Kalpastatin avtofagiyani saqlash orqali angiotensin II vositachiligida podotsitlar shikastlanishining oldini oladi
Mar 17, 2022
qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blez Robin1,3, Joel Peres2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Dengiz Kamyu1, Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, He'le'ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He'nique1,Pyer-Lui Tharaux1va Oliviya Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Parij, Fransiya; va2Parij Dekart universiteti, Sorbonna Parij Siti, Parij, Fransiya
Surunkali glomerulyar patologiyalarda proteinuriyaning kuchli prognozli qiymati, shuningdek, glomerulyar fi-filtratsiya to'sig'ining o'zgarishi, podotsitlarning shikastlanishi va glomerulyar chandiqlar bilan glomerulyar kasallikning rivojlanishiga yordam beradigan angiotensin II ning patogen roli qat'iy tasdiqlangan. Bu erda surunkali angiotensin II sabab bo'lgan gipertenziya inhibe qilinganligini aniqladikavtofagiyasichqon glomeruliyasidagi oqim. Atg5 ning (avtofagiya bilan bog'liq bo'lgan oqsilni kodlovchi gen), ayniqsa podotsitda yo'q qilinishi tezlashtirilgan dangiotensin II tomonidan qo'zg'atilgan podotsitopatiya, kuchaygan albuminuriya va glomerulosklerozga olib keldi. Bu shuni ko'rsatadiki, avtofagiya bu holatda podotsitda asosiy himoya mexanizmi hisoblanadi. Podositlarda angiotensin-II induktsiyalangan kalpain faolligini inhibe qiladiavtofagiyaoqim. Endogen kalpain inhibitorining transgenik ifodasi bo'lgan sichqonlarning podotsitlarikalpastatinyuqori podotsitni ko'rsatadiavtofagiyaangiotensin II ga bog'liq bo'lgan inhibisyonga chidamli bo'lgan. Bundan tashqari, doimiy otofagiya bilankalpastatincheklangan podotsitlarning shikastlanishi va albuminuriya. Bu topilmalar shuni ko'rsatadiki, gipertenziya glomerulyar struktura va funktsiyaga patogen ta'sir ko'rsatadi, qisman podotsitlar avtofagiyasining blokadasiga olib keladigan kalpainlarning faollashishi orqali. Ushbu topilmalar angiotenzin II vositachiligidagi gipertenziyaning muvozanatni buzgan taqdirda patogen oqibatlarga olib keladigan kaltsiy ta'sirida kalpani jalb qilish orqali autofagiyani inhibe qiladigan original mexanizmni ochib beradi.kalpastatinfaoliyat. Shunday qilib, calpain vositachiligida pasayishning oldini olishavtofagiyayuqori renin-angiotensin tizimining faolligi bilan bog'liq bo'lgan nefropatiyalar uchun istiqbolli yangi terapevtik strategiya bo'lishi mumkin.
Kalit so'zlar: angiotenzin II;avtofagiya; kalpastatin; gipertenziya; podotsit
Tarjima bayonoti
Avtofagiyaning rivojlanishidagi hal qiluvchi rolini hisobga olgan holdabuyrakkasalliklar, farmakologik modulyatsiyaavtofagiyabir nechta oldini olish va davolash uchun istiqbolli strategiya bo'lishi mumkinbuyrakkasalliklar. Bunga parallel ravishda, podotsitlarda kalpain faolligining haddan tashqari faollashishi podotsitlar funktsiyasiga zararli ta'sir ko'rsatishi aniqlandi, ammo uning zararli ta'sir mexanizmlari aniqlanmagan. Bu erda biz kalpain angiotenzin II ning zararli ta'sirini zararli blokadaga bog'laydigan dalillarni keltiramiz.avtofagiyapodotsitlarda va kalpain inhibisyonu podotsitlar autofagiyasini qisman saqlab turish orqali podotsit kasalliklari uchun istiqbolli terapevtik maqsad bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
ga bosingSurunkali buyrak kasalligi uchun Cistanche deserticola ma
Gipertenziya surunkali surunkali kasallikning asosiy sababi sifatida diabetdan keyin ikkinchi o'rinda turadibuyrakKasallik1-3 va hatto qon bosimining o'rtacha ko'tarilishi buyrak kasalligining so'nggi bosqichi uchun mustaqil xavf omilidir.4 Ko'payib borayotgan eksperimental tadqiqotlar podotsitlarning rivojlanishida muhimligini ta'kidladi.buyrakjarohat. Eksperimental gipertenziv nefropatiyada buyrak funktsiyasining pasayishi bilan podotsitlarning progressiv yo'qolishi va mikrovaskulyar o'zgarishlar erta paydo bo'ladi.5 Bemorlarda hayotiy podotsitlarning siydik bilan chiqarilishi preeklampsi uchun sezgir va o'ziga xos belgi ekanligi ko'rsatilgan,6,7 va nefrosklerozli bemorlarda sezilarli darajada bo'lgan. glomerulyar podotsitlarning zichligi nisbatan pastbuyrakdonorlar.8,9 Bundan tashqari, glomerulyar kasallikning rivojlanishiga yordam beruvchi angiotensin II (AngII) ning patogen roli nafaqat gipertonik sharoitlarda, balki bir qancha glomerulyar kasalliklarda ham yaxshi tasdiqlangan.10-21
Glomerulyar gipertenziya glomerulyar kapillyarlarning cho'zilishi, endotelial shikastlanish va glomerulyar oqsil filtratsiyasining oshishiga olib keladi, bu esa glomerulyar kollaps va glomerulosklerozga olib keladi. Shuningdek, u glomerulyar tuzilmalarga to'g'ridan-to'g'ri ta'sir ko'rsatadi va kompensatsiyaga qaratilgan tartibga soluvchi signallarni keltirib chiqaradi. Faollashtirilgan tizimli va mahalliy renin-angiotensin-aldosteron tizimi (RAAS) mezangial giperplaziyani va tomir o'tkazuvchanligi omillarining sintezini rag'batlantiradi. Bir vaqtning o'zida podotsitlar kaltsiy signalini ko'rsatadi22,23 va ularning shaklini AngII tip 1 retseptorlari (AT1) - bog'liq stimulyatsiya bilan o'zgartiradi. AT1 qon bosimi va tuz va suv gomeostazi uchun taniqli RAAS ishtirokida vositachilik qiladi. Angiotensinga aylantiruvchi ferment inhibitörleri va AT1 blokerlari bemorlarda gipertenziya va yurak etishmovchiligini davolash uchun klinik jihatdan qo'llaniladi. Qizig'i shundaki, ikkala bloker ham himoya ta'sirini ko'rsatadibuyrakfunktsiyasi.
Avtofagiya hujayra gomeostazini, ayniqsa postmitotik hujayralarda29,30 va ayniqsa podotsitlarda saqlash uchun zarur ekanligi ko'rsatildi.31-34Avtofagiyauzoq umr ko'radigan sitoplazmatik oqsillar va disfunktsiyali organellalar uchun lizosomal bilan bog'liq degradatsiya tizimidir35,36 va autofagosomalarda oqsillar va organellalarning sekvestrlanishini o'z ichiga oladi. Avtofagosomalarning shakllanishi Map1lc3a/b, Beclin 1 va Tags kabi bir nechta genlarning induksiyasiga bog'liq. 37 Otofagik yo'lning disregulyatsiyasi buyraklarning qarishi patogenezida va boshqa ko'plab omillar bilan bog'liqligi haqida dalillar ortib bormoqda.buyrako'tkir buyrak shikastlanishi, polikistik buyrak kasalligi, qarish va diabetik nefropatiya kabi kasalliklar.31,32,38-41
ni tartibga solishavtofagiyapodotsitlarda, fiziologik va birinchi navbatda, patologik kontekstda yaxshi ma'lum emas. Biz yaqinda podotsitlar avtofagiyasi fiziologik sharoitda rapamitsin (mTOR) regulyatsiyasining mexanik maqsadidan mustaqil ekanligini ko'rsatdik, bu hujayra turini istisno qiladi.42 AT1 faollashuvi hujayralardagi oqsil sintezi va oqsil almashinuvini rag'batlantiradi. Shunday qilib, biz RAAS faollashuvi oqsil almashinuvini rag'batlantirish va proteostazga ham ta'sir qilishi mumkin deb o'yladik.
Ushbu tadqiqotda biz podotsitlardagi AngIIsignaling roliga e'tibor qaratdikavtofagiyatartibga solish. Biz AngII ning podotsitlarga surunkali blokirovka qiluvchi ta'sirida vositachilik qiluvchi kaltsiy bilan faollashtirilgan proteazlar kalpainlarini aniqladik.avtofagiya. Bundan tashqari, biz endogen kalpain inhibitori ekanligini aniqladikkalpastatingipertoniya davrida AngIIga bog'liq bo'lgan otofagiya inhibisyonu va podotsitlar shikastlanishining oldini olishga muvaffaq bo'ldi.
Ushbu topilmalar AngII vositachiligidagi gipertenziyani inhibe qiladigan original mexanizmni ochib beradiavtofagiyaKalpastatin faolligining muvozanati buzilgan taqdirda patogen oqibatlarga olib keladigan kalpainni kaltsiy tufayli jalb qilish orqali.
USULLARI
Hayvonlar
Kalpastatintransgenik (CSTTg) sichqonlar doktor E. Letavernier tomonidan muloyimlik bilan taqdim etildi.43 Atg5 genining podotsitlarga xos buzilishi (Nphs2.cre Atg5lox/lox) bo'lgan sichqonlar Nphs2.cre sichqonlarini44 Atg5lox/lox bilan kesib o'tish orqali avval tasvirlanganidek31 hosil qilingan. C57BL6/J fonida sichqonlar45. Ushbu tadqiqotda Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlari va 10 dan 12 haftagacha bo'lgan nazoratsiz erkagidan foydalanilgan. Gipertenziv model AngII (Sigma-Aldrich, A9525) 1 mg/kg/min dozada 4 dan 6 haftagacha osmotik minipompalar (Alzet Corp, 2006 yil) orqali sk infuzioni bilan yaratilgan. Nasoslar elkama pichoqlari va kalçalar o'rtasida orqada sc implantatsiya qilindi. Sichqonlar oziq-ovqatda tuz qo'shimchasini (3 foiz NaCl) oldi. Barcha tadqiqotlarda nazorat sifatida Atg5lox/lox (yovvoyi turdagi [WT]) sichqonlari ishlatilgan. Nefronni kamaytirish modeliga ega deoksikortikosteron asetat (DOCA) tuzi uchun kattalar erkak sichqonlari bir tomonlama chap nefrektomiyadan o'tkazildi. Nefrektomiyadan ikki hafta o'tgach, ular 21-kunlik chiqarilishi (Innovative Research of America) implantatsiya qilingan DOC pelletlarini oldilar. Ikkinchi pellet birinchi implantatsiyadan 3 hafta o'tgach implantatsiya qilindi. Barcha sichqonlar ad libitum ichimlik suvida 0,9 foiz NaCl qabul qildi va 6 haftalik DOC qo‘llanilgandan so‘ng o‘ldiriladi.46 Tajribalar fransuz veterinariya ko‘rsatmalariga va Yevropa hamjamiyati tomonidan hayvonlardan eksperimental foydalanish uchun ishlab chiqilganlarga muvofiq o‘tkazildi (L358-86/ 609EEC) va Frantsiya tadqiqot vazirligi va mahalliy universitet tadqiqot axloq qo'mitasi (APAFIS-7646 va -22373) tomonidan tasdiqlangan.
