Buyrak rivojlanishida nefron progenitor hujayralarida xromatinning mavjudligi va mikroRNK ifodasi

Batafsil ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Endryu Klugston^1,2,3, Endryu Bodnar^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6, Alissa Louler^8,9,10, Kristi Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10, Jaklin Xo^2,3*va Dennis Kostka^1,4*

¹Rivojlanish biologiyasi kafedrasi, Pitsburg universiteti tibbiyot maktabi, Pitsburg, PA, AQSh²Rangos tadqiqot markazi, Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasi, Pitsburg, PA, AQSh³Pediatriya kafedrasi, Nefrologiya bo'limi, Pitsburg tibbiyot fakulteti universiteti, PA, AQSh⁴Hisoblash va tizim biologiyasi kafedrasi va Pitsburg evolyutsion biologiya va tibbiyot markazi, Pitsburg universiteti tibbiyot maktabi, Pitsburg, PA, AQSh⁵Genetika va genomik tibbiyot bo'limi, Pediatriya bo'limi, Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasi, Pitsburg, PA, AQSh⁶Patologiya bo'limi, Klinik biokimyoviy genetika laboratoriyasi, Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasi, Pitsburg, PA, AQSh⁷Pediatriya bo'limi, Gastroenterologiya, gepatologiya va ovqatlanish bo'limi, Pitsburg tibbiyot fakulteti universiteti, Pitsburg, PA, AQSh.⁸Hisoblash biologiyasi,⁹Biologiya fanlari va¹⁰Neyrologiya instituti, Karnegi Mellon universiteti, Pitsburg, PA, AQSh

Abstrakt

Sutemizuvchilar nefronlari populyatsiyadan kelib chiqadinefron progenitori hujayralari, va bu hujayralar transkriptomlaridagi o'zgarishlar nefron sonining muhim determinanti bo'lgan nefrogenezning to'xtashiga yordam beradi. MikroRNK (miRNK) ifodasini tavsiflash va taxminiy sis-regulyatsiya hududlarini aniqlash uchun biz sichqonchadan nefron progenitor hujayralarini yig'dik.buyraklarembrionning 14,5-kunida va tug'ruqdan keyingi kuni nol va tahlil qilingan kichik RNK ifodasi va transpozaza kirishi mumkin bo'lgan kromatin. Biz 1104 miRNK (ifoda o'zgarishi bilan 114) va 46 374 xromatinga kirish mumkin bo'lgan hududlarni (2103 ta o'zgarishlar mavjud bo'lmagan holda) ifodasini aniqladik. Genom miqyosida bizning ma'lumotlarimiz hujayra differentsiatsiyasi, hujayra migratsiyasi, hujayradan tashqari matritsaning o'zaro ta'siri va rivojlanish signalizatsiya yo'llari kabi jarayonlarni ta'kidlaydi. Bundan tashqari, ular Eya1 va Pax8 uchun yangi nomzod cis-regulyatsiya elementlarini aniqlaydilar, ikkala gen ham nefron progenitor hujayralar differentsiatsiyasida rol o'ynaydi. Va nihoyat, biz ifodani o'zgartiruvchi miRNKlarni, jumladan let{15}}p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p va miR{{ bilan bog'laymiz. 20}}p, nomzod cis-regulyatsiya elementlari va maqsadli genlar bilan. Ushbu tahlillar nefron progenitatorlarida miRNK uchun yangi taxminiy cis-regulyatsiya lokuslarini ta'kidlaydi.

Kirish

Funktsional birlikbuyraknefron bo'lib, u chiqindilarni filtrlash va organizmdagi suv, kislota-asos va elektrolitlarning normal gomeostazini saqlashga xizmat qiladi. Nefron soni odamlarda keng farq qiladi (odatda ikki yuz ming va bir milliondan ortiq nefron (Hughson va boshq., 2003)) va odamlarda tug'ilishdan oldin (taxminan postnatal kun 2-3 sichqonlarda aniqlanadi (Hartman va boshqalar). ., 2007; Hinchliffe va boshqalar, 1991)). Nefron tug'ilgandan keyin qayta tiklana olmaydi va nefronning kamayishi surunkali buyrak kasalligi va gipertenziya xavfining oshishi bilan bog'liq (Bertram va boshq., 2011). Nefron soni, o'z navbatida, ko'p jihatdan hujayralar populyatsiyasi tomonidan belgilanadinefron progenitori hujayralari(Cebrian va boshqalar, 2014b). ning oxirgi bosqichlaridabuyrakRivojlanish jarayonida nefron nasl-nasabi differensiallashishga moyilligini oshiradi, bu ularning populyatsiyasini asta-sekin yo'q qiladi va nefrogenezning yakuniy to'xtashini ko'rsatadi (Hartman va boshq., 2007; Rumballe va boshq., 2011; Volovelskiy va boshq., 2018). Nefrogenezni to'xtatishni tartibga soluvchi mexanizmlarni tushunish nefron bilan ta'minlanganligini va keyingi buyrak kasalligi xavfini aniqlash uchun muhim ahamiyatga ega.

davomidabuyrakRivojlanish, o'z-o'zidan yangilanadigan Cited1 plus /Six2 plus nefron progenitors primed Cited1-/Six2 plus progenitors bo'lib, keyinchalik Wnt9b/-katenin (McMahon) ga javoban buyrak pufakchalariga differensiallanadi. va boshqalar, 2016; Rumballe va boshqalar, 2011). Erta va kech nefron nasl-nasabidagi ichki transkripsiyaviy o'zgarishlar ildiz hujayralarining qarishiga ta'sir qiluvchi genlar va yo'llarni, xususan, mTor va uning repressor hamartinini o'z ichiga oladi (S. Chen va boshq., 2015; Volovelskiy va boshq., 2018). Darhaqiqat, hamartin nefron progenitatorlarini o'z-o'zini yangilash uchun signallarga desensitizatsiya qiladi va shu yo'l bilan nefrogenezni to'xtatishga hissa qo'shadi (S. Chen va boshq., 2015). Nefronning dastlabki avlodlari o'z-o'zini yangilashga ko'proq moyil bo'ladi degan fikrga muvofiq, xromatinning mavjudligi nefron progenitori hujayra transkripsiyasi omillari, jumladan Six2 va Wt1 ning bog'lanish joylari uchun boyitilganligini kuzatish, kech nefron avlodlari bilan solishtirganda (Hilliard va boshq. , 2019). Ushbu transkripsiya omillari genomdagi "tartibga soluvchi issiq nuqtalarda" joylashgan kuchaytiruvchi ketma-ketliklarni bog'lashi ko'rsatilgan (O'Brien va boshq., 2018). Nefron progenitatorlarining induktsiyasi -katenin darajasining ko'tarilishi tufayli yuzaga keladi, bu nefrogenez dasturini faollashtirishga tayyor bo'lgan genlarda Lef1/Tcf7 komplekslarining faollashishiga olib keladi (Park va boshq., 2012) va Tcf7l1 va Tcf7l2 bilan kompleks qilish taklif qilingan. gen faollashuvini osonlashtiradigan tartibga soluvchi kromatin halqalarini yaratish va qo'llab-quvvatlash (Guo va boshq., 2021).

ga bosingBuyrak kasalliklarini davolash uchun Cistanche tubulosa kukuni

Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar nefrogenezning to'xtatilishini tartibga solishda mikroRNKlar (miRNK) bilan bog'liq. miRNK qisqa, kodlanmaydigan RNK molekulalari bo'lib, ular RNK-induktsiyali susturucu kompleksi (RISC) (Bartel, 2009) orqali translatsiyani kamaytirish yoki yaxshilangan degradatsiya uchun messenjer-RNK transkriptlarini (mRNK) maqsad qiladi. Lin28b oqsili miRNKlar oilasining ma'lum bo'lgan repressori-7dir (Heo va boshq., 2008). Lin28b ifodasi nefrogenez davom etganda nefron progenitatorlarida kamayadi va bu let{8}} miRNK oilasining ifodalanishining oshishi bilan mos keladi (Yermalovich va boshq., 2019). Bundan tashqari, Wt{11}}nasabdagi Lin28b ifodasining shartli induktsiyasi nefrogenezni uzaytirish uchun etarli bo'lgan let{12}} miRNKning repressiyasiga olib keladi (Yermalovich va boshq., 2019). Boshqa miRNKlar nefrogenez vaqtini tartibga soladimi yoki yo'qmi noma'lum. Bundan tashqari, nefrogenez jarayonida uzoq vaqt davomida kodlanmaydigan RNK ifodasini tartibga soluvchi kuchaytirgichlar aniqlangan bo'lsa-da (Nishikawa va boshq., 2019), ularning hech biri nefron progenitatorlarida miRNK ifodasini tartibga solishi ko'rsatilmagan.

Ushbu tadqiqotda biz bir vaqtning o'zida nefrogenezni to'xtatishga hissa qo'shadigan yangi miRNKni va potentsial cis-regulyatsiya xususiyatlarini aniqlashga harakat qildik. Shuning uchun, miRNK ifodasidagi o'zgarishlarni va embrionning 14.5 (E14.5) kuni va tug'ruqdan keyingi nol kuni (P 0) o'rtasidagi xromatin mavjudligini kuzatish uchun biz birlamchi va o'tkazilmagan ma'lumotlardan mos keladigan mRNK-seq va ATAC-seq ma'lumotlar to'plamini yaratdik.nefron progenitori hujayralaribu ikki vaqt nuqtalarida. Biz turlicha ifodalangan 114 miRNKni aniqladiknefron progenitori hujayralariushbu ikki vaqtli nuqtalar o'rtasida, shuningdek, biz differentsial ravishda kirish mumkin bo'lgan hududlar (DAR) deb ataydigan o'zgaruvchan xromatin mavjudligining 2103 mintaqasi. MiRNKning sezilarli darajada o'zgarishining bashorat qilingan gen maqsadlarini boyitish tahlillari, shuningdek DARlarning genomik joylashuvi epitelial hujayralar differentsiatsiyasiga, hujayra migratsiyasiga, hujayradan tashqari matritsalarning o'zaro ta'siriga va Wnt, Notch va TGF signalizatsiyasi kabi asosiy rivojlanish signalizatsiya yo'llariga ta'sir qiluvchi yo'llarni nazarda tutadi. . Biz xromatindagi mavjudlikdagi sezilarli o'zgarishlarni kuzatamiz va nefron progenitor hujayralarida Eya1 va Pax8 genlari uchun taxminiy kuchaytiruvchi sifatida ikkita genomik hududni nazarda tutuvchi bir nechta dalillarni taqdim etamiz. Nihoyat, biz 33 juft miRNK va DAR uchun izchil xromatin mavjudligi va miRNK ifodasi oʻzgarishlarini aniqladik, jumladan let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p, va miR-9-3p va differensial ravishda ifodalangan miRNKlar uchun nefron progenitatorlarida ifodalangan taxminiy maqsadli genlar mavjud.

