bo'lganligi sababli, bu topilmalar birgalikda buyraklardagi dorilarning joylashishi va toksikligini bashorat qilish uchun ko'proq fiziologik in vitro model tizimlaridan foydalanishni qo'llab-quvvatlaydi. Shunisi e'tiborga loyiqki, kesishish kuchlanishining 0.5 va 2.0 din/sm² o'rtasida tashuvchi funktsiyasida sezilarli farq yo'q. Essig va Fridlander (2003) tomonidan olib borilgan oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, hujayra morfologiyasini o'zgartirish uchun minimal 0,17 din/sm2 siljish kerak bo'ladi va boshqa tadqiqotlarda fiziologiya 1 din/sm² gacha (Duan va boshqalar, 2010). Bu yuqori va barqaror siljish stressi darajalarining buyrak dori vositalarining funksionalligiga ta'sirini o'rganish bo'yicha birinchi tadqiqot bo'lib, biz 0,5 va 2,0 din/sm² kesish stressi o'rtasidagi biologik farqning kattaligi bo'lishi mumkin. Bizning tahlillarimizdagi kesish stressining ushbu darajalari orasidagi farqlarni aniqlashga imkon beradigan darajada katta emas edi. Qo'shimcha tekshirish talab etilsa-da, bizning natijalarimiz fiziologik jihatdan mos modellar uchun zarur shart-sharoitlarni va kasallik tufayli ortib borayotgan kesish stressi darajasining buyraklar dori vositalari bilan ishlashga ta'sirini yoritib beradi.

Eksperimental usullarimizning cheklovlaridan biri shundaki, biz faqat pH 7,4 da tashishni apikal va bazal tomondan pH 7,4 bo'lgan muhitdan foydalangan holda, avvalroq hOCT2/hMATE1 MDCK hujayralari uchun tasvirlangan eksperimental usullarga taqlid qildik (Konig va boshq.. 2011). Apikaldan bazal pH gradienti OCT2 va MATE1 funktsiyalariga ta'sir qilishi mumkin va odatda fiziologik sharoitlarda pH gradienti mavjud (Muller va boshq., 2013). Shunday qilib, bizning usullarimiz OCT2 va MATE1 funktsiyalarida apikaldan bazal pH gradienti va kesish stressi o'rtasidagi o'zaro ta'sirni baholash qobiliyatimizni chekladi. Biz barcha eksperimental sharoitlarda izchil pHof7.4 dan foydalanganimiz sababli, pH gradientining etishmasligi bizning topilmalarimizga ta'sir qilishi dargumon, lekin apikaldan bazal pH gradienti mavjud bo'lganda topilmalarimizni OCT2 va MATE1 transportida qo'llash imkoniyatini cheklaydi.

Ajablanarlisi shundaki, transfektsion inson va endogen OCT2 ning mRNK ifodasi statik nazorat bilan solishtirganda barcha darajadagi kesish stressiga duchor bo'lgan hujayralarda oshdi. Transporter ifodasining yuqori regulyatsiyasi o'ziga xos bo'lib, endogen P-GP ifodasiga yoki transfektsiyalangan MATE1ga o'lchanadigan ta'sir ko'rsatmadi. Transporter ifodasining ko'tarilishi transportning kuchayishi mexanizmini tushunish imkonini beradi va mRNK barqarorligi yoki mRNK transkripsiyasining kuchayishi natijasi bo'lishi mumkin. Shunisi qiziqki, transfektsion va endogen tashuvchilar ham yuqori tartibga solingan, bu kutilmagan, chunki transfektsiyalangan OCT2 sitomegalovirus promouteri ostida ifodalangan va endogen gen ekspressiyasini tartibga solish mexanizmlariga bo'ysunmasligi kerak. Ajablanadigan bo'lsa-da, bu kuzatuv misli ko'rilmagan emas. Perfuziyaga duchor bo'lgan OAT1 transfektsiyasilangan proksimal tubula hujayralariga o'xshash ta'sir haqida xabar berilgan, ammo ifodaning kuchayishi mexanizmi noaniq bo'lib qolmoqda (Jansen va boshq., 2016). Boshqa bir tadqiqotda Nrf2 signali kesish stressiga javoban endogen MATE2-K ifodasini oshirishda rol o'ynashi aniqlandi (Fukuda va boshq., 2017). Buni qo'shimcha o'rganish kafolatlanadi va kelajakdagi tekshiruvlar mavzusi bo'ladi.

Shuningdek, biz apikal kesish oqimining kiritilishi hujayralarning kvadrat santimetriga protein miqdorini oshirganligini aniqladik. Bu effekt 0.5 va 2 din/sm² siljish uchun bir xil darajada edi, bu mRNK ifodasi va ASP plus transportida kuzatilgan effektga oʻxshaydi. Kesish stressi balandroq bo'lishiga olib keladigan ba'zi dalillar mavjudbuyrakepiteliya hujayralari, bu kvadrat santimetr uchun hujayralar hajmining ko'payishiga olib keladi va shuning uchun har kvadrat santimetrga protein miqdori oshishi mumkin; ammo, bu ilgari nashr etilgan hodisa faqat kattaroq ma'lumotlar to'plamidagi kichik kuzatuv edi va miqdori belgilanmagan (Long va boshq., 2017). Apikal kesish oqimi mavjudligida o'stirilgan hujayralardagi umumiy oqsilning ko'payishi sog'lom uchun normal protein tarkibini ko'rsatishi mumkinbuyrakquvurliepiteliya hujayralariga faqat hujayralarning apikal kesish oqimiga ta'sir qilish orqali erishish mumkin. Shu sababli, statik madaniyatda o'stirilgan hujayralardagi oqsil miqdorining past darajasi buyrakning o'tkir shikastlanishi kabi apikal filtrat oqimi past bo'lgan holatlarda klinik jihatdan yuzaga kelishi mumkin bo'lgan anormal hujayra holatini ko'rsatishi mumkin. Ushbu hodisa qo'shimcha o'rganishga loyiqdir.

Cilia proksimal tubulada mexanosensial rollarga ega ekanligi ma'lum (Raghavan va Weisz, 2016). Shu sababli, bu yerda xabar qilingan OCT2 va MATE{2}}vositachiligining ortishida ularning muhim rol o'ynashini aniqlash uchun kiprikchalarni olib tashlashning tashuvchi funksiyasiga ta'siri o'lchandi. Bizning tadqiqotlarimizda siliyani olib tashlash orqali ASP plyus transportida kesishga bog'liq o'sishlarning to'liq blokadasi Raghavan va boshqalar tomonidan olib borilgan tadqiqotlarda topilgan ta'sirga o'xshaydi. (2014), u suyuqlik oqimiga javoban endositozda siliyaga bog'liq yuqori regulyatsiyani ko'rsatdi. Ammoniy sulfat hujayraning xatti-harakati va funksionalligiga boshqa xaraktersiz ta'sir ko'rsatishi mumkin, bu bilvosita erigan moddalarni tashishga ta'sir qilishi mumkin. Maqsaddan tashqari yuzaga kelishi mumkin bo'lgan ta'sirlarga qaramay, desiliatsiyaning bu usuli organik eritmalarning tashuvchi vositachilik harakatida siliyer sezish rolini sinab ko'radi. Kiprikchadagi mexano-sensorli oqsillar va tashuvchi o'rtasidagi signalizatsiya mexanizmi hozircha noma'lum. Gipotezalardan biri shundaki, organik kation tashuvchilarning funktsiyasi o'zgargan ion tashish orqali o'zgaradi. Siliyani olib tashlash proksimal tubula hujayralarida erigan moddalar harakatini o'zgartirishi ma'lum, ayniqsa Nat/K plus ni kamaytirish orqali. ATPaz membranasini lokalizatsiya qilish va paracellular transportni o'zgartirish (Overgaard va boshq., 2009). Bu H gradientiga bog'liq bo'lgan antiporter MATE1 funktsiyasida o'zgarishlarga olib kelishi mumkin. Yana bir faraz shundan iboratki, kesish stressini sezish organik kation tashuvchilarning ifodasiga ta'sir qiladi. Kesish stressi MATE{11}}K funksiyasini Nrf2 signali orqali modulyatsiya qiladi (Fukuda va boshq., 2017). Boshqa organik kation tashuvchilar kesish stressiga xuddi shunday javob berishlari mumkin, bu mexanik sensorli siliya olib tashlanganida yo'q qilinadi. Bularning aksariyati noma'lum va qo'shimcha o'rganishni talab qiladi. Qizig'i shundaki, siliyani olib tashlash 0,2 din / sm² kesish stressiga duchor bo'lgan hujayralar tomonidan ASP plyus tashishga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi, ammo kesish stressi 0,5 din / sm2 ga oshirilganda mustahkam ta'sir kuzatildi. Bu shuni ko'rsatadiki, siliya chegaraning kesishish kuchlanish darajasini sezadi; o'z navbatida, siliya signalining transportga o'lchanadigan ta'siridan oldin tashuvchining ifodasi va funktsiyasidagi o'zgarishlar kutilmoqda. Umuman olganda, organik kationlarni tashishning siliyer kuchlanishni siliyer sezgisiga bog'liqligi mexanik sensorli signalizatsiya yo'lini va kesishga kuchli javob berish uchun zarur bo'lgan minimal stress darajasini tushunish imkonini beradi.

Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, bu ma'lumotlar suyuqlik oqimining kesish stressi MDCK hujayralarida organik kation tashuvchisi funktsiyasi va ifodasiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi. Bundan tashqari, organik kationlarni tashishning ko'tarilishi siliya mavjudligiga bog'liq edi. Apikal kesish stressi har qanday in vitro modellashtirishning muhim tarkibiy qismi ekanligini taklif qilamizbuyrakquvurlihujayralar va dorilarning buyrak sekretsiyasini tozalash va nefrotoksikligini modellashtirishning muhim tarkibiy qismi bo'lishi mumkin. Mexanik stress signallari transporter faolligini va ifodasini oshiradigan o'ziga xos mexanizm hali ham noaniq va qo'shimcha o'rganishni talab qiladi.

Ma'lumotnomalar

Astashkina A, Mann B va Grainger DW (2012) Yuqori samarali dori skriningi va toksikligi uchun in vitro hujayra madaniyati modellarini tanqidiy baholash. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E va Ciarimboli G (2006) Inson organik kation tashuvchisining tartibga solish mexanizmlari va holatlarining tavsifi 2. Am J Physiol Cell Physiol 290: C1521-C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Li CZ, Roy S, Fissell WH va Ferrell N (2016) Polarizatsiyalangan buyrak epiteliya hujayralarini baholash uchun yaxshilangan o'tkazuvchanlikka ega modulli mikrofluidik bioreaktor. Biomikrofluidika 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S, and Wang T (2010) Sichqoncha proksimal tubula hujayralarida membrana tashuvchisi lokalizatsiyasi va ifodalanishining stressdan kelib chiqadigan o'zgarishlari. Proc Natl Acad Sci USA 107: 21860–21865.

Ernandez T, Udvan K, Chassot A, Martin PY va Feraille E (2018) Birlashgan nefrektomiya va apikal suyuqlikni kesish stressi kanalning asosiy hujayralarini yig'ishda ENaC ko'pligini kamaytiradi. Am J Physiol Renal Physiol 314: F763–F772.

Essig M va Friedlander G (2003) Naychali kesish stressi va buyrak proksimal quvur hujayralarining fenotipi. J Am Soc Nephrol 14 (1-qo'shimcha): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD va Fissell WH (2010) Buyrak epitelial hujayralarini baholash uchun o'rnatilgan transepitelial elektr qarshilik (TEER) o'lchash elektrodlari bo'lgan mikrofluidik bioreaktor. Biotechnol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT va Fissell WH (2012) Mikrofluidik bioreaktorda buyrak quvurli epitelial hujayralari tomonidan albumin bilan ishlov berish. Biotechnol Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT va Fissell WH (2012) Suyuqlikning kesishishi ostida epiteliya hujayralarini o'rganish uchun mikrofluidik bioreaktor. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M va Kawamata Y (2017) Suyuqlikni kesish stressi MATE{2}}K ifodasini Nrf2 yo'lini faollashtirish orqali rag'batlantiradi. Biochem Biophys Res Commun 484:358–364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM va boshqalar; Xalqaro Transporter Konsortsiumi (2010) Dori vositalarini ishlab chiqishda membrana tashuvchilar. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY va Ingber DE (2013) Dori-darmonlarni tashish va nefrotoksiklikni baholash uchun inson buyragi proksimal tubula-on-a-chip. Integr Biol 5: 1119–1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF va boshqalar. (2016) Bioinjeneriya qilingan buyrak kanalchalari uremik toksinlarni samarali ravishda chiqaradi. Ilmiy vakili 6:26715.