Birlamchi podotsitlar madaniyati tajribasi
Differentsiallangan birlamchi podotsitlar avval tavsiflanganidek ekilgan.47,48 Qisqacha aytganda, yangi ajratilgan buyrak korteksi Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Keyin to'qimalar 70 mm va 40 mm hujayra filtrlari (BD Falcon, 352340 va 352350) orqali o'tkazildi. 40 mm hujayra filtriga yopishgan glomeruli fosfat tamponli tuz (PBS; Life Technologies, 10010023) va 0,5 foizli sigir zardobi albumini (Eurobio, HALALB07-65) bilan olib tashlandi va keyin ikki marta bosim ostida AOK qilindi. PBS da. Yangi ajratilgan glomerullar 6-Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) quduqli idishlarga solingan, unga 10 foiz homila buzoq zardobi va 1 foiz penitsillin/streptomitsin (Life Technologies, 12140 dan 12140 g gacha) qo'shilgan. va o'sadi. Podotsitlarning boyitishi ilgari tavsiflanganidek Western blot tahlili bilan tasdiqlangan31,48,49 (Qo'shimcha rasm S1). Podotsitlar 4 soat davomida bafilomisin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) mavjud bo'lmagan yoki yo'qligida ekilgan. Immunofluoresans tajribalari uchun birlamchi podotsitlar 4 ta idish yorlig'iga qo'yilgan (Dutcher, 055071). Keyin podotsitlar 10 daqiqa davomida 4 foizli paraformaldegidda o'rnatildi va immunofluoresans uchun qayta ishlandi.
Kalpain faolligini tahlil qilish
Hujayra ichidagi kalpain faolligi avval tavsiflanganidek birlamchi podotsitlarda aniqlangan.50–52 Jami 100000 hujayra Roswell Park Memorial Institute 1640 da 10% homila bilan toʻldirilgan 24-quduq toʻqima madaniyati idishlarida ekilgan. buzoq zardobi va 1 foiz penitsillin/streptomitsin. Belgilangan madaniyat davridan so'ng, muhit 10 mM kalpain inhibitori bilan yoki 4 mM CaCl2 bo'lgan Krebs-Ringer HEPES bikarbonat (KRH) eritmasi (pH 7,4) bilan almashtirildi-1 va qo'shilishdan oldin 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. 50 mM kalpain substrat N-suksinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metil kumarin (Sigma-Aldrich, S6510). 90-daqiqalik inkubatsiya davridan so'ng, kalpain faolligi FL floresansi (360 nm qo'zg'alishda va 430 nm emissiyada o'lchanadi) kalpain inhibitori bilan va bo'lmagan-1 o'rtasidagi farq sifatida aniqlandi.
G'arbiy dog'
Birlamchi podotsitlar fosfataza va proteaza ingibitorini o'z ichiga olgan 80 ml radioimmunopresipitatsiya tahlili buferi bilan tirnalgan. Protein kontsentratsiyasi BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285) bilan o'lchandi. Yigirma mikrogram oqsil Criterion XT prekast gelida elektroforezlangan (12 foiz Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteinlar poliviniliden diftorid membranasiga o'tkazildi (Thermo Fischer Scientific, 88518). Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T) 5 foizli sutda bloklanganidan so'ng membranalar quyon poliklonal anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), quyon poliklonal anti-ATG5 bilan inkubatsiya qilindi. (1:2000, Hujayra signalizatsiya texnologiyasi, 2630), gvineya cho'chqasi poliklonal anti-Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), quyon poliklonal anti-kalpain 1 domen IV (1:1000, Abcam) ), quyon poliklonal anti-kalpain 2 amino-terminal I domenining oxiri (1:1000, Abcam, ab39165), sichqoncha monoklonal IgG1 anti-kalpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), quyon podotsinga qarshi (1:1000, Abcam, ab50339), gvineya cho'chqasiga qarshi nefrin (1:500, PROGEN, GP-N2) va kalamush monoklonal tubulinga qarshi (1:5000, Abcam, ab6160) antikor. Yuvishdan keyin membranalar horseradish peroksidaza bilan bog'langan antikor bilan inkubatsiya qilindi (1: 2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Maxsus signallarni aniqlash LAS 4000 qurilmasida (Fuji) ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) yordamida amalga oshirildi. Miqdorni aniqlash uchun ImageJ dasturi (Milliy sog'liqni saqlash institutlari) yordamida densitometriya tahlilidan foydalanildi.
Qon bosimini o'lchash va fiziologik baholash
Sichqonlarning sistolik qon bosimi dumli manjet usuli (Visitech Systems Inc., BP-2000) yordamida qayd etilgan. Har bir sichqonchadan o'nta o'lchov olindi va keyin o'rtacha qiymat aniqlandi. Sistolik qon bosimi boshlang'ich bosqichda (12 haftalik) va davolanish muddati tugagunga qadar har hafta o'lchandi. Barcha sichqonlar 6-soatlik siydik yig'ish uchun suvga erkin kirish imkoni bilan metabolik kataklarga joylashtirildi. Siydikdagi kreatinin va plazmadagi karbamid kontsentratsiyasi kolorimetrik usul (Olympus, AU400) yordamida spektrofotometrik tarzda tahlil qilindi. Siydik bilan albumin chiqarilishi sichqon siydigida albumin miqdorini aniqlash uchun maxsus fermentga bog'liq immunosorbent tahlili yordamida o'lchandi (Crystal Chem, 80630).
Gistologiya
Buyraklaryig'ib olingan va 4 foiz PBS-buferli formalinda fiksatsiya qilingan. Buyrak morfologiyasini baholash uchun parafin o'rnatilgan bo'laklar (qalinligi 3- mm) Masson strikromida bo'yalgan. Buyraklar anomaliyalari glomeruloskleroz, mezangial kengayish, tubulyar atrofiya yoki gipslar va fibrozni o'z ichiga olgan tarkibiy anormalliklarning mavjudligi va og'irligiga qarab baholandi. Sklerotik glomeruliyalarning nisbati har bir kishi uchun kamida 50 glomeruliyani ko'r-ko'rona tekshirish orqali baholandi.buyrakBo'lim.
Buyrak bo'limlari va birlamchi podotsitlarning immunofluoresans bilan bo'yalishi
Ruxsat etilgan birlamchi podotsitlar TBS-T 3 foizli sigir zardobi albuminida bloklandi va bir kechada 4 daraja haroratda gvineya cho'chqasiga qarshi SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) va quyonlarga qarshi antikor bilan inkubatsiya qilindi. -yashil FL floresan oqsili (GFP; 1:500, Abcam, ab290). TBS-T yuvilgandan so'ng, FL florofor bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar eshak anti-gvineya cho'chqasi IgG AF594-konjugatsiyalangan antikor (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) va eshakning quyonga qarshi IgG AF488-konjugatsiyalangan antikorlari ( Invitrogen, A21206) qo'llanilgan. Tasvirlar Zeiss 2 futlik lyuminestsent mikroskop, AxioCam HRccamera va Axiovision 4.3 dasturi yordamida olingan.
Formalin bilan biriktirilgan kerosinli (FFPE) uchunbuyraklar, bo'limlar (3 mm) deparafinizatsiya qilindi va gidratlandi va antigenni olish qizdirilgan sitrat tamponida (pH 6) amalga oshirildi. Keyin bo'limlar Triton 0.1 foiz (Euromedex) bilan o'tkazuvchan bo'ldi va TBS-T 3 foizli sigir zardobi albumini bilan 4 C da tunda antikor inkubatsiyasidan oldin bloklandi. Biz echki anti-nefrinidan foydalandik (1:100, PROGEN, GP). -N2), gvineya cho'chqasi anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), quyonlarga qarshi GFP (1:1000, Abcam, ab290), echkilarga qarshi podokaliksin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) va quyonlarga qarshi Wilm's tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) antikorlari. Ikkilamchi antikorlar Invitrogendan Alexa488- va Alexa 568- konjugatsiyalangan antikorlar edi. Yadrolar Hoechst yordamida ko'k rangga bo'yalgan. Slaydlar floresan o'rnatish vositasi (Dako, S3023) yordamida o'rnatildi. Fotomikrografiyalar Zeiss Axiophot fotomikroskopi va Axiovision dasturi yordamida olingan. Fiji bo'yicha yarimavtomatik miqdorlar sichqoncha boshiga kamida 30 glomeruliyadagi glomerulyar bo'limda nefrin-musbat va PODXL+ maydonlarini aniqlash uchun ishlatilgan. Podocytenumber sichqonchaning kamida 30 glomeruli bo'limida WT1+ yadrolari soni sifatida hisoblangan.
Transmissiya elektron mikroskopiya usuli
Buyrak korteksining kichik qismlari (1 mm3) 3 foizli glutaraldegid darajasida (Elektron mikroskopiya fanlari) 1 dan 30 kungacha mahkamlangan va PBSda uch marta yuvilgan. Namunalar 0,1 M PBS (pH 7,4) da 1 foizli osmiy tetroksid 0,1 M (elektron mikroskopiya fani)da postfikslangan va suvda yuvilgan. Namunalar alkogol navlarida va 100 foiz propilen oksidida suvsizlandi (Elektron mikroskopiya fani). Qatronlar infiltratsiyasi quyidagicha amalga oshirildi: Epikote 812 va propilen oksidini 1:1 nisbatda 30 daqiqa davomida aralashtiring, so'ngra Epikote 812 va propilen oksidini 1:2 nisbatda bir kechada xona haroratida aralashtiring. Namunalar 100 foizli Epikote 812 ga 4 mm jelatinli kapsulalarga solingan va 60 C ga qadar isitiladigan pechda polimerlangan. Ultra yupqa bo‘laklar UFC7 ultramikrotom (Leica MicrosystemsGmbH) bilan kesilib, Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science) ga joylashtirildi. Ular 7 foiz uranil asetat (LFG Distribution) va Reynoldning qo'rg'oshin sitrati (LFG) bilan bo'yalgan. Namunalar olish uchun Digital Micrograph dasturi (Gatan) bilan ishlaydigan Orius SC1000 CCD kamerasi (Gatan) bilan JEM1011 transmissiya elektron mikroskopida (JEOL) tekshirildi.