Natijalar

E14.5 va P0 dan nefron progenitor hujayra populyatsiyalarining izolyatsiyasibuyraklar

Nefron progenitori hujayralariE14.5 yoki P 0 da Itg 8 uchun musbat tanlov bilan ajratilgan va har bir namuna mRNK-seq, ATAC-seq va sifat nazoratini amalga oshirish uchun bo'lingan (Qo'shimcha rasm 1 AB). Miqdoriy PCR (qRT-PCR) Six2 va Cited1 nefron progenitor marker genlari (Huang va boshq., 2016) butunga nisbatan izolyatsiya qilingan nefron progenitor namunalarida yuqori darajada ifodalanganligini tasdiqladi.buyrak, boshqa hujayralar turlari uchun markerlardan ko'ra ko'proq (shu jumladan, siydik yo'llari kurtaklari (Caleb) (Cebrian va boshq., 2 {{10}} 14a), endotelial hujayralar (Pecan) (Kobayashi va boshq., 2008), buyrak stromasi (Pdgfr ) (S. Chen va boshq., 2015) va buyrak pufakchalari (Lhx1) (Brunskill va boshq., 2014) (Qo'shimcha rasm 1 C).Jinsga kelsak, E14.5 namunalari uchun ishlatiladigan axlat miqdori: 27% dan 50% gacha urgʻochi va P0 namunalari uchun urugʻlar 31% dan 75% gacha urgʻochi boʻlgan. Oʻrtacha E14.5 namunalari 38%, P0 namunalari esa 49% ayollar edi (Qoʻshimcha rasm 1D). -mos keladigan nefron progenitor hujayra populyatsiyalari bizga tahlil qilish imkonini berdikromatinga kirish imkoniyativa ikki martalik nuqtalarda rivojlanishning bir xil bosqichlarida kichik RNK ifodasi (E14.5 va P0).

Erta va kech nefron progenitatorlari alohida miRNK transkripsiya profillariga ega

Kichik-RNK ketma-ketligi 1,1{6}}4 ta ma'lum miRNK transkriptlarini aniqladi va E14.5 va P{{10}} namunalari o'rtasida ifodada sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatadigan 114 miRNKni aniqladi (noto'g'ri aniqlash tezligi ( FDR)=0.05; Qo‘shimcha 1-jadval). Differensial ravishda ifodalangan miRNKlarning yarmi E14.5 bilan solishtirganda P0 da ifodalanganligini koʻrsatadi va asosiy komponentlar tahlili P0 bilan solishtirganda E14.5 namunalari orasida miRNK ifodasining koʻproq bir xilligini taʼkidlaydi (1A-rasm). Ierarxik klasterlash miRNKlarning mos ravishda E14.5 va P0 oʻrtasida ortib borayotgan va kamayuvchi ifoda guruhlariga aniq guruhlanishini koʻrsatadi (1B-rasm). MiRNKlar oilasining-7a'zolari aniqlangan eng yuqori darajada ifodalangan miRNKlar qatoriga kiradi va biz muhim o'zgarishlarga ega bo'lgan barcha oila a'zolarining ifodasi P0da (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) ko'payganini ta'kidlaymiz. Bu Lin28b ifodasining qisqarishi nefrogenez jarayonida let{24}} oila ifodasining keng ko'payishiga olib kelishini ko'rsatadigan natijalarga mos keladi (Yermalovich va boshq., 2019). P0 da sezilarli darajada yuqori ifodalangan boshqa miRNKlarga podotsitlar differentsiatsiyasiga ta'sir qilishi ma'lum bo'lgan miR{28}} oilasining a'zosi bo'lgan miR-429-3p (Z. Li va boshq., 2016) va ikkala miR{{30} kiradi. }}a-5p va miR-125b-5p. Ularning oxirgi ikkitasi Lin28 transkriptlarini turli xil uyali muhitda bostirishi ma'lum (Chaudhuri va boshq., 2012; Potenza va boshq., 2017). P0 da sezilarli darajada past ifodalangan miRNK angiogenez- (S. Vang va boshq., 2008) va proliferatsiyani rag'batlantiradigan (Schober va boshq., 2014) miR-126 ni o'z ichiga oladi.

DIANA miRPath vositasi mikro T-CDS (Vlachos va boshq., 2015) tomonidan bashorat qilinganidek, ularning tegishli gen maqsadlari asosida miRNKning KEGG yoʻl tahlilini oʻtkazish imkonini beradi. E14.5 va P0 (yuqoriga yoki pastga) oʻrtasida ifodalanishda eng katta oʻzgarishlarga ega miRNKlar nefrogenezda asosiy rol oʻynaydigan yoʻllarni tartibga soluvchi ekanligini aniqlaymiz (1C-rasm, 2-rasm). Masalan, Tgf- nefron progenitori differentsiatsiyasini rag'batlantirish uchun atrofdagi stromal hujayralar tomonidan chiqariladi (Rowan va boshq., 2{{50}}18) va biz nefron progenitori miRNKning quyi oqim effektorlariga qaratilgan ekspressiyasining kamayganini qayd etamiz. "TGF-signalizatsiya yo'li" (KEGG yo'li mmu04350, p-qiymati 1,45e- 6). "MAPK signalizatsiya yo'li" (mmu04010) nefron progenitatorlarini differentsiatsiya qilish uchun tashkil etish va tayyorlashga ta'sir qiladi va ularning Itg 8 orqali hujayradan tashqari matritsa (ECM) bilan o'zaro ta'sirini tartibga soladi (Ihermann-Hella va boshq., 2018). Biz ushbu MAPK signalizatsiya yo'lida turli genlarni nishonga olgan ko'plab yuqoriga va pastga tartibga solinadigan miRNKlarni qayd etamiz (yuqoriga va pastga ro'yxatlar uchun mos ravishda 3,5e- 6 va 3,0e- 4 p-qiymatlari) . Nihoyat, KEGG yo'li "Hujayradan tashqari matritsa (ECM) retseptorlari o'zaro ta'siri" (mmu04512) aniqlangan eng sezilarli darajada boyitilgan yo'ldir va uning tarkibiy genlari vaqt o'tishi bilan ekspressiyani oshiradigan miRNK tomonidan ancha sezilarli darajada nishonlanadi (p-qiymati 7,4e{). {32}} ortib borayotgan miRNK va 1,1e-2 kamaygan). ECM bilan bog'langan genlar biz aniqlagan eng yuqori ifodalangan va sezilarli darajada ortib borayotgan miRNKlar tomonidan nishonga olinadi, jumladan miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, va-7f-5p. Xususan, miR-196a-5p bizning namunalarimizdagi eng yuqori ifodalangan miRNK bo‘lib, u E14,5 va P0 o‘rtasida 8-baravar ortishini ko‘radi. MiRNKning bashorat qilingan maqsadlari bo'lgan (TargetScan (Agarval va boshq., 2015) yordamida) P0 da ifodalangan gen transkriptlari o'z-o'zini yangilash va farqlash uchun MAPK/AP1 va Six2/-katenin yo'llari o'rtasida taklif qilingan molekulyar bog'lanish Bach2 ni o'z ichiga oladi. mos ravishda nefron avlodlarida (Hilliard va boshq., 2019).

Nefron ajdodlarida differensial tarzda ifodalangan miRNKlarning taxminiy maqsadlarini aniqlash uchun miRDBda taqdim etilgan miRNKlarning hisoblash izohidan (Y. Chen va Vang, 2020) va ohak bazasidan (HY) izohlangan eksperimental miRNK-mRNK o‘zaro ta’siridan foydalandik. Huang va boshq., 2020), bizning ilgari yaratilgan E14.5 bir hujayrali RNK ketma-ketlik ma'lumotlar to'plamimiz bilan birgalikda (Bais va boshq., 2020). Shunday qilib, biz nefron progenitörlerinde E14.5 va P0 o'rtasidagi miRning differentsial ifodasiga asoslangan potentsial miRNK-mRNK o'zaro ta'sirlari ro'yxatini yaratdik, o'z-o'zini yangilaydigan va astarlangan nefron progenitörleri o'rtasida maqsadli gen ekspressiyasining mos keladigan o'zgarishi, shuningdek astarlangan va nefron progenitatorlarini farqlash (2-rasm). Bizning tahlilimiz shuni ko'rsatadiki, Meis2 va Hmga2 nefron avlodlarida miRNKlarning let-7 oilasining potentsial nishoni hisoblanadi (2-rasm), Meis2 va Hmga2 ifodasining kamayishi, let{19}} oila a'zolarining ko'payishi bilan bog'liq. nefron progenitlarini farqlash yoki qarishda. Meis2 transkripsiya omili nefron progenitatorlarida va buyrak stromasida kuchli ifodalangan.buyrakrivojlanish (Lam va boshq., 2014) va boshqa kontekstlarda hujayra proliferatsiyasini tartibga solish bilan bog'liq (Abruzzese va boshq., 2019). Hmga2 giston bo'lmagan xromatinni bog'laydigan oqsil bo'lib, u ildiz hujayralarida yuqori darajada ifodalanadi va u turli xil mezenximal o'smalar bilan bog'liq (Fusco & Fedele, 2007; Lam va boshq., 2014). Xuddi shunday, farqlashda miR-34b-5p, miR-983p va miR{10}}a-3p ifodalarining kamayishi bilan bog‘liq bo‘lgan ortib borayotgan Jag1 ifodasi mavjud. yoki qarigan nefron progenitatorlari (2-rasm). Jag1 - bu Notch signalizatsiyasining asosiy ligand bo'lib, uning ifodasi nefron progenitatorlari farqlanganda ortadi (Chung va boshq., 2016). O'z-o'zini yangilaydigan, astarlangan va farqlovchi nefron progenitatorlari o'rtasidagi ekspressiv o'zgarishlarga ega genlar uchun barcha prognoz qilingan yoki izohlangan miRNK maqsadlari Qo'shimchada mavjud.

1-rasm. E14.5 va P0 nefron progenitors o'rtasidagi miRNK ifodasidagi sezilarli o'zgarishlar.A) Asosiy komponentlar tahlili shuni ko'rsatadiki, rivojlanish vaqt nuqtasi miRNK ifodasi o'zgarishiga asosiy hissa qo'shadi. B) Barcha sezilarli darajada o'zgaruvchan miRNKning nisbiy ifodasini tasvirlaydigan issiqlik xaritasi. Chapdagi E14.5 namunalarini o'z ichiga olgan ustunlar och yashil rangda, o'ngdagi P0 namunalari bo'lgan ustunlar esa quyuq yashil rangda izohlanadi. C) Yuqoriga va pastga tartibga solinadigan miRNKning bashorat qilingan gen maqsadlari (mos ravishda qizil va ko'k chiziqlar) orasida o'ziga xos KEGG yo'llaridan genlarni boyitish. Minimal p-qiymati 1e-5.

