Cistanche Deserticola polisaxarid RANKL signalini va reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarishni inhibe qilish orqali osteoklastogenez va suyak rezorbsiyasini susaytiradi.

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song va boshqalar

Osteoporoz - bu osteopeniya va suyak mikro tuzilishining buzilishi bilan tavsiflangan metabolik kasallik. Osteoklastlar suyak matritsasini buzadigan asosiy effektor hujayralardir va ularning anormal funktsiyasi osteoporozning rivojlanishiga olib keladi. Hujayra almashinuvi jarayonida reaktiv kislorod turlari (ROS) to'planishi osteoklastlarning ko'payishi va differentsiatsiyasiga yordam beradi, shuning uchun osteoporozda muhim rol o'ynaydi.Cistanchedesertikolapolisakkarid(CDP) o'smaga qarshi, yallig'lanishga qarshi va antioksidant ta'sirga ega. Biroq, CDP ning osteoklastlarga ta'siri aniq emas. Ushbu tadqiqotda CDP ni ko'rsatish uchun tartaratga chidamli kislota fosfatazani bo'yash, immunofluoresans, teskari transkripsiya-polimeraza zanjiri reaktsiyasi va western blot tahlilidan foydalanilgan.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklastogenez va gidroksiapatit rezorbsiyasini inhibe qiladi. Bundan tashqari, CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)shuningdek, Ctsk, Mmp9 va Acp5, jumladan, osteoklast marker genlarining ekspressiyasini inhibe qildi va yadro omili KB (RANK) ifodasi retseptorlari faollashtiruvchisiga ta'sir qilmadi. Mexanik tahlillar shuni ko'rsatdiki, CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklastlarda RANKL vositachiligida ROS ishlab chiqarishni susaytirish uchun antioksidant fermentlarning ekspressiyasini oshiradi va faollashtirilgan T hujayralarining yadro omilini va mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaz faollashuvini inhibe qiladi. Ushbu natijalar CDP haddan tashqari osteoklast faolligi tufayli kelib chiqqan osteoporozni davolash uchun nomzod dori bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

KALİT SO'ZLARsuyak rezorbsiyasi,Cistanchedesertikolapolisakkarid, MAPK, osteoklast, reaktiv kislorod turlari

cistanche bodibilding

1|KIRISH

Osteoblastlar vositachiligida suyak shakllanishi va osteoklastlar vositachiligida suyak rezorbsiyasi o'rtasidagi muvozanat suyak metabolik gomeostazini saqlashda muhim rol o'ynaydi (Manolagas, 2000; Zhu va boshq., 2018). Suyak rezorbsiyasi suyak hosil bo'lishidan oshib ketganda, osteoporoz paydo bo'ladi, bu suyak massasining kamayishi va suyak mikrostrukturasining shikastlanishi bilan tavsiflanadi (Ikeda, 2008). Osteoporoz keksa odamlar va postmenopozal ayollarda keng tarqalgan kasallik bo'lib, uning patogenezi to'liq aniqlanmagan (Cooper & Melton, 1992). Estrogen etishmovchiligi osteoporozning asosiy sababidir (Manolagas, O'Brien va Almeida, 2013). Bundan tashqari, reaktiv kislorod turlari (ROS) yadro omili KB ligandining (RANKL) retseptorlari faollashtiruvchisi tomonidan qo'zg'atilishi mumkin va osteoklast shakllanishi bilan bog'liq (Yip va boshq., 2005) va shuning uchun osteoporozning rivojlanishiga hissa qo'shishi mumkin (Manolagas, 2010). Ba'zi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Nrf2-antioksidant tanqisligi ROS darajasini oshiradi va RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklast farqlanishiga yordam beradi (Hyeon, Li, Yang va Jeong, 2013). Shuning uchun osteoklastlarni farqlash paytida ROS ishlab chiqarishni kamaytirish osteoporozni davolash uchun terapevtik strategiya sifatida baholanishi kerak.