Cistanche-buyrak kasalligi
Polimeraza zanjiri reaktsiyasining miqdoriy massivi
Yangi ajratilgan glomerullar QIAzol Lizis reaktivida (Qiagen) -80 darajada muzlatilgan. Fenol asosidagi usul yordamida umumiy RNK ekstraktsiyasi ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga muvofiq qayta ishlandi. cDNKlar RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) yordamida sintez qilindi va real vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 33) bilan Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) yordamida amalga oshirildi. . Miqdoriy PCR plitalari Applied Biosystems StepOnePlus sikl qurilmasida ishga tushirildi. Har bir massivda teskari transkripsiya samaradorligi va genomik DNK ifloslanishi uchun sifat nazorati mavjud. Miqdoriy PCR tahlili GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) yordamida 2-DDCT usuli yordamida amalga oshirildi va ifodalangan gen ifodasida Log2 marta o'zgarishi kabi.
Silikon proteomik tahlilda
Silikoda kalpaning yorilishi joyini bashorat qilish DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) va CaMPDB (http://) yordamida amalga oshirildi. calpain.org/) onlayn vositalar. Sichqoncha oqsilining aminokislotalar ketma-ketligi Uniprot (https://www.uniprot.org) dan olingan. Natijalar S1 va S2 qo'shimcha jadvallarida qayta tiklangan.
Statistik tahlillar
Barcha grafiklar individual qiymatlarni va o'rtacha ± SEMni ifodalaydi. Statistik tahlillar GraphPad Prism dasturining 9-versiyasi yordamida amalga oshirildi. Ikki guruh o'rtasidagi taqqoslash namunalar Anderson-Darling va D'Agostino normallik testlaridan va dispersiya tengligi uchun F testidan o'tganida parametrikStudent t-testi yordamida amalga oshirildi. Aks holda, parametrik bo'lmagan Mann-Whitney testi ishlatilgan. Bir nechta guruhlar o'rtasidagi taqqoslash 1-tartibli yoki 2-variant tahlili, so'ngra Simak tuzatishi bilan bir nechta taqqoslash testi yordamida amalga oshirildi. P < 0.05="" qiymatlari="" muhim="" deb="" hisoblandi.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
1-rasm|Angiotensin II (AngII) D yuqori tuzli diet (HSD) tufayli kelib chiqqan gipertenziya glomerulyarlarni inhibe qiladi.avtofagiya. (a–c) yovvoyi turdagi (WT) sichqonlarning glomeruli (a,a0)dagi Podokaliksin (PODXL; qizil) va P62 (yashil) immunofluoressensiyasi, (b,b0 ) dan 6 haftalik AngII + HSDdan so‘ng WT sichqonlari va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan olingan (c,c0) gipertenziya davrida podotsitlarda va podotsitlarga xos ATGda P62 to‘planishini ko‘rsatadi{{1{{12} }}}} nuqsonli sichqonlar. O'q uchlari (a0 ) ichida WTdagi P62+ nuqtalarni bildiradi. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan qarama-qarshi bo'lgan. Rasmning pastki qismlari yuqori kattalashtirishni ko'rsatadi. Barlar=50 mm. (d) Glomerulyar maydonning ulushi sifatida ifodalangan P62+ maydonining bog'liq miqdori. n=4 WT sichqonlari va n=5 WT AngII + HSD bilan va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlari. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Mann-Whitney testi: *P=0.0159. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
NATIJALAR
AngII D yuqori tuzli dietadan kelib chiqqan gipertenziya podotsitlar otofagiyasini inhibe qildi
Podositlar yuqori darajada namoyon bo'ladiavtofagiyain vivo, avtofagiyaning asosiy belgisi bo'lgan LC3 (GFP-LC3 sichqonlari) ga GFP sintezi bilan transgen sichqonlarda kuchli GFP ifodasi bilan ko'rsatilgan (Qo'shimcha rasm S2A). Avtofagiya - bu avtofagosomalarning doimiy shakllanishi va avtofagolizosomalarning degradatsiyasi bilan kechadigan dinamik jarayon. Xlorokin bilan avtofagosomal degradatsiyani blokirovka qilish GFP+ nuqtalarining to'planishiga olib keldi, bu podotsitlarda yuqori avtofagik oqimni ko'rsatadi (Qo'shimcha rasmlar S2A va B). GFP+ nuqtalarining avtofagosomalar ekanligi tasdiqlanishi GFP va SQSTM1/P62 uchun ikki tomonlama immuno-FL floresansi orqali ko'rsatildi, bu tomonidan parchalangan chaperon oqsili.avtofagiya(Qo'shimcha rasm S2C va D). Shunga qaramay, xlorokin bilan davolash GFP+ P62+ nuqtalarining to'planishiga olib keldi, bu podotsitlarda muhim avtofagik oqimni ko'rsatdi. Va nihoyat, GFP-LC3 sichqonlaridan ajratilgan birlamchi podotsitlarda GFP va P62 ifodasi va bafilomisin A1 bilan davolashda GFP+ va P62+ nuqtalarining kuchli to'planishi, autofagosomal degradatsiyaning boshqa blokatori (E-H qo'shimcha rasm) in vitroda yuqori avtofagik oqim saqlanib qolgan. .
Keyin gipertenziyaning podotsitlarning avtofagik javoblarini modulyatsiya qilish qobiliyati 6 hafta davomida yuqori tuzli dieta (HSD) bilan AngII bilan to'ldirilgan sichqonlarda va gipertenziv bo'lmagan nazoratlarda baholandi. 1-rasmda ko'rsatilganidek, AngII + HSD glomeruliyalarda P62 to'planishini podotsitlarda kuchli to'planishiga olib keldi, bu esa AngII + HSD podotsitlar uchun javobgar ekanligini ko'rsatadi.avtofagiyablokada (1a-d-rasm). Qizig'i shundaki, podotsitlarda P62 to'planishi podotsitlar autofagiyasi (Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlari) uchun etishmaydigan sichqonlarda kuzatilganiga o'xshash edi. Gipertenziyaning boshqa modeli, DOC-tuz modelida biz kasallikning vaqt davomida podotsitlarda progressiv P62 to'planishini kuzatdik (Qo'shimcha rasm S3).
Atg5 ning ayniqsa podotsitlarda yo'q qilinishi AngII D HSD modelida albuminuriya, podotsitlar yo'qolishi va glomerulyar shikastlanishning kuchayishiga olib keladi.
Keyin biz tekshirdikavtofagiyafaqat podotsitlardagi blokada (Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlari) AngII + HSD modelida glomerulyar shikastlanishga ta'sir qiladi. Biz birinchi navbatda Nphs2 ekanligini tasdiqladik. cre Atg5lox/lox sichqonlari normal qon bosimiga ega, normal edibuyrakfunktsiyasi va 10 oygacha glomerulyar gistologik lezyonlar yo'q, ilgari xabar qilinganidek (Qo'shimcha rasm S4).32 Keyin, Atg5lox/lox (WT) va Nphs2. cre Atg5lox/lox sichqonlari 6 hafta davomida HSD bilan AngII bilan infuzion qilingan. Muhimi shundaki, tadqiqot davomida AngII infuzionidan keyin 2 guruhda sistolik qon bosimi o'xshash bo'lgan (2a-rasm), ammo qon bosimini o'lchash uchun ishlatiladigan quyruq usuli kichik qon bosimi farqlarini bartaraf eta olmasligi mumkin. HSD bilan AngII infuzioni WT sichqonlarida siydik albumin-kreatinin nisbatini sezilarli darajada oshirdi va bu ta'sir Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlarida sezilarli darajada oshdi (2b-rasm). Gipertenziv Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlari, shuningdek, WT littermates bilan solishtirganda glomerulyar sklerozning sezilarli darajada oshganini ko'rsatdi (2c-e-rasm). O'lchangan proteinuriya bilan kelishilgan holda, ATG5 da podotsit etishmovchiligi bo'lgan sichqonlarda oqsilli quyma va quvurli kengayish sezilarli darajada keng tarqalgan (2f-h-rasm).
2-rasm|Atg5 ning ayniqsa podotsitlarda yo'q qilinishi albuminuriyaning sezilarli darajada oshishiga olib keladi,buyrakjarohati va angiotensin II (AngII) infuzion D yuqori tuzli diet (HSD) 6 haftadan keyin podotsit yo'qolishi. (a) AngII + HSD 36 kun davomida Atg5lox/lox va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlarida sistolik qon bosimi. har bir genotipga n=9 sichqon. Qiymatlar o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Ikki tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA): ns. (b–m) da n=10 sichqon har bir genotip. (b,g,h,k) da qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha±SEM sifatida taqdim etiladi. (b) AngII + HSD (davomi)
2-rasm|(davomi) Nphs2da albuminuriyaning keskin o'sishiga olib keldi. cre Atg5lox/lox sichqonlari Atg5lox/lox nazorat sichqonlari bilan solishtirganda. Ikki tomonlama ANOVA: genotip, P=0.013; vaqt, P=0.0018. (c-f) 6 haftalik AngII + HSDdan keyin Atg5lox/lox nazorati va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan olingan glomerullarning Massonning trikrom bilan bo'yalgan qismlarining vakillik tasvirlari. Barlar=50 mm dyuym (c,d). Barlar=100 mm dyuym (e,f). (g,h) solishtirish (g) sklerotik glomeruliyalar nisbati va (h) mikroskopik maydonga to'g'ridan-to'g'ri naychalar soni. Mann-Uitni testi: **P=0,0026 dyuym (h), ***P=0,0003 dyuym (g). (i,j) 6 hafta davomida AngII + HSDdan keyin Atg5lox/lox nazorati va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan glomerulilarda Wilmʼs tumor 1 (WT1; qizil) va Podocalyxin (PODXL; yashil) ifodalanishining vakil immunofluoresans tasvirlari. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Barlar=50 mm. (k) Glomerulyar bo'limda WT1+ hujayralar sonini aniqlash. Mann-Uitni testi: **P=0,0029 dyuym (l,m). 6 hafta davomida AngII + HSDdan keyin Atg5lox/lox nazorati va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan glomerullarda CD44 (yashil) ifodalanishining vakil immunofluoresans tasvirlari. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Barlar=50 mm. (n, o) Atg5lox/lox nazorati va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan 6 hafta davomida AngII + HSD dan so'ng glomeruli bo'limlarining vakili transmissiya elektron mikroskopi fotomikrograflari, hipertansif Nphs2 da podotsit oyoq jarayonining o'chirilishini (o'q uchlari) ko'rsatadi. cre Atg5lox/lox sichqonlari. Barlar=1 mm. har bir genotipga n=3 sichqon. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun www.kidney-international.org saytida ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang.
3-rasm|Kalpain ifodasi va podotsitlardagi faolligi. (a) birlamchi podotsitlarda kalpain-1, kalpain-2 va kalpain-4 ifodasining Western blot tahlili. Tubulin ifodasi normalizatsiya sifatida xizmat qiladi. (b) Kalpain faolligi angiotensin II (AngII; 100 nM) bilan 24 soat davomida yoki kalpeptinsiz (10 mM) davolangan yoki davolanmagan birlamchi podotsitlarda o'lchandi. n=5 ta mustaqil tajriba. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA): davolash, P=0.0035. Sidakning ko'p taqqoslash testi: *P=0.0128 AngII uchun bazaviy ko'rsatkich, ##P=0.0056 uchun AngII + kalpeptin va AngII. (c) Kalpain faolligi yovvoyi turdagi (WT) yoki asosiy podotsitlarda o'lchandikalpastatin24 soat davomida AngII (100 nM) bilan davolangan yoki davolanmagan transgenik (CSTTg) sichqonlar. n=7 ta mustaqil tajriba. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Ikki tomonlama ANOVA davolash uchun juftlangan: genotip, P=0.0483. Sidakning bir nechta taqqoslash testi: *** WT AngII uchun P=0.0009 va boshlang'ich, *P=0.0420 CSTTg AngII uchun boshlang'ich, #P=0.0424 WT va CSTTg AngII. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
Nphs2 da glomerulus boshiga podotsitlar soni sezilarli darajada kamaydi. cre Atg5lox/lox sichqonlari AngII + HSD bilan davolash qilingan (2i-k-rasm). AngII infuzioni + HSD bilan Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlarida podotsitlar shikastlanishi hatto glomerullarda parietal epitelial hujayra (PEC) faollashuv belgisi CD44 ifodasi bilan ko'rsatilganidek, fokal va segmental glomerulosklerozga o'tdi (2l va m-rasm). Elektron mikroskopiya tahlili HSD bilan surunkali AngII infuzioni bilan ATG5 etishmovchiligi bilan bog'liq sezilarli o'zgarishlarni aniqladi, shu jumladan, hipertansif Nphs2 da oyoq jarayonining o'chirilishi. cre Atg5lox/lox sichqonlari. Aksincha, WT sichqonlarining podotsitlarida HSD bilan 10 haftalik AngII infuzionidan keyin ham bir nechta ultrastruktura nuqsonlari topilgan (2n va o-rasm), bu podotsitlarning AngII + HSD tomonidan qo'zg'atilgan zararga chidamliligi uchun ularning avtofagik faolligi zarurligini ko'rsatadi. Umuman olganda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, AngII + HSD modelida,avtofagiyainhibisyon podotsitlar shikastlanishi va yo'qolishini kuchaytiradi va keyingi fokal va segmental glomerulosklerozni keltirib chiqaradi.
AngII D HSD podotsitlarda kalpain faolligini faollashtiradi, bu esa autofagiya blokadasiga hissa qo'shadi.
Kalpain faolligi aniqlanganidek (i) AngII tomonidan bir nechta hujayra turlarida faollashadi va (ii) bir nechta hujayralarni parchalaydi.avtofagiya-bog'liq oqsillar,53 biz AngII + HSD vositachiligidagi otofagiya blokadasi AngII tomonidan qo'zg'atilgan kalpain faolligining oshishi bilan bog'liq bo'lishi mumkinmi, deb qiziqdik. Biz birinchi navbatda birlamchi podotsitlar kalpainlarning 3 ta keng tarqalgan shaklini ifodalashini aniqladik (3a-rasm). Keyin biz AngII birlamchi podotsitlarda kalpain faolligini rag'batlantirganini ko'rsatdik. Kalpain faolligining bu o'sishi selektiv kalpain inhibitori tomonidan bloklangan (3b-rasm). Biz qo'shimchali sichqonchani ishlatdikkalpastatintransgen ifodasi (kalpain faolligining pasayishiga olib keladi)43 AngII + HSD vositachiligida kalpainlarning rolini baholash uchunbuyrakshikastlanish va otofagiya blokadasi. CSTTg sichqonlarining birlamchi podotsitlari nazorat sichqonlarining podotsitlari bilan solishtirganda AngII ga javoban kalpain faolligining pasayishini ko'rsatdi (3c-rasm). Shunday qilib,kalpastatinpodotsitlarda haddan tashqari ekspressiya AngII vositachiligida kalpain faollashuvini kamaytirdi.
Keyingi baholadikavtofagiyaCSTTg sichqonlarining podotsitlardagi darajalari. Biz GFP-LC3 transgeni bilan CSTTg sichqonlarini yaratdik. LC3-GFP muxbiri avtofagosomalarni GFP+/P62+ nuqta sifatida sanashga ruxsat berdi. Avtofagik oqim bloklanganda P62 hujayralardagi agregatlarda to'planadi. Bazal holatda biz CSTTg GFP-LC3 sichqonlarining podotsitlarida oddiy GFP-LC3 sichqonlarining podotsitlariga qaraganda kamroq GFP+ P62+ nuqtalarini (4a, b va e-rasm) va kamroq P62 to‘planishini (4c, d va f-rasm) hisobladik. Kalpastatin miqdori yuqori bo'lgan sichqonlarning podotsitlarida otofagik oqimning kuchayganligini ko'rsatadi.
4-rasm|Podositlarda otofagik oqimni baholashkalpastatintransgenik (CSTTg) sichqonlar. (a,b) 12-haftalik GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarining glomeruliyalarida yashil FL floresan oqsili (GFP) (yashil) va P62 (qizil) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari. O'q uchlari GFP+ P62+ autofagosomalarni ko'rsatadi. (c,d) 12-haftalik GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlaridan olingan glomerullarda P62 (yashil) va Podokaliksin (PODXL; qizil) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari. Rasmning pastki qismlari yuqori kattalashtirishni ko'rsatadi. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Barlar=50 mm. (e) podotsitda LC3+ P62+ nuqtalar sonini aniqlash. Mann-Whitney testi: **P= 0.0065. (f) Glomerulyar bo'limda P62+ maydoni miqdorini aniqlash. Mann-Whitney testi: *P=0.0420. (e,f), n=5 GFP-LC3 sichqonlari va n=8 CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
Avtofagik oqimni LC3, LC3-I sitoplazmatik shaklining avtofagosomal parchalangan va LC3, LC3-II ning fosfatidiletanolamin bilan bog'langan shakliga konversiyasini o'lchash orqali kuzatish mumkin. . CSTTg sichqonlarining podotsitlari bafilomisin A1 borligida ham, yo‘qligida ham LC{4}}I dan LC3-IIga o‘tishning kuchayganligini va P62 ifodasining kamayganligini ko‘rsatdi (5a va b-rasm), bu esa organizmda otofagik oqimning kuchayganligini ko‘rsatadi. kalpastatinning haddan tashqari ko'payishi bilan podotsitlar. Nihoyat, xlorokin kiritilgandan so'ng podotsitlarda GFP+ P62+ nuqtalarining to'planishi CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida GFP-LC3 sichqonlariga qaraganda muhimroq bo'lgan, bu shuni tasdiqlaydi.kalpastatinhaddan tashqari ekspressiya in vivo jonli ravishda podotsitlarda otofagik oqimni keltirib chiqaradi (5c-e-rasm). Umuman olganda, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, AngII podotsitlarda kalpain faolligini rag'batlantiradi, ya'niavtofagiyapodotsitlarda kalpain tomonidan inhibe qilinadi va kalpastatinning haddan tashqari ko'payishi bilan endogen kalpain faolligini inhibe qilish podotsitlarda autofagik oqimni rag'batlantirish uchun etarli.
CSTTg sichqonlari AngII D HSD tomonidan qo'zg'atilgan podotsit shikastlanishidan himoyalangan
CSTTg sichqonlari hech narsani ko'rsatmadibuyrakkamida 12 oylik bo'lgunga qadar o'zgartirish (qo'shimcha S5-rasm). Biz AngII + HSD davolash paytida CSTTg sichqonlarida podotsit shikastlanishini tahlil qildik. WT sichqonlarida 4 haftalik gipertenziyadan keyin engil glomeruloskleroz va podotsitlar shikastlanishi paydo bo'lgan bo'lsa-da, podokaliksin va nefrinning g'ayritabiiy ifodasi bilan ko'rsatilgan, CSTTg sichqonlari kamroq sklerotik glomerulyar lezyonlarni taqdim etdi (6a va b-rasm) va podokaliksin va nefrin ifodasini saqlab qoldi (6c-rasm). . Podositlar fenotipidagi bunday farqlar podotsit yadrolarining zichligi WT va gipertenziv CSTTg sichqonlari o'rtasida farq qilmaydigan bosqichda kuzatilgan (6i-k-rasm).
5-rasm|Avtofagosomal degradatsiyani blokirovka qilish podotsitlarning otofagik oqimining kuchayganligini tasdiqladi.kalpastatintransgenik (CSTTg) sichqonlar. (a) Yovvoyi turdagi (WT) yoki CSTTg sichqonlarining birlamchi podotsitlarida LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1) / P62 va ATG5 ifodasining Western blot tahlili. Tubulin ifodasi normalizatsiya sifatida xizmat qiladi. Podotsitlar madaniyat tutilishidan oldin 4 soat davomida bafilomisin A1 (BafA1; 100 nM) bilan davolangan yoki davolanmagan. (b) LC{{10}}II/tubulin va P62/tubulin nisbatlarini miqdoriy aniqlash. n=10 WT sichqonlari va n=8 CSTTg sichqonlari. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Davolash uchun juftlashtirilgan dispersiyaning ikki tomonlama tahlili: LC3-II/tubulin uchun: genotip, P=0.{{30}}008; davolash, P <0,0001; p62/tubulin="" uchun:="" genotip,="" p="0.0884;" davolash,="" p=""><0,0001. sidakning="" bir="" nechta="" taqqoslash="" testi:="" lc3-ii/tubulin="" uchun:="" ***wt="" plus="" bafa1="" uchun="" wt="" plus="" bafa1="" uchun="" p="">< 0,0001="" y="" bafa1,="" ***="" csttg="" plus="" bafa1="" uchun="" csttg="" y="" bafa1="" uchun="" p="">< 0,0001,="" ##p{="" {34}}.0028="" wt="" +="" bafa1="" va="" csttg="" +="" bafa1="" uchun;="" p62/tubulin="" uchun:="" ***="" wt="" plus="" bafa1="" uchun="" wt="" +="" bafa1="" uchun="" p="">< 0,0001,="" ***="" csttg="" plus="" bafa1="" uchun="" csttg="" +="" bafa1ga="" nisbatan="" p="">< 0,0001.="" (c,d)="" 12-="" haftalik="" gfp-lc3="" va="" csttg="" gfp-lc3="" sichqonlarining="" glomeruliyalarida="" yashil="" fl="" floresan="" oqsili="" (gfp;="" yashil)="" va="" p62="" (qizil)="" ifodasining="" vakillik="" immunofluoresans="" tasvirlari.="" rasmning="" pastki="" qismlari="" yuqori="" kattalashtirishni="" ko'rsatadi.="" yadrolar="" hoechst="" (ko'k)="" bilan="" bo'yalgan.="" barlar="50" mm.="" sichqonlarni="" o'ldirishdan="" 4="" soat="" oldin="" xlorokin="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" bilan="" davolashdi.="" o'q="" uchlari="" gfp+="" p62+="" autofagosomalarni="" ko'rsatadi.="" (e)="" podotsitda="" lc3+="" p62+="" nuqtalar="" sonini="" aniqlash.="" har="" bir="" genotipga="" n="5" sichqon.="" qadriyatlar="" alohida="" uchastkalar="" va="" o'rtacha="" sifatida="" taqdim="">±SEM. Teng SD bilan juftlashtirilmagan t-test: *P=0.0302. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
6-rasm |Kalpastatinhaddan tashqari ekspressiya angiotensin II (AngII) D yuqori tuzli diet (HSD) vositachiligida podotsit shikastlanishining oldini oladi. (a,b) 6 haftalik AngII + HSDdan so'ng yovvoyi tipdagi (WT) va kalpastatin transgenik (CSTTg) sichqonlardan olingan glomeruliyalarning Massonning trixrom bilan bo'yalgan qismlarining vakillik tasvirlari. Barlar=50 mm. (c, d, f, g) 6 haftalik AngII + HSD va (e) WT va CSTTg sichqonlarida (c, d) Podocalyxin (PODXL) va (f,g) nefrin (NPHS1) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari va (e) ,h) tegishli miqdorlar. Barlar=50 mm. (i, j) 6 haftalik AngII + HSDdan so'ng WT va CSTTg sichqonlarining glomeruliyalarida Wilm's o'simtasi 1 (WT1; yashil) va PODXL (qizil) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari va (k) WT1+ sonini aniqlash. glomerulyar bo'limda hujayralar. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Barlar=50 mm. (e,h,k) da qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha±SEM sifatida taqdim etiladi. n=9 WT sichqonlari va n=7 CSTTg sichqonlari. Teng SD bilan juftlashtirilmagan t-test: **P=0,0095 dyuym (e), *P=0,0249 dyuym (h), P=0,7891 dyuym (k). Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
Xuddi shunday, 6 haftalik gipertenziyadan so'ng, GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida podotsitlar shikastlanishi kuzatildi, ammo GFP-LC3 sichqonlarida lezyonlar ko'proq aniqlandi (7-rasm). Siydikdagi albuminning kreatininga nisbati GFP-LC3 sichqonlarida 4 haftalik AngII + HSDdan keyin yuqori bo'ldi (7a-rasm). Podotsitlar soni 2 genotip orasida farq qilmadi, ammo GFP-LC3 (nazorat) sichqonlarida nefrin ifodasi sezilarli darajada kamaydi (7b-e-rasm). Bilan bog'lashkalpastatin-vositalangan himoya, ultrastruktura tahlili AngII + HSD bilan davolash qilingan GFP-LC3 sichqonlarida oyoq jarayonining engil va fokal yo'qolishini ko'rsatdi, bu bilan CSTTg sichqonlarida oyoq jarayonining o'chirilishi yaxshiroq saqlanib qolgan, garchi glomerulyar podvalda oyoq jarayonlari sonining global miqdori membrana (GBM) uzunligi statistik jihatdan farq qilmadi, chunki podotsitlar shikastlanishi bizning modelimizda fokusli va segmentaldir (7f-h-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, makrofaglar va T-limfotsitlar infiltratsiyasibuyraklarguruhlar o'rtasida farq qilmadi (qo'shimcha S6-rasm). Birgalikda bu natijalar shuni ko'rsatdikalpastatinAngII + HSD sabab bo'lgan podotsit shikastlanishining oldini oldi.
Kalpastatinning haddan tashqari ekspressiyasi AngII D HSD bilan davolashdan keyin sichqonlarning podotsitlarida avtofagik oqimni tiklaydi.
Nihoyat, biz hayron bo'ldikkalpastatin-AngII + HSD modelidagi vositachi glomerulyar himoya podotsitlarda otofagiyani saqlab qolish bilan bog'liq. Qizig'i shundaki, CSTTg va GFP-LC3 CSTTg sichqonlarida podotsitlarda AngII + HSD tomonidan qo'zg'atilgan P62 to'planishining oldi olindi (8a-d-rasm), bu kalpastatin podotsitlar blokadasini oldini olganligini ko'rsatadi.avtofagiya. Shunisi e'tiborga loyiqki, avtofagosomalarning GFP+ P62+ nuqta belgilarining soni gipertenziv GFP-LC3 va GFP-LC3 CSTTg sichqonlarining podotsitlarida o'xshash edi, shuning uchun AngII + HSD to'liq hibsga olish o'rniga podotsitlarning avtofagik oqimining sekinlashishini keltirib chiqardi (8e-rasm). g).
Podositlar oqsillarida kalpain ajralish joyini silika prognozida
Podositlardagi potentsial kalpain maqsadlarini bashorat qilish uchun biz bir nechta silika vositalaridan foydalandik (qo'shimcha jadvallar S1 va S2). Uchta onlayn ma'lumotlar bazasi solishtirildi: GPS-CCD, 54 CaMPDB, 55 va DeepCalpain.56 Silikat tahlilida ular orasida kalpainlar tomonidan parchalanishi mumkin bo'lgan bir nechta podotsit oqsillari, nefrin va podotsin aniqlandi. Shunday qilib,kalpastatin- vositachilik glomerulyar himoyasi kalpain fermentativ faolligining pasayishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu esa ba'zi podotsitlar oqsillarining parchalanishini kamaytirishga olib keladi.
Bundan tashqari, kamida 3avtofagiya-bog'liq oqsillar kalpainlarning bevosita nishoni hisoblanadi. ATG5 kalpainlar tomonidan parchalanib, ATG12-ATG5 kompleks hosil bo‘lishining buzilishiga olib keladi.57,58 Kalpain ingibitorlarini in vivo jonli qo‘llash, shuningdek, Beclin-1 otofagiya oqsilining parchalanishining oldini oldi.59 Silika tahlilida autofagiya bilan bog'liq oqsillardagi taxminiy parchalanish joyi kalpain autofagiya oqsillarini fermentativ parchalanishi orqali autofagiyani tartibga solishi mumkinligi haqidagi gipotezani qo'llab-quvvatlaydi.
Cistanche-buyrak funktsiyasi
AngII plus HSD bilan davolash qilingan sichqonlarning glomerulida endoplazmatik retikulum (ER) va oksidlovchi stress belgilarining mRNK ifodasi
Biz AngII + HSD davolash paytida glomeruliyadagi kantitativ PCR orqali endoplazmatik retikulum (ER) stressini va oksidlovchi stressni baholadik (1-jadval). Dastlabki bosqichda biz WT va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlarining glomeruliyalarida tahlil qilingan genlarning mRNK ifodasida hech qanday o'zgarishlarni kuzatmadik (Qo'shimcha rasm S7). Gipertenziyadan 6 hafta o'tgach, Nphs2 dan glomeruli. cre Atg5lox/lox sichqonlari WT glomeruli bilan solishtirganda Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 va Hsp90b1 ning ko'payishi bilan ER stressi va oksidlovchi stress yo'llari genlarining turli mRNK profilini ko'rsatdi.avtofagiyapodotsitlarning kamayishi AngII + HSD tomonidan qo'zg'atilgan ER stressi va oksidlovchi stressni qo'llab-quvvatladi. Aksincha, CSTTg sichqonlarining glomerulilari ER stressining bir nechta genlari va oksidlovchi stress yo'llarining pastga regulyatsiyasini, shuningdek ba'zi pro-apoptotik genlarning ekspressiyasini kamaytirdi (9-rasm).
Birgalikda bu natijalar shundan dalolat beradikalpastatinhaddan tashqari ekspressiya AngII + HSD tomonidan qo'zg'atilgan ER va oksidlovchi stressni kamaytirish orqali glomerulyar shikastlanishning oldini olishi mumkin.
MUHOKAZA
Ushbu tadqiqotda biz AngII + HSD sabab bo'lgan gipertenziyada podotsitlar autofagiyasi sezilarli darajada pasayganligini ko'rsatdik. Bundan tashqari, Atg5 ning podotsitlarga xos o'chirilishi bo'lgan sichqonlar AngII + HSD sabab bo'lgan glomerulosklerozga va podotsitlar yo'qolishiga ko'proq moyil bo'lgan, bu shuni ko'rsatdiki,avtofagiyapodotsitlarda gipertenziv nefropatiya rivojlanishiga to'sqinlik qiladi, bu AngII + HSD sabab bo'lgan podotsitlar shikastlanishida avtofagiyaning muhim rolini ta'kidlaydi. Hujayra autofagiyasini tartibga soluvchi hujayradan tashqari stimullar haqida juda kam narsa ma'lum va bu natijalar podotsitlar autofagiyasining AngII tomonidan patofiziologik tartibga solinishiga oydinlik kiritadi.
Ko'pgina inson glomerulopatiyalarida podotsitlar oyoq jarayonining o'chirilishi proteinuriyaga olib keladigan glomerulyar shikastlanishning o'ziga xos belgisidir. Avtofagiya podotsitlar funktsiyasini saqlab qolishda muhim rol o'ynaydi, chunki bu terminalda farqlangan hujayralar yuqori tezlikda namoyon bo'ladi.avtofagiyahatto stress bo'lmasa ham. Oldingi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, AngII shartli ravishda o'lmas sichqon podotsit hujayralarida reaktiv kislorod turlarini yaratish orqali autofagiyaga yordam beradi.60 Reaktiv kislorod turlarining ishlab chiqarilishi haqiqatan ham ko'plab hujayralar turlarida otofagiyaning umumiy induktoridir va bizning topilmalarimiz bilan bunday nomuvofiqlik sabablari tushunarsiz. Ushbu so'nggi tadqiqotdan farqli o'laroq, biz sichqon hujayralari qatorini emas, balki podotsin va nefrin ifodasini va in vivo yondashuvni saqlaydigan sichqonchaning asosiy madaniy podotsitlaridan foydalandik. Biz postmitotik podotsitlar konstitutsiyaning g'ayrioddiy yuqori darajasini ko'rsatadigan oldingi xabarlarni tasdiqlaymizavtofagiya. Lizosomal ingibitorlar mavjudligi yoki yo'qligida AngII stimulyatsiyasidan keyin LC{0}}II ning ortib borayotgan miqdorini o'lchash autofagik oqimning ko'payishi yoki bloklanishini aniqlash uchun zarur. Oldingi tadqiqotlar bu hodisani e'tiborsiz qoldirgan.60
7-rasm |Kalpastatinhaddan tashqari ekspressiya yashil FL floresan oqsili (GFP) - LC3 sichqonlarida angiotensin II (AngII) D yuqori tuzli diet (HSD) - vositachilik podotsit shikastlanishining oldini oladi. (a) AngII + HSD CSTTg (kalpastatin transgenik) GFP-LC3 sichqonlari bilan solishtirganda GFP-LC3 sichqonlarida albuminuriyaning keskin oshishiga olib keldi. n=8 dan 13 tagacha sichqonlar har bir genotip. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Dispersiyaning ikki tomonlama tahlili: genotip, P=0.0429; vaqt, P=0.0165. Sidakning ko'p taqqoslash testi: *P=0.0453 GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlari uchun 28-kuni. (b,c) Wilm's o'smasi 1 (WT1; yashil) va nefrin ifodasining reprezentativ immunofluoresans tasvirlari (NPHS1) (qizil) 18-haftalik GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarining glomerulyarlarida 6 haftalik AngII infuzioni + HSDdan keyin. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Barlar=50 mm. 6 haftalik AngII infuzioni + HSDdan so'ng 18-haftalik GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida glomerulyar bo'limda (d) NPHS1+ maydoni va (e) glomerulyar bo'limda WT1+ hujayralar soni. n=19 GFP-LC3 sichqonlari va n=25 CSTTg GFP-LC3 sichqonlari. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Teng SD bilan juftlashtirilmagan t-test: **P=0.0010 in (d), P= 0.1158 in (e). (f, g) 6 haftalik AngII + HSDdan so'ng GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlaridan glomeruliyalarning transmissiya elektron mikroskopiyasi tasvirlari. O'q uchlari oyoq jarayonining o'chirilishini ko'rsatadi. Barlar=1 mm. (h) glomerulyar bazal membrananing (GBM) mikrometri uchun oyoq jarayonlari sonini aniqlash. har bir genotipga n=3 sichqon. Qiymatlar alohida uchastkalar va o'rtacha SEM sifatida taqdim etiladi. Har bir chizma GBM ning 1 uzluksiz uzunligidagi GBM mikrometri uchun podotsitlarning o'rtacha sonini ifodalaydi. Teng SD bilan juftlashtirilmagan t-test: P=0.7512. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
Bu erda biz AngII perfuziyasi va HSD ga asoslangan gipertonik modeldan foydalandik. Podotsitlar AT1 retseptorlarini ko'rsatadi va AngII.13,16,26,61-65 kabi erkin filtrlangan peptidlarga ta'sir qiladi. RAAS inhibisyonining kuzatilgan renoprotektiv ta'siri, hech bo'lmaganda qisman, bu podotsitlarning blokadasi tufayli bo'lishi mumkin, deb taxmin qilinadi. maxsus RAAS. Xuddi shunday, in vivo tadqiqotlar AngII ning podotsitlar shikastlanishiga ta'sirini tasdiqladi va AT1 ning podotsitga xos genga yo'naltirilishi eksperimental qizil yuguruk nefritida glomerulusdagi AT1 retseptorlarining faollashishini tezlashtirish uchun etarli ekanligini ko'rsatdi.buyrakgipertoniya bo'lmaganda shikastlanish.66,67 Kalpain vositachiligiavtofagiyaBizning modelimizdagi tartibsizlik podotsitlarda to'g'ridan-to'g'ri AngII-AT1 signalizatsiyasi yoki gipertenziya oqibati bo'lishi mumkin. Bu savolga erta javob berishimiz mumkin. Darhaqiqat, DOC-tuz modelida biz gipertenziv sichqonlarning podotsitlarida P62 to'planishini aniqladik (Qo'shimcha rasm S3). Bu shuni ko'rsatadiki, bu modeldagi podotsitlarda avtofagiya blokadasi sodir bo'ladi, bu AngII dan mustaqil bo'lishi kerak.68 Podositlarda AT1 tanqisligi bo'lgan sichqonlarda kalpain faolligiga taalluqli podotsitlar shikastlanishini va avtofagik oqimni baholash bo'yicha keyingi tadqiqotlar bunday tartibga solishni aniqlash uchun zarur bo'ladi. podotsitlar autofagiyasi AngII ning bevosita yoki bilvosita ta'siriga bog'liq.
8-rasm |KalpastatinHaddan tashqari ekspressiya angiotensin II (AngII) D yuqori tuzli dietani (HSD) oldini oladiavtofagiyapodotsitlarda pastga regulyatsiya. (a, b) Yashil FL floresan oqsili (GFP) - LC3 va CSTTg dan glomeruliyalarda P62 (yashil) va Podokaliksin (PODXL; qizil) ifodasining reprezentativ immunofluoresans tasvirlari (kalpastatintransgenik) GFP-LC3 sichqonlari 6 haftalik AngII + HSDdan keyin. Rasmning pastki qismlari yuqori kattalashtirishni ko'rsatadi. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Barlar=50 mm. (c,d) Glomerulyar bo'limda P62+ maydonini aniqlash. n=9 yovvoyi turdagi (WT) va n=7 CSTTg sichqon (c) va n=16 GFP-LC3 sichqon va n=16 CSTTg GFP-LC3 sichqon (d) da. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Mann-Uitni testi: **P=0,0033 (c), **P=0,0011 (d). (e, f) 6 haftalik AngII + HSDdan so'ng GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlaridan glomerullarda GFP (yashil) va P62 (qizil) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari. Rasmning pastki qismlari yuqori kattalashtirishni ko'rsatadi. O'q uchlari GFP+ P62+ autofagosomalarni ko'rsatadi. (g) podotsitda LC3+ P62+ nuqtalar sonini aniqlash. n=11 GFP-LC3 sichqonlari va n=16 CSTTg GFP-LC3 sichqonlari. Qiymatlar alohida chizmalar va o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etiladi. Teng SD bilan juftlashtirilmagan t-test: P=0.1014. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang: www.buyrak-international.org.
1-jadval|Maxsus RT2 Profiler PCR massivi
Kalpain-1 va kalpain-2 hamma joyda tarqalgan yallig'lanishga qarshi proteazlar bo'lib, ularning faolligi boshqariladigan.kalpastatin, ularning o'ziga xos inhibitori. Darhaqiqat, kalpastatin kalpainlarni tanlab inhibe qiladi va hozirgi kunga qadar boshqa proteazlar yo'q. Kalpain faollashuvi yaqinda bog'langanbuyrakbir qancha patologik kontekstlarda shikastlanish.69,70 Kaltsiy kanali tashuvchi vaqtinchalik retseptor potentsial kanali C6 Ca2+/kalsinevrin faollashuvi orqali podotsitlarda kalpainni-1 faollashtirishi aniqlandi. Fokal va segmental glomerulosklerozli bemorlarning buyraklarida vaqtinchalik retseptorlari potentsial kanali C6 ifodasi, kalpain va kalsineurin faolligi ortdi va podotsitlar sitoskeletal barqarorligi uchun juda muhim bo'lgan kalpain maqsadli talin-1 ifodasining kamayishi kuzatildi.71 Vaqtinchalik retseptorlari potentsial kanali. C6, shuningdek, kalpain-1 va kalpain-2 bilan bevosita bog'lanadi. Bu o'zaro ta'sir talin{11}} bo'linishini tartibga solish va podotsitlar harakatini boshqarish uchun juda muhimdir.72
Transgen sichqonlarning haddan tashqari ifodalanishikalpastatinqon tomirlarini qayta qurish va AngIIga bog'liq yallig'lanishdan himoyalangan73; glomerulonefrit,43 sepsis,74 yoki allograftni rad etish75 modellarida yallig'lanishga qarshi; va yoshga bog'liq yallig'lanishga qarshi.76 Bu sichqonlarda podotsitlarning shikastlanishi o'rganilmagan. Peltier va boshqalar. haddan tashqari ifodalanganligini ko'rsatdikalpastatinbuyraklardagi AngIIga bog'liq perivaskulyar yallig'lanishning oldini oldi.43 Shunday qilib, CSTTg sichqonlarida buyrakni himoya qilish, hech bo'lmaganda qisman, yallig'lanishga qarshi mexanizm orqali vositachilik qilishi mumkin edi. Biz modelimizda makrofaglar va limfotsitlar infiltratsiyasini baholadik va ularda sezilarli farq topmadik.buyrakglobal tahlil qilishda CSTTg va nazorat sichqonlari o'rtasidagi yallig'lanishbuyrakleykotsitlar infiltratsiyasi (qo'shimcha rasm S6).
Kalpain yaqinda autofagiyani tartibga solishda ishtirok etgan (yaqinda Weber va boshq.53 da ko'rib chiqilgan) diabetik kontekstda kalpainni inhibe qilishning qiziqarli va bioprotektiv xususiyatlari bilan qayta tiklash orqali.avtofagiya.77 Bu yerda, biz orqali calpain inhibisyonu xabarkalpastatinhaddan tashqari ekspressiya (i) gipertenziya paytida podotsitlar shikastlanishining oldini oldi va (ii) podotsitlarda otofagiyani tikladi, shu bilan gipertenziya paytida kalpain faollashuvining yangi zararli rolini ta'kidladi.avtofagiya.
Deyarli barcha ATG oqsillari in vitroda kalpainlar tomonidan parchalanishi ko'rsatilgan. 78 Bu erda biz buni taxmin qildikavtofagiyaGipertenziv CSTTg sichqonlarida xizmat ko'rsatish kalpainni inhibe qilish orqali amalga oshirildi. Bizning gipotezamizni qo'llab-quvvatlash uchun biz CSTTg dan podotsitlar in vitro AngII bilan shubha qilinganda kalpain faolligini pasayishini ko'rsatdik (3c-rasm). Biz CSTTg sichqonlarining podotsitlarida ATG5 oqsilining ko'payishini aniqladik, bu kalpastatinning haddan tashqari ekspressiyasi bu kontekstda kalpain vositachiligida ATG5 ajralishini oldini olganligini ko'rsatadi (5a-rasm). Aksincha, bu ko'rsatildikalpastatin-vositalangan kalpain inhibisyonu ularning proteaz faolligini inhibe qilishdan mustaqil bo'lishi mumkin79; Shunday qilib, biz kalpastatinning fermentativ faolligiga bog'liq bo'lmagan autofagiyani tartibga solishni istisno qila olmadik.
Xulosa qilib aytganda, ushbu topilmalar ilgari tan olinmagan rolini ochib berdikalpastatinpodotsitlarni tartibga solishdaavtofagiyava gipertenziv nefropatiyalarda podotsitlarning omon qolishini oshirish uchun yangi terapevtik strategiyalarni o'rganishga yordam berdi.
OSHHOR QILISh
Barcha mualliflar raqobatdosh manfaatlar yo'qligini e'lon qilishdi.
MAQDAT
Ushbu ish Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) va Université de Parij tomonidan qo'llab-quvvatlandi. IB Milliy Ta'lim vazirligi, de la Recherche et de la Technologie magistratura stipendiyasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi. OL EFSD/Novo Nordisk Yevropada DiabetesResearch dasturi va Société Francophone duDiabète (SFD) granti tomonidan qo‘llab-quvvatlangan Diabetni o‘rganish bo‘yicha Yevropa jamg‘armasi (EFSD) mukofoti orqali moliyalashtirildi. BR va CH Yevropa tadqiqot kengashi va Yevropa Ittifoqi (P-LT) tomonidan 107037 boshlang'ich granti tomonidan moliyalashtirildi. YS Fondation de France tomonidan aspirantura stipendiyasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi.