Shakl 2. miRNK-mRNKning o'zaro ta'siri nefron progenitori hujayralarining qarishi va differentsiatsiyasida mumkin bo'lgan roli. MiRNK (doiralar) va mRNK (kvadratchalar) ko'rsatilgan. E14.5 va P0 oʻrtasida ifodalangan miRNKlar qizil rangda, kamaygan miRNKlar koʻk rangda koʻrsatilgan. Izohlangan maqsadli genlar (mirDB va mir TarBase'dan) o'z-o'zini yangilash, astarlash yoki farqlash o'rtasidagi ortib borayotgan ifoda bilannefron progenitori hujayralari(Bais va boshq., 2020) qizil rangda ko'rsatilgan, mRNK ifodasi ko'k rangda kamayadi. mirDB va mirTarDB ning kuzatilgan ifoda oʻzgarishlariga mos kelmaydigan qirralari olib tashlandi, ammo qoʻshimcha 2-jadvalga kiritilgan.

Erta va kech nefron progenitatorlari alohida xromatin muhitiga ega

E14.5 va P{3}} nefron progenitatorlaridan olingan ATAC-seq ma'lumotlari bizga kirish mumkin bo'lgan kromatinning 46 374 mintaqasini aniqlashga imkon berdi (kamaytirish tezligi (Boleu va boshq., 2015) chegarasi {{). 22}}.1, qarang (3-rasm C qo‘shimcha, 3-jadval), namunalar va vaqt nuqtalari bo‘yicha birlashtirilgan. Bizning ma’lumotlarimiz ENCODE loyihasining ATAC-seq ko‘rsatmalariga (ENCODE, nd) mos kelishini ta’kidlaymiz (Qo‘shimcha rasm 3 A, B) va biz IDR cho'qqilari orasida randomizatsiyalangan nazoratdagiga qaraganda yuqori saqlanish sur'atlarini kuzatamiz (Qo'shimcha 3 D rasm). FANTOM5 (de Rie va boshq., 2017) kuchaytiruvchi ma'lumotlar bazalari va 13 495 ta EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020) bo'yicha kamida bitta sichqoncha to'qimasida yoki hujayra turida prognoz qilingan tartibga soluvchi rollarga ega DNK ketma-ketligini o'z ichiga oladi.

Asosiy komponent tahlili (namunalar orasidagi jins farqlari uchun tuzatilgan) rivojlanish vaqti bo'yicha namunalarning aniq guruhlanishini aniqladi (3A-rasm). Xromatin mavjudligidagi o'zgarishlar bilan genomik lokuslarni aniqlash uchun biz E14.5 va P{4}} namunalari orasidagi ATAC-seq signalini solishtirdik. Biz 2,1{11}}3 DARni kuzatdik, FDRni 10 foizda nazorat qildik. Ulardan 1323 tasi (55 foiz) E14.5 bilan solishtirganda P0 darajasida foydalanish imkoniyatini oshirdi va ierarxik klasterlash mos ravishda E14.5 va P0 oʻrtasida ochiladigan va yopiladigan DARlar oʻrtasidagi aniq farqni koʻrsatdi (3B-rasm).

Transkripsiya faktor izlari HINT yordamida aniqlandi va HOCOMOCO 11 maʼlumotlar bazasidan motiflar yordamida DNKni bogʻlovchi oqsillarga moslashtirildi (Kulakovskiy va boshq., 2018). Sinovdan o'tkazilgan 431 ta motiflar orasida nefrogenez bilan bog'liq bir nechta transkripsiya faktorlari oqsillari uchun oyoq izlarini o'z ichiga olgan DARlar E14.5 va P0 oralig'ida foydalanish imkoniyatining oshishini ko'rsatadi. DARlarda yashovchi, foydalanish imkoniyatini oʻrtacha oshiruvchi izlar orasida birinchi oltitasi Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd bilan mos keladigan transkripsiya faktor izlariga tegishli. (0.13), Six4 (0.13), iyun (0.12) va Fos (0.11). DARlarni yopishda izohlangan izlar E2F2 va E2F4 transkripsiya omillarini o'z ichiga oladi, ular hujayra siklining rivojlanishiga ta'sir qilishi ma'lum (Gaudet va boshq., 2011) va hujayra proliferatsiyasini (D. Vang va boshq., 2000) boshqa uyali kontekstlarda (Qo'shimcha rasm) 4).

DARlarni ochish va yopishning biologik kontekstini baholash uchun biz gen to'plamlarini bog'liq o'zgaruvchan xromatin hududlarini boyitish bilan ta'kidlash uchun Izohlarni Genomik hududlarni boyitish vositasidan (GREAT) foydalandik (McLean va boshq., 2010). Ushbu yondashuv bilan biz nefron progenitori rivojlanishi bilan chambarchas bog'liq bo'lgan Gen Ontologiyasi (GO) biologik jarayonlarini aniqlaymiz: xususan, ochilgan DARlar orasida eng boyitilgan jarayon "Epitelial hujayralar differentsiatsiyasini tartibga solish" (GO: 0030856, Binom Q-qiymati {{3) }}.5e-5) va "Epitelial hujayralar differentsiatsiyasining ijobiy regulyatsiyasi" (GO:0030858, binom Q-qiymati=5e-3) eng sezilarli boyitilgan 10 talikka kiradi ( Qo'shimcha rasm 5). Ikkalasi ham nefron progenitatorlarining mezenximaldan epiteliyaga o'tishga (MET) moyilligining ortishi bilan mos keladi, chunki ular farqlanadi (S. Chen va boshq., 2015). Boshqa sezilarli boyitilgan yo'llar qatoriga "Notch signalizatsiya yo'lining ijobiy regulyatsiyasi" (GO: 0045747, binom Q-qiymati=2e-5) kiradi, bu Notch signalining nefron progenitori differentsiatsiyasini rag'batlantirishdagi roliga mos keladi ( Chung va boshq., 2016). Aniqlangan 10 083 ta yopilish DARlari GREATning muhimlik mezonlariga asoslangan muhim GO shartlarini aniqlamadi (Qo'shimcha 5-rasmga qarang).

3-rasm. Xromatinga kirish imkoniyatidagi farqlar E14.5 va P0 ni tavsiflaydi.nefron progenitori hujayralari.A) ATAC-seq namunalarining asosiy komponent tahlili rivojlanish vaqt nuqtalarini o'zgaruvchanlikning asosiy manbai sifatida ta'kidlaydi. B) ATAC-seq namunalari bo'yicha sezilarli darajada o'zgaruvchan IDR hududlarini ko'rsatadigan issiqlik xaritasi. E14.5 namunalari/ustunlari och yashil rangda, P0 namunalari/ustunlari esa quyuq yashil rangda izohlanadi. C) GREAT bo'yicha E14.5 va P0 oralig'ida ochiladigan genomik hududlar uchun boyitilgan GO Biologik jarayon atamalari binomial P-qiymati, FDR 0.001 dan kichik yoki unga teng.

Keyinchalik, biz kashf qildikkromatinga kirish imkoniyatinefron progenitor hujayralar differentsiatsiyasida e'lon qilingan rollarga ega genlar uchun promotorlar va kuchaytirgichlarni o'z ichiga olgan genomning hududlarida. Ular orasida Six2 transkripsiya omili ko'p potentsialni saqlash uchun juda muhimdirnefron progenitori hujayralari(Self va boshq., 2006) va barcha namunalarda biz uning promouteri va Six2 transkripsiyasini boshlash joyidan (TSS) yuqorida ma'lum bo'lgan Six2 kuchaytirgichi atrofida mavjud bo'lgan xromatinni kuzatdik (O'Brien va boshq., 2018) (rasm) 4A, B, ko'k soyali joylar). Shuningdek, biz promouterda mavjud bo'lgan xromatin hududlarini va siydik yo'llari kurtaklari shoxlanishini rag'batlantirish uchun nefron progenitatorlari tomonidan chiqariladigan Gdnf oqsili uchun nashr etilgan kuchaytirgichni (4D, E-rasm) qayd etamiz (Sanches va boshq., 1996; Vega va boshq., 1996). ). Ushbu kuchaytirgich gen promotoridan ~ 113 kb yuqorida joylashgan va nefron progenitörlerinin rivojlanishi kontekstida Wnt signaliga javob berishi ma'lum (Park va boshq., 2012). Gdnf uchun promouter vaqt o'tishi bilan sezilarli darajada o'zgarmasa-da, izohli kuchaytirgich kirish imkoniyatini sezilarli darajada oshiradi. Shuningdek, biz genning TSS dan ~ 325 kb yuqorida joylashgan Eya1 uchun nefron progenitatorlarida faol nashr etilgan kuchaytirgichni o'rab turgan mavjud xromatin hududlarini ham qayd etamiz (Park va boshq., 2012) (Qo'shimcha rasm 6). Eya1 nefron progenitori multipotentligini saqlab qolish uchun Six2 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi transkripsiya omilidir (J. Xu va boshq., 2014).

Biz maʼlum tartibga solish xususiyatlarini bir-biriga mos kelmaydigan, lekin EnhancerAtlas 2.0 da izohlanganidek, turli sichqoncha hujayralari turlarida oʻziga xos genlar uchun kuchaytiruvchi faollikka ega boʻlishi taxmin qilingan hududlarni qamrab oluvchi bir nechta DARlarni kuzatamiz.0 (Gao va Qian, 2020). Eya1 ning e'lon qilingan kuchaytirgichiga qo'shimcha ravishda (Park va boshq., 2012) (6-qo'shimcha rasm), Eya1 intronlaridan biridagi yopilish DAR (5A-B-rasm) sichqonchadagi Eya1 genida kuchaytiruvchi faollikka ega bo'lishi kutilayotgan hududni o'z ichiga oladi. nerv progenitori va granulotsit-monotsit progenitor hujayralar (Gao & Qian, 2020). Kuchaytiruvchi faollikning pasayishiga muvofiq, E14.5 scRNA-seq ma'lumotlaridan foydalangan holda nefron progenitatorlarini farqlashda Eya1 ifodasi kamayganini oldindan kuzatgan edik (Qo'shimcha rasm 7) (Bais va boshq., 2020). Bu faol kuchaytirgich belgisi, H3K27ac va Ctnnb1, Lef1, Six2 va Tcf7 bilan bog'lanishning etishmasligini ko'rsatadigan birlamchi E16.5 nefron progenitatorlarida nashr etilgan ChIP-seq ma'lumotlariga mos keladi (5-rasm) (Guo va boshqalar) ., 2021). Ushbu potentsial kuchaytirgich, shuningdek, mezenximadan epiteliyaga o'tish (MET) paytida nefron progenitörlerinin differentsiatsiyasi va integratsiyasi uchun muhim bo'lgan transkripsiya omili bo'lgan Hoxd10 uchun transkripsiya omili izlarini ham o'z ichiga oladi (Yallowitz va boshq., 2011).