Osteoklastlar monotsitlar yoki makrofaglar gematopoetik nasldan kelib chiqadi va suyak rezorbsiyasini amalga oshiradigan yagona ko'p yadroli hujayralardir (Teitelbaum, 2000). Shu sababli, osteoklast shakllanishi bilan bog'liq tadqiqotlar suyak metabolizmi kasalliklarini samarali davolash usullarini ishlab chiqishda katta ahamiyatga ega (Lorenzo, 2017). Osteoblastlar va faollashtirilgan T hujayralari tomonidan ishlab chiqarilgan makrofag koloniyasini ogohlantiruvchi omil (M-CSF) va RANKL osteoklastogenezni tartibga soluvchi muhim sitokinlardir (Kim va Kim, 2016; Teitelbaum va Ross, 2003). RANKL faollashtirilgan T hujayralarining yadro omili (NFATc1) ifodasini qo'zg'atadi, bu osteoklast shakllanishi paytida faol bo'lgan muhim transkripsiya omili (Ishida va boshq., 2002). Faollashtirilgan NFATc1 osteoklastogenez va osteoklast funktsiyasini tartibga soluvchi tartratga chidamli kislota fosfataza (TRAcP) va katepsin K (CTSK) kabi osteoklast marker genlarining ifodalanishiga yordam beradi (Balkan va boshq., 2009; Crotti va boshq., 2008).

Cistanchedesertikolapolisakkarid(CDP) ning go'shtli poyasidan ajratilganCistancheva immunitetni tartibga solish, o'smaga qarshi, qarishga qarshi va boshqa farmakologik ta'sirga ega (Guo va boshq., 2016; Jia, Guan, Guo va Du, 2012). CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)sichqonchaning mikroglial hujayralarida lipopolisakkariddan kelib chiqqan azot oksidi (NO) ishlab chiqarishga inhibitiv ta'sir ko'rsatdi (BV-2 hujayralari; Nan va boshq., 2013). Bundan tashqari, feniletanoidga boy ekstrakti (ECD).Cistanchemushaklarning shikastlanishini kamaytirish, sut kislotasi to'planishini kechiktirish va energiyani saqlashni yaxshilash orqali sichqonlarning suzish qobiliyatini oshirdi (Cai va boshq., 2010). Biroq, CDP ning osteoklast funktsiyasi va faoliyatiga ta'siri noma'lumligicha qolmoqda.

Ushbu tadqiqotda biz CDP ni ko'rsatdik(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastlarning differentsiatsiyasini va suyak rezorbsiyasini inhibe qiladi. Asosiy mexanizm bu CDP edi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)ROS ishlab chiqarishni susaytirish uchun antioksidant fermentlarning ekspressiyasini kuchaytiradi va keyin RANKL bilan faollashtirilgan NFAT va mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaz (MAPK) signalizatsiya kaskadlarini bostiradi. Ushbu natijalar CDP ekanligini ko'rsatadi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)haddan tashqari osteoklastik suyak rezorbsiyasi natijasida kelib chiqqan osteoporozni davolash uchun ishlatilishi mumkin.

maca ginseng cistanche

2|MATERIALLAR VA USLUBLAR

2.1|Materiallar

CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)(tozaligi > 98 foiz) Solarbio (Pekin, Xitoy) dan sotib olindi va fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS) 1 mM konsentratsiyada tayyorlangan. Antikorlar c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforlangan (p)-ERK, p-p38, p-JNK va -aktin uchun xosdir, Santadan olingan. Kruz biotexnologiyasi (San-Xose, Kaliforniya). V-ATPase d2 ga antikorlar ilgari tavsiflanganidek ishlab chiqarilgan (H. Feng va boshq., 2009). 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) va lusiferaza tahlil tizimi Promega (Sidney, Avstraliya) dan olingan. . Rekombinant M-CSF R&D Systems (Minneapolis, MN) dan sotib olingan. Rekombinant GST-rRANKL oqsili ilgari tasvirlanganidek ifodalangan va tozalangan (Xu va boshq., 2000).

2.2|Hujayra madaniyati

RAW264.7 hujayralar (sichqoncha makrofagi hujayralari) American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) dan olindi va 10 foizli homila sigir zardobi, 2 mM bilan to'ldirilgan modifikatsiyalangan minimal muhim muhitda (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Avstraliya) yetishtirildi. L-glutamin, 100 U/ml penitsillin va 100 ug/ml streptomitsin (to'liq muhit). Suyak iligidan olingan monotsitlar (BMM) 6 haftalik C57BL / 6J sichqonlaridan ajratildi, ular G'arbiy Avstraliya universitetining Hayvonlar etikasi qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protseduralarga muvofiq evtanizatsiya qilindi (RA/3/100/1244). Uzoq suyaklar yumshoq to'qimalardan xoli bo'lib ajratildi va suyak iligi femur va tibiadan yuvildi, so'ngra M-CSF (50 ng / ml) ishtirokida to'liq muhitda o'stirildi.