Kola I va Landis J (2004) Farmatsevtika sanoati eskirish darajasini pasaytira oladimi? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C va Fromm MF (2011) Inson OCT1 / MATE1 yoki OCT2 / MATE1 ni ifodalovchi ikki marta transfektsion MDCK hujayralari: organik kationlarni qabul qilish va hujayralararo translokatsiyani aniqlash omillari. Br J Pharmacol 163: 546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jekson EK, Baty CJ, and Weisz OA (2017) Proksimal tubula apikal endositozi mTORga bog'liq yo'l orqali suyuqlik kesish stressi bilan modulyatsiya qilinadi. Mol Biol Cell 28: 2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL va boshqalar. (2015) Inson buyrak tubulyar hujayralarida epiteliya tuzilishining siljish stressidan kelib chiqqan o'zgarishi. PLoS One 10: e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L, and Giacomini KM (2013) Dori vositalarini ishlab chiqishda buyrak tashuvchilar. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53: 503–529.

Myuller F, König J, Hoier E, Mandery K, and Fromm MF (2013) Organik kation tashuvchisi OCT2 va ko'p dori va toksin ekstruziya oqsillari MATE1 va MATE{3}}K antiviral lamivudinni tashish va dori o'zaro ta'sirida roli. Biochem Pharmacol 86: 808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI va boshqalar. (2004) Oddiy kattalardagi inson proksimal tubula hujayralarining o'sishi, o'lmasligi va differentsiatsiyasi. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A, and Yeaman C (2009) Desiliatsiya epitelial hujayra birikmalari va sirt domenlarini keskin qayta qurish bilan bog'liq. Mol Biol Hujayra 20: 102–113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR, and Day MJ (2007) It geni ekspressiyasini o'rganishni aniq normallashtirish uchun bir nechta ichki mos yozuvlar (uy bekasi) gen tahlillarini ishlab chiqish va qo'llash. Vet Immunol Immunopathol 117:55-66.

Pfaller W va Gstraunthaler G (1998) Nefrotoksiklikni in vitro sinovi--biz bilgan va bilishimiz kerak bo'lgan narsalar. Atrof-muhit salomatligi istiqboli 106 (2-ilova): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD va Weisz OA (2014) Birlamchi siliya vositachiligida buyrak proksimal tubula hujayralarida apikal endositozni kesish stressiga bog'liq tartibga solish. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V va Weisz OA (2016) Proksimal tubula funktsiyasini tartibga solishda mexanosensorning rolini aniqlash. Am J Physiol Renal Physiol 310: F1–F5.

Schmittgen TD va Livak KJ (2008) Qiyosiy C(T) usuli bilan real vaqtda PCR ma'lumotlarini tahlil qilish. Nat Protoc 3: 1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B va Ulfendahl H (1983) FITC-inulin kalamushlarda buyrak tubulasi belgisi sifatida. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR va Begg DA (1994) MDCK epiteliya hujayralarida sitokalasin D ning qattiq birikmalar va aktin filamentlariga kontsentratsiyaga bog'liq ta'siri. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzak B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Kayrak F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S va boshqalar. (2018) Buyrak hujayralarini tashkil qilishni o'rganish uchun diametri o'zgargan kichik naychalarni loyihalash. Biomikrofluidika 12: 024114.

Watkins PB (2011) Dori xavfsizligi fanlari va giyohvand moddalarni ishlab chiqishdagi qiyinchiliklar. Clin Pharmacol Ther 89: 788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J va Grillari-Voglauer R (2008) hTERT faqat buyrak proksimal kanalchalarining epitelial hujayralarini funktsional xususiyatlarini o'zgartirmasdan abadiylashtiradi. Am J Physiol Renal Physiol 295: F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Chjan X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y va Giacomini KM (2013) Kuchli, tanlangan ko'p dori va toksin ekstruziyasi tashuvchisi 1 (MATE1, SLC47A1) ingibitorlarining kashfiyoti retsept bo'yicha dori profilini yaratish va hisoblash modellashtirish orqali. J Med Chem 56:781–795.