24-xromosomaga kirish imkonsizligini oshiradigan DAR sichqonchaning buyragi, ichak epiteliyasi va bachadonidan yetishtirilgan hujayralardagi Pax8 transkripsiya omili uchun prognoz kuchaytiruvchi faollik bilan xromatin mintaqasini bir-biriga moslashtiradi (Gao va Qian, 2020). Pax8 Pax2 bilan qisman ortiqcha, ammo nefron progenitatorlarida ushbu ikkita transkripsiya omilidan kamida bittasi talab qilinadi.buyrakrivojlanish (Bouchard va boshq., 2002; Narlis va boshq., 2007). Biz ilgari Pax8 ifodasi differentsiatsiyalanuvchi va tabaqalashtirilgan nefron progenitatorlarida ortib borishini kuzatgan edik (7-qo'shimcha rasm) va biz ushbu tartibga solish xususiyatini o'z ichiga olgan DARda foydalanish imkoniyati sezilarli darajada oshganini qayd etamiz. Bu hudud, shuningdek, faol kuchaytirgich belgisi, H3K27ac va Ctnnb1, Lef1, Six2 va Tcf7 ning birlamchi E16.5 nefron progenitatorlaridan olingan ChIP-seq ma'lumotlarida bog'lanishi bilan bog'liq (5-rasm) (Guo va boshq., 2021). Biz ushbu DARning yuqori darajada saqlanib qolgan kirish cho'qqisiga to'g'ri keladigan bir qator transkripsiya omillari izlarini kuzatamiz, jumladan Sall1 uchun ikkitasi, nefrogenezga ta'sir qilishi ma'lum bo'lgan yadro omili (Kanda va boshq., 2014) va MYC bilan bog'liq sink barmoqlari uchun yaqindan guruhlangan ettita oyoq izlari. protein (Maz), dozaga bog'liq ta'sir ko'rsatadigan transkripsiya omilibuyrakodamlar va sichqonlarda rivojlanish (Haller va boshq., 2018). Qo'shimcha 3-jadvalda biz topadigan kirish mumkin bo'lgan hududlarning to'liq ro'yxati, shuningdek, ularning tegishli differentsial mavjudlik statistikasi, genlar, ekzonlar va promotorlar uchun izohlar va aniqlangan nefrogenez bilan bog'liq bo'lgan asosiy transkripsiya omillari izlari ro'yxati mavjud.

4-rasm. Ma'lum va taxminiy tartibga solish joylaridagi ATAC-seq profillari. Yuqoridan pastgacha bo'lgan har bir panel uchun qirralarning katlam boyitishini bildiradi.kromatinga kirish imkoniyatiE14.5 va P0 namunalarida, IDR va DARlar koʻk (oʻzgarmas IDR) va yashil (ochuvchi DAR) ranglarda ajratib koʻrsatilgan. va qizil (DARni yopish). Quyidagi faset gen izohlari, nukleosomalarning joylashuvi (kulrang) va birlashtirilgan E14.5 va P0 namunalarida oʻlchangan nukleosomalardan xoli hududlar (qizil) hamda PhastCon60 saqlanish ballari (qora rang 1{{)ni bildiradi. 12}}0 foiz saqlanish, oq 0 foiz saqlanish.A) Six2 transkripsiya omilining promotori va gen tanasi. B) Six2 uchun Enhancer Park et tomonidan nashr etilgan. al. C) Gdnf uchun differensial foydalanish mumkin bo'lgan kuchaytirgich, P0 darajasida foydalanish imkoniyati ortdi. D) Gdnf uchun promouter.

Shakl 5. Nefrogenez bilan bog'liq genlar uchun potentsial yangi kuchaytirgichlar bilan bir-biriga mos keladigan DARlar. A va C) Panellar qiziqish genini o'rab turgan 1MB hudud xaritasini, yashil rangda oqsil kodlovchi genlar va tavsiya etilgan kuchaytiruvchi/promoter o'zaro ta'sirini qora halqa sifatida tasvirlaydi. . B va D) Yuqoridan pastgacha panellarda burma boyitish tasvirlangankromatinga kirish imkoniyatiE14.5 va P{2}} namunalarida oʻlchandi, IDRlar yashil (ochilish) va qizil (yopish) bilan taʼkidlangan, soʻngra Guo et tomonidan oʻlchangan ushbu hududlarda ChIP-seq oʻlchovlari. al. asosiy nefron progenitorihujayralar(Guo va boshq., 2021). Uchinchi panelda Enhancer Atlas 2.0 (qizil) dan gen izohlari (ko'k) va prognoz qilingan tartibga soluvchi elementlar tasvirlangan va to'rtinchi panel ATAC-seq ma'lumotlarida aniqlangan transkripsiya faktor izlarini bildiradi. Beshinchi panelda nukleosomalar (kulrang) va NFRlar (qizil) tasvirlangan, pastki panel esa konservatsiyani bildiradi. A) Eya1 uchun gen tanasi va potentsial Eya1 kuchaytirgichini o'z ichiga olgan 1MB hududi taxminan 325kb yuqorida. B) Potentsial Eya1 kuchaytirgichini o'z ichiga olgan 4,5 kb hudud. C) Pax8 gen lokusu va bashorat qilingan kuchaytirgichni o'z ichiga olgan 1MB mintaqa. D) bashorat qilingan kuchaytirgich va uning bir-biriga o'xshash DARni o'z ichiga olgan 4,5 kb hudud.

Topologik jihatdan bog'langan domenlar potentsial kuchaytiruvchi - miRNK munosabatlarini aniqlashga yordam beradi

Topologik assotsiatsiyalangan domenlar (TADlar) yuqori tartibli xromatin tashkilotining megabaza miqyosdagi hududlari bo'lib, ular uch o'lchovli fazoda xromatinning yadroga o'ralishi natijasida hosil bo'ladi (Dixon va boshq., 2012) va kuchaytiruvchi-promoter o'zaro ta'siri odatda cheklangan. bir xil TAD ichidagi elementlar (Symmons va boshq., 2014). Biz sichqonchaning embrion ildiz hujayralaridan (ESC) hosil qilingan izohlardan foydalangan holda nefron progenitatorlaridan TADlarni taxmin qildik (Y. Vang va boshq., 2018). MiRNKning mumkin bo'lgan sis-regulyatsiya hududlarini tekshirish uchun biz o'zgarishlarni korrelyatsiya qildikkromatinga kirish imkoniyatibir xil TAD ichida differensial ifodalangan miRNK bilan. Umuman olganda, 42 778 noyob kirish mumkin boʻlgan mintaqalar (taxminan 92 foiz) izohli TADlar ichida joylashgan boʻlib, ulardan 30626 (taxminan 72 foiz) maʼlum promouter bilan bir-biriga mos kelmaydi. Bunga 2103 DAR kiradi, vaqt o'tishi bilan mos ravishda 1180 va 923 ochiladi va yopiladi. O'n beshta ochilish DAR bir yoki bir nechta miRNK bilan TADni E14.5 va P0 oralig'ida ko'tarilgan ifoda bilan taqsimlaydi va to'qqizta yopilish DAR bir yoki bir nechta miRNK bilan TADni ifodasi kamayadi. 6-rasm ushbu yondashuvni umumlashtiradi va DARlar va ularning mos keladigan miRNKlari orasidagi masofani ko'rsatadi, ular 27 kb dan 1 mb dan ortiq (o'rtacha: 447 kb). 1-jadvalda mumkin bo'lgan DAR - miRNA munosabatlari to'plami, har bir mos keladigan miRNK uchun bitta DAR ro'yxati keltirilgan.

Izohlangan miRNK kuchaytiruvchi juftliklar orasida biz uchta alohida qiziqishni qayd etamiz. Birinchidan, ochiladigan DAR 120 kb let{2}}c{3}}p quyi oqimida va 73 kb miR-125b-5p quyi oqimida aniqlandi, bu Six2 bilan bog‘liq. ilgari nashr etilgan E16.5 nefron progenitori ChIP-seq ma'lumotlar to'plamida bog'lanish joyi (7A-rasm) (Guo va boshq., 2021). Let-7c-5p biz aniqlagan eng yuqori let{16}} miRNKlardan biridir va let-7 oilasi Lin28b transkriptlarini ham bostirishi ma'lum (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu va boshqalar, 2011). Shuni ta'kidlaymizki, Hmga2 va Meis2 nefron nasl-nasabidagi let{23}} oilasining potentsial yangi maqsadlari sifatida ham aniqlangan (2-rasm). miR-125b-5p sichqonchaning gematopoetik va progenitor hujayra turlarida Lin28 transkriptlarini bostirishi ham ko'rsatilgan (Chaudhuri va boshq., 2012). Ikkinchidan, miR-9-3p - miR-9-5p ning teskari komplementi, yaqinda miRNK dan himoya qiladi.buyrakmetabolik yo'llarga qaratilgan fibroz (Fierro-Fernández va boshq., 2020). Biz E14.5 va P0 nefron ajdodlari oʻrtasida miR{2}}ptrankriptlarning 10-baravardan koʻproq pasayishini aniqladik va biz taxminan 249 kb masofada potentsial tartibga soluvchi elementni aniqladik (7B-rasm). Biz bog'langan DARda Snai1 va Snai2 uchun transkripsiya faktor izlarini kuzatamiz, ular epiteliyadan mezenximaga o'tishni (EMT) rag'batlantirishi ko'rsatilgan (Sundararajan va boshq., 2019). Nihoyat, biz miR-181a-2-3p ni 2-xromosomada 131kb yuqori oqimdagi mumkin bo‘lgan intergenik sis-regulyatsiya lokusuga moslashtirdik, bunda nefron progenitori asosiy regulyatori bo‘lgan Wt1 transkripsiya omili uchun transkripsiya omilining izi qayd etilgan. omon qolish (Kreidberg va boshq., 1993) va e'lon qilingan E16.5 nefron progenitori ChIP-seq ma'lumotlar to'plamida Six2 bog'lanishi (7C-rasm)) (Guo va boshq., 2021).

Jadval 1. miRNK ifodasi o'zgarishlari, bir xil TADda bir yoki bir nechta DARga mos keladi.

Shakl 6. Nomzod kuchaytiruvchisi — maqsad-miRNK juftlarini topish.A) MiRNK ifodasini mumkin bo'lgan tartibga solish uchun foydalanish imkoniyati mintaqalari qanday ustuvorligini ko'rsatadigan oqim diagrammasi. B) Har bir skrining qilingan miRNKning ularning nomzod kuchaytirgichiga nisbatan genomik joylashuvi (to'q sariq vertikal chiziq). Ularning log2 marta o'zgarishi shkalasi y o'qida ko'rsatilgan va ortib borayotgan yoki kamayadigan ifodaga ega miRNK mos ravishda yashil va qizil rang bilan ajratilgan.

Shakl 7. To'rtta potentsial kuchaytiruvchi - maqsadli miRNK juftlari. TADlar kulrang rangda ta'kidlangan, boshlang'ich nuqtalari bilan tekislangan va nisbiy o'lchamni ko'rsatish uchun bir xil masshtabda chizilgan. Ansambldan ma'lum genlar binafsha rangda ko'rsatilgan va quyuqroq hududlar eksonlarni bildiradi. Nisbiy kirish imkoniyati E14.5 va P0 mos ravishda gorizontal qora chiziq ustidagi va ostidagi shtrixli chizmalar sifatida, shuningdek, belgilangan DARdagi toʻplanishni aks ettiruvchi ichki chizmalarda hamda Guo et tomonidan chop etilgan ChIP-seq maʼlumotlarida koʻrsatilgan. . al. (Guo va boshq., 2021). HINT tomonidan aniqlangan transkripsiya omili izlari to‘q sariq rangli bannerlarda keltirilgan. O'ngdagi alohida panellardagi chiziqli chiziqlar miRNK ifodasini (yashil) va tavsiya etilgan kuchaytiruvchi hududlarda (to'q sariq) normallashtirilgan Tn5 kiritish hodisalarini ko'rsatadi. A) let{7}} oila a'zosi let-7c-5p juda yuqori ifodalangan.nefron progenitori hujayralariva genlararo mintaqada 119kb masofadagi "pik_54636"ga mos keladi. B) miR-9-3p DAR 249kb masofaga mos keladi. C) miR-181a 2-3p "peak_5887" dan 131kb uzoqlikda joylashgan bo'lib, bu mumkin bo'lgan intergenik kuchaytirgich.

Munozara

Ushbu tadqiqotda biz bir vaqtning o'zida nefrogenezni to'xtatishga hissa qo'shadigan yangi miRNKni va potentsial cis-regulyatsiya xususiyatlarini aniqlashga harakat qildik. Biz nefron progenitor hujayralarida differensial ravishda ifodalangan 114 miRNKni, shuningdek, E14.5 da P0 ga nisbatan 2,1{6}}3 DARni aniqladik.buyraklar. Biz Eya1 va Pax8 genlari uchun yangi taxminiy kuchaytirgichlarni bashorat qiladigan bir nechta xususiyatlarni kuzatamiznefron progenitori hujayralari. Nihoyat, biz izchillikni aniqladikkromatinga kirish imkoniyativa 33 juft miRNK va DAR uchun miRNK ifodasi oʻzgaradi, jumladan let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p va miR-9-3p va differensial ravishda ifodalangan miRNKlar uchun nefron progenitatorlarida ifodalangan taxminiy maqsadli genlar mavjud. Birgalikda bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, nefron progenitatorlariga xos bo'lgan va nefrogenez bosqichiga bog'liq bo'lgan o'zgarishlar progenitator hujayraning xromatin muhitida va uning miRNK transkriptomida aks etadi.

Nefron progenitori miRNK transkriptomasida kuzatilayotgan o'zgarishlar orasida biz nasllarning yoshiga qarab let{0}} oilasida ifodaning keng ko'payishini qayd etamiz. Bu avvalgi hisobotlarga mos keladi: Lin28b oqsili va let{2}} miRNKlar oilasi bir-biriga qarama-qarshidir va sutemizuvchilarda let-7 ifodasini boshqaradigan bistabil kalitni hosil qiladi (Chju va boshq., 2011) va nefron ajdodlari, ortib borayotgan let{5}} ifodasiga o'tish nefrogenezning to'xtash vaqtiga bevosita ta'sir qiladi (Yermalovich va boshq., 2019). Shuningdek, miR-125b-5p ning ko'payishini kuzatamiz, bu boshqa uyali kontekstlarda Lin28b ifodasini bostirishi ham ma'lum (Chaudhuri va boshq., 2012; Potenza va boshq., 2017). Let{12}} oilasi va miR-125b-5p 114 miRNK qatoriga kiradi, ular nefron progenitatorlarida E14.5 va P0 oʻrtasida differensial tarzda ifodalanadi, bu nefron progenitori rivojlanishida miRNKlarning rolini koʻrsatadi. let-7/Lin28b bilan cheklanmaydi. Misol uchun, ifodasi pasaygan miRNKlar miR{21}} oilasining ikki a'zosini o'z ichiga oladi, ular podotsitlar differentsiatsiyasida rol o'ynaydi (Z. Li va boshq., 2016): miR-200b -3p va miR-429-3p. Keyinchalik, vaskulogenezni rag'batlantirishi ma'lum bo'lgan miR{26}}a 5p ifodasining pasayishini kuzatamiz (Schober va boshq., 2014; S. Vang va boshq., 2008). Bu vaskulogen va nefron progenitatorlarining umumiy mezenximali nasl-nasabini va bu hujayralarning bir qismining nefron progenitatorlariga aylanish majburiyatini aks ettirishi mumkin.

DIANA miRPath (Vlachos va boshq., 2015) yordamida miRNKlarni o'zgartirishning bashorat qilingan gen maqsadlarining yo'l tahlillari nefron progenitatorlarining asosiy regulyatorlari bo'lgan MAPK va TGF signalizatsiyasini ko'rsatadi (Hilliard va boshq., 2019; Ihermann-Hella va boshq., ). Yuqori tartibga solinadigan miRNKlarning prognoz qilingan gen maqsadlari orasida bir nechta boshqa KEGG yo'llari, jumladan, hujayradan tashqari matritsa, aktin sitoskeleti va fokal adezyon bilan bog'liq yo'llar: hujayra migratsiyasining barcha muhim qirralari, differentsiatsiya, dallanish, biriktirish, qutblanish va proliferatsiya. (Rozario va Desimone, 2010). ECM bilan bog'langan genlar biz aniqlagan eng yuqori ifodalangan va sezilarli darajada ortib borayotgan miRNKlar, jumladan, biz aniqlagan eng yuqori ifodalangan transkript tomonidan nishonga olinadi: miR-196a-5p. miR-196a-5p Col1a1, Col1a2 va Col3a1 genlarini nishonga olishi ma'lum - bu genlar buyrak stromasiga transdifferentsiyadan o'tadigan Pax{19}}yetkichi nefron progenitatorlarida yuqori tartibga solinadi (Naiman et al. al., 2017). Shunday qilib, miR{21}}a-5ko'tarilgan ekspressiya avlodlar yoshiga qarab nasl chegaralarini mustahkamlashda rol o'ynashi mumkin. Bundan tashqari, biz nefrogenezning to'xtashiga hissa qo'shishi mumkin bo'lgan yangi potentsial miRNK-mRNK maqsadli o'zaro ta'sirini aniqlaymiz, shu jumladan Hmga2 va Meis2 (hujayra proliferatsiyasi bilan bog'liq) let{25}} oilasini tartibga solish (Abruzzese va boshqalar) ., 2019; Fusco va Fedele, 2007; Lam va boshqalar, 2014; Mugford va boshq., 2009) nefron progenitatorlari yoshi sifatida. Hmga2-da ma'lum roli yo'qbuyrakrivojlanish. Biroq, Meis2 buyrak rivojlanishi uchun zarur bo'lgan Meis1 transkripsiya omili bilan funktsional mos keladi deb hisoblanadi (Hisa va boshq., 2004). Shuningdek, biz maqsadli bo'lishi mumkin bo'lgan miRs (miR-34b-5p, miR-983p va miR-200a-3p) ning pastga regulyatsiyasini kuzatamiz. Jag1, yuqori tartibga solingan va nefron differentsiatsiyasida muhim ahamiyatga ega (Chung va boshq., 2016).

O'zgaruvchan miRNK transkriptomasi bilan bir vaqtda biz nefron progenitori hujayrasining xromatin muhitidagi E14.5 va P0 o'rtasidagi o'zgarishlarni o'lchadik. Biz Eya1 va Pax8 uchun ikkita taxminiy yangi kuchaytirgichni (i) ularning ushbu gen promotorlariga yaqinligi, (ii) ularning tegishli o'zgarishlari asosida tasvirlaymiz.kromatinga kirish imkoniyatirivojlanish jarayonida psevdotime gen ekspressiyasiga mos ravishda differentsiatsiya jarayonida o'zgarishlar, (iii) izlaribuyrakRivojlanish transkripsiya omillari, (iv) ketma-ketlikni saqlash, (v) Enhancer Atlas2 dan boshqa to'qimalar/hujayra turlarida kuchaytirgich funktsiyasining dalillari.0 (Gao va Qian, 2020) va (vi) E16dagi ChIP-seq ma'lumotlari Faol kuchaytirgichlar (H3K27ac) belgisi va Ctnnb1, Lef1, Six2 va Tcf7 ning transkripsiya omili bilan bog'lanishi uchun .5 nefron progenitatorlari. Biz Eya1 kuchaytirgichi uchun xromatinga kirishning pasayishini kuzatamiz, bu Eya1ning nefron progenitori multipotentligini oshirishdagi roliga mos keladi va Eya1 ning yo'qolishi progenitator populyatsiyaning erta epitelizatsiyasiga olib keladi (J. Xu va boshq., 2014; PX). Xu va boshqalar, 1999). Pax8 va uning homologi Pax2 nefron progenitörlarining nasl-nasabini aniqlashga hissa qo'shadi (Bouchard va boshq., 2002) va bu genlardan kamida bittasi bo'lmagan nefron progenitatorlari METdan o'tmaydi (Narlis va boshq., 2007). Pax8 kuchaytirgichi uchun biz aniqlagan xromatinga kirishning ortishi buyrak epiteliyasida nefronlarning farqlanishi natijasida Pax8 ifodasining oshishiga mos keladi.

DARlarni boyitish tahlili (McLean va boshq., 2010) "Epiteliy differentsiatsiyasini tartibga solish" ochilgan xromatin hududlari orasida eng sezilarli boyitilgan atama sifatida aniqlandi, bu biz aniqlagan DARlarda farqlash va rivojlantirish uchun signallarni boshqaradigan yoki ularga javob beradigan tartibga soluvchi xususiyatlarni o'z ichiga olishi mumkinligini ko'rsatadi.nefron progenitori hujayralariepiteliya hujayralari turlariga bo'linadi. Notch signalizatsiyasi ochilgan DARlar orasida aniqlangan eng sezilarli darajada boyitilgan GO atamalaridan biridir va nefron progenitatorlarida bu yo'l Six2 ifodasini bostirish va nefron progenitori hujayra differentsiatsiyasini rag'batlantirishi ma'lum (Chung va boshq., 2016). Ushbu yo'l bilan bog'liq genlar orasida Jag1, Notch signalizatsiyasidagi asosiy ligand bo'lib, uning ifodasi Six2 va Hes1 ifodasi bilan teskari bog'liqligi xabar qilingan (Chung va boshq., 2016). Biz shuni ta'kidlaymizki, Jag1 uchta miRNK uchun izohlangan maqsaddir (miR34b-5p, miR98-3p va miR200a-3p, 2-rasm). Va nihoyat, biz DARlarni ochishda qon tomirlarini qayta qurish va morfogenez bilan bog'liq genlarning boyitishini kuzatamiz, garchi bu ushbu rivojlanish yo'llari va epitelial hujayralar differentsiatsiyasi o'rtasida taqsimlangan genlar, jumladan Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 va Hey2 ning natijasi bo'lsa ham.

O'zgarishlarkromatinga kirish imkoniyatiorasidanefron progenitori hujayralarioldingi tadqiqotlarda o'lchangan (Guo va boshq., 2021; Hilliard va boshq., 2019).

Umuman olganda, bizning natijalarimiz Notchsignaling va Pax{0}}bog'liq genlarni ta'kidlab, avvalgi tadqiqotlarga mos keladi. Shunisi e'tiborga loyiqki, ushbu hisobot bilan solishtirganda ushbu oldingi tadqiqotlarda ba'zi eksperimental farqlar mavjud. Six2-TGC transgen reportyor sichqonchasidan floresan bilan faollashtirilgan hujayra yordamida GFPni ifodalovchi nefron progenitatorlarini izolyatsiya qilish, bu allelning nefron sonining taxminan 45 foizga kamayganligi haqidagi ma'lumotlar bilan chalkashtirib yuboriladi (Hilliard va boshq. , 2019; Volovelskiy va boshqalar, 2018). Bundan tashqari, madaniyatli nefron avlodlari (past yoki yuqori dozali CHIR bilan yetishtirilgan) birlamchi nefron progenitatorlaridan farqli transkriptomlarga ega ekanligi ko'rsatildi, bu ularning xromatinga kirish imkoniyati ham boshqacha bo'lishini ko'rsatadi (Guo va boshq., 2021; Hilliard va boshq., 2019). Tadqiqotimizning maqsadi xromatin landshaftidagi o'zgarishlar miRNK ifodasini erta va kech nefron progenitörlariga qanday ta'sir qilishini tushunish bo'lganligi sababli, asosiy nefron progenitatorlarini tahlil qilish zarur edi.

Cistanche buyraklar uchun yaxshiroqdir

Xromatin muhitida kuzatilgan ushbu o'zgarishlarni miRNK ifodasidagi mos o'zgarishlar bilan birlashtirib, biz keyingi o'rganish uchun nefrogenezni to'xtatishda bir nechta yangi taxminiy miRNK kuchaytiruvchi juftliklarni nazarda tutamiz. MiRNKlar miR-125a-5p va let-7c-5p, masalan, E14.5 va P0 o'rtasidagi ifodaning sezilarli o'sishini ko'rishadi. , va bu xuddi shu TADda DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) ning o'sib bo'lmaydiganligi bilan takrorlanadi. Bu DAR, shuningdek, Six2 bog'lovchi sayt bilan bog'langan (Guo va boshq., 2021) va miR-125a-5p va/yoki let{{18} ifodasiga ta'sir qiluvchi kuchaytirgichni bildirishi mumkin. }c{19}}p, bu esa o'z navbatida Lin28b repressiyasi orqali differentsiatsiyani rag'batlantirishi mumkin. Xuddi shunday, biz miR 181a uchun mumkin bo'lgan kuchaytirgichni kuzatamiz, u odamlarda renin ifodasini modulyatsiya qilish uchun ma'lum (Marques va boshq., 2015) va BIRC6 va apoptozni bostirish qobiliyati tufayli nefrotoksiklikni kamaytirish uchun terapevtik maqsad hisoblanadi (Liu va boshqalar. al., 2018). Nihoyat, miR-9-3p bilan bog‘langan yopilish DARni kuzatamiz, bunda Wnt signaliga javob beruvchi Snai1 va Snai2.miR-9-3p ning teskari komplementi, miR-9-5p oqsillari uchun transkripsiya faktor izlari mavjud. dan himoya qilishi ma’lumbuyrakfibroz (Fierro-Fernández va boshq., 2020), Snai1 va Snai2 sichqon teri saratoni hujayralarida karsinoma metastazini rag'batlantirishi ko'rsatilgan (Olmeda va boshq., 2008) va saraton kasalliklarida epiteliyadan mezenximaga o'tishni (EMT) rag'batlantiradi. (Sundararajan va boshq., 2019), miR -9 esa angiogenez va o'simta endotelial hujayralarining migratsiyasini rag'batlantirishi ma'lum (Zhuang va boshq., 2012). Wnt signalining ortishi Snai1 va Snai2 ifodalarining pasayishiga olib keladigan mexanizm mavjud bo'lishi mumkin, bu esa o'z navbatida nefron progenitori differentsiatsiyasini qo'llab-quvvatlash uchun miR{11}}p ifodasini kamaytiradi.

Bizning tadqiqotimiz embrion rivojlanish davrida nefron progenitatorlarining xromatin landshafti va miRNK transkriptomasidagi o'zgarishlarni har tomonlama aniqladi va biz nefrogenezni to'xtatishda rol o'ynashi mumkin bo'lgan nomzod sis-regulyatsiya hududlarini va miRNKni aniqladik. mRNK-seq va ATAC-seq ma'lumotlarini boyitish tahlillari, jumladan, Notch va TGF- kabi nefron progenitori differentsiatsiyasini tartibga soluvchi yo'llar kabi ishtirok etishi mumkin bo'lgan mexanizmlar haqida qiziqarli maslahatlar beradi. Shuningdek, biz Eya1 va Pax8 uchun ikkita yangi taxminiy tartibga soluvchi elementlar haqida xabar beramiz, bu genlar uchun muhim bo'lgan.buyrakrivojlanish va nefrogenezni to'xtatishga aloqador bo'lgan asosiy miRNK uchun potentsial tartibga solish ketma-ketliklari.

Usullari

Sichqoncha shtammlari

Wildtype CD-1 homilador ayollar Charles River Laboratories, Inc.dan olingan (Wilmington, MA, AQSH, RRID: MGI:5659424) vabuyraklarE14.5 yoki P{2}} embrion kunida axlatdan yig'ib olingan. Barcha hayvonlar Pitsburgdagi (Pittsburg, Pensilvaniya, AQSh) UPMC bolalar kasalxonasidagi Rangos tadqiqot markazidagi vivariumga joylashtirildi va barcha hayvonlar tajribalari Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasining siyosatiga muvofiq amalga oshirildi. Pitsburg. Har bir embrion yoki kuchukcha uchun jins Y-xromosoma geni Sry uchun quyidagi primerlardan foydalangan holda quyruq parchalaridan ajratilgan genomik DNKda PCR o'tkazish yo'li bilan aniqlandi: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ va SryR 5ʹ-CTTATGTTCATTCATAGTAG,{}}CCATGTAG'{} ilgari nashr etilgan (McFarlane va boshq., 2013).

Kichik RNK ketma-ketligi va tahlili

dan ajratilgan umumiy RNKnefron progenitori hujayralariATAC-seq hujayra fraktsiyasi olib tashlanganidan keyin qolgan qismi QIAseq miRNA kutubxonasini tayyorlash to'plami (Qiagen 3315{{10}}2) yordamida kutubxona tayyorlash uchun Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasida Sog'liqni saqlash fanlari ketma-ketligi yadrosiga topshirildi. Illumina NextSeq500 da mRNK-seq kutubxonalarining bir uchli ketma-ketligi amalga oshirildi va kutubxonalar har bir kutubxona uchun taxminan 50 million bir tomonlama o'qish chuqurligiga qadar ketma-ketlashtirildi. Keyinchalik ketma-ket o'qishlar Rsubread to'plami (Liao va boshq., 2019) (versiya 2.0.1) yordamida sichqonchaning mm10 genomiga moslashtirildi va miRBase ro'yxatida (22-versiya) ma'lum miRNKga izoh berildi (Kozomara va Griffiths-Jones, 2014) Rsubread to'plamining featureCounts funksiyasi bilan. Ma'lum miRNKning differentsial ifodasi DESeq2 R to'plami (versiya 1.26.0) yordamida o'lchandi (Love va boshq., 2014). Ma'lum miRNKga izohlangan moslashtirilgan o'qishlar ulushi, shuningdek, har bir namunadagi ayol embrionlarning ulushi DESeq2 ga taqdim etilgan sinov modeliga kofaktor sifatida kiritilgan. So‘ngra differensial ifodalangan miRNK noto‘g‘ri aniqlash tezligini 5 foizda nazorat qilganda aniqlandi va ularning o‘zgarish yo‘nalishi (o‘sish va pasayish) ularning katlam o‘zgarishi qiymatiga qarab aniqlandi (“o‘sish” E14.5 bilan solishtirganda P0 da yuqori ifodani ko‘rsatmoqda) . MiRNKning prognoz qilingan gen maqsadlari o'rtasidagi tartibga solish yo'llarini sezilarli darajada ortib borayotgan va kamaygan ifoda bilan boyitish DIANA vositalari miRPath 3.0 versiyasi yordamida hisoblangan (Vlachos va boshq., 2015). MiRNK uchun bashorat qilingan maqsadli transkriptlar TargetScan (Agarwal va boshq., 2015) va miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) omborlaridan olindi.