2.3|Osteoklastogenez tahlili

BMMlar har bir quduq uchun 6 × 103 hujayra zichligidagi 96 quduqli madaniyat plitalariga qo'yildi va M-CSF (50 ng / ml) va GST-rRANKL (100 ng / ml) mavjud bo'lgan to'liq muhit bilan ishlov berildi. CDP ning o'zgaruvchan kontsentratsiyasining yo'qligi(Cistanchedesertikolapolisakkarid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>uchta yadro) osteoklastlar sifatida aniqlangan.

2.4|Sitotoksiklik tahlillari

BMMlar har bir quduqqa 6 × 103 hujayradagi 96 quduqli plitalarga ekilgan va yopishtirish uchun bir kechada qoldirildi. Ertasi kuni hujayralar CDP ning turli konsentratsiyasi bilan inkubatsiya qilindi(Cistanchedesertikolapolisakkarid). Yana 48 soatdan keyin MTS eritmasi (20 µl/quduq) qo‘shildi va 2 soat davomida hujayralar bilan inkubatsiya qilindi. 490 nm chastotada absorbans mikroplastinka o'quvchi bilan aniqlandi (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Immunofluoresan bo'yash

BMMlar bir kechada M-CSF (50 ng/ml) ishtirokida har bir quduqqa 6 × 103 hujayra zichligida ekilgan. Keyin hujayralar etuk osteoklastlar hosil bo'lgunga qadar M-CSF va GST-rRANKL (100 ng/ml) bilan rag'batlantirildi. Keyin osteoklastlar turli konsentratsiyali CDP bilan ishlov berildi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)4% paraformaldegid bilan mahkamlashdan oldin 48 soat davomida 0,1% Triton X‐100–PBS bilan o'tkazuvchanlik va PBSda 3% sigir zardobi albumini bilan blokirovka qilish. Tayyorlangan hujayralar F-aktin uchun bo'yash uchun qorong'ida 45 daqiqa davomida rodamin bilan konjugatsiyalangan phalloidin bilan inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar PBS bilan yuvilgan, yadrolar 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) bilan bo'yalgan va konfokal mikroskop uchun qoplamalar bilan o'rnatilgan.

cistanche tajribasi

2.6|Gidroksiapatit rezorbsiyasi tahlili

Olti quduqli kollagen bilan qoplangan plitalarda (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) o'stirilgan BMM (har bir quduq uchun 1 × 105 hujayra) osteoklast faolligini o'lchash uchun GST-rRANKL (100 ng/ml) va M-CSF (50 ng/) bilan stimulyatsiya qilindi. ml) etuk osteoklastlar hosil bo'lgunga qadar (Chjou va boshq., 2016). Keyin hujayralar hujayra dissotsiatsiya eritmasi (Sigma-Aldrich) yordamida plastinkadan muloyimlik bilan ajratildi va teng miqdordagi etuk osteoklastlar gidroksiapatit bilan qoplangan 96 quduqli plitalardagi (Corning Osteoassay, Corning, NY) alohida quduqlarga ekildi. Yetuk osteoklastlar GST-rRANKL va M-CSF o'z ichiga olgan muhitda CDP bilan yoki bo'lmasdan inkubatsiya qilingan.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)ko'rsatilgan konsentratsiyalarda. 48 soatdan keyin quduqlarning yarmi yuqorida tavsiflanganidek, har bir quduqdagi ko'p yadroli hujayralar sonini baholash uchun TRAcP faolligi uchun immunohistokimyoviy bo'yalgan. Qolgan quduqlar hujayralarni olib tashlash va rezorbsiyalangan joylarni o'lchash imkonini berish uchun 10 daqiqa davomida oqartirildi. Rezorbsiyalangan joylar standart yorug'lik mikroskopi ostida suratga olindi va Image J dasturi (Milliy sog'liqni saqlash institutlari, Bethesda, MD) osteoklastlar tomonidan so'rilgan gidroksiapatit yuzasining foiz maydonini aniqlash uchun ishlatilgan.

2.7|Lusiferaza muxbiri tahlillari

NFATