Kimerik inson papillomavirusi-16 OIVdan P18I10 va T20 peptidlarini taqdim etuvchi virusga o'xshash zarralar-1 konvert BALB/c sichqonlarida HPV16 va OIV-1-o'ziga xos gumoral va T hujayrali immunitetni keltirib chiqaradi
Dec 07, 2023
Annotatsiya:
Ushbu tadqiqotda OIV-1 gp120 ning V3 halqasidan olingan OIV-1 P18I10 CTL peptid va OIV-1 gp41 ning T20 termoyadroviyga qarshi peptidlari HPV16 L1 kapsid oqsiliga kiritildi. sutemizuvchilar hujayralarini ifodalash tizimidan foydalangan holda kimerik HPV: OIV (L1: P18I10 va L1: T20) VLPlarni yaratish. HPV: OIV VLPlari xromatografiya orqali tozalandi. Biz HPV16 L1 kapsid oqsillarining DE halqasiga P18I10 yoki T20 peptidlarini kiritish kimerik HPV: OIV VLP ning in vitro barqarorligi, o'z-o'zini yig'ishi va morfologiyasiga ta'sir qilmasligini ko'rsatdik. Muhimi shundaki, u ximerik HPV: OIV VLPlarida taqdim etilgan ketma-ket va konformatsion P18I10 va T20 peptidlariga qaratilgan OIV-1 antikorlari reaktivligiga ham, in vivo jonli ravishda HPV16 L{28}}maxsus antikorlarining induksiyasiga ham xalaqit bermadi. Ximerik L1:P18I10/L1:T20 VLP vaktsinalari HPVga16-, lekin zaif OIVga{35}}o'ziga xos antikor javoblari va HPV16- va OIV-1-o'ziga xos T-ni keltirib chiqarishi mumkinligini kuzatdik. BALB/c sichqonlarida hujayra javoblari. Bundan tashqari, BCG.HIVA vaktsinasini qo'llashdan keyin geterologik immunizatsiyada OIVga xos hujayrali javoblarni kuchaytirish uchun potentsial kuchaytiruvchi bo'lishi mumkin. Ushbu tadqiqot ishi rivojlanayotgan va sanoati rivojlangan mamlakatlarda zudlik bilan zarur bo'lgan HPV16 va OIV{42}} infektsiyasini nazorat qilish uchun yangi kimerik HPV: OIV VLP asosidagi vaktsina platformasini yaratishga hissa qo'shadi.
Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi
Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing
【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kalit so‘zlar:
OIV-1; HPV16; vaktsina; virusga o'xshash zarralar; P18I10; T20 enfuvirtidi; BCG.HIVA; gumoral immunitet; T xujayrasi vositachiligidagi immunitet
1.Kirish
Odamning immunitet tanqisligi virusi-1 (OIV-1) orttirilgan immunitet tanqisligi sindromini (OITS) keltirib chiqaradigan kasallik 1980-yillarning boshida kashf etilgan va shundan beri u global epidemiyaga aylangan [1]. Yuqori faol retrovirusga qarshi davolash (HAART) bilan birgalikda OIV-1 infektsiyasini nazorat qilishda haqiqiy ta'sir ko'rsatishi mumkin bo'lsa-da, emlash hali ham jamoat manfaati uchun asosiy yondashuv bo'lib qolmoqda. global OIV-1 epidemiyasini tugatish [2]. O'ttiz yildan ortiq davom etgan OIV-1 bo'yicha chuqur izlanishlar va ko'plab vaktsina klinik sinovlariga qaramay, hozirgacha litsenziyalangan OIV-1 vaktsinasiga erishib bo'lmaydi. Tailandda o'tkazilgan RV144 sinovi OIV{14}} infektsiyasiga qarshi 31,2% kam samaradorlikni aniqlagan birinchi holat bo'ldi [3]. Klinik sinovlardan o'tgan boshqa OIV{16}} vaktsina nomzodlarining aksariyati asosan DNK, rekombinant virus vektorlari yoki subunit protein modellariga asoslangan edi [4,5]. Ideal holda, samarali OIV{19}} vaktsinasi tug'ma immunitet reaktsiyalarini qo'zg'atishi, virusli infektsiyaning oldini olish uchun antikorlarni zararsizlantirishi [6], shuningdek infektsiyalangan hujayralarni yo'q qilish uchun sitotoksik T-limfotsitlar (CTL) javoblarini qo'zg'atishi mumkin [7]. Biroq, har bir javobni olish uchun turli xil vaktsina strategiyalari talab qilinishi mumkin, bu alohida, ammo parallel ravishda ishlab chiqish sa'y-harakatlarini kafolatlaydi. Immunogenlar va etkazib berish vektorlarini tanlash OIV{22}} vaktsinalarining funktsiyasi va o'ziga xosligiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi [8,9]. OIV-1 vaktsinasini ishlab chiqishda standart yondashuvlardan foydalanilgan takroriy nosozliklar gumoral va hujayrali javoblarda etkazib berish vektorini tanlash, asosiy kuchaytiruvchi rejimlar va immunogen o'ziga xosligi muhimligini tan olishga olib keldi. Inson papillomavirusining (HPV) 100 dan ortiq turlari allaqachon ma'lum bo'lib, HPV 16 va 18 genotiplari butun dunyo bo'ylab bachadon bo'yni saratonining taxminan 70% uchun javobgardir [10]. Subunit vaktsinalar turi sifatida tasniflangan HPV L1 virusiga o'xshash zarrachalar (VLP) asosan yovvoyi tipdagi virionga o'xshash L{34}} o'ziga xos gumoral javoblarni va shuningdek, T hujayra vositachiligidagi javoblarni keltirib chiqarishi mumkin [11-13]. Hozirgi vaqtda bozorda uchta HPV profilaktik vaktsinasi litsenziyalangan va ularning barchasi HPV L1 kapsid oqsilining VLPlariga asoslangan. Ulardan ikkitasi, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, AQSH) va Gardasil{40}} (Merck) xamirturush (Saccharomyces cerevisiae) ifoda tizimi tomonidan, ikkinchisi Cervarix (GSK, Brentford, Buyuk Britaniya) ishlab chiqariladi. bakulovirus ekspresyon vektori/hasharot hujayralari (BEVS/IC) tizimi [14] tomonidan. Shu paytgacha sutemizuvchilarning ekspression tizimida HPV16 L1 oqsillarini ishlab chiqarishning maqbul sharoitlari aniq belgilanmagan. Shunday qilib, HPV va OIV infektsiyalaridan himoya qiladigan qo'shma vaktsinani ishlab chiqish ushbu ikki asosiy global patogenga qarshi kurashda mantiqiy harakatdir.
Virusga o'xshash zarrachalar (VLP) asosidagi OIV{2}} vaktsinalarining dizayn kontseptsiyalari bo'yicha oldingi ko'rib chiqish maqolamizda biz papillomavirus VLP kabi konvertsiz VLPlar etkazib berish vektori sifatida funktsional rol o'ynashi mumkinligini eslatib o'tdik. OIV-1 CTL yoki neytrallashtiruvchi antikor epitoplari [15,16]. Bu gipoteza gp120 OIV-1 konvert oqsilining (Env) V3 halqasidan P18I10 CTL epitopini va 2F5 epitopini yoki gp41 OIV-1 Env ning MPER hududidan P18I10 CTL epitopini taqdim qiluvchi bir nechta kimerik sigir papillomaviruslarida (BPV) L1 VLPda tasdiqlangan. [17–22]. Odam papillomavirusi turi-16 (HPV16) L1 kapsid oqsillarining strukturaviy xususiyati BPVnikiga o'xshaydi va o'z-o'zidan bir qatlamli L1 VLPlarga birikishi mumkin [23]. HPV16 L1 oqsillaridan beshtasi pentamer hosil qiladi va 72 pentamer HPV16 VLP ga o'z-o'zidan yig'iladi [24]. Biroq, kimerik HPV16: OIV kapsid oqsillari in vitroda barqaror bo'lishi va morfologik integral VLPlarga o'z-o'zidan yig'ilishi mumkinligi haqida aniq dalillar hali ham mavjud emas. Boshqa tomondan, HPV16 L1 VLP lari yuqori immunogen xususiyatga ega va antigenga xos T va B-hujayra immun javoblarini keltirib chiqarishga qodir [11-13]. HPV orqali OIV{40}} epitoplarining namoyon bo'lishi: OIV VLPs immunogen bo'lishi mumkinmi yoki yo'qligini hali ko'rish kerak. Ushbu tadqiqotda biz sutemizuvchilar hujayralarini ifodalash tizimi bo'lgan inson 293F hujayralaridan foydalangan holda kimerik VLP asosidagi HPV: OIV vaktsinasini ishlab chiqishni maqsad qildik. HPV 16 L1 oqsili strukturaviy vaktsina vazifasini bajardi va P18I10 va T20 peptidlari OIV-1 immunogenlari sifatida tanlandi va HPV 16 L1 oqsilining DE halqasiga kiritildi. 10 ta aminokislotadan (qoldiqlar 311–320: RGP GRAFVTI) o'z ichiga olgan immunodominant P18I10 CTL epitopi OIV-1 gp120 glikoproteinining uchinchi o'zgaruvchan domenidan (V3) olingan. P18I10 peptidi sitotoksik T-limfotsit (CTL) javoblarini induktsiya qilish uchun H-2Dd cheklangan MHC sinf-I molekulasi sifatida aniqlangan [25,26]. Enfuvirtid nomi bilan tanilgan va antiretrovirus multimerik termoyadroviy peptid sifatida ishlab chiqilgan T20 peptidi membranaga yaqin joylashgan C-terminal heptad spiral ketma-ketligini taqlid qiluvchi 36 ta aminokislotalar ketma-ketligidan (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) iborat.0 s proksimal tashqi hududi (MPER) OIV{0}} konvert glikoprotein 41 (gp41) [27]. Ushbu ikkita OIV{4}} T (P18I10) va B (T20) hujayraga asoslangan epitoplar kimerik VLP asosidagi HPV: OIV vaktsinasini ishlab chiqish platformasi uchun boshlang'ich nuqta va kontseptsiya tajribasining isboti sifatida tanlangan.
So'nggi o'n yil ichida VLP asosidagi OIV-1 vaktsinalarining ko'plab turli xil prime-boost formatlari sinovdan o'tkazildi [15]. Oldingi OIV-1 VLP [28] yoki kimerik BPV: OIV VLP [17-22] vaktsina strategiyalarining aksariyati gomologik asosiy kuchaytiruvchi rejimdan foydalangan holda immunitet reaktsiyalarini yaratishga qaratilgan bo'lsa-da, ikkita sobiq tadqiqot geterologik immunizatsiyani taklif qildi. rekombinantdan iboratMikobakteriya bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) OIVni ifodalovchi-1 Gag prime va HIV-1 Gag VLP kuchayishi T-hujayra immunitetini oshirishga hissa qo'shishi mumkin [29,30]. Bizning tadqiqot guruhimizda biz HIVA immunogenini ifodalovchi rBCG va rekombinant virusli vektor MVA bilan kuchaytirishni ko'rsatdik. HIVA xavfsiz bo'lib, BALB/c sichqonlarida OIV{6}}o'ziga xos T-hujayra immun javoblarini keltirib chiqardi [31-33]. Doktor Tomas Xanke tomonidan ishlab chiqilgan HIVA immunogeni toʻliq uzunlikdagi OIV-1 Gag oqsilidan iborat boʻlib, bir nechta CTL epitoplari, jumladan, C-terminalidagi P18I10 epitoplari bilan birlashtirilgan [34]. Shuning uchun biz BALB/c sichqonlarida BCG.HIVA OIV: HPV (L1: P18I10) VLP tomonidan qo'zg'atilgan T-hujayra immun javoblarini kuchaytirishi mumkinligini baholashni maqsad qildik.
Ushbu tadqiqotda kimerik HPV: OIV (L1: P18I10 va L1: T20) immunogenlari 293F ifoda tizimi yordamida ishlab chiqilgan va ishlab chiqarilgan. Kimerik L1: P18I10 va L1: T20 protein ifodasi immuno-bo'yoq bilan tasdiqlangan. HPV: OIV VLP'lari keyinchalik 3-bosqichli xromatografik usul, jumladan, kation (CEC), o'lchamni istisno qilish (SEC) va geparinga yaqinlik (H-AC) xromatografiyasi bilan tozalandi. Keyin tozalangan HPV ning in vitro barqarorligi, in vitro o'z-o'zini yig'ishi va morfologiyasi: OIV VLP'lari mos ravishda kamaytirmaydigan SDS-PAGE, molekulyar massa tahlili va transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) bilan tasdiqlangan. Kimerik HPVda taqdim etilgan ketma-ket va konformatsion P18I10 va T20 peptidlari: OIV VLP'lari Western blot va bilvosita Elishay tahlili yordamida in vitroda OIVga qarshi-1 gp120 V3 va 2F5 monoklonal antikorlari bilan tavsiflangan. Nihoyat, HPV ning immunogenligi: OIV VLPs BALB/c sichqon modelida baholandi. Biz kimerik L1:P18I10 va L1:T20 VLP asosidagi vaktsinalar HPV16- va OIV-1-o‘ziga xos antikor javoblarini, kimerik L1:P18I10 VLP esa HPV16- va OIVni keltirib chiqarishi mumkinligini ko‘rsatdik. {37}}BALB/c sichqonlarida o‘ziga xos T-hujayra javoblari. Immunogen HPV: OIV vaktsinasini ishlab chiqish va ishlab chiqarish hali ham imkonsiz bo'lganligi sababli, ushbu tadqiqot HPV va OIV{40}} infektsiyalarini nazorat qilish uchun yangi kimerik VLP asosidagi vaktsinalarni ishlab chiqish bo'yicha global sa'y-harakatlarni qo'llab-quvvatlashga arziydigan asosiy strategiyani taqdim etdi.