Nefron progenitori izolyatsiyasi

Buyraklar{0}} E14.5 embrionlari yoki P0 kuchukchalarining axlatlaridan ajratildi va har bir axlat bitta namuna sifatida qabul qilindi. Keyingi tahlillarda "butun buyrak nazorati" sifatida foydalanish uchun umumiy RNK izolyatsiyasi uchun har bir namuna uchun bitta buyrak ishlatilgan (pastga qarang). Har bir vaqt nuqtasida jami uchta namuna to'plangan. Keyin kortikal hujayralar har bir namunadan ilgari e'lon qilingan magnit faollashtirilgan hujayralarni saralash (MACS) yordamida ajratilgan (Brown va boshq., 2011). Qisqacha aytganda, buyraklar 2 mM kollagenaza A (Roche 11088793001) va 3,5 mM pankreatin (Sigma P1625) bilan fosfat tamponli sho'r suvda (PBS) 15 daqiqa davomida 37 daraja haroratda qisman hazm bo'ldi. Ovqat hazm qilish reaktsiyasi 100 foizli sovuq homila sigir zardobi (FBS) yordamida to'xtatildi va hujayra suspenziyasi to'plandi va 1 mM fenilmetilsulfonil ftorid (PMSF) proteaza ingibitori (Sigma130170) bilan sovuq Dulbecco fosfat-buferli tuzida (DPBS) qayta suspenziya qilindi. Hujayralar yuvildi va PBSdagi 2 foizli FBS dan iborat muzdek sovuq izolyatsiya buferida qayta suspenziya qilindi, so'ngra Integrin alpha 86s (IAF 86s) uchun antikorlarga biotinlangan magnit boncuklar (Dynabeads FlowComp Flexi to'plami, ThermoFisher 11061D) bilan inkubatsiya qilindi. DSB-X Biotin Protein Labeling Kit (ThermoFisher D-20655) yordamida. Ushbu boncuklar bilan bog'langan nefron ajdodlari ilgari nashr etilgan (Hemker va boshq., 2020) ajratilgan va har bir namuna uchun buyraklar bo'ylab birlashtirilgan. 50,{29}} nefron progenitor hujayradan iborat alikvot zudlik bilan qayta ishlandi.kromatinga kirish imkoniyatikutubxonani tayyorlash protokoli (pastga qarang) va umumiy RNK Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004) yordamida qolgan hujayra suspenziyasidan olingan.

ning boyitishini tasdiqlash uchunnefron progenitori hujayralariboshqa hujayra turlariga nisbatan umumiy RNK nefron progenitatorlaridan, shuningdek, butundan ajratilganbuyraklar(butun buyrak nazorati, yuqoriga qarang) va quyidagi markerlar uchun miqdoriy teskari transkripsiyali PCR (qRT-PCR) amalga oshirildi: nefron progenitor markerlari Six2 va Cited1 (L. Huang va boshq., 2016) va Lhx1, Pdgfr uchun, Buyrak pufakchasini (Brunskill va boshq., 2014), buyrak stromasini (S. Chen va boshq., 2015), endoteliyni (Kobayashi va boshq., 2008) va siydik pufagini (Cebrian va boshq., 2014a) belgilaydigan Pecan va Caleb. ) mos ravishda hujayralar; Shuningdek, 1-rasmga qarang. Gapdh (Barber va boshq., 2005) uy xo'jaligi geni sifatida ishlatilgan va nisbiy miqdoriy aniqlash 2-DDCt usuli orqali hisoblangan (Livak va Shmittgen, 2001). Ushbu transkriptlar uchun primerlar 2-jadvalga kiritilgan.

Jadval 2. RT-PCR primerlari.

Xromatinga kirish imkoniyatikutubxona tayyorlash

Taxminan 50,000nefron progenitori hujayralariNextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) yordamida ATAC-seq uchun har bir ketma-ketlik kutubxonasini yaratish uchun avval chop etilgan usulga (Buenrostro va boshq., 2013) muvofiq oʻzgartirishlar kiritilgan. Qisqacha aytganda, hujayralar 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF proteaz inhibitori va hajmining 0,05% Triton X-100 dan iborat muzdek sovuq noionli lizis tamponida hujayra liziatsiyasi uchun 10 daqiqa davomida to'xtatildi. yadro membranalari buzilmagan holda membranalar. Buzilmagan nefron progenitor yadrolari transpozaza fermentini o'z ichiga olgan transpozitsiya tamponida qayta suspenziya qilindi va 37 daraja haroratda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Transpozitsiya jarayonida chiqarilgan erkin genomik DNK MinElute PCR Purification kiti (Qiagen 28004) yordamida tozalandi va keyin Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011) dan oldinga (i7) va teskari (i5) indeks primerlari yordamida indekslandi. Indeks ligatsiyasi va fragmentlarni kuchaytirish usulining PCR kuchaytirish termal tsikli dasturi yordamida erishildi.

ATAC-seq kutubxonasi uchun zarur boʻlgan kuchaytirish sikllarining optimal sonini aniqlash uchun SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) va 96-quduq C100 Termal Cycler (Bio-Rad) yordamida qPCR yon reaksiyasi oʻtkazildi. har bir tsikl uchun muxbir qiymati (Rn). Reaksiya maksimal floresansining uchdan bir qismiga yetgan sikl raqami qolgan kuchaytirish sikllarining optimal soni sifatida aniqlandi va indekslangan ATAC-seq transpozitsiya reaktsiyasining qolgan hajmi yakuniy kuchaytirishda qo'shimcha tsikllar soniga duchor bo'ldi. dastur. Yakuniy kutubxonalar Amure XP magnit boncuklari (Beckman Coulter A63881) yordamida tozalandi.

Xromatinga kirish imkoniyatiketma-ketlik

ATAC-seq kutubxonasining juft-uchli ketma-ketligi Illumina NextSeq500 da Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasida Sogʻliqni saqlash fanlari ketma-ketligi yadrosi tomonidan amalga oshirildi, kutubxona konsentratsiyasi bilan multiplekslangan holda har bir namunada 90 million juft oʻqishni olish kutilmoqda. . Oʻqishlar sifati TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (0.4.3-versiya) “--juftlangan” rejimida va boshqa standart sozlamalar bilan qisqartirildi. O'qishlar mm10 genomiga (Church va boshq., 2011) Bowtie2 (Langmead va boshq., 2009) (versiya 2.3.1) "--mahalliy -q -X 2000 --" sozlamalari bilan moslashtirildi. m". Xuddi shu DNK fragmentining PCR dublikatlari natijasida olingan o'qishlar standart sozlamalar bilan Picard Tools (Broad Institute, 2016) MarkDuplicates funksiyasi (2.10.9 versiyasi) yordamida belgilangan. Genomning bir nechta joylashuvi bilan noaniq xaritalangan oʻqishlar, agar toʻrttadan kam imkoniyat boʻlsa, tasodifiy ravishda ushbu joylardan biriga tayinlangan va aks holda yoʻq qilingan (ENCODE, nd) (https://github saytida mavjud boʻlgan Python skriptidan foydalangan holda). com/kundajelab/atac_dnase{26}}quvurlari, (Li, 2017) "--paired-end -k" sozlamalari bilan). Samtools (H. Li va boshq., 2009) (versiya 1.3.1) takrorlangan, xaritalanmagan, etim va mitoxondrial o'qishlarni filtrlash, shuningdek, BAM fayllarini saralash va indekslash uchun ishlatilgan. ATAC-seq ma'lumotlarining sifatini nazorat qilish ENCODE loyihasining ATAC-seq ko'rsatmalariga (ENCODE, nd) amal qildi va kutubxona o'lchamlaridagi farqlarni normallashtirish uchun namunaviy kutubxonalar tasodifiy pastga tushirildi va har birida 31 million juftlashtirilgan o'qishlar mavjud.

Cistanche buyrak infektsiyasini oldini oladi

Kirish mumkin bo'lgan xromatin hududlarini aniqlash

Filtrlangan ATAC-seq o'qishlarini o'z ichiga olgan BAM fayllari Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (2.26.0 versiyasi) yordamida juftlashtirilgan BED formatiga aylantirildi. "- bed pe -mate1" sozlamalari bilan funksiya. Kirish mumkin boʻlgan xromatin hududlari ChIP-seq (MACS2, versiya 2.1.1.20160309) modelga asoslangan tahlili) keng choʻqqi chaqiruv algoritmi (Zhang va boshq., 2008) yordamida, “--format BEDPE {{ sozlamalari bilan aniqlangan. 18}}g mm -p 0.01 --keng --shift 37 --matn oʻlchami 75 --barcha --modelni takrorlang”. Ishonchli kirish mumkin bo'lgan hududlarni aniqlash uchun juft-juft taqqoslashlar (ma'lum bir vaqt oralig'idagi har bir replikatsiya kombinatsiyasi) amalga oshirildi va takrorlanmaydigan kashfiyot tezligi (IDR) (Q. Li va boshq., 2011) ommaviy foydalanish mumkin bo'lgan ma'lumotlar yordamida hisoblab chiqildi. Python ilovasi (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu va boshq., 2015) sozlamalari bilan "--kiritish fayli turidagi keng choʻqqi --darajasi p.value {{ 35}}soft-IDR-ostagi 0.1 --chiqish-fayl tipidagi yotoq”. Xususan, har bir vaqt nuqtasi uchun barcha kirish mumkin boʻlgan hududlarning birlashtirilgan BED fayli har bir taqqoslash uchun “--peak-list” argumenti orqali taqdim etilgan (masalan, ikkita E14.5 namunasini solishtirganda, barcha E14.5 keng choʻqqilari. barcha uchta replikatsiya o'rtasida ishlatiladi). Kamida ikkita juftlik takroriy taqqoslashda (kamida 20 foiz oʻxshashlik bilan) IDR boʻyicha izchil boʻlgan foydalanish mumkin boʻlgan hududlar yuqori ishonchli kirish mumkin boʻlgan hududlarning birlashgan toʻplamiga birlashtirildi (“IDR hududlari”).

Kirish mumkin bo'lgan xromatin hududlaridagi o'zgarishlar

Berilgan namunadagi har bir IDR hududiga kirish imkoniyati namunalar bo'ylab ketma-ketlik GC tarkibini normallashtirishda sodir bo'ladigan transpozitsiya hodisalari sonini hisoblash orqali aniqlandi. Bunga maxsus skript yordamida erishildi (qo'shimcha dasturiy ta'minot omborida mavjud, qo'shimcha ma'lumotlarga qarang). Keyinchalik, Limma-voom (versiya 3.42.2) dasturiy paketi (Ritchie va boshq., 2006) yordamida bu qiymatlarni vaqt nuqtalari boʻyicha taqqoslash yoʻli bilan ushbu qulaylikdagi oʻzgarishlar aniqlandi. Embrion jinsini hisobga olish uchun har bir namunadagi ayol embrionlarining ulushi differensial qulaylik tahlili uchun ishlatiladigan chiziqli modellarga kofaktor sifatida kiritilgan va Limma paketining partiya effektini olib tashlash funksiyasidan foydalangan holda vizualizatsiyalarda partiya effekti sifatida olib tashlangan. Xromatinning differensial kirish mumkin bo'lgan hududlari (DAR) noto'g'ri aniqlash tezligini 10 foizga nazorat qilganda sezilarli darajada ochilgan (E14.5 va P0 oralig'ida foydalanish imkoniyati oshdi) yoki yopilgan (E14.5 va P0 oralig'ida foydalanish imkoniyati kamaygan) deb hisoblanadi. . Genomik hududlarni ochish va yopishning funktsional boyitish tahlillari tegishli koordinatalarni Genomik hududlarni Izohlarni boyitish vositasiga yuborish orqali aniqlandi (GREAT, http://great.stanford.edu/public/html/ saytida mavjud) (McLean va boshq., 2010). ). Ma'lum va bashorat qilingan kuchaytirgichlarning izohlari FANTOM5 (Andersson va boshq., 2014), VISTA (Visel va boshq., 2007) va EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020) omborlaridan olindi.