Elizabeth Huc, Nikolas Peres, Corina Suldac va ERIU970 jamoasiga (Université de Paris, PARCC, Inserm, Parij, Fransiya) hayvonlarni parvarish qilish va ularga ishlov berishda yordam bergani uchun Nikolas Sorhaindoga biokimyoviy o‘lchovlar (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital) uchun rahmat. , Parij, Frantsiya) va Alen Shmitt va Jan-Mark Massefor transmissiya elektron mikroskopiyasi (Institut Cochin, Parij, Fransiya). Biz Morgan Le Gallga (Kochin proteomik 3P5, Parij, Fransiya) kremniyni tahlil qilishda yordam bergani uchun minnatdorchilik bildiramiz. Biz Véronique Oberweis, Bruno Pillard va Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Parij, Fransiya) tomonidan ma'muriy yordamni tan olamiz.
QO'SHIMCHA MATERIAL
Qo'shimcha fayl (PDF)
S1-rasm. Birlamchi podotsitlar madaniyati podotsit belgilarini ifodalaydi. WT va CSTTg sichqonlaridan birlamchi podotsit madaniyatida NPHS1 va NPHS2 podotsit belgilarining ifodalanishini Western blot tahlili. Tubulin (TUBA) yuklashni boshqarish vazifasini bajaradi. Har bir genotipda n=4 sichqonning vakili.
S2-rasm. Podositlarning yuqori bazal darajasiavtofagiya. (A, B) CQ (80mg/kg) bilan davolash qilingan yoki o‘ldirilmagan GFP-LC3 sichqonlarining glomeruliyalarida GFP (yashil) va NPHS1 (qizil) ning o‘ldirishdan 4 soat oldin ifodalangan immunofluoresans tasvirlari. O'q uchlari GFP+ autofagosomalarini ko'rsatadi. (C, D) O'ldirishdan 4 soat oldin CQ (80mg / kg) bilan davolash qilingan yoki etilmagan GFP-LC3 sichqonlarining glomeruliyalarida GFP (yashil) va P62 (qizil) ifodasining vakili immunofluoresans tasvirlari. O'q uchlari GFP+ P62+ autofagosomalarni ko'rsatadi. (A–D) (0 ) kattalashtirishni anglatadi. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Bar=50 mm. Har bir holat uchun N=4 sichqon (E–H) GFP-LC3 sichqonlarining birlamchi podotsitlarida GFP (yashil) va P62 (qizil) ifodasi (F, H) yoki yo‘q (E, G) ifodalangan immunofluoresans tasvirlari ) Bafifilomisin A1 (100 nM) bilan 4 soat davomida. Har bir shart uchun N=5 ta sichqon.
S3-rasm. P62 gipertenziyaning DOC-tuz modelida podotsitlarda to'planadi. (A-C) 2 dan 6 haftagacha DOC-tuz modelidan so'ng WT sichqonlarining glomerulida P62 (yashil) va PODXL (qizil) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari. (0 ) kattalashtirishni bildiradi. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. Bar ¼ 50 mm. (D) podotsitlar maydoniga P62 maydoni miqdorini aniqlash (foiz). Har bir shart uchun N=5–6 sichqon. Dispersiyaning bir tomonlama tahlili: vaqt P=0.0059, Sidakning koʻp taqqoslash testi: D42 va D14 **P=0.0055, D28 va D14 P=0.8590.
S4-rasm. Podositavtofagiyapodotsitlar rivojlanishi uchun zarurdir. (A) Atg5lox/lox va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlarida sistolik qon bosimi, (B) siydik albumin-kreatinin nisbati va (C) qon karbamid azot darajasi. Bir genotip uchun N=5–6 sichqon. Qadriyatlar alohida uchastkalar va vositalar sifatida taqdim etiladi±SEM. Mann-Whitney testi: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) va P=0.6623 (C). (D–E) Atg5lox/lox va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan olingan glomerullarning Massonning trikrom bilan bo'yalgan qismlarining vakillik tasvirlari. (F-G) Atg5lox/lox va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlarida PODXL (yashil) va WT1 (qizil) ifodasining vakili immunofluoresans tasvirlari. Yadrolar Hoechst (ko'k) bilan bo'yalgan. (D–G) Bar=50 mm. Har bir genotip uchun N ¼ 6 sichqon. (H-I) Atg5lox/lox va Nphs2.cre Atg5lox/lox sichqonlaridan glomerullarning transmissiya elektron mikroskopi bo'limlarining vakillik fotomikrograflari. Bar=1 mm. Har bir genotip uchun N=3 sichqon.
S5-rasm.Kalpastatinhaddan tashqari ifoda ta'sir qilmaydibuyrakbazaviy funktsiya. (A) 12-haftalik GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida qon karbamid azoti va (B) plazma albumin darajasi. N=5 GFP-LC3 va N=6 CSTTg GFP-LC3. Qadriyatlar alohida uchastkalar va vositalar sifatida taqdim etiladi±SEM. Mann-Whitney testi: P=0.6623 (A) va P=0.9307 (B). (C, D) GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlaridan glomeruliyalarning Massonning trikrom bilan bo'yalgan qismlarining vakillik tasvirlari. (E-H) GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida PODXL (E, F) va NPHS1 (G, H) ifodasining vakillik immunofluoresans tasvirlari. (C–H) Bar=50 mm. (I, J) Glomerulyar bo'lim uchun PODXL va NPHS1 maydonining bog'liq miqdori. N=5 GFP-LC3 va N=6 CSTTg GFP-LC3. Qadriyatlar alohida uchastkalar va vositalar sifatida taqdim etiladi±SEM. Mann-Whitney testi: P=0.1898 (A) va P=0.8413 (B).
Cistanche-buyrak funktsiyasi
S6-rasm.Kalpastatinhaddan tashqari ekspressiya global buyrak yallig'lanishiga ta'sir qilmaydi. 6 haftalik Angiotensin II thHSDdan keyin GFP-LC3 va CSTTg GFP-LC3 sichqonlarida F4/80 (A, B) va CD3 (D-E) ifodasining vakili immunohistokimyosi. Bar=200 mm. (C, F) F4/80 va CD3 maydonining bog'liq miqdoribuyrakBo'lim. N=7 CSTTg GFP-LC3 va N=8 GFP-LC3 sichqonlari. Qiymatlar alohida uchastkalar sifatida taqdim etiladi va SEMni bildiradi. Mann-Uitni testi: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
S7-rasm. Podositavtofagiyadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
S1-jadval. Kalpain parchalanish joylarini kremniy oldindan ko'rishda. GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) va DeepCalpain Predict (http://deepcalpain) bilan podotsitlar bilan bog'liq va autofagiya bilan bog'liq oqsillarda kalpain parchalanish joylari taxmin qilingan. saraton kasalligi. info/help.php). Qo'shimcha fayl (Excel)
Qo'shimcha jadval S2. To'liq fayl in silico kalpain parchalanish joylarini oldindan ko'rish. Kalpain parchalanish joylari podotsitlar bilan bog'liq va prognoz qilinganavtofagiya- GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) va DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php) bilan bog'liq oqsillar. GPS-CCD va DeepCalpain Predict uchun har bir oqsil uchun prognozli bo'linish joylari tiklanadi.
ADABIYOTLAR
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA va boshqalar. Surunkali kasallikning tarqalishibuyrakQo'shma Shtatlardagi kasallik. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Vang C va boshqalar. CKD skriningi uchun kimga murojaat qilish kerak? Qandli diabet, gipertenziya va yurak-qon tomir kasalliklarining ta'siri. Am J Buyrak Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC va boshqalar. Albominuriya bilan va albuminuriyasiz saqlanib qolgan taxminiy GFR bo'lgan shaxslarda ESRD uchun xavf omillari: Buyrakni erta baholash dasturi (KEEP) natijalari. Am J Buyrak Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J va boshqalar. Asosiy buyrak kasalligi bo'lmagan sub'ektlarda qon bosimining ko'tarilishi va oxirgi bosqichdagi buyrak kasalligi xavfi. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S va boshqalar. Podotsitlarning shikastlanishi Dahl tuzi-gipertenziv kalamushlarning glomerulopatiyasi asosida yotadi va aldosteron blokerlari tomonidan qaytariladi. Gipertenziya. 2006;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Vagner SJ, Turner ST va boshqalar. Siydik bilan podotsitlarning chiqarilishi preeklampsi uchun belgi sifatida. Men J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Vagner SJ, Bailey KR va boshqalar. Podosituriya proteinuriya va preeklampsiyaning klinik xususiyatlaridan oldin paydo bo'ladi: uzunlamasına istiqbolli tadqiqot. Gipertenziya. 2013;61:1289–1296.
8. Vang G, Lai FM, Kwan BC va boshqalar. Insonning gipertenziv nefrosklerozida podotsitlarning yo'qolishi. Men Gipertenziya. 2009;22:300–306.
9. Vang G, Kvan BC, Lai FM va boshqalar. Gipertenziv nefrosklerozli bemorlarda miRNKlarning intrarenal ifodasi. Men Gipertenziya. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G va boshqalar. Surunkali proteinurik nefropatiyalar: buyrak shikastlanishining turli shakllari bo'lgan 352 bemorning istiqbolli kohortida natijalar va davolanishga javob. Am J Buyrak Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP va boshqalar. Angiotensin II ga bog'liq bo'lgan doimiy podotsitlarning beqarorlashgan glomeruli yo'qolishi oxirgi bosqichning rivojlanishiga sabab bo'ladi.buyrakkasallik. Buyrak Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Angiotensin-II retseptorlari blokerlarining eksperimental streptozototsin bilan qo'zg'atilgan diabetik nefropatiyaning kalamush modelida podotsit shikastlanishi va glomerulyar apoptozga ta'siri. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG va boshqalar. Angiotensin II NFAT vositachiligidagi ijobiy geribildirim signalizatsiya yo'li orqali TRPC6 ifodasini oshirish orqali podotsitlarning shikastlanishiga hissa qo'shadi. Men J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. EUCLID tadqiqot guruhi. Insulinga bog'liq diabet va normoalbuminuriya yoki mikroalbuminuriya bilan og'rigan me'yoriy bemorlarda lisinoprilning tasodifiy platsebo-nazoratli sinovi. Lanset. 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH va boshqalar. Proteinuriya, 2-toifa diabetik nefropatiya bilan og'rigan bemorlarda renoproteksiya uchun maqsad: RENTALdan darslar. Buyrak Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Anjiyotensin II tomonidan qo'zg'atilgan glomerulyar perm selektivligidagi o'zgarishlar podotsitlar disfunktsiyasini va diafragmaning yoriqlari oqsillarini qayta tashkil etishni nazarda tutadi. Semin Nefrol. 2004;24:131–140.