2. Materiallar va usullar
2.1. BCG.HIVA2auxo.int vaktsina shtammini qurish
HIVA immunogenini ifodalovchi rekombinant BCG avvalroq E.coli-mikobakteriyali integrativ vektor p2auxo.int yordamida tuzilgan. HIVA antijenini ifodalovchi E. coli/mikobakteriya vektorining qurilishi ilgari tasvirlangan [31-33]. BCG.HIVA2auxo.int PBS-Tween20 dan 2 × 107 cfu/ml gacha suyultirildi, bakterial to'plarni buzish uchun sonikatsiya qilindi va orqa oziq-ovqat yostig'iga yoki BALB/c sichqonchalariga (50 mkL, 106 cfu/sichqoncha) emlandi.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
2.2. Bakterial kulturalar va transformatsiyalar
Doktor Pau Ferrer tomonidan taqdim etilgan E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, AQSH) ning glitsin oksotrofik shtammi hujayralari minimal M9-hosil muhitda (M9-D:) yetishtirildi. Na2HPO4, 6,78 g/l; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{1{18}}}},5 g/l; NH4Cl, 1 g/l, glyukoza, 1{{2{23}} }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; tiamin, 0.1 g/l; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/l;AlCl3·6H2O, 0,13 mg/l;ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/l;CoCl2·6H2O, 0,47 mg/l; CuSO4·H2O, 4,6 mg/l; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2 · 4H2O, 4,2 mg/l; NiCl2 · 6H2O, 0,02 mg/l; Na2MoO4 · 2H2O, 0,06 mg/L) , glitsin bilan to'ldirilgan (70 mkg/ml). E. coli M151Gly hujayralari elektroporatsiya yo'li bilan p2auxo.HIVA plazmidlari bilan o'zgartirildi. Buning uchun E. coli kulturalari 600 nm da 0,9 optik zichlikka yetishtirildi va 2,5 kV, 25 mF va 200 Ō da Bio-Rad gen pulser elektroporatori yordamida o'zgartirildi. Transformatsiya qilingan hujayralar M{75}}D agar plastinkalarida (avval tavsiflanganidek, 1,5% baktoagar qo‘shilgan komponentlar) selektsiya uchun glitsin qo‘shmasdan yoki nazorat sifatida glitsin qo‘shilgan holda ekilgan. WR Jacobs Jr., BR Bloom va T. Hsu tomonidan taqdim etilgan lizin auksotrofik BCG shtammi, BCG∆lys, elektroporatsiya yo'li bilan p2auxo.HIVAint plazmid DNK bilan o'zgartirildi. Mikobakteriyalar Middlebrook 7H9 bulon muhitida yoki 0,05% Tween 80 bo'lgan albumin-dekstroza-katalaz (ADC; Difco) bilan to'ldirilgan Middlebrook agar 7H10 muhitida yetishtirildi. L-lizin monohidroxlorid (Sigma, Kavasaki, Yaponiya) distillangan suvda eritildi. 40 mkg/ml yakuniy konsentratsiyada qo'shimcha sifatida ishlatiladi. Transformatsiya qilish uchun BCG 600 nm da 1,5 optik zichlikka yetishtirildi va 2,5 kV, 25 mF va 1000 Ō da Bio-Rad gen pulser elektroporatori yordamida o'zgartirildi. Keyin transformatorlar lizin qo'shmasdan, 0,05% Tween 80 ni o'z ichiga olgan ADC bilan to'ldirilgan Middlebrook agar 7H10 muhitida o'stirildi.
2.3. Hujayra chiziqlari va hujayra madaniyati
Inson embrion buyragidan (HEK) 293 hujayradan olingan 293F hujayralari (Tibco) 5 ml/L penitsillin-streptomitsin (Tibco) qo‘shilgan FreeStyle 293 ifoda muhitida (Tibco) yetishtirildi va 37 ◦C inkubatorda inkubatsiya qilindi. 125 rpm tezlikda aylanadigan orbital shaker platformasida 5% CO2 namlangan atmosfera.
2.4. 293F ifoda tizimi yordamida L1: P18I10 va L1: T20 oqsillarini ishlab chiqarish
pCDNA3.1 konstruksiyasi mos ravishda L1:P18I10 va L1:T20 ximerik oqsillariga mos keladigan L1:P18I10 yoki L1:T20 DNK kodlash ketma-ketliklarini o'z ichiga olgan. OIV-1 P18I10 CTL peptidi (RGPGRAFVTI) yoki T20 peptidi (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) HPV16 L1 kapsid oqsilining DE halqasiga kiritildi. 130-136 aminokislotalarni kodlaydigan HPV16 L1 DE halqa ketma-ketligi P18I10I10 yoki T20 peptidlari bilan almashtirildi. L1: P18I10 yoki L1: T20 DNK kodlash ketma-ketliklari Kozak ketma-ketligi bilan o'zgartirildi, inson kodoni bilan optimallashtirildi, HindIII va XbaI cheklash fermenti saytlari bilan yonma-yon joylashgan va GeneArt gen sintezi xizmatlaridan foydalangan holda pcDNA3.1 (+) vektoriga klonlandi ( Thermo Fisher, Waltham, MA, AQSH). Rekombinant plazmid DNK (pDNK) kuchaytirish uchun E. coli DH5 vakolatli hujayralariga (Invitrogen) aylantirildi va plazmid Maxi to'plamlari (QIAGEN, Hilden, Germaniya) yordamida ekstraksiya qilindi. 293F xujayralari 30 ml FreeStyle 293 ifoda muhiti bilan 125 ml Erlenmeyer kolbasida (Korning, Nyu-York, NY, AQSH) 1,0 × 106/ml zichlikka yetishtirildi va shoxlangan p18I10 yoki L1:T20DNA yordamida vaqtinchalik transfektsiya qilindi. 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) MVt quvvatga ega polietilenimin, DNK ning PEI 1:3 (w/w) va DNK ning madaniyat muhitiga 1:1 (w/v) optimallashtirilgan nisbatida. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga [35]. 293F xujayralari transfeksiyadan keyin 96 soatda yig'ib olindi. 293F hujayralari taxminan 50% yashovchanlik bilan 3,6 × 106 hujayra/mL qo'shilish zichligiga erishishi mumkin.
2.5. Immunofluoresans bilan bo'yash
Hujayralar shisha slaydda 100% sovuq aseton bilan o'tkazuvchan bo'lgan. Keyinchalik, fiksatsiyalangan hujayralar HPV16 L1 antikori CAMVIR-1 (Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya) bilan tekshirildi va sichqonchaga qarshi IgG-FITC (Sigma) bilan ushlandi. Immunitet bilan bo'yalgan hujayra monolayerlari PBS bilan yaxshilab yuvilgan va DAPI (Abcam) bilan o'rnatish muhiti bilan qoplangan. Immunofluoresans tasvirlari 40 × kattalashtirishda teskari mikroskop ostida tekshirildi. Transfektsiya samaradorligi FITC (yashil)-musbat hujayralar va DAPI (ko'k)-bo'yalgan hujayralar nisbati bilan aniqlandi.
2.6. HPV ni tozalash: OIV (L1: P18I10 va L1: T20) VLP
125 ml Erlenmeyer kolbasida (30 ml madaniyat muhiti/kolba) jami 108 transfektsion 293F xujayralari 5 daqiqa davomida 1500 aylanish tezligida santrifüjlash orqali yig'ildi va ikki marta PBS bilan yuvildi. Hujayra granulalari 1% Triton X-100, proteaz inhibitori (1:100) (Millipore) va benzonaz (25 U/mL) (Millipore) bilan tuzilgan lizis buferida qayta suspenziya qilindi. Hujayra lizatlari 0,45 mikron PVDF shprits filtri (Millipore) bilan aniqlandi. HPV: OIV (L1:P18I10 va L1:T20) VLP namunalari kation almashinuvi (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, AQSh), o‘lchamni istisno qilish (Capto Core 700, GE) va yaqinlik (HiTrap Geparin HP) yordamida ketma-ket tozalandi. , GE) xromatografiya. Xromatografik protokollar bizning oldingi tadqiqotlarimizda tasvirlangan [36,37] va ishlab chiqaruvchining protokoliga amal qilgan [38]. Har bir tozalash bosqichida L1 oqsil signali Western blot tahlili bilan tavsiflangan va HPV16 L1 antikori CAMVIR-1 [39] bilan tekshirilgan.
2.7. Qisqartirmaydigan SDS-PAGE
HPV16 L1, L1:P18I10 va L1:T20 VLP 5% (v/v) 2-merkaptoetanol ({{11}) boʻlmaganda yoki mavjud boʻlmaganda 2× Laemmli namuna buferi (BIO-RAD) bilan aralashtiriladi. }ME) va xona haroratida (RT) 24 soat davomida reaksiyaga kirishdi. Namunalar 8-16% TGX dog'siz protein jellari (BIO-RAD) bilan ajratilgan. Keyin jellar PVDF membranalariga o'tkazildi. Membranalar anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb bilan 1:4000 suyultirish bilan tekshirildi. Shundan so'ng, membranalar sichqonchaga qarshi IgG peroksidaza konjugati (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) bilan 1:4000 suyultirish bilan inkubatsiya qilindi. Signal Western Blot ECL substrat to'plami (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida kimilyuminesans tomonidan ishlab chiqilgan va vizuallashtirilgan. Blot tasvirlar Odyssey Fc tasvirlash tizimi yordamida olingan.
2.8. Molekulyar massa tahlili
2-ME bilan ishlov berilmagan HPV16 L1, L1:P18I10 va L1:T20 VLPlar 1000 kDa molekulyar og'irlikni kesish (MWCO) ultrafiltratsiya qurilmalari (SARTORIUS) orqali filtrlangan. 2-ME bilan ishlov berilgan HPV16 L1, L1:P18I10 va L1:T20 VLPlar 100 kDa MWCO ultrafiltratsiya qurilmalari (Amicon) orqali oʻtkazildi. Retentatlar asl hajmgacha qayta tiklandi va filtrlash moslamasi namunasi rezervuaridan yig'ildi, filtratlar esa santrifuga trubasining pastki qismida to'plandi. L1 signali anti-HPV16 L1 mAb bilan problangan nuqta nuqta yordamida o'lchandi va sichqonchaga qarshi IgG-peroksidaza konjugati (Sigma-Aldrich) tomonidan aniqlandi. Tasvirlar Odyssey Fc Imaging System yordamida kimyoluminesans kanalida olingan.
Cistanche tubulosa foydalari- immunitet tizimini mustahkamlash
2.9. Salbiy bo'yash va transmissiya elektron mikroskopiyasi
Uglerod bilan qoplangan mis to'rlarni (Sigma-Aldrich) ultrabinafsha nurlar ostida 5 daqiqa davomida zaryad qilgandan so'ng, tijorat HPV16 L1 (Abcam), tozalangan L1: P18I10 va L1: T20 VLP'lar 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, NaCl 137) bilan muvozanatlashtirildi. ) 1 daqiqa davomida panjaralarga so'riladi va uch marta miliQ suv bilan yuviladi. HPV: OIV VLP'lari 1 daqiqa davomida pH 4,5 (Sigma-Aldrich) da 2% uranil asetat bilan salbiy bo'yalgan. Ortiqcha bo'yash vositalari Whatman sifatli filtr qog'ozi (Sigma-Aldrich) bilan olib tashlandi. To'rlar kuzatuvdan kamida 2 soat oldin namlagich kamerasiga joylashtirildi. Tasvirlar mos ravishda SA135K (100 nm) va SA59000 (200 nm) kattalashtirishda uzatuvchi elektron mikroskop (Tecnai Spirit 120 kV) yordamida olingan.
2.10. Natriy dodesil sulfat-poliakrilamid jel elektroforez va Western Blotting tahlili
Teng miqdorda (500 ng) HPV16 L1 oqsili (Abcam), tozalangan L1:P18I10 va L1:T20 VLP 5% 2-ME ni o‘z ichiga olgan 2× Laemmli namuna buferi bilan aralashtiriladi va 95 ◦C da 5 daqiqa qaynatiladi. . Namunalar 8-16% TGX Stainsiz protein jellari bilan ajratildi va keyin Yarim quruq uzatish moslamasi (Bio-Rad) yordamida PVDF membranasiga (Millipore, Burlington, MA, AQSh) o'tkazildi. Membrana TBSTda 5% yog'siz sut bilan bloklangan. Keyin membranalar anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb bilan 1:4000, anti-OIV-1 gp120 V3 halqa mAb (NIBSC, EVA3012) 1 suyultirishda tekshirildi: 40 va HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) mos ravishda 1:4000 suyultirishda. Shundan so'ng, membranalar sichqonchaga qarshi IgG peroksidaza konjugati (Sigma-Aldrich) bilan 1:4000 suyultirish bilan inkubatsiya qilindi. Signalni ishlab chiqish uchun Western ECL substrat to'plami (BIO-RAD) ishlatilgan. Blot tasvirlari Odyssey Fc tasvirlash tizimidan kimyoluminesans kanalida olingan.
2.11. Sichqonlarni immunizatsiya qilish, sarumlarni yig'ish va splenotsitlarni izolyatsiya qilish
Bu HPV ning immunogenligini ko'rsatish uchun kontseptsiyani tasdiqlovchi dastlabki tadqiqot: OIV VLP (L1:P18I10 va L1:T20 VLP). Bizning HPV dozasi, yuborish yo'li va asosiy oshirish oralig'i: OIV VLP'lari sichqonlarni sigir papillomavirusi (BPV) bilan immunizatsiya qilgan oldingi tadqiqotlarga ishora qiladi: antikor reaktsiyalarini qo'zg'atish uchun OIV VLPlari [20,21]. Tozalangan HPV: OIV VLPlari litsenziyalangan Gardasil{13}} HPV vaktsinasiga [40] oʻxshash formulani taʼminlash uchun teng hajmda (har bir 0,5 ml doza uchun 225 mkg) alyuminiy gidroksifosfat sulfat (Termo Fisher) bilan emulsiya qilindi. Barcha sichqoncha guruhlari teng jins taqsimotiga ega edi (har bir guruhda erkak n=4 va ayol n=4). A va B guruhlarida BALB/c sichqonlari mushak ichiga (im) mos ravishda 10 mkg L1:P18I10 yoki L1:T20 VLPlar bilan gomologik asosiy oshirish rejimiga rioya qilish orqali immunizatsiya qilindi. C guruhida sichqonlarga 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int intradermal tarzda (id, oziq-ovqat yostig'ida) va mushak ichiga 10 mkg L1:P18I10 VLP bilan kuchaytirildi. D guruhida musbat nazorat sichqonlariga Gardasil- 9 prime, so'ngra 10 mkg HPV16 L1 VLP bilan Gardasil{31}} boost mushak ichiga yuborildi. E guruhida salbiy nazorat sichqonlari PBS buferi bilan ikki marta immunizatsiya qilindi. Asosiy boost oralig'i 2 hafta edi. Sichqonlar 28-kuni qurbon qilindi. Sichqonlarning yuraklaridan qon namunalari olindi. Sarumlar santrifüjlash yo'li bilan olindi va Elishay tahlili uchun -20 ◦C da saqlanadi. Murin taloqlari olib tashlandi va 5 ml shpritsli kauchuk piston bilan hujayra filtri (Falcon) orqali alohida bosildi. Qizil qon hujayralarini ACK lizing buferi (Lonza) bilan olib tashlangandan so'ng, splenotsitlar yuvildi va R10 limfotsit muhitida qayta suspenziya qilindi (RPMI 1640 10% xomilalik buzoq zardobi (FCS), penitsillin-streptomitsin, 20 mM HEPESM va 46}}ME) 2 × 107 hujayra/ml konsentratsiyada.
2.12. Ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili
HPV16 L1- va OIV{2}}ximerik HPV bilan bog‘langan spesifik antikorlarni sinash uchun: HIV VLP in vitro, 50 µL teng konsentratsiyali (200 ng/ml) rekombinant HPV16 L1 oqsili (Abcam, ab119880) ), 50 mM karbonat bikarbonat tamponida (pH=9.6) (Sigma) tozalangan L1:P18I10 va L1:T20 VLP'lar ketma-ket suyultirildi va Maxisorb plitalari (Nunc) ustiga qoplandi. Plitalar bir kechada 4 ◦C da inkubatsiya qilindi. Plitalar blokirovka qiluvchi tampon (TBSTda 5% yog'siz sut) bilan 37 ◦C da kamida 2 soat davomida bloklangan. Ikki marta TBST bilan yuvilgandan so'ng, VLP bilan qoplangan plitalar 1:8000 suyultirishda HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb, 1:8000 suyultirishda 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) va OIV-1 gp120 V3 halqa mAb (NIBSC, EVA3012) blokirovkalash buferida mos ravishda 1:40 suyultirilganda, 37 ◦C da 2 soat davomida. TBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, plitalar rekombinant protein G peroksidaza konjugati (Thermo Scientific, Waltham, MA, AQSh) bilan blokirovkalash tamponida 1:4000 suyultirishda 37 ◦C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. TMB ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) signalini ishlab chiqish uchun ishlatilgan va 50 µL 2M H2SO4 bilan to'xtatilgan. Har bir quduqning optik zichligi (OD) EL × 800 absorbans mikroplatini o'quvchi yordamida 450 nm to'lqin uzunligida o'lchandi va qayd etildi.
BALB/c sichqonlarida VLP tomonidan qo'zg'atilgan antikorlarni o'lchash uchun mikrotitr plitalari 50 µL 2 µg/ml rekombinant HPV16 L1 oqsili (Abcam, ab119880), OIV{6}} P18I10 peptid (NIBSC, ARP734) bilan qoplangan. T20 peptidi (NIBSC, ARP984), mos ravishda, 50 mM karbonat-bikarbonat buferi (pH=9,6). Plitalar bir kechada 4 ◦C da inkubatsiya qilindi. Plitalar blokirovka qiluvchi tampon (TBSTda 5% yog'siz sut) bilan 37 ◦C da kamida 2 soat davomida bloklangan. Shu bilan birga, AE guruhi immunizatsiya qilingan sichqonlardan to'plangan sarumlar TBSTda 1:50 nisbatda 5% yog'siz sut bilan suyultirildi. Ikki marta TBST bilan yuvilgandan so'ng, plitalar suyultirilgan sarum bilan 2 soat davomida 37 ◦C da inkubatsiya qilindi. TBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, plitalar blokirovkalash tamponida 1:4000 suyultirilganda rekombinant protein G HRP konjugati bilan qo'shildi va 37 ° C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. TMB Elishay signalini ishlab chiqish uchun ishlatilgan va 50 µL 2M H2SO4 bilan to‘xtatilgan. Har bir quduqning OD 450 nm to'lqin uzunligida EL × 800 absorbans mikroplatasini o'quvchi (Biotek) yordamida o'lchandi.
2.13. IFN- ELISpot tahlili
Fermentga bog'langan immun changni yutish joyi (ELISpot) tahlili ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq tijorat sichqoncha IFN-ELISpot to'plami (Mabtech, Nacka Strand, Shvetsiya) yordamida amalga oshirildi. ELISpot plitalari (MSISP4510, 96-poliviniliden diftoridli membranali quduq plitalari, Millipore, Middlesex County, MA, AQSH) 70% EtOH bilan ishlov berildi va tozalangan sichqonchaga qarshi interferon- (IFN-) tutuvchi monoklonal antikor bilan qoplangan. fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS) kechada 4 ◦C da 5 µg/ml yakuniy konsentratsiyaga qadar. Keyin har bir quduqqa 2,5 × 105 yangi splenotsit qo'shildi. Keyinchalik, A va B guruhlari hujayralari 2 mkg/ml HPV16 L1 VLP va OIV-1 P18I10 peptidlari bilan rag'batlantirildi. Barcha namunalar va nazoratlar ikki nusxadagi quduqlarga solingan. ELISpot tahlillari 37 ◦C, 5% CO2 da 16 soat davomida inkubatsiya qilindi. Plitalar keyinchalik PBS bilan 5 marta yuvildi, PBS 2% xomilalik buzoq zardobida (FCS) suyultirilgan biotinlangan anti-IFN-monoklonal antikor (mAb) bilan 2 soat davomida inkubatsiya qilindi, 2 mkg/ml yakuniy konsentratsiyaga keltirildi, 5 marta yuvildi. PBS da va PBS 2% FCS da streptavidin-ishqoriy fosfataza konjugati bilan inkubatsiya qilinadi. Keyin plitalar 100 µL 5-bromo-4-xloro-3-indolil fosfat (BCIP)/nitroko‘k tetrazolium (NBT) substrat eritmasi (Sigma-Aldrich) bilan inkubatsiya qilishdan oldin PBS bilan 5 marta yuvildi. , Sent-Luis, MO, AQSh). 5-10 daqiqadan so'ng plitalar musluk suvi bilan yuvildi, quritildi va natijada paydo bo'lgan dog'lar ELISPOT o'quvchi (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Germaniya) yordamida hisoblandi. Guruhlar o'rtasida IFN-nuqta hosil qiluvchi hujayralar (SFC)/106 ni solishtirish imkonini berish uchun har bir hayvon uchun fon javoblarining o'rtacha qiymati barcha quduqlardan alohida ajratildi. Ijobiy javoblarni aniqlash uchun chegara har bir quduq uchun kamida besh nuqta va salbiy nazorat quduqlaridagi nuqtalarning o'rtacha sonidan oshib ketadigan javoblar va salbiy nazorat quduqlarining uchta standart og'ishi sifatida aniqlandi.
2.14. Statistik tahlil
Barcha statistik tahlil Prism 6 GraphPad dasturi (CA, AQSH) yordamida amalga oshirildi. Biz rekombinant HPV16 L1 oqsili (Abcam, ab119880) va HPV: OIV VLPlarining 5 xil Elishay plastinka qoplama konsentratsiyasi (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) ustida oʻtkazilgan tajriba maʼlumotlaridan foydalandik. Biz 2 guruhdan ma'lumotlarni to'pladik (HPV16 L1 va HPV: OIV VLPs) va har bir qoplama kontsentratsiyasi uchun uchta replikatsiya to'pladik. Prizmadagi grafik ma'lumotlarni X o'qida qoplama kontsentratsiyasini (ng/mL) va Y o'qida OD450 ni ko'rsatadigan scatterplot sifatida ko'rsatdi. Biz in vitro ELISA maʼlumotlarimiz chiziqli naqshda bogʻlanganligini taxmin qilganimiz uchun, biz chiziqli regressiya tahlilini oʻtkazdik va maʼlumotlar toʻplami-1 va maʼlumotlar toʻplamini (antikor) tasdiqlash uchun ikki chiziqning qiyaliklarini solishtirdik. HPV16 L1 va HPV o'rtasidagi reaktivlik: OIV VLP) ularning harakatlarida farq qiladi. Biz eng mos keladigan chiziq bilan birga 95% ishonch oralig'ini tanladik. Prizma bizning ikkala ma'lumotlar to'plamimizda avtomatik ravishda chiziqli regressiya chizig'ini qo'ydi va 95% ishonch oralig'ini ifodalovchi nuqtali chiziqni chizdi. Chiziqli regressiya tahlili paytida dasturiy ta'minot faqat moslikni ko'rsatadigan ma'lumotlar to'plamimizning o'rtacha Y qiymatini hisoblab chiqdi. Bundan tashqari, Prizma bizga sharh berdi, shuning uchun biz ikki yonbag'ir o'rtasidagi farqlar juda muhim degan xulosaga kelishimiz mumkin.
Bizda sichqonchani immunizatsiya tajribalaridan to‘plangan 5 ta to‘plam (ELISA) va 4 ta to‘plam (ELISPOT) bor edi. Ushbu ma'lumotlar to'plamlari har bir guruhda teng songa ega (erkak n=4 va ayol n=4). Biz Gardasil{4}}immunlangan sichqonlarni ijobiy nazorat guruhi sifatida va PBS bilan immunizatsiyalangan sichqonlarni salbiy nazorat guruhi sifatida ishlatdik. Bizning ishlab chiqilgan tajribalarimiz ma'lumotlari mos kelmadi yoki juftlashtirilmadi. Ushbu vositalar boshqacha ekanligini bilish uchun biz bir tomonlama dispersiya tahlilini (ANOVA) o'tkazdik. Biz birinchi navbatda ma'lumotlarimizni Gauss normal taqsimotiga mos kelishini tekshirdik. Biz Elishay tahlilidagi ma'lumotlarning ba'zi guruhlari Gauss normal taqsimlash testidan o'tmaganligini aniqladik. Shuning uchun biz ushbu ma'lumotlarning parametrik bo'lmagan statistik tahlilini o'tkazdik. Aksincha, ELISPOT tahlilidagi barcha ma'lumotlar guruhlari Gauss normal taqsimot testidan o'tgan. Shunday qilib, biz ushbu ma'lumotlarning parametrik statistik tahlilini o'tkazdik. Muhimlik chegarasi va ishonch darajasi 0.05 (95% ishonch oralig'iga ekvivalent) ga o'rnatildi. p qiymati, umuman olganda, guruhlar o'rtasida farqlar mavjudligi ehtimolini ko'rsatadi. Ushbu eksperiment bo'yicha bizning asosiy g'amxo'rligimiz guruhlarimiz o'rtasidagi farqlar bo'lganligi sababli, Prizmadagi ko'p taqqoslashlar bizga barcha guruhlardagi har bir boshqa guruhlar bilan taqqoslash natijasini berdi.
2.15. Etik bayonotlar
Olti-sakkiz haftalik BALB/c sichqonlari Envigodan (Inotiv kompaniyasi, Chikago, IL, AQSh) sotib olindi va mahalliy hokimiyat organlari (Generalitat de Catalunya, loyiha raqami 11157) va Universitat Autònoma de Barselona Etika qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Hayvonlar ustida o'tkazilgan tajribalar Generalitat de Catalunya hayvonlarning farovonligi to'g'risidagi qonun hujjatlariga qat'iy muvofiq edi. Barcha eksperimentlar mahalliy Tadqiqot Etikasi Qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (Protsedura 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barselona).
3. Natijalar
3.1. L1: P18I10 va L1: T20 immunogenlarini loyihalash va HPV ni baholash: 293F ifoda tizimi yordamida OIV oqsilini ifodalash
OIV-1 Env uchinchi oʻzgaruvchan domeni (V3) halqasidan P18I10 peptid va OIV-1 Env membranasining proksimal tashqi hududidan (MPER) olingan T20 peptid HPV16 L1 DE halqa oqsiliga ximerik L1 hosil qilish uchun kiritildi. :P18I10 va L1:T20 immunogenlari. Kimerik L1: P18I10 va L1: T20 DNK kodlash ketma-ketliklari 293F hujayralarida vaqtinchalik transfeksiya uchun pcDNA3.1 (+) plazmid DNK ifoda vektoriga klonlandi (1A-rasm). HPV16 L1, kimerik L1: P18I10 va L1: T20 kapsid oqsillarining monomer tuzilmalari SWISS modeli serveri yordamida oldindan bashorat qilingan (1B-rasm). HPV16 asosiy kapsid oqsili L1 (7cn2.1.R) HPV16 L1, L1: P18I10 va L1: T20 kapsid oqsili homologiyasini modellashtirish uchun tizimli shablon sifatida tanlangan. Oldingi tadqiqotda [41] bog'langan P18I10 peptidining konformatsiyasi bilan solishtirganda, bizning kimerik L1: P18I10 oqsilimizdagi P18I10 peptidining N dan C gacha bo'lgan asosiy zanjir yo'nalishi o'ngdan chapga (1B-rasm, o'rta va yuqori panel) ishlaydi. va P18I10 yon zanjirlari T hujayra retseptorlari bilan potentsial o'zaro ta'sir qilishi mumkin (1B-rasm, o'rta va pastki panel). Oldingi koʻrib chiqish qogʻozidagi [42] OIV-1 termoyadroviy inhibitori peptidining tuzilishi bilan solishtirganda, HPV16 L1 kapsid oqsiliga kiritilgan T20 peptid spiralga oʻxshash shaklda koʻrsatilgan (1B-rasm, oʻng va yuqori panel). ) va ochilgan T20 yon zanjirlari B hujayra retseptorlari tomonidan tan olinishi mumkin (1B-rasm, o'ng va pastki panel). HPV16 L1 kapsid oqsillari bir xilda 72 pentamer kapsomerli T=7 ikozahedral zarrachaga [43] to'planishi mumkinligi sababli, kimerik HPV ning tashqi yuzasiga P18I10 yoki T20 peptidlarining yuqori zichlikdagi namoyon bo'lishi: OIV VLPs potentsial yuqori immunostimulyatsiondir. epitopga xos immun javoblarni qo'zg'atish.
Shakl 1. L1: P18I10 va L1: T20 immunogen dizayni va kimerik HPV ning tuzilishi: 293F ifoda tizimidan foydalangan holda OIV VLP. (A) Ximerik L1:P18I10 va L1:T20 DNK kodlash ketma-ketliklari 293F hujayralarida vaqtinchalik transfeksiya uchun mos ravishda pcDNA3.1+ ifoda vektorlariga klonlandi. (B) HPV16 L1 va kimerik HPV ning monomer tuzilmalarini bashorat qilish: SWISS modeli serveridan foydalangan holda OIV kapsid oqsillari. HPV16 asosiy kapsid oqsili L1 (7cn2.1.R) HPV16 L1 (chap panel), L1: P18I10 (o'rta panel) va L1: T20 (o'ng panel) kapsid oqsili homologiyasini modellashtirish uchun tizimli shablon sifatida tanlangan. HPV16 L1 kapsid oqsilining ikkilamchi strukturaviy elementlari spirallar uchun 5 -h1–h5 harflari bilan etiketlanadi. Iplar orasidagi HPV16 L1 kapsid oqsilining halqalari BC, CD, DE, EF, FG va HI deb etiketlanadi. OIV-1 P18I10 va T20 peptidlarining L1 ikkilamchi strukturaviy elementlari strelkalar (yuqori panel) bilan belgilangan. P18I10 va T20 peptidlarining HPV16 L1 kapsid oqsili yuzasidan chiqib turgan qismi strelkalar (pastki panel) bilan ko'rsatilgan. (C) 293F hujayralarida L1 oqsilining immunofluoresans bo'yalishi. Quyidagi pDNA.L1:P18I10 (chapda), pDNA.L1:T20 (o'rtada) va pDNA. kiritishsiz (o'ngda) 293F hujayralarida transfektsiya qilingan. Transfektsiyalangan hujayralar anti-HPV16 L1 mAb bilan tekshirildi va sichqonchaga qarshi IgG-FITC (yashil kanal) bilan aniqlandi. Hujayra yadrolari DAPI (ko'k kanal) bilan bo'yalgan. Immunofluoresans tasvirlari Adobe Photoshop yordamida birlashtirildi
HPV16 L1 protein C terminali ketma-ketligi infektsiya paytida hujayra yadrosini import qilish mexanizmlariga vositachilik qilganligi sababli [44], HPV16 L1 oqsilining yadroviy lokalizatsiya signallari (NLS) oldingi tadqiqotlarda aniqlangan [45]. HPV16 L1 epitopini (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] tanib olish uchun CAMVIR{6}} monoklonal antikori tanlandi va L1:P18I10 va L1 ifodasini kuzatish uchun muxbir sifatida flüoresanga asoslangan boʻyoq FITC ishlatilgan: T20 oqsillari. Immunofluopresents tasvirlari HPV16 L1 (yashil rangda) asosan 293F hujayralarining yadrolarida (ko'k rangda) lokalizatsiya qilinganligini aniq ko'rsatdi. Nazorat plazmidi bilan kesilgan 293F hujayralarida (pcDNA3.1 plazmid qo'shimchasiz) L1 signali kuzatilmadi (1C-rasm). Natijalar shuni ko'rsatdiki, kimerik L1:P18I10 va L1:T20 kapsid oqsillari polietilenimin (PEI) vositachiligida transfeksiya yordamida ifodalanishi va HPV16 L1 CAMVIR-1 monoklonal antikori tomonidan tan olinishi mumkin.
3.2. Xromatografik usullar yordamida L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarni tozalash
The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa va geterologik pastki diapazon<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.
Shakl 2. L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarni tozalash va tavsiflash. (A) L1:P18I10 va L1:T20 VLPni xromatografiya bilan tozalashning sxematik jarayon sxemasi. (B, C) Har bir tozalash bosqichidan L1: P18I10 va L1: T20 VLP namunalarining Western blot tahlili. Har bir tozalash bosqichida L1 signali anti-HPV16 L1 mAb bilan tekshirilgan Western blot tahlili bilan tavsiflanadi. O'q L1:P18I10 ning ~56 kDa va L1:T20 oqsillarining ~58 kDa molekulyar og'irligini ko'rsatadi. 1-qator: aniqlangan hujayra lizati (CCL); 2-qator: kation almashinuvi xromatografiyasidan (CEC) namunani yuklashdan oqim (FT); 3-qator: MSK eluati; 4-qator: CEC 2M NaCl regeneratsiyasi bosqichidan FT; 5-qator: o‘lchamni istisno qilish xromatografiyasi (SEC) FT-1; 6-qator: SEC FT-2; 7-qator: geparinga yaqinlik xromatografiyasidan (H-AC) namunani yuklashdan FT; 8-qator: H-AC eluat; 9-qator: H-AC 2M NaCl regeneratsiyasi bosqichidan FT; 10-qator: 10-katlama diafiltratsiyasi.
3.3. L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning in vitro barqarorligi va o'zini o'zi yig'ishi
Tozalangan HPV: OIV VLP’larining HPV16 L1 VLP’lariga o‘xshash in vitro barqarorligini tasdiqlash uchun biz HPV ning disulfid o‘zaro bog‘lanishini baholash uchun SDS-PAGEni kamaytirdik: OIV kapsid oqsillari (3A-rasm). Ma'lumki, pH, ion kuchi, harorat [52] va oksidlanish-qaytarilish muhiti HPV16 L1 kapsid oqsillarining disulfid aloqalari bilan bog'liqdir [53]. HPV L1 VLP past pH va yuqori ion kuchida o'z-o'zidan yig'ilishga moyildir. VLPlarni maksimal darajada demontaj qilish odatda nisbatan uzoq vaqt davomida 5% 2-merkaptoetanol (2-ME) kabi qaytaruvchi moddalarning yuqori konsentratsiyasiga ta'sir qilishni talab qiladi [54]. Qaytaruvchi moddalar 2-ME boʻlmaganida, HPV-16 L1, L1:P18I10 va L1:T20 oqsillarining faqat kichik bir qismi aniq molekulyar ogʻirligi (MV) 55 kDa boʻlgan monomerlarga oʻtadi. . L1 oqsillarining taxminan 70% disulfid kattaroq dimerlarga yoki pentamerlarga bog'langan, prognoz qilingan MVt 110 kDa va 280 kDa (3A-rasm, 2, 4 va 6-bandlar). Aksincha, demontaj buferidagi deyarli barcha HPV-16 oqsillari SDS-PAGEda monomerik tuzilmalar paydo bo'ldi (3A-rasm, 3, 5 va 7-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatdiki, tozalangan L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning in vitro barqarorligi bir xil pH, ion kuchi va termal sharoitlarda HPV16 L1 VLPs kabi disulfid o'zaro bog'lanish naqshlarini taqdim etdi. Tozalangan VLPlar yuqori konsentratsiyali qaytaruvchi moddalarga uzoq muddatli ta'sir qilishdan so'ng pentamerlar, trimerlar va dimerlar darajasiga qadar parchalangan ko'rinadi. Bu ma'lumotlar oldingi tadqiqotlar bilan mos keladi [53,54] Biroq, HPV ni qismlarga ajratish: OIV VLPs hali to'liq emas edi (monomerlar).
Shakl 3. L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning in vitro barqarorligi. (A) Qaytarmaydigan SDS-PAGEda L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning disulfid o'zaro bog'lanishi. HPV16 L1 VLP, tozalangan L1:P18I10 va L1:T20 VLP mos ravishda 2-merkaptoetanol (2-ME) yo‘qligida yoki mavjud bo‘lganda Laemmli namuna buferi bilan aralashtirildi va qaytarilmasdan tahlil qilindi. SDS-PAGE. L1 monomerining (55 kDa), L1 dimerining (110 kDa) va L1 pentamerining (280 kDa) pozitsiyasi o'q bilan ko'rsatilgan. 1-qator: oqsil molekulyar og'irlik belgisi; 2-qator: HPV16 L1 VLP; 3-qator: HPV16 L1 VLP 2-ME bilan davolanadi; 4-qator: L1: P18I10 VLP; 5-qator: L1:P18I10 VLP 2-ME bilan ishlanadi; 6-qator: L1: T20 VLP; 7-qator: L1:T20 VLP 2-ME bilan ishlanadi. (B) L1:P18I10 va L1:T20 VLPlarning molekulyar massa tahlili. 2-ME (2, 4 va 6 qatorlar) bilan ishlov berilmagan yigʻilgan VLPlar 1000 kDa molekulyar ogʻirlikni kesish (MWCO) diafiltratsiya qurilmalari (yuqori panel) orqali filtrlangan. 2-ME bilan ishlov berilgan qismlarga ajratilgan VLP (3, 5 va 7 qatorlar) 100 kDa MWCO santrifüj filtr qurilmalari (pastki panel) orqali filtrlangan. Retentatlar (R) filtrlash moslamasi namunalari rezervuarlaridan, filtratlar (F) esa santrifüj naychalarining pastki qismida to'plangan. L1 oqsil signali anti-HPV16 L1 mAb bilan tekshirilgan nuqta nuqta yordamida aniqlandi.
To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) va retentatlarda saqlanib qolgan. Shakl kamaytirmaydigan SDS-PAGEda kuzatilgan ma'lumotlarga mos keldi. 2-ME bilan ishlov berilgan barcha VLP guruhlari monomerik diapazonda (~55 kDa) kamaytirmaydigan SDS-PAGEda ko'rsatilgan bo'lsa-da (3A-rasm, 3, 5 va 7-rasm). Biroq, mos keladigan qisqartirilgan VLPlar 100kDa ultrafiltratsiya membranalari orqali filtrlanmagan (3B-rasm, pastki panel). Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, kimerik HPV: OIV oqsillari o'z-o'zidan kattaroq zarrachalarga birlasha oladi, ammo VLP ning monomerlarga maksimal darajada demontaj qilinishi nafaqat disulfid bog'lanishlarini, balki pH yoki ion kuchi kabi boshqa denaturatsiya qiluvchi omillarni ham talab qiladi.
3.4. L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning morfologik xarakteristikasi
Transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) HPV16 L1 va HPV: OIV VLPlarining morfologik konformatsiyasini tekshirish uchun ishlatilgan. OIV{2}} P18I10 va T20 peptidlari mos ravishda HPV16 L1 oqsilining DE halqalariga kiritildi. Ushbu tijorat HPV16 L1 va kimerik HPV: OIV kapsid oqsillari o'z-o'zidan in vitroda taxminan 50-60 nm diametrli integral VLPlarga o'z-o'zidan yig'ilishi mumkin (4A-C-rasm, o'ng panel). Oldingi tadqiqotlarda [55,56] chop etilgan HPV16 L1 VLP elektron mikrografigi bilan solishtirganda, bu erda HPV16 L1, L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarining ikozahedral tuzilishi kamroq kontrast va noaniq edi. Bunga biz ushbu tadqiqotda foydalangan salbiy dog 'reagenti sabab bo'lishi mumkin. Oldingi tadqiqotda [37] chop etilgan va boshqa davom etayotgan maqolada (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) chop etilgan tadqiqotimizda xamirturush va bakulovirusdan olingan L1: P18I10 VLP (xuddi shu kimerik)da elektron mikrografiyalarning yaxshi sifati va ruxsatiga ega bo'ldik. konstruksiya) PBSda muvozanatlashtirildi va fosfotungstik kislota (PTA) bilan manfiy bo'yalgan. Ushbu tadqiqotda turli xil VLP ishlab chiqarish va tozalash tizimlaridan foydalanganimiz sababli, sutemizuvchilar hujayralaridan olingan L1: P18I10 va L1: T20 VLP'lar Tris-HCl bilan muvozanatlashtirildi va uranil asetat bilan salbiy bo'yalgan. Elektron mikrografiyalarni yaxshilash mumkin bo'lsa-da, biz HPV16 L1, L1: P18I10 va L1: T20 kapsid oqsillarining aksariyati TEM ekrani ostida morfologik VLPlarga o'z-o'zidan yig'ilishi mumkinligini aniq ko'rishimiz mumkin (rasm 4A-C, chap panel). ). Asosan, HPV VLP yuqori tuz sharoitida agregatsiyadan himoyalangan [57]. HPV16 L1 va HPV ning aniqlanishi mumkin bo'lgan agregatsiyasining ba'zilari: past tuzli Tris-HCl buferidagi OIV VLP'larini pastroq kattalashtirish ostida ko'rish mumkin (4A-C-rasm, chap panel). Ushbu natijalardan biz OIV-1 P18I10 yoki T20 peptidlarini kiritish orqali L1 DE halqasining qisman ketma-ketligini o'zgartirish HPV: OIV VLP morfologiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmagan degan xulosaga keldik.
Shakl 4. L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning elektron mikrograflari. (A) HPV16 VLP ning morfologiyasi. (B) L1:P18I10 VLPlarning morfologiyasi. (C) L1:T20 VLPlarning morfologiyasi. Tozalangan VLPlar UV-zaryadlangan uglerod bilan qoplangan mis panjaralarda so'riladi va 2% uranil asetat bilan salbiy bo'yalgan. Rasmlar transmissiya elektron mikroskop ostida olingan. Chiziq mos ravishda 59,{17}} (chap panel) kattalashtirishda 200 nm va 135K (o‘ng panellar) kattalashtirishda 100 nm ni ifodalaydi
3.5. HPV-16 va OIV-1 epitoplarining taqdimoti va reaktivligi
Ketma-ket OIV{0}} P18I10 yoki 2F5 epitoplari xromatografiya bilan tozalangan L1:P18I10 yoki L1:T20 VLPlarda taqdim etilganligini tasdiqlash uchun epitopga xos mAblar yordamida Western blot tahlili va bilvosita Elishay oldindan tuzilgan. Biz HPV16 L1 oqsilining yuqori darajada saqlanib qolgan epitopini (GFGAMDF, aa 230–236) tanib olish uchun CAMVIR-1 deb atalgan taniqli monoklonal antikorni (mAb) tanladik [39,58]. Oldin nashr etilgan OIV{20}} gp120 V3 halqa epitopi (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) ketma-ket P18I10 epitoplarini (RGPGRAFVTI, aa311–320) aniqlash uchun tanlangan [59]. Boshqa tomondan, T20 peptid tavsifi uchun OIV-1 gp{31}}F5 epitopi (ELDKWA) ni taniydigan keng neytrallashtiruvchi antikor (bnAb) tanlandi. 60,61]. HPV16 L1 mAb bilan tekshirilgan Western blot tahlili mos ravishda HPV16 L1, L1:P18I10 va L1:T20 oqsiliga mos keladigan 55, 56 va 58 kDa diapazonlarini ko'rsatdi (5A, B, chapdagi rasm). L1: P18I10 oqsilining molekulyar og'irligi (MW) HPV16 L1 oqsiliga o'xshash edi (5A-rasm, chap). L1:T20 oqsiliga mos keladigan band, qo'shimcha aminokislotalar ketma-ketligidan bashorat qilinganidek, HPV16 L1 oqsilidan biroz yuqoriroq ekanligi kuzatildi (5B-rasm, chap). L1:P18I10 va L1:T20 oqsiliga mos keladigan taxminan 56 va 58 kDa diapazonlari anti-OIV-1 gp120 V3 va 2F5 mAb bilan tekshirilgan Western blot tahlilida aniqlandi (5A, B, o'ngdagi rasm) ). Biz anti{75}}F5-bo‘yalgan L1:T20 oqsilining molekulyar og‘irligini (MVt) to‘g‘ri deb hisobladik va kutilgan 58 kDa ga to‘g‘ri keldi (5B-rasm, o‘ng). Biroq, anti-OIV-1 gp120 V3-bo'yalgan L1:P18I10 oqsilining MVt miqdori biroz pastroq (5A-rasm, o'ngda). Buni kimerik L1: P18I10 oqsillarining heterojen tuzilishi bilan bog'lash mumkin. SDS-PAGE da denaturatsiya holatida ketma-ket epitop konformatsiyasi yo'qolishi mumkinligi sababli. Shu sababli, biz L1: P18I10 VLP ximeriklarida to'g'ri taqdim etilgan konformatsion P18I10 peptidini namoyish qilish uchun bilvosita Elishayni amalga oshirdik (5E-rasm). Boshqa tomondan, biz ishlatgan anti-OIV-1 gp120 V3 halqa antikori P18I10 epitopini emas, balki butun OIV-1 V3 halqasini tanidi. Shunday qilib, umumiy anti-V3 signali pastroq edi (5A, B-rasm, o'ng panellar). Shunga qaramay, bu natijalar ketma-ket OIV-1 P18I10 va T20 peptidlari HPV: OIV VLPlarida taqdim etilganligini ko'rsatdi.
5-rasm. HPV-16 va OIV-1 epitoplari taqdimoti. (A, B) Ximerik L1:P18I10 va L1:T20 VLPlarning ketma-ket epitopini aniqlash. Tozalangan L1:P18I10 va L1:T20 VLPlar anti-HPV16 L1, anti-OIV-1 gp120 V3 va 2F5 mAb yordamida Western blot bilan tahlil qilindi. HPV16 L1 VLP nazorat sifatida ishlatilgan. L1 (55 kDa), L1: P18I10 (56 kDa) va L1: T20 (58 kDa) oqsillarining molekulyar og'irligi o'q bilan ko'rsatilgan. 1-qator: oqsil molekulyar og'irlik belgisi; 2-qator: HPV16 L1 oqsili; 3-qator: L1: P18I10 oqsili; 4-qator: L1: T20 oqsili. (C, D) HPV16 L1 mAb ning kimerik L1:P18I10 va L1:T20 VLP larga ulanishi. (E) Anti-OIV-1 gp120 V3 mAb ning kimerik L1:P18I10 VLP larga ulanishi. (F) OIV-1 2F5 mAb ning kimerik L1:T20 VLP larga ulanishi. Bilvosita ELISA ning chiziqli grafigi mos ravishda anti-L1, anti-OIV-1 gp120 V3 yoki 2F5 mAbs bilan bog'langan rekombinant HPV16 L1, L1:P18I10 va L1:T20 VLPlarning konformatsion epitoplarini aniqlash uchun bajarildi. Ma'lumotlar uchta mustaqil tajribaning vakili. Tozalangan L1: P18I10 va L1: T20 VLP larning chiziqli farqini tijorat L1 VLP larning standart egri chizig'i bilan solishtirish uchun oddiy chiziqli regressiya testi o'tkazildi; ns: muhim emas; ** p <0,01.
Bundan tashqari, HPVda taqdim etilgan OIV{{{50}}}} konformatsion epitoplari: OIV VLPlari gp120 V3 va 2F5 neytrallashtiruvchi antikorlar tomonidan in vitroda aniqlanishi mumkinligini aniqlash uchun biz tekshirish uchun bilvosita Elishay tahlilini o'tkazdik. epitop bilan bog'lanishning o'ziga xosligi va reaktivligi. 5C-rasmda ko'rsatilganidek, D, HPV16 L1, L1: P18I10 va L1: T20 VLPlar anti-L1 mAb tomonidan tan olingan. Har bir suyultirish chizig'ining qiyaligini solishtirish uchun chiziqli regressiya tahlilini o'tkazdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, L1: P18I10 yoki L1: T20 VLP ning L1 epitopini bog'lash o'ziga xosligi HPV16 L1 VLP'lardan farq qilmaydi. Bundan tashqari, anti-OIV-1 gp120 V3 mAb L1:P18I10 VLP'larni bog'lay oldi, ammo HPV16 L1 VLP'larni emas (5E-rasm). Bundan tashqari, 2F5 mAb L1: T20 VLP larni taniy oladi, ammo HPV16 L1 VLP ni taniy olmaydi (5F-rasm). Chiziqli regressiya tahlilidan so'ng, L1: P18I10 va HPV16 L1 o'rtasidagi gp120 V3 epitopini bog'lash o'ziga xosligidagi farq juda muhim edi (p <0,01%). L1: T20 VLP ning 2F5 epitop bilan bog'lanish o'ziga xosligi HPV16 L1 VLP dan sezilarli darajada farq qildi (p <0,01%). Bu usul hidrofobik hujayrali lipidlar 2F{62}}neytrallashtiruvchi antikorlarni HPV: OIV VLPs in vitro bilan bog‘lash uchun zarur emasligini ko‘rsatdi. Anti-OIV-1 gp120 V3 va 2F5 neytrallovchi antikorlarning HPV: OIV VLPlariga nisbatan reaktivligi nisbatan yumshoq bo‘lsa-da, anti-OIV-1 gp120 V3 va 2F5 mAb ning HPV: OIV VLP bilan bog‘lanishi sezilarli darajada edi. epitopga xos.
3.6. BALB/c sichqonlari immunizatsiyasidan keyin L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarning immunogenligi
Biz L1:P18I10 va L1:T20 VLP bilan BALB/c sichqonlari immunizatsiyasidan so'ng HPV16- va OIV{1}}maxsus immun javoblarini baholadik. Emlash taqvimi 6A-rasmda ko'rsatilgan. Shilliq qavatni qo'llashdan keyin VLP tomonidan qo'zg'atilgan immunogenlik tizimli yuborishdan ko'ra zaifroq bo'lganligi sababli, sichqonlar Gardasil{10}} HPV16 L1 dozasining oltidan bir qismi bilan mushak ichiga immunizatsiya qilindi [22,62]. Kimerik HPV dozasi (10 µg/100 µL) uchun alyuminiy gidroksifosfat sulfat yordamchisi: OIV VLPlari Gardasil-9 bilan bir xil konsentratsiyaga (1 mg/1 ml) sozlangan. Emlash natijalaridagi jins farqini baholash uchun erkak (n=4) va urg'ochi (n=4) sichqonlar o'rtasidagi antikor javoblarining taqqoslanishi baholandi. L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP va Gardasil-9 guruhida urgʻochi sichqonlarning HPV16 L1 antikorlariga qarshi javoblari erkak sichqonlarga qaraganda oʻrtacha yuqori boʻlgan (6B-rasm). 4 tadan 2 tasida (50%) L1:P18I10 VLP bilan immunizatsiya qilingan urg‘ochi, 4 tadan 3 tasi (75%) L1:T20 VLP bilan immunlangan urg‘ochi va Gardasil bilan immunizatsiya qilingan barcha (100%) urg‘ochi sichqonlarda L1 antikorlarining yuqori titri aniqlandi. erkak sichqonlarga qaraganda. Gardasil-9 guruhidagi urgʻochi sichqonlar tomonidan qoʻzgʻatilgan L1ga qarshi javoblar erkak sichqonlarga qaraganda ancha yuqori boʻlgan (p=0.0041) (6B-rasm). BCG.HIVA priming va L1:P18I10 VLP kuchaytiruvchi guruhda anti-L1 antikor javoblarining juda past darajasi aniqlandi. Ushbu naqsh BCG asosan IgG ishlab chiqarishdan ko'ra T-hujayra reaktsiyalarini keltirib chiqarishini tavsiflovchi oldingi topilmalarga mos keladi [63].
Shakl 6. BALB/c sichqonlarida L1:P18I10 va L1:T20 VLPlar tomonidan gumoral immun javoblarning induksiyasi. Emlash taqvimi (A) da barcha sichqoncha guruhlari teng jins taqsimotiga ega edi (erkak n=4 va ayol n=4). A va B guruhlari: mushak ichiga 10 mkg L1:P18I10 yoki L1:T20 VLP bilan gomologik prime-boost immunizatsiya (im); C guruhi: 106 cfu rBCG.HIVA intradermal (id) bilan astarlash va 10 mkg L1:P18I10 VLPs im bilan kuchaytirish; D guruhi: 10 mkg HPV16 L1 VLP ni o'z ichiga olgan Gardasil-9 bilan gomologik prime-boost emlash; E guruhi: PBS buferi bilan ikki marta immunizatsiya. Asosiy boost oralig'i 2 hafta edi. Ushbu sinovning yakuniy nuqtasi 28-kuni edi. Sarumlar to'plandi va Elishay tahlili uchun 1:50 titrida suyultirildi. (B) erkak va urgʻochi sichqonlarda HPV L{30}}maxsus IgG. (C-E) L1: P18I10 va L1: T20 VLPlar tomonidan qo'zg'atilgan epitopga xos IgG. Elishay yuqorida ta'riflanganidek, BALB/c sichqonlari tomonidan qo'zg'atilgan anti-L1, anti-P18I10 va anti-T20 IgGni tahlil qilish uchun o'tkazildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan. Guruhlar orasidagi farqlarni solishtirish uchun bir tomonlama ANOVA (parametrik bo'lmagan) testi o'tkazildi. OD: optik zichlik. Ns ahamiyatsiz; ** p <0,01
Biz L1: P18110 va L1: T20 VLP bilan immunizatsiya qilingan sichqonlar BALB/c sichqonlarida HPV-16 L1-maxsus va OIV{6}} epitopiga xos antikorlarni keltirib chiqarishi mumkinligini baholadik. Sichqoncha zardobidagi VLP tomonidan qo'zg'atilgan IgG antikorlari mos ravishda rekombinant HPV16 L1 oqsili, P18I10 yoki T20 peptidlari bilan qoplangan Elishay tomonidan o'lchandi. PBS nazorat guruhi bilan solishtirganda Gardasil{17}} guruhida 1:50 sarum titrida L{14}}maxsus IgG ning statistik farqi aniqlandi (p=0.0039). Gardasil-9, L1:P18I10 va L1:T20 VLP bilan immunizatsiya qilingan sichqonlarning L1ga qarshi javoblari o‘xshash edi va sezilarli darajada farq qilmadi (6C-rasm). BCG.HIVA2auxo.int prime va L1:P18I10 VLP kuchaytiruvchi sichqonlar juda past darajada anti-L1 IgG ni keltirib chiqardi. Ushbu natijalar HPV: OIV VLP bilan immunizatsiya qilingan sichqonlar Gardasil{39}}immunlangan sichqonlar bilan bir xil darajada anti-L1 IgG hosil qilganligini ko'rsatdi (6C-rasm). Garchi L1: P18I10 VLP guruhi boshqa emlash guruhlariga qaraganda P18I10 epitopiga xos IgG ning yuqori darajasiga tendentsiyaga ega bo'lsa-da, bu farqlar statistik ahamiyatga ega emas edi (6D-rasm). L1:P18I10 VLP bilan immunizatsiya qilingan sichqonlarning ba'zilarida (8 dan 4 tasi, 50%), Gardasil bilan emlangan sichqonlarga nisbatan yuqoriroq P18I10 bog'lovchi antikorlari kuzatildi. Shu bilan bir qatorda, T-test tahlili L1:P18I10 VLP va Gardasil-9 guruhi o'rtasidagi farq sezilarli ekanligini ko'rsatdi (p=0.005) (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). L1:T20 VLP guruhida Gardasil-9 guruhiga nisbatan T20 peptidiga nisbatan ancha yuqori antikor javobi aniqlandi (p=0.0083). Kutilganidek, anti-T20 titrlari Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP va BCG.HIVA prime va L1:P18I10 VLP kuchaytiruvchi guruhlari bilan birgalikda aniqlanmadi (6E-rasm). T20 peptidiga xos antikorning titri nisbatan past edi. Buning sababi: (1) T20 subdominant peptid; (2) MPER yoki 2F5 neytrallashtiruvchi antikorlarning paydo bo'lishi peptid-lipid konjugatlarini talab qiladi (6E-rasm). Umuman olganda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, L1:P18I10 va L1:T20 VLP sichqonlarda HPV16-, ammo zaif OIVga{97}}o'ziga xos antikor reaktsiyalarini keltirib chiqarishi mumkin.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
Sichqonlarda HPV va OIVga xos T-hujayra immun javoblarini baholash uchun biz 7A-rasmda ko'rsatilgan immunizatsiya jadvaliga amal qildik. Bundan tashqari, heterolog BCG.HIVA2auxo.int primingi va L1:P18I10 VLP kuchaytirilishi gomologik L1:P18I10 VLP prime va kuchaytiruvchi immunizatsiya bilan solishtirilib, o'ziga xos HPV16 va OIV-1 T-hujayra immun javoblarining chastotasini baholash uchun o'tkazildi. Gardasil-9 va PBS guruhlari o'rtasida HPV16 L1 VLP bilan taloq stimulyatsiyasidan so'ng IFN-sekretsiyasi bo'yicha farq yo'q edi. L1- o'ziga xos IFN-sekretsiyasidagi farqlar L1:P18I10 VLP va Gardasil-9 guruhlari o'rtasida ham ahamiyatli emas edi. Biz L{24}}o'ziga xos IFN-sekretsiyasining kuchsizligi stimul sifatida ishlatiladigan HPV16 L1 VLP ning past konsentratsiyasi (2 mkg/ml) bilan bog'liq bo'lishi mumkin degan xulosaga keldik. BCG.HIVA2auxo.int prime va L1:P18I10 VLP boost guruhi Gardasil-9 guruhi bilan emlangan sichqonlar bilan solishtirganda, IFN-sekretuvchi splenotsitlarning yuqori chastotasini keltirib chiqardi va IFN-sekretsiyasida sezilarli farqlar kuzatildi (p {{36) }}.0103). 8 sichqondan 3 tasi (~38%) eng yuqori L1- IFN-javoblarini keltirib chiqardi (7B-rasm). Buni oldingi tadqiqotlarimizga ko'ra BCG ning noaniq yordamchiligi bilan bog'lash mumkin [64-66]. Yovvoyi tipdagi BCG ning aniq boshlang'ich ta'siri, rBCG hosilalarining keyingi kuchaytiruvchi vaktsinalar uchun kuchli yordamchi sifatida harakat qilish qobiliyatiga mos keladi [64,65]. OIV{48}}maxsus T-hujayra javoblariga kelsak, IFN nuqta hosil qiluvchi hujayralar (SFC)/106 ta splenotsitlarning eng yuqori umumiy kattaligi Gardasil qabul qilgan sichqonlarga nisbatan BCG.HIVA2auxo.int sichqonlarida kuzatilgan{{54} } vaktsinalar yoki L1:P18I10 VLP. BCG.HIVA bilan astarlangan va L1:P18I10 VLP bilan kuchaytirilgan sichqonlar L1:P18I10 VLP gomologik prime-boost bilan emlangan sichqonlarga nisbatan sezilarli darajada yuqori IFN-sekretsiyasini aniqladi (p=0.0268). Bundan tashqari, L1:P18I10 VLP bilan emlangan sichqonlarda Gardasil{72}} vaktsinalarini olgan sichqonlarga nisbatan ancha yuqori IFN-sekretsiyasi kuzatildi (p=0.0157) (7C-rasm). Kutilganidek, IFN sekretsiyasi Gardasil-9 va PBS guruhlarida aniqlanmadi. Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, (1) L1:P18I10 VLPlar OIV-1-maxsus T-hujayralari immun javoblarini keltirib chiqargan; (2) L1:P18I10 VLP HPVga xos T-hujayra immun javoblarini keltirib chiqardi va (3) BCG.HIVA2auxo.int L1:P18I10 VLP tomonidan qo'zg'atilgan OIV-1-maxsus T-hujayra immun javoblarini kuchaytirishi mumkin.