Transkripsiya omilining izlari

Transkripsiya faktor izlari barcha BAM fayllarini bir vaqtning o‘zida birlashtirib, so‘ngra Regulatory Genomics Toolbox-ning Hmm-asosidagi TF Footprints Identification (HINT) dasturiy ta’minotini (versiya 0.12.3), xususan, ATAC uchun oyoq izi modelini ishga tushirish orqali aniqlandi. -seq ma'lumotlari (www.regulatory-genomics.org saytida mavjud) (Z. Li va boshqalar, 2018). Bu dastur "oʻng-ishora izi --organizm=mm10 --at-seq --juftlangan uchi" sozlamalari bilan ishga tushirildi. Keyin oyoq izlari HOCOMOCO 11 maʼlumotlar bazasidan (Kulakovskiy va boshq., 2018) maʼlum sichqonchani bogʻlash motivlari bilan izohlangan, “Organizmga=mm10 mos keladigan oʻng-motif tahlili” sozlamalari bilan HINTning motivlarni moslashtirish funksiyasidan foydalangan holda. HINT balli 10 dan past bo'lgan izlar chiqarib tashlandi. Nihoyat, motivga mos keladigan izlar orasidagi differentsial faollik naqshlari RGT-HINT dasturining differentsial funktsiyasi yordamida o'lchandi, bunda "o'ng-ishora differensial --organizm=mm10 --miloddan avvalgi {{27}) sozlamalari mavjud. }NC 12 --chiqish-profillari". Faoliyatning sezilarli darajada o'zgaruvchan darajalari p-qiymati 0,05 (Fridman-Nemeny usuli) chegarasi asosida aniqlandi.

Cistanche buyraklar faoliyatini yaxshilashi mumkin

Nukleosoma konfiguratsiyasi

Xuddi shu vaqt nuqtasidan olingan o'qishlar bitta BAM fayliga birlashtirildi va NucleoATAC to'plami (versiya 0.3.4) ikkala bog'langan nukleosoma diadalari va nukleosomalardan xoli hududlarni ko'rsatadigan o'qish uzunligi naqshlarini aniqlash uchun ishlatilgan ( NFRs) (Schep va boshq., 2015). Ushbu dastur standart sozlamalar yordamida amalga oshirildi. Nukleosomalarga izoh berilgan, chunki 146bp mintaqa har bir nukleosoma diadasi atrofida joylashgan.

Bir hujayrali RNK ifodasi

Bir hujayrali gen ifodasi ma'lumotlari oldingi qo'lyozma uchun qayta ishlangan (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais va boshq., 2020) va Gene Expression Omnibus'dan olingan. (GEOID GSE158166). Qo'shimcha 7-rasmga kiritilgan qayta ishlangan ma'lumotlar hujayra turlari, genlarni ifodalash darajalari, past o'lchamli (tSNE) joylashuvi va proliferatsiya qiluvchi va farqlovchi nefron progenitatorlari klasterlari o'rtasida o'rnatilgan traektoriyaga nisbatan psevdotime izohlarni o'z ichiga oladi. Ma'lumotlarga kirish va tartibga solish SingleCellExperiment R paketi yordamida amalga oshirildi (Lun & Risso, 2019).

Nefron progenitor hujayralarining qarishi va differentsiatsiyasida miRNK-mRNK o'zaro ta'siri

O'z-o'zini yangilash, astarlash va farqlash o'rtasida o'zgaruvchan ifodaga ega genlarnefron progenitori hujayralariBais va boshqalar tomonidan nashr etilgan qo'shimcha 3 va 4-jadvallardan olingan. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Birlamchi nefron progenitatorlarida kromatin immunoprecipitatsiya ketma-ketligi

Birlamchi nefron ajdodlarida -katenin, Lef1, Six2 va Tcf7 bog'lanishi uchun xromatin immunopretsipitatsiyasi ketma-ketligi (ChIP-seq) ma'lumotlari Guo va boshqalar uchun GEO omboridagi (GSE131119) BedGraph fayllaridan olindi, 2021 yil. Signalning o'rtacha qiymatlari kengaytirildi takroriy namunalar bo'ylab.

MiRNK ifodasiga ta'sir qiluvchi tartibga soluvchi elementlar uchun skrining

MiRNKning potentsial kuchaytirgichlarini tekshirish uchun biz miRNK va DAR-larga 3D Genome brauzeridan yuklab olingan sichqon embrion ildiz hujayralarining mm10 izohlari asosida joylashgan topologik bog'langan domenlarga (TAD) izoh berdik (http://3dgenome saytida mavjud) .fsm.northwestern.edu/) (Y. Vang va boshq., 2018). ning hududlarikromatinga kirish imkoniyativa miRNK nomzod kuchaytirgichlar - miRNK juftlari, agar ular bir xil TADni egallagan bo'lsa va foydalanish imkoniyati va ekspressiyasida izchil o'zgarishlarni ko'rsatsa (miRNK ifodasining oshishi bilan foydalanish imkoniyatini oshiradi va aksincha) deb hisoblanadi. DARlar faqat ma'lum promouter yoki ekson uchi bilan bir-biriga mos kelmasa, mumkin bo'lgan "tartibga solish xususiyatlari" sifatida ko'rib chiqildi. Potentsial juft miRNK va taxminiy tartibga soluvchi elementlar, agar ular 1) bir xil TAD doirasida bo'lsa va 2) E14.5 va P0 o'rtasida sezilarli o'zgarishlarni boshdan kechirgan bo'lsa (miRNK ifodasini oshirish va IDR hududiga kirish imkoniyatini oshirish va aksincha) birinchi o'ringa qo'yiladi. .

Minnatdorchilik

Shelby Hemker va Abha Bais eksperimental dizaynga hissa qo'shdilar. ATAC-seq va mRNK-seq uchun ketma-ketlik Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasida Sog'liqni saqlash fanlari Sequencing Core tomonidan amalga oshirildi.

Raqobatdosh manfaatlar

Raqobat qiluvchi manfaatlar e'lon qilinmagan

Moliyalashtirish

AC Milliy diabet va ovqat hazm qilish instituti grantlari tomonidan qo'llab-quvvatlandiBuyrakMilliy salomatlik instituti (T32DK061296-17) qoshidagi kasalliklar. DK Milliy Sog'liqni saqlash instituti (R01GM115836) qoshidagi Milliy umumiy tibbiyot fanlari instituti grantlari bilan qo'llab-quvvatlandi. JH Milliy Sog'liqni saqlash instituti (R01DK103776 va 125015) qoshidagi Qandli diabet va ovqat hazm qilish va buyrak kasalliklari milliy instituti grantlari bilan qo'llab-quvvatlandi. DMC Nefrotik sindromni o'rganish tarmog'i (NEPTUNE) martaba rivojlantirish mukofoti va Pitsburgdagi bolalar kasalxonasi tadqiqot maslahat kengashi doktorlikdan keyingi stipendiya tomonidan qo'llab-quvvatlandi. YP Pitsburgdagi UPMC bolalar kasalxonasi va Shimoliy Amerika mitoxondrial kasalliklar konsortsiumi grantlari tomonidan qo'llab-quvvatlandi.

Ma'lumotlar mavjudligi

Sichqonchaning taxminiy kuchaytirgichlari FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; fayl bu yerda mavjud), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; fayl bu yerda mavjud) va EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980 fayllari bu yerda mavjud) dan olindi. ma'lumotlar bazalari. Sichqoncha mm10 genomi va uning izohlari Illumina genomlari loyihasi orqali yuklab olingan (bu yerda mavjud). mm9 koordinatalarini mm10 ga ko'tarish uchun zanjirli fayl UCSC genom brauzeridan olindi (DOI: 10.1101/gr.229102; fayl bu yerda mavjud). Sichqoncha embrion ildiz hujayralaridan TAD izohlari 3D Genom brauzeridan olindi (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; fayl bu yerda mavjud). Bashorat qilingan miRNK transkript maqsadlari TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, fayl bu yerda mavjud) va miRDB 6-versiyasidan (DOI: 10.1093/var/gkz757, fayl bu yerda mavjud) olindi. IDR/DAR joylashuvi, izohlar va differentsial boyitish natijalarini oʻz ichiga olgan ATAC-seq maʼlumotlari GEO (GSE168339) da mavjud, mRNK-seq maʼlumotlari, jumladan izohlar va differentsial ifoda natijalari (GSE168342). Ma'lumotlarni qayta ishlash va tahlil qilish va raqamlarni yaratish uchun ishlatiladigan kompyuter kodi https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers sahifasida mavjud.

Bibliografiya

Abruzze, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M. (2019). Homeobox transkripsiya omili MEIS2 ko'p miyelomda saraton hujayralarining omon qolishi va IMiD faolligining regulyatoridir: Bromodomain va Extra-Terminal (BET) oqsil inhibitörleri tomonidan modulyatsiya. Hujayra o'limi va kasalligi, 10 (4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarval, V., Bell, GW, Nam, JW va Bartel, DP (2015). Sutemizuvchilar mRNKlarida samarali mikroRNK maqsadli joylarini bashorat qilish. Elife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Migel-Escalada, I., Tuyoq, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Shmidl, C., Suzuki, T. ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Shvartsfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Inson hujayralari turlari va to'qimalarida faol kuchaytirgichlar atlasi. Tabiat, 507 (7493), 455-461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Galoreni kesish. Bioinformatika bo'yicha. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Yagona hujayrali RNK ketma-ketligi nefrogenez jarayonida asosiy hujayra populyatsiyalarida differentsial hujayra sikli faolligini ochib beradi. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Sartarosh, RD, Xarmer, DW, Coleman, RA va Klark, BJ (2005). GAPDH uy xo'jaligi geni sifatida: 72 ta inson to'qimalari panelida GAPDH mRNK ifodasini tahlil qilish. Fiziologik genomika. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNK maqsadli tanib olish va tartibga solish funktsiyalari. Hujayra, 136 (2), 215-233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Duglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). Inson nefron soni: salomatlik va kasallik uchun ta'siri. Bolalar nefrologiyasi, 26 (9), 1529-1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ va Li, Q. (2015). Qayta tiklanmaydigan kashfiyot darajasi (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A. va Busslinger, M. (2002). Pax2 va Pax8 tomonidan nefrik naslning spetsifikatsiyasi. Genlar va rivojlanish. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Kimdan: Jurnal Pre-proof

2021 Elsevier Inc tomonidan nashr etilgan.