17. Vang L, Flannery PJ, Spurney RF. Podositlarda angiotensin II retseptorlari subtiplarining xarakteristikasi. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ va boshqalar. Proteinuriya va diabetik nefropatiyada podotsit diafragma oqsili, nefrinning ifodasi: angiotensinga aylantiruvchi ferment inhibisyonining ta'siri. Qandli diabet. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S va boshqalar. IgA nefropatiyasi bo'lgan bemorlarda angiotensinga aylantiruvchi ferment inhibitori, angiotensin II retseptorlari antagonisti va kaltsiy antagonistining siydik podotsitlariga ta'siri. Men J Nefrolman. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG va boshqalar. Angiotensin II madaniyatdagi kalamush podotsitlarida sitozolik kaltsiy faolligini oshiradi. Buyrak Int. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C va boshqalar. Nefrotik proteinuriya bilan og'rigan bemorlarda angiotensinga aylantiruvchi fermentni inhibe qilishning uzoq muddatli foydali ta'siri. Am J Buyrak Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S va boshqalar. Angiotensin II buzilmagan glomerulus podotsitlarida hujayra ichidagi kaltsiy faolligini oshiradi.BuyrakInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG va boshqalar. Angiotensin II podotsitlarning hujayra funktsiyalarini modulyatsiya qiladi. Buyrak Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E va boshqalar. Stretch inson podotsitlarida angiotensin II-AT (1) ga bog'liq mexanizm orqali nefrin ifodasini pasaytiradi: rosiglitazonning ta'siri. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Stretch, taranglik va adezyon - podotsitlardagi aktin sitoskeletining adaptiv mexanizmlari. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K va boshqalar. Podositlarda mahalliy to'qimalarning angiotensin tizimining mexanik kuchlanish bilan faollashishi. Buyrak Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C va boshqalar. Tsiklik cho'zish kuchi kultivatsiya qilingan kalamush mezangial hujayralarida transformatsiya qiluvchi o'sish omili-beta izoformlarini tanlab yuqori tartibga soladi. Men J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Podotsitlarning shikastlanishi uni nefrektomizatsiyalangan-dezoksikortikosteronli gipertenziv kalamushlarda glomeruloskleroz rivojlanishining muhim bosqichidir. Virchows arxivi. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J va boshqalar. Otofagiyaning yo'qolishi oshqozon osti bezi beta-hujayralari massasini va faoliyatini kamaytiradi, natijada giperglikemiya paydo bo'ladi. Hujayra Metab. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M va boshqalar.Avtofagiyaorol gomeostazi va yuqori yog'li dietaga javoban beta-hujayra massasining kompensatsion o'sishida muhim ahamiyatga ega. Hujayra Metab. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C va boshqalar. Endotelial hujayralar va podotsitlar avtofagiyasi diabet bilan bog'liq glomerulosklerozdan sinergik tarzda himoya qiladi. Avtofagiya. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C va boshqalar. Avtofagiya glomerulyar kasalliklarning sezuvchanligiga ta'sir qiladi va qarigan sichqonlarda podotsitlar gomeostazini saqlaydi. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A va boshqalar. Buyrak biopsiyasi namunalarida podotsitlarda otofagiyaning ikki turi: ultrastrukturaviy tadqiqot. J Submikrosk sitol patol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I va boshqalar. MAP-LC3, istiqbolli autofagosomal marker, PAN nefrozidan podotsitlarni farqlash va tiklash jarayonida qayta ishlanadi. FASEB J. 2003; 17: 1165-1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM va boshqalar.Avtofagiyahujayra o'z-o'zini hazm qilish orqali kasallik bilan kurashadi. Tabiat. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S va boshqalar. Semizlikdagi nuqsonli jigar autofagiyasi ER stressini kuchaytiradi va insulin qarshiligini keltirib chiqaradi. Hujayra Metab. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionskiy DJ. Avtofagosoma shakllanishi: asosiy mexanizmlar va moslashuvlar. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Tomas MC, Koya D. Oziq moddalarni sezish, autofagiya va diabetik nefropatiya. Qandli diabet. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H va boshqalar. Autofagiya: yangi terapevtik maqsadbuyrakkasalliklar. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B va boshqalar. Rivojlanayotgan roliavtofagiyabuyraklar faoliyati, kasalliklar va qarishda. Avtofagiya. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Glomerulyar qarish va kasallik uchun avtofagiyaning oqibatlari. Hujayra to'qimalarining Res. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang V, Yamahara K va boshqalar. Podotsitlar mtor signalidan qat'iy nazar, yuqori bazal otofagiya darajasini saqlab turadi. Avtofagiya. 2020;16:1932– 1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J va boshqalar. Kalpain faollashishi va sekretsiyasi eksperimental glomerulonefritda glomerulyar shikastlanishga yordam beradi: dalillar.kalpastatin- transgen sichqonlar. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A va boshqalar. Transgen sichqonlarda Cre rekombinazning podotsitlarga xos ifodasi. Ibtido. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M va boshqalar. Nerv hujayralarida bazal otofagiyaning bostirilishi sichqonlarda neyrodegenerativ kasallikka olib keladi. Tabiat. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O va boshqalar. Tetraspanin CD9 parietal epiteliya hujayralarining migratsiyasi va proliferatsiyasini va glomerulyar kasallikning rivojlanishini nazorat qiladi. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S va boshqalar. Epidermal o'sish omili retseptorlari glomerulyar shikastlanishga va tez progressiv kresentik glomerulonefritda buyrak etishmovchiligiga yordam beradi. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A va boshqalar. Endotelin{1}}ning podotsitlarga bevosita ta'siri diabetik glomerulosklerozga yordam beradi. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O va boshqalar. Yadro omili eritroid 2-bog'liq 2 omil peroksizoma proliferatori tomonidan faollashtirilgan g retseptorlarining podotsitlarga xos ifodasini qo'zg'atadi. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R va boshqalar. T-limfotsitlar tomonidan chiqarilgan kalpainlar IL{2}} ifodasini nazorat qilish uchun TLR2 ni parchalaydi. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S va boshqalar. kalpain/kalpastatintizimi melanomaning o'sishi va metastatik tarqalishida qarama-qarshi rollarga ega. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D va boshqalar. Kalpainlar glomerulonefritning tez progressiv shaklida qon tomirlarini tiklashga yordam beradi: ularning tashqi ko'rinishidagi potentsial roli. Arterioskler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E va boshqalar. Ikkita g'azablangan qushni bir tosh bilan o'ldirish:avtofagiyaneyrodegenerativ kasalliklarda va undan tashqarida kalpainlarni inhibe qilish orqali faollashtirish. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X va boshqalar. GPS-CCD: kalpaning parchalanish joylarini bashorat qilish uchun yangi hisoblash dasturi. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y va boshqalar. CaMPDB: kalpain va modulyatsiya qiluvchi proteoliz uchun resurs. Genom haqida ma'lumot. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J va boshqalar. Kalpain parchalanish joylarini aniq prognoz qilish va saraton mutatsiyalari natijasida kelib chiqadigan buzilishlar. Old Genet. 2019;10:715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Shmid I va boshqalar. Atg5 ning kalpain vositasida bo'linishi otofagiyani apoptozga o'tkazadi. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G va boshqalar. ATG5 ning kalpain1 vositachiligida bo'linishi orqali bazal otofagiyani nazorat qilish.Avtofagiya. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A va boshqalar. Kalpain vositasida Beclin-1 parchalanishi va in vivo jonli ravishda retinal ishemik shikastlanishdan keyin otofagiya deregulyatsiyasi. Hujayra o'limi Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S va boshqalar. ANG II rag'batlantiradiavtofagiyapodotsitlarda. Am J Physiol Hujayra Fiziol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Glomerulyar podotsitlarda angiotensin II tomonidan epidermal o'sish omili retseptorlarining transaktivatsiyasi. Nefron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.
62. Xarrison-Bernard LM, Navar LG, Xo MM va boshqalar. Katta yoshli kalamushlarda ANG II AT1 retseptorlarining immunohistokimyoviy lokalizatsiyasibuyrakmonoklonal antikordan foydalanish. Men J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J va boshqalar. Inson podotsitlarida renin angiotensin tizimining funktsional ifodasi. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F710–F719.
64. Pavenstadt H. Franz Volhard mukofoti 2000: podotsitda angiotensin II signalizatsiyasi. Buyrak qon bosimi Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Podositlardagi renin-angiotensin aldosteron tizimi. Semin Nefrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J va boshqalar. Angiotensin II infuzioni nefrin ifodasi o'zgarishini va podotsitlar apoptozini keltirib chiqaradi. Men J Nefrolman. 2008;28:500– 507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P va boshqalar. Glomerulyar turdagi 1 angiotensin retseptorlari sichqonchaning otoimmün nefritida buyrak shikastlanishi va yallig'lanishini kuchaytiradi. J Clin Invest. 2009;119:943–953.
68. Song K, Styuart D, Abraham N va boshqalar. Kanal reninini yig'ish DOCA tuzi gipertenziyasi yoki buyrak shikastlanishiga vositachilik qilmaydi. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D va boshqalar. Lipopolisakkaridlar keltirib chiqaradigan o'tkir davrda endotelial kalpain nokautining himoya rolibuyrakp38-iNOS yo'lining susayishi va NO/ROS ishlab chiqarilishi natijasida shikastlanish. Exp Mol Med. 2020;52:702– 712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Kalpain{1}} faolligi adrenal glome rulosa hujayra modelida angiotensin II tomonidan qo'zg'atilgan aldosteron ishlab chiqarishga asoslanadi. Endokrinologiya. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M va boshqalar. Kaltsiyga bog'liq bo'lgan proteaz kalpain-1 TRPC6 faolligini podotsitlar shikastlanishi bilan bog'laydi. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. Fermer LK, Rollason R, Whitcomb DJ va boshqalar. TRPC6 kanal faolligidan qat'iy nazar kalpain bilan bog'lanadi va faollashtiradi va podotsitlar sitoskeletini, hujayra yopishishini va harakatchanligini tartibga soladi. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A va boshqalar. Kalpain/kalpastatin tizimini angiotensin II tomonidan qo'zg'atilgan gipertenziyada yurak-qon tomir tizimini qayta qurishning oldini olish uchun yangi strategiya sifatida maqsad qilib olish. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C va boshqalar.Kalpastatinprokoagulyant mikropartikullarning chiqishini cheklash orqali polimikrobiyal sepsisni nazorat qiladi. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M va boshqalar. O'tkir allogreft rad etishda kalpain/kalpastatin balansining muhim roli. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S va boshqalar. Kalpainning maxsus inhibisyoni himoya qiladibuyrakyallig'lanishga qarshi. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Li WH, Shao NY va boshqalar. Kalpain inhibisyonu tiklanadiavtofagiyava diabetik endo liopatiyaning inson iPSC modelida mitoxondriyal parchalanishni oldini oladi. Ildiz hujayra vakili 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Koen GM, Bampton ET. Hujayra o'limi proteazlari tomonidan yuqori oqsillarni in vitro bo'linishi. Avtofagiya. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M va boshqalar. Kalpain-kalpastatin kompleksining L-domeni bilan differentsial regulyatsiyasikalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