Shakl 7. BALB/c sichqonlarida kimerik L1:P8I10 VLP va BCG.HIVA tomonidan HPV16 va OIV-1ga xos T hujayra javoblarining induksiyasi. Emlash jadvali (A) da tasvirlangan. Barcha sichqoncha guruhlari teng jins taqsimotiga ega edi (erkak n=4 va ayol n=4). A guruhi: mushak ichiga 10 mkg L1:P18I10 VLP bilan gomologik prime-boost immunizatsiya (im); B guruhi: 106 cfu rBCG.HIVA intradermal (id) bilan astarlash va 10 mkg L1:P18I10 VLPs im bilan kuchaytirish; C guruhi: 10 mkg HPV16 L1 VLP ni o'z ichiga olgan Gardasil-9 bilan gomologik prime-boost emlash; D guruhi: PBS buferi bilan ikki marta immunizatsiya. Asosiy boost oralig'i 2 hafta edi. Ushbu sinovning yakuniy nuqtasi 28-kun edi. Splenotsitlar IFN-ELISpot tahlili uchun ajratildi. HPV16 va OIV-1 ga T-hujayralarining immun javoblari HPV16 L1 VLP va P18I10 peptidlari bilan splenotsit stimulyatsiyasidan keyin IFN-ELISpot yordamida ex vivo baholandi. (B, C) HPV16 L1- va OIV-1 P8I10-o‘ziga xos T-hujayra javoblari L1:P8I10 VLP va BCG.HIVA primi bilan birgalikda L1:P18I10 VLP kuchayishi bilan yuzaga keladi. Ma'lumotlar median ± SD sifatida ko'rsatilgan. Guruhlar orasidagi farqlarni solishtirish uchun bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi. Ns ahamiyatsiz; * p <0,05.
4. Diskussiya
HPV16 va OIV-1 ham jinsiy yo'l bilan yuqadigan kasalliklar bo'lib, hozirda ko'plab vaktsina tadqiqotlari markazida bo'lib turibdi. Garchi HPV profilaktik vaktsinalari tijoratlashtirilgan bo'lsa va OIV{2}} yuqishi antiretrovirus davolash (ART) va PrEP orqali katta darajada nazorat qilingan bo'lsa-da, samarali, xavfsiz va arzon kimerik HPV: ikkala virusga qarshi OIV vaktsinasi shoshilinch zaruratdir. Ushbu tadqiqotda (1) biz 293F ifoda tizimi va xromatografik tozalash usuli kimerik L1: P18I10 va L1: T20 VLPlarni ishlab chiqarish va tozalash uchun mumkin bo'lgan yondashuvlar bo'lishi mumkinligini ko'rsatdik; (2) biz P18I10 yoki T20 peptidlarini HPV16 L1 kapsid oqsillarining DE halqasiga kiritish kimerik HPV ning in vitro barqarorligi, o'z-o'zini yig'ishi va morfologiyasiga ta'sir qilmasligini tasdiqladik: OIV VLPs; (3) Kimerik HPV ning DE halqalariga ta'sir qilgan ketma-ket va konformatsion P18I10 yoki T20 peptidlari: OIV VLP'lari OIVga qarshi-1 gp120 V3 va 2F5 neytrallashtiruvchi antikorlar tomonidan in vitroda aniqlanishi mumkin; (4) Kimerik L1:P18I10 va L1:T20 VLPlar HPV ni keltirib chiqarishi mumkin, ammo BALB/c sichqonlarida zaif OIVga xos bog‘lovchi antikorlar. Bundan tashqari, HPV16 L1 oqsiliga OIV-1 P18I10 yoki T20 peptidlarining kiritilishi HPV16 L1-in vivo jonli ravishda o'ziga xos antikor induktsiyasiga ta'sir qilmagan; (5) L1:P18I10 VLPlar HPV16 va OIV-1-o'ziga xos T-hujayra javoblarini qo'zg'atishi mumkin; (6) BCG.HIVA prime va L1:P18I10 VLP kuchayishi BALB/c sichqonlarida L1:P18I10 VLP gomologik prime-boost bilan solishtirganda IFN hosil qiluvchi splenotsitlarning eng yuqori miqdorini keltirib chiqardi. Bu topilmalar rBCG va kimerik HPV: OIV VLPs asosidagi OIV{59}} vaktsinalarining keyingi rivojlanishini qo'llab-quvvatladi. Umuman olganda, ushbu tadqiqot HPV va OIV infektsiyalarini nazorat qilish uchun yangi kimerik VLP vaktsinalarini ishlab chiqish bo'yicha global sa'y-harakatlarni qo'llab-quvvatlashga loyiq bo'lishi mumkin bo'lgan asosiy strategiyani taqdim etadi.
Ushbu tadqiqotda L1:P18I10 va L1:T20 VLPlar HPV Gardasil{8}} vaktsinasi bilan bir xil darajadagi HPV16 L1 bog'lovchi antikorlarini keltirib chiqarishi mumkin. Biroq, L1: P18I10 va L1: T20 VLPlar faqat past darajadagi P18I10 va T20 epitopiga xos OIV-bog'lovchi antikor javoblarini keltirib chiqaradi. Bu Elishay tahlil plitalarining mos ravishda HPV16 L1 rekombinant oqsili, OIV-1 P18I10 peptid va OIV{24}} T20 peptidlari bilan qoplangani bilan bog'liq bo'lishi mumkin deb taxmin qildik. L1: P18I10 va L1: T20 VLP'larimiz tomonidan qo'zg'atilgan sichqonlarga qarshi L1 antikorlari L1 oqsilining bir nechta bog'lovchi epitoplarini nishonga olishi mumkin. Aksincha, bizning L1:P18I10 va L1:T20 VLPlarimiz tomonidan ishlab chiqarilgan sichqonlarning OIVga qarshi-1 antikorlari HPVda faqat bitta OIV peptidini (P18I10 yoki T20) maqsad qilib oladi: OIV VLP. Shunday qilib, anti-OIV-1 biriktiruvchi antikorlarning umumiy maksimal maksimal OD450 qiymatlari HPV16 L1 antikorlariga qaraganda ancha past edi.
Biz HPV16 L1 kapsid oqsili DE halqasini OIV-1 immunogenining dastlabki kiritish hududi sifatida tanlaganimiz sababi sichqonlarni sigir papillomavirusi (BPV) bilan immunizatsiya qilgan oldingi tadqiqotga ishora qildi: antikor reaktsiyalarini qo'zg'atish uchun OIV VLPlari [20]. Ma'lumki, HPV L1 asosiy kapsid oqsillarining sirt ta'sirida bo'lgan DE va FG halqalarida joylashgan epitoplar vaktsinani keltirib chiqaradigan o'zaro neytrallashuvchi antikorlarga dominant hissa qo'shadi [67]. Bundan tashqari, oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, OIV-1 MPERni BPV L1 DE halqasiga kiritish OIV-1 Env [20] da MPER ning tabiiy konformatsiyasini aniq taniydigan qisman neytrallashtiruvchi antikorlarni keltirib chiqarishi mumkin. Biroq, rekombinant BPV L1:MPER VLP immunogenlikka va OIV{14}} MPER BPV L1 oqsiliga kiritilgandan keyin BPVga qarshi neytrallanishga ta'sir qiladimi yoki yo'qmi, hech qanday ma'lumot ko'rsatilmagan. HPV16 L1 VLP larini OIV antijeni yetkazib berish vektori sifatida qo‘llagan tadqiqotimizda biz OIV{18}} peptidini kiritish HPV L1 tuzilishini o‘zgartirmaganini va kimerik HPV: OIV oqsillari hali ham VLP hosil qilish qobiliyatiga ega ekanligini kuzatdik. Bundan tashqari, biz HPV: OIV VLP nomzodi (bizning) va tasdiqlangan VLP asosidagi HPV vaktsinasi (litsenziyalangan Gardasil-9) o'rtasida taqqoslanadigan immun javoblarni ko'rsatish uchun immunobridging kontseptsiyasini amalga oshirdik. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, OIV-1 P18I10 yoki T20 peptidining kimerik HPVga kiritilishi: OIV VLP'lari HPV Gardasil bilan solishtirganda HPV16 L1-o'ziga xos bog'lovchi antikorlarining o'xshash titrini keltirib chiqarishi mumkin-9 vaktsina. Litsenziyalangan HPV Gardasil-9 VLP vaktsinasi bilan HPV Gardasil-9 VLP vaktsinasining kimerik versiyalari bilan solishtirganda, turiga xos anti-HPV16 L1 bog‘lovchi antikorlar bizning ma’lumotlarimizga mos keldi.
HPV16 L1 VLP tarkibiga kiritilgan optimal OIV-1 xorijiy antigenining uzunligi va joylashuvi va natijada paydo bo‘lgan kimerik HPV: OIV VLP ning in vitro barqarorligi sichqonlarni immunizatsiya qilishdan oldin tekshirilishi kerak. Hozirgi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, P18I10 yoki T20 peptidlarini HPV16 L1 oqsiliga kiritish kimerik HPV: OIV VLP ning in vitro barqarorligi, o'z-o'zini yig'ishi va morfologiyasiga ta'sir qilmagan. Bu natijalar OIV{9}} MPER domenini BPV L1 DE halqa ketma-ketligiga kiritish BPV L1 kapsid oqsilining VLP larga o'z-o'zini yig'ish qobiliyatiga ta'sir qilmasligini ko'rsatadigan oldingi tadqiqotlarga mos keldi [20]. Asosan, HPV L1 kapsid oqsillarining DE va FG halqalarida joylashgan epitoplar L{16}}o'ziga xos o'zaro neytrallashuvchi antikorlarni qo'zg'atishga yordam beradi [67]. Bu yerda biz HPV16 L1 DE halqasiga OIV{19}} P18I10 yoki T20 peptidlarining kiritilishi sichqonlar immunizatsiyasidan so‘ng kimerik HPV: OIV VLPs tomonidan L{25}}o‘ziga xos antikor induktsiyasiga ta’sir qilmasligini ko‘rsatdik. Bundan tashqari, OIV-1 P18I10 yoki T20 epitoplari kimerik HPV ning HPV16 DE halqalarida: OIV VLPlari in vitroda aniqlangan va in vivo jonli ravishda immunogen edi. HPV16 L1 VLPs OIV{33}} epitopini yuzaga chiqarish uchun potentsial asos bo'lib xizmat qiladi. Ushbu tadqiqotda biz kimerik HPV yuzasida taqdim etilgan konformatsion P18I10 va T20 peptidlarini ko'rsatish uchun bilvosita Elishayni o'tkazdik: OIV VLP. Kelajakda immun-elektron mikroskopiya ham P18I10 yoki T20 antijenining strukturaviy lokalizatsiyasini va HPV: OIV VLPs doirasida tashkil etilishini ko'rsatish uchun qo'shimcha yondashuv bo'lishi mumkin.
O'z-o'zini yig'ish HPV16 L1 VLPlarning in vitro barqarorligining vakili indeksidir. Ma'lumki, pH, ion kuchi, harorat [52] va oksidlanish-qaytarilish muhiti HPV16 L1 kapsid oqsillarining disulfid aloqalari bilan bog'liqdir [53]. Papillomavirus VLPlari bo'yicha oldingi ishlar L1 asosiy kapsidni o'z-o'zini yig'ish uchun disulfid aloqalarining muhimligini ko'rsatdi [68,69]. Disulfid shakllanishi tegishli geometriyada L1 kapsid oqsilining yuqori sisteinini ko'rsatdi [53]. Ushbu disulfid o'zaro bog'liqliklari HPV virionlari va VLP ni barqarorlashtiradigan 175 va 428 (HPV16 uchun) qoldiqlarini bog'laydi [70]. Ushbu tadqiqotda biz L1: P18I10 va L1: T20 kapsid oqsillarini in vitroda o'z-o'zidan yig'ilishga moyilligini isbotlash uchun bilvosita dalil sifatida molekulalararo disulfid o'zaro bog'lanish naqshlarini tahlil qildik. Shakl 3A da biz tozalangan L1: P18I10 va L1: T20 VLP'lar bir xil pH, ion quvvati va termal sharoitlarda HPV16 L1 VLP kabi o'xshash molekulalararo disulfid o'zaro bog'lanish naqshlarini taqdim etishini ko'rsatdik. 3B-rasmda biz tozalangan L1: P18I10 va L1: T20 oqsillari in vitroda kattaroq zarrachalarga (L1 pentamer MW 280 kDa dan kattaroq) o'z-o'zini yig'ish qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatdik. Shuning uchun, 4-rasmda kuzatilgan morfologik o'z-o'zini yig'ish VLP namunasi (ikosahedral tuzilma unchalik yaxshi bo'lmasa-da) bilan birgalikda biz tozalangan kimerik HPV xulosasiga keldik: OIV VLPs in vitro barqaror. VLP barqarorligidan tashqari, kimerik HPV ning immunogenligiga ta'sir ko'rsatishi mumkin bo'lgan boshqa ko'plab muhim omillar: OIV VLP'larini hisobga olish kerak, masalan, VLP ning turli qovuzloqlari orasida immunogenni kiritish joyi [71], dozasi, asosiy oshirish oralig'i va yuborish yo'li [22] , va boshqalar.
OIV-1 gp120 V3 halqasidan olingan P18I10 peptidlari OIV bilan kasallangan hujayralarda asosiy gistomoslashuv kompleksi (MHC-I) I sinf molekulalari tomonidan taqdim etiladi [26]. CD8+, sitotoksik T-limfotsitlar (CTL) MHC-I bilan cheklangan P18I10 antijenlarini tanib olishi va OIV bilan kasallangan hujayralarni yo'q qilish uchun IFN- kabi turli sitokinlarni ajratishi mumkin [72-75]. Rekombinant virusli yoki plazmid DNK P18I10 peptidlarini xost hujayralarida eksprese qilish va MHC-I yo'li orqali P18I{20}}o'ziga xos hujayra javoblarini qo'zg'atish uchun yaxshi vaktsina vositalaridir [76-79]. Masalan, P18I10 epitopiga qarshi IFN va CTL javoblarini qo'zg'atish uchun DNK prime va modifikatsiyalangan emlash virusi Anqara (MVA) qo'shma sxemasi etarli edi [79]. Aksincha, ekzogen P18I10 peptidlari MHC-I yo'li [80,81] orqali CD8+ T-hujayralariga samarali tarzda taqdim etilmaydi va tegishli adjuvantlar [82-85] yoki antigen tashuvchilar ishtirokini talab qiladi, masalan. VLP. Masalan, adjuvantlar bilan to'ldirilgan sintetik P18I10 peptidlarining immunogenligi T-yordamchi determinantlari yo'qligi sababli chegaralangan edi [82-85]. Avvalroq OIV-1 Gag VLP [86], gepatit B sirt antijeni (HBsAg) VLP [87], parvovirus VP2 VLP [88] va papillomavirus L1 VLP [17-19] haqida xabar berilgan edi. MHC-I-cheklangan CTL epitopining in vivo taqdimoti uchun etkazib berish vektori sifatida harakat qilishi mumkin. VLP tomonidan qo'zg'atilgan MHC-I bilan cheklangan T-hujayra reaktsiyalarining mexanizmi hali ham noaniq bo'lsa-da, VLP ning zarracha tuzilishi makrofaglar yoki dendritik hujayralarning endositik so'rilishiga yordam berishi mumkin, shu bilan sitozolga kirish va keyinchalik odatiy MHC-I yo'liga kiradi [89, 90]. Bundan tashqari, MHC-I bilan cheklangan P18I10 determinanti MHC-II yo'li orqali CD4+ yordamchi T-hujayra javoblarini keltirib chiqarishi kuzatildi [91,92]. Gibrid BPV1 L1 VLPlar MHC-I va MHC-II yo'llari [17,19] orqali terapevtik virusga xos CTL javoblarini olish uchun antijenik epitop tashuvchilar sifatida ishlatilishi mumkin, bu virusli infektsiyani nazorat qilish uchun vaktsina dizayni uchun istiqbolli strategiyani ta'minlaydi. Ba'zi dastlabki tadqiqotlar, shuningdek, HPV16 E7 epitopini yoki OIV{80}} gp120 V3 ning P18I10 epitopini, shuningdek, VLP epitopiga xos humoral va T hujayralarining tizimli immunitetini ifodalovchi BPV L1 VLP larini ko'rsatdi [18]. Oldingi tadqiqotlarga muvofiq, biz oldindan ko'rsatdik, bizning kimerik HPV: OIV (L1: P18I10) VLP'larimiz P18I10 peptidi bilan splenotsit stimulyatsiyasidan keyin BALB/c sichqonlarida OIVga xos T-hujayra immun javoblarini keltirib chiqarishi mumkin. Bundan tashqari, BCG.HIVA primingi sichqonlarda OIV-1-maxsus T-hujayralarining immun javoblarini kuchaytirdi. Biroq, L1: P18I10 VLP tomonidan qo'zg'atilgan ko'p funktsiyali T-hujayra immun javoblari qo'shimcha immunologik tadqiqotlarni talab qiladi.
Bir nechta saqlanib qolgan CTL epitoplariga nisbatan kengroq CD8+ T-hujayra javoblari OIV-1 genetik xilma-xilligini yengish va undan qochish uchun foydalidir [7,93-100]. OIV{6}} T-hujayra immunogenlarining oqilona dizayni, masalan, HIVA, bir nechta CTL epitoplariga javob berish potentsialiga ega bo'lishi kerak [34]. Doktor Tomas Xanke tomonidan ishlab chiqilgan OIV-1 HIVA immunogeni toʻliq uzunlikdagi OIV-1 Gag oqsilidan iborat boʻlib, bir nechta CTL epitoplari, jumladan, C-terminalidagi P18I10 epitoplari bilan birlashtirilgan [34]. DNK, MVA va rBCG HIVA immunogen yetkazib beruvchi vositalar sifatida tanlandi va sichqoncha va noinson primat (NHP) modellarida heterolog asosiy kuchaytiruvchi rejimlardan foydalangan holda CTL epitopiga xos hujayrali javoblarning yuqori kattaligi va kengligini keltirib chiqardi [34,101]. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, BCG.HIVA prime MVA.HIVA bilan birgalikda BALB/c sichqonlarida OIV-1-maxsus IFN hosil qiluvchi CD{23}} T-hujayralarini kuchaytiradi [31-33,102]. Qizig'i shundaki, VLPlar rBCG [29,30] yoki DNK vaktsinalari [103,104] bilan heterolog immunizatsiyada OIVga xos hujayrali javoblarni oshirish uchun potentsial kuchaytiruvchi bo'lishi mumkin. Misol uchun, OIVni ifodalovchi rBCG-1 Gag oqsili NHP modellarida Gag VLP yordamida T-hujayra immun tizimini faol ravishda kuchaytirishi mumkin [29,30]. Joriy tadqiqotda biz BCG.HIVA primingi HPV: OIV (L1:P18I10) VLP tomonidan qo'zg'atilgan T-hujayra immun javoblarini kuchaytirishi mumkinligini ko'rsatdik. Biz ushbu rBCG prime va VLP kuchaytiruvchi rejim tomonidan yaratilgan koʻp funksiyali CD4+, CD8+ va xotira T-hujayralarining javoblari hajmini yanada oʻrganamiz.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
Hozirda bizning tadqiqot guruhimiz OIVni yaxshilash uchun tHIVconsvX va HIVACAT (HTI) T-hujayra immunogeni kabi yangi OIV-1 T-hujayra immunogenlarini ifodalovchi istiqbolli rBCG: OIVga qarshi vaktsinalar yaratishga eʼtibor qaratmoqda-1 variant mosligi va T-hujayra javob kengligi. 2-avlod HIVconsvX immunogenlari M guruhining saqlanib qolgan hududlarini qayta aniqlash va vaktsinadagi potentsial 9-mer T-hujayra epitoplarining global variantlarga mos kelishini maksimal darajada oshirish uchun bivalent mozaikadan foydalangan holda ishlab chiqilgan [64]. HTI immunogeni T-hujayra nishonlarini qoplash uchun moʻljallangan boʻlib, ularga nisbatan T-hujayralarining javoblari asosan OIV-1-infektsiyasi past OIV{13}} virusli yuklangan shaxslarda kuzatiladi [65,66]. Papilloma VLP bir nechta CTL epitop tashuvchisi ekanligi isbotlanganligi sababli [17], biz kengroq induktsiya qilish uchun ThivconsvX yoki HTI T-hujayra immunogenlarini ifodalovchi rBCG bilan birgalikda bir nechta saqlanib qolgan OIV{19}} CTL epitoplarini tashuvchi kimerik HPV16 L1 VLP larni yaratishni maqsad qildik. OIVga qarshi CTL immun javoblari-1. Kimerik HPVda taqdim etilgan OIV-1 CTL epitopining yuqori zichligi va bir nechta nusxalari: OIV VLP immun tizimiga antigen yetkazib berishni yaxshilashi va CTL reaktsiyalarining yuqori chastotasini keltirib chiqarishi mumkin. Aksincha, rekombinant BCG in vivo sekin replikatsiya tufayli CTL javoblarining past chastotasini hosil qilish ehtimoli ko'proq. Chunki BCG T hujayralarining differentsiatsiyasiga aniq ta'sir qiladi, ya'ni BCG CD8+ T-xujayralari [105] ishtirokida CD8+ T-hujayralari xotirasini qo'zg'atishi mumkin, bu immunogen xususiyatga ega. BCG ni heterolog prime-boost rejimlarida astarlovchi vosita sifatida moslashtirishi mumkin. Shunday qilib, biz HPV: OIV VLPlarimiz yangi OIV-1 T-hujayra immunogenini ifodalovchi rekombinant BCG bilan astarlanganda OIV-1 CTL javoblarining kattaligi va kengligini oshirish uchun istiqbolli kuchaytiruvchi bo‘lib ko‘rinishini kutgandik. .
T20 peptidida yuqori darajada saqlanib qolgan chiziqli epitop 2F5 (ELDKWA) mavjud. Uzoq muddatli OIV bilan kasallangan bemorlardan to'plangan 2F5 antikori keng miqyosda neytrallash samaradorligiga ega ekanligi xabar qilindi [106,107]. Gp41 ning MPER kam immunogen hisoblanadi, ehtimol uning hujayrali va virusli fosfolipid ikki qavatiga yaqin joylashishi bilan bog'liq [108]. Lipit muhitda MPERni taqdim qiluvchi DNK vektorlaridan foydalanish gp{11}}maxsus nAbs [109–111] ni keltirib chiqarish uchun foydalidir. Masalan, doktor Britta Varen tomonidan ishlab chiqilgan OIV-1 T20-kodlovchi DNK vaktsinalari oʻzaro faoliyat neytrallovchi antikor (nAb) javoblarini keltirib chiqarishi koʻrsatilgan [109]. Aksincha, peptid yoki subunit vaktsina strategiyalaridan foydalangan holda gp41 ga qaratilgan nAbsni qo'zg'atish bo'yicha ko'plab dastlabki urinishlar muvaffaqiyatsizlikka uchradi [112-116]. Yaqinda ba'zi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, sichqonlarda 2F5 epitopi yoki OIV{24}} gp41 tomonidan qo'zg'atilgan 2F{27}}o'ziga xos antikorlarni ifodalovchi BPV L1 VLPlari o'zaro faoliyat neytrallanishga olib kelgan [20,21]. Gepatit B sirt antijeni (HBsAg) OIV-1 2F5 epitopi yoki MPER [59,117-119] bilan birlashganda xuddi shunday immunogenlik namunasi topilgan. Bu yerda biz ximerik HPV16 L1 VLP tarkibida OIV-1 T20 va P18I10 peptidlarining taqdim etilishi OIV-1 va HPV16 ga qarshi antikor javoblarini keltirib chiqarishi mumkinligini ko‘rsatdik. OIV{44}} funktsional tikanlar yoki VLPlar kabi konformatsion iskala ustida barqarorlashtirilgan neytrallashtiruvchi epitoplar keng neytrallashtiruvchi antikorlarga (bnAbs) erishish uchun B-hujayra immunogen dizaynining asosiy oqimi bo'lishi mumkin [93]. Biroq, ko'pchilik yangi bnAb epitoplari (taxminan 90%) doimiy bo'lmagan va 3-o'lchovli konfiguratsiyalarda birlashtirilgan [120] tashkil topgan hududlardir. Protein iskalasida uzluksiz epitoplarning ko'rinishini hisoblash modellashtirish orqali bashorat qilish mumkin bo'lsa-da [121], bu bnAb epitoplari konvertsiz HPV16 L1 oqsil skafoldiga o'rnatilishi mumkin. Aksincha, OIV-1 B-hujayra immunogenlarining ozchiligi, masalan, OIV-1 gp41 ning MPER (2F5) yoki gp120 ning V3 halqasi (P18IIB) chiziqli neytrallashtiruvchi epitoplarni o'z ichiga oladi va ular uchun mos bo'lishi mumkin. HPV: OIV oqsili orqa miya. Shuning uchun biz spiral shakllanishi uchun qulay tuzilish nuqtai nazaridan OIV{67}} MPER kengaytirilgan T20 peptidiga kiritilgan chiziqli 2F5 neytrallashtiruvchi epitopni tanladik [122]. T20 peptidlari, agar 2F5 epitopining tabiiy konfiguratsiyasi taqdim etilgan bo'lsa, neytrallashtiruvchi antikor javoblarini olish uchun L1 kapsid iskalalarida birlashtirilishi va barqarorlashishi mumkin. Ushbu tadqiqotda biz 2F5 nAbs ximerik HPV: OIV (L1: T20) VLPs in vitro bilan bog'langanligini aniqladik. Bundan tashqari, L1:T20 VLPlar BALB/c sichqonlarida T20-maxsus bog‘lovchi antikorlarni ham qo‘zg‘atishi mumkin. OIV{81}} termoyadroviy inhibitör (T20) peptidlari tomonidan qo‘zg‘atilgan antikorlar gp41 ning MPERida joylashgan hidrofobik trans-membran T20 qoldig‘ini bog‘lash uchun anti-OIV-1 termoyadroviy peptid Enfuvirtid bilan o‘xshash xususiyatlarga ega ekanligi to‘g‘risida dalillar ortib bormoqda. OIV{89}} sintezi va virus nazoratiga hissa qo'shadi [109,123,124]. Oldingi sharhlarimizga ko'ra, HPV va OIVga xos neytrallashtiruvchi antikor va CTL javoblarini qo'zg'atish uchun kimerik VLP asosidagi vaktsinalarning oqilona dizayni har doim immunogen tanlash, antigenni etkazib berish vektorlari va asosiy kuchaytirish rejimlari nuqtai nazaridan ko'rib chiqilishi kerak. Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, ushbu tadqiqot sutemizuvchilar hujayralariga asoslangan muqobil ifoda platformasi va kimerik HPV: OIV VLP ni yaratish uchun kengaytiriladigan xromatografik tozalash usulini ko'rsatdi. Bizning yangi tozalash usullarimiz antijenik HPV: OIV VLPlarini sut emizuvchilar hujayralaridan tiklashga yordam beradi, deb hisoblaymiz, bu maqsadda vaqtni, xarajatlarni va mehnatni qisqartirish va sanoat ishlab chiqarish quvvatini oshirish. Bundan tashqari, biz HPV16 L1 VLPs sifatida ishlashi mumkinligini ko'rsatdik. P18I10 yoki T20 peptidlarining HPV16 L1 kapsid oqsillarining DE halqasiga kiritilishi kimerik HPV ning in vitro barqarorligi, o‘z-o‘zini yig‘ishi va morfologiyasiga ta’sir qilmagani uchun OIV-1 peptid antigenini yetkazib berish platformasi: OIV VLP’lari in vivo HPV16 L1-maxsus antikor induksiyasiga xalaqit bermang. Boshqa tomondan, kimerik HPV: OIV VLPlari HPV16 va OIVga xos B va T-hujayralarining ikkala virusga qarshi immun javoblarini keltirib chiqarishi mumkin. Bu hisobotda OIV-1 immunogenlarini ifodalovchi rekombinant BCG va HPV: OIVga qarshi emlashda foydalanish mumkin bo‘lgan OIV-1 vaksinalarini ishlab chiqish imkoniyatlari o‘rganildi. HPV16 va OIV-1 ga qarshi samarali kimerik vaktsinani ishlab chiqish hali ham qiyin bo'lganligi sababli, bu ish yangi kimerik HPV ning rivojlanishiga qadam qo'yadi: HPV16 va OIVni nazorat qilish uchun OIV VLP asosidagi vaktsina platformasi{{118} }} infektsiya, bu rivojlanayotgan va sanoati rivojlangan mamlakatlarda zudlik bilan zarur.
Ma'lumotnomalar
1. UNAIDS Global OIV va OITS statistikasi-2018 Fact Sheet. 2019. Onlaynda mavjud: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (kirish 2020-yil 15-iyun).
2. Baeten, JM OIV uchun PrEP: dalil uchun A darajasi, ammo ta'sir kutilmoqda. Nat. Ruhoniy Orol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]
3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaevkungval, J.; Chiu, J.; Parij, R.; Premsri, N.; Namvat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; va boshqalar. Tailandda OIV-1 infektsiyasining oldini olish uchun ALVAC va AIDSVAX bilan emlash. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]
4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM OIV vaktsinasini ishlab chiqishdagi asosiy ilmiy to'siqlar: tarixiy istiqbol va kelajak yo'nalishlari. Old. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]
5. Robinson, HL OIV / OITSga qarshi emlashlar: 2018. Klin. Farmakol. U erda. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]
6. Vang, Q.; Chjan, L. Keng neytrallashtiruvchi antikorlar va OIV-1 infektsiyasiga qarshi vaktsina dizayni. Old. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]
7. Kollinz, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ OIVni nazorat qilish, davolash va oldini olishda T hujayralari. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]
8. Pollard, AJ; Bijker, EM Vaktsinologiya bo'yicha qo'llanma: asosiy tamoyillardan yangi ishlanmalargacha. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]
9. Shapiro, SZ OIV vaktsinasini ishlab chiqish urinishlaridan umumiy vaktsinologiya tadqiqotlari uchun darslar. Vaktsina 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]
10. Ahmad, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Bachadon bo'yni saratoni bilan og'rigan Yaman bemorlari orasida inson papillomavirusi 16 va 18 pastki turlarining tarqalishi. Osiyo Tinch okeani J. Saraton Oldingi. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]
11. Olcese, VA; Chen, Y.; Shlegel, R.; Yuan, H. Tipga xos, konformatsion epitopni shakllantirishda HPV16 L1 halqa domenlarining xarakteristikasi. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]
12. Dupuy, C.; Buzoni-Geyt, D.; Tuz, A.; Le Kann, P.; But, D.; Coursaget, P. HPV 16 L1 virusiga o'xshash zarrachalar tomonidan sichqonlarda induktsiya qilingan hujayrali immunitet. Mikrob. Patog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]
13. Shiller, J.; Lowy, D. HPV profilaktik vaktsinalarining yuqori quvvati uchun tushuntirishlar. Vaktsina 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]
14. Markowitz, LE; Schiller, JT Inson papillomavirusiga qarshi vaktsinalar. J. Yuqtirish. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]
15. Chen, CW; Saubi, N.; Jozef-Munne, J. Virusga o'xshash zarrachalar asosidagi OIV-1 vaktsinalarining dizayn konsepsiyalari. Old. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]
16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Jozef, J. Inson papillomavirusi va OIV uchun kimerik virusga o'xshash zarrachalarga asoslangan vaktsinalarni loyihalash: O'rganilgan saboqlar. OITS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]
17. Liu, WJ; Liu, XS; Chjao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Papillomavirus virusiga o'xshash zarrachalar bir nechta sitotoksik T hujayra epitoplarini etkazib berish uchun. Virusologiya 2000, 273, 374–382. [CrossRef]
18. Liu, XS; Abdul-Jabbor, I.; Qi, YM; Freyzer, IH; Zhou, J. Papillomavirus virusiga o'xshash zarrachalar bilan mukozal immunizatsiya sichqonlarda tizimli va shilliq immunitetni keltirib chiqaradi. Virusologiya 1998, 252, 39-45. [CrossRef]
19. Peng, S.; Freyzer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Papillomavirus virusiga o'xshash zarrachalar aniqlangan CTL epitoplarini MHC sinf I yo'liga etkazishi mumkin. Virusologiya 1998, 240, 147–157. [CrossRef]
20. Chjay, Y.; Chjon, Z.; Zarifard, M.; Nayza, GT; Qiao, L. OIV-1 gp41 ning membrana-proksimal tashqi hududidan saqlanib qolgan epitoplarni taqdim qiluvchi sigir papillomavirusiga o'xshash zarralar shilliq qavat va tizimli antikorlarni keltirib chiqardi. Vaktsina 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]
21. Chjan, X.; Huang, Y.; Fayad, R.; Nayza, GT; Qiao, L. Sigir papillomavirusi-OIV-1 gp41 kimerik virusga o'xshash zarrachalar bilan og'iz orqali emlash orqali odamning immunitet tanqisligi virusi 1 (OIV-1) ga qarshi shilliq qavat va tizimli neytrallashtiruvchi antikorlarni induktsiya qilish. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]
22. Xiao, SL; Ven, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Kimerik BPV1 VLP ni qo'llash yo'nalishi induktsiya qilingan immun javoblarning xarakterini aniqlaydi. Immunol. Hujayra Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]
23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, HEATER; Roden, RICHARD; Dyurst, M.; Gissmann, L.; Loui, DR; Schiller, JT 16 LI va L{3}}L2 tipidagi inson papillomavirusining virusga o'xshash zarrachalarga samarali o'z-o'zini yig'ishi. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]
24. Chjao, Q.; Potter, CS; Karrager, B.; Lander, G.; Qasamyod, J.; Taun, V.; Ibrohim, D.; Dunkan, P.; Washabaugh, MVt; Sitrin, RD GARDASIL® dagi virusga o'xshash zarrachalarning kriyotransmissiya elektron mikroskopiyasi orqali tavsifi. Hum. Vaktsinalar Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]
25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Pikard, O.; M'bika, JP; Zaguri, JF; Mukrim, Z.; Viller, A.; Beix, F.; Berni, A.; Zagury, D. HLA-A11-immunlangan shaxsda OIVga xos sitotoksik T-limfotsitlar-1 gp160 antigen va sintetik P18IIIB peptid. OITS Res. Hum. Retroviruslar 1994, 10, 19-25. [CrossRef]
26. Nakagava, Y.; Kikuchi, X.; Takaxashi, H. TCR va peptid/MHC oʻzaro taʼsirining molekulyar tahlili P18-I10-oluvchi peptidlar yordamida bitta D-aminokislota oʻrnini bosuvchi. Biofizika. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]
27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; U, Y. OIVning N-trimerida pastki cho'ntakning identifikatsiyasi va tavsifi-1 Gp41: Virusli kirish va dori maqsadiga ta'siri. Yordamchi vositalar 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]
28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Kallow, D.; Foksal, R.; Patu, G.; Xojkin K.; Weber, JN asemptomatik OIV seropozitiv sub'ektlarda OIV p17/p24:VLP (p{4}}VLP) ning xavfsizligi va immunogenligini o'rganish bo'yicha ikkinchi bosqich pilot bosqichi. J. Yuqtirish. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]
29. Chege, GK; Burgers, VA; Stuts, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; va boshqalar. Noinsoniy Primat modelidagi BCG-VLP Prime-Boost OIVga qarshi emlash nomzodiga auksotrofik mikobakteriya bovisga mustahkam immunitet. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]
30. Chege, GK; Tomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Born, V.; Uilyamson, C.; Maklin, J.; Kulrang, CM; Rybicki, EP; Uilyamson, AL OIV 1-toifa S kichik turiga asoslangan rekombinant BCG va Pr55gag virusiga o'xshash zarracha vaktsinalaridan foydalangan holda asosiy kuchaytiruvchi immunizatsiya rejimi babunlarda Gagga xos javoblarni muvaffaqiyatli keltirib chiqaradi. Vaktsina 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]
31. Jozef, J.; Saubi, N.; Im, EJ; Fernandes-Lloris, R.; Gil, O.; Kardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Yangi tug'ilgan sichqonlarni BCG.HIVA222 + MVA.HIVA bilan emlash OIV-1-maxsus immun javoblarini kuchaytiradi: yosh va immunizatsiya yo'llarining ta'siri. Klin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]
32. Saubi, N.; Xea-Mallorki, E.; Ferrer, P.; Xurtado, C.; Sanches-Ubeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Jozef, J. BCG lizin auksotrofi tomonidan vektorlangan OIV-TB pediatrik vaktsina uchun yangi mikobakterial vaktsina dizayni. Mol. U erda. Usullari Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]
33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Gitar, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Jozef, J. OIV-TB Pediatrik vaktsina uchun integral ifoda vektorini o'z ichiga olgan BCG.HIVA2auxo.int ning klinikgacha rivojlanishi. Barqarorlik va o'ziga xos OIV-1 T-hujayra immunitetini oshirish. Hum. Vaktsinalar Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]
34. Xanke, T.; McMichael, AJ Keniyada bir yillik klinik sinov-2000 uchun eksperimental OIV{1}} vaktsinasini loyihalash va qurish. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]
35. Dyurocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Suspenziya o'sib borayotgan inson 293- EBNA1 hujayralarini vaqtincha transfeksiya qilish orqali yuqori darajadagi va yuqori samarali rekombinant oqsil ishlab chiqarish. Nuklein kislotalari Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]
36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Li, SJ; Kim, HJ Saccharomyces cerevisiae dan inson papillomavirusi turi 16 L1 oqsilini bir bosqichli xromatografik tozalash. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]
37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Jozef-Munné, J. Pichia pastorisida ximerik HPV-OIV oqsili L1P18 ifodasi; virusga o'xshash zarralarni tozalash va tavsiflash. Farmatsevtika 2021, 13, 1967. [CrossRef]
38. GE. CaptoTM Core 700 va Capto Q ImpRes dan inson papilloma virusiga o'xshash zarrachalarni tozalashda foydalanish. J. Asia's Pharm. Biofarma. Ind. 2014, 1–4.
39. Maklin, CS; Chercer, MJ; Maynke, J.; Smit, GL; Xiggins, G.; Stenli, M.; Minson, AC Rekombinant emlash virusidan foydalangan holda 16-toifa inson papillomavirusiga monoklonal antikorni ishlab chiqarish va tavsiflash. J. Klin. Patol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]
40. Merck Canada Inc. Mahsulot monografiyasi Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.
41. Achour, A.; Persson, K.; Xarris, RA; Sundbek, J.; Sentman, CL; Lindkvist, Y.; Shnaydes, G.; Kärre, K. H-2D(d) MHC I sinfining kristall tuzilishi 2,4 Å o'lchamdagi OIV-1- olingan peptid P18-110 bilan komplekslangan: T hujayra va NK hujayra uchun ta'siri tan olish. Immunitet 1998, 9, 199–208. [CrossRef]
42. Pang, V.; Tom, SC; Zheng, YT Hozirgi peptid OIV turi-1 termoyadroviy inhibitörleri. Antivir. Kimyo. Kimyoviy. 2009, 20. [CrossRef]
43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Kasini, G.; Harrison, SC Inson papillomavirusining L1 oqsilidan yig'ilgan kichik virusga o'xshash zarrachalarning tuzilishi 16. Mol. Hujayra 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]
44. Kun, PM; Weisberg, AS; Tompson, CD; Xyuz, MM; Pang, YY; Loui, DR; Schiller, JT Inson papillomavirusi 16 kapsidlari infektsiya paytida yadroviy kirishga vositachilik qiladi. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]
45. Chjou, J.; Eshik panjarasi, J.; Quyosh, XY; Krouford, LV; Maklin, CS; Frazer, IH Inson papillomavirusi 16-toifa L1 oqsilining yadroviy lokalizatsiya signalini aniqlash. Virusologiya 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]
46. Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Virusga o'xshash zarrachalarni bioprocessing: Qiyinchiliklar va imkoniyatlar. Farm. Bioprocess. 2013, 1, 407–409.
47. Bousargin, L.; Tuze, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. 16-toifa inson papillomavirusi kapsid oqsillarining musbat zaryadlangan ketma-ketligi geparan sulfat retseptorlari orqali maqsadli hujayralarga gen o'tkazilishiga vositachilik qilish uchun etarli. J. General Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]
48. Sasagava, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nosir Hajibageri, MA; Finch, J.; Krouford, L.; Tommasino, M. Schizosakcharomyces pombe bo'linish xamirturushida 6 va 16 turdagi inson papillomaviruslarining virusga o'xshash zarralarini sintez qilish va yig'ish. Virusologiya 1995, 206, 126-135. [CrossRef]
49. Biemelt, S.; Sonnevald, U.; Galmbaxer, P.; Vilmitzer, L.; Myuller, M. Transgen o'simliklarda inson papillomavirusi 16-toifa virusga o'xshash zarrachalarni ishlab chiqarish. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]
50. Zahin, M.; Joh, J.; Xonal, S.; Husk, A.; Meyson, H.; Varzecha, X.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Tamaki barglaridan HPV16 L1 oqsili va VLP ning miqyosli ishlab chiqarilishi. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]
51. Ayres, KA; Cianciarullo, AM; Karneyro, SM; Villa, LL; Bokkardo, E.; Peres-Martines, K.; Peres-Arellano, I.; Oliveyra, MLS; Ho, PL Rekombinant Lactobacillus casei hujayralari tomonidan inson papillomavirusi turi 16 L1 virusga o'xshash zarrachalarni ishlab chiqarish. Ilova. Atrof. Mikrobiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]
52. Shank-Retzlaff, ML; Chjao Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Oliy, K.; Nguyen, M.; Vang, F.; Vang, N.; Vang, B.; Vang, Y.; va boshqalar. Gardasil® ning termal barqarorligini baholash. Hum. Vaktsina. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]
53. Mukerji, S.; Torsteinsson, MV; Jonston, LB; DePhillips, Pensilvanya; Zlotnik, A. Inson papillomavirusi 16 virusga o'xshash zarrachalarning In Vitro yig'ilishining miqdoriy tavsifi. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]
54. Makkarti, deputat; Oq, WI; Palmer-Xill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA In vitroda inson papillomavirusi 11-toifa virusga o'xshash zarrachalarni miqdoriy qismlarga ajratish va qayta yig'ish. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]
55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Loui, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 asosiy kapsid oqsili o'z-o'zidan virusga o'xshash zarrachalarga aylanadi, ular juda immunogendir. Proc. Natl. akad. Sci. AQSh 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]
56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Immunogenik inson papillomavirusi-16 virusga o'xshash zarrachalardan olingan asosiy kapsid oqsilini ishlab chiqarish. Hindistonlik J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.
57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Vang, B.; Graham, TL; Vang, N.; Volkin, DB Noion bo'lmagan sirt faol moddalar bilan inson papillomavirusi virusiga o'xshash zarralarni barqarorlashtirish. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]
58. Karter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Kristensen, Shimoliy Amerika; Galloway, DA Inson papillomavirusi turini aniqlash 16-Kapsid L1 asosiy oqsilining C-terminal qo'lidagi o'ziga xos epitop. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]
59. Fon Brunn, A.; Brend, M.; Reyxxuber, K.; Morys-Vortmann, C.; Deynhardt, F.; Schdelt, F. OIV-I ning asosiy neytrallashtiruvchi domeni gepatit B yadrosi zarralari yuzasida ifodalanganda yuqori immunogendir. Vaktsina 1993, 11, 817–824. [CrossRef]
60. Dennison, SM; Anasti K.; Scearce, RM; Sazerlend, L.; Parklar, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorniy, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; va boshqalar. Neytral bo'lmagan OIV-1 gp41 Konvert klasteri II Inson monoklonal antikorlari fosfolipidlar va oqsil autoantigenlari bilan bog'lanish uchun polireaktivlikni ko'rsatadi. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]
61. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fisher, M.; Leemann, C.; Manrike, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oksenius, A.; va boshqalar. Antiretrovirus terapiya to'xtatilgandan so'ng, odam neytrallashtiruvchi antikorlarini passiv o'tkazish orqali OIV-1 tiklanishining kechikishi. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]
62. Shank-Retzlaff, M.; Vang, F.; Morli, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Braun, M.; Rouland, K.; Pankari, G.; Zorman, J.; Lou, R.; va boshqalar. Sichqoncha kuchi va inson papillomavirusi 16-toifa virusga o'xshash zarralar va Gardasil vaktsina namunalari uchun in vitro nisbiy quvvati o'rtasidagi bog'liqlik. Hum. Vaktsina. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]
63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubi, N.; Soto, CY; Jozef Munne, J. Rekombinant Mycobacterium bovis BCG asosidagi OIVga qarshi vaktsinani ishlab chiqishdagi yutuqlar va muammolar: O'rganilgan saboqlar. Ekspert Rev. Vaktsinalar 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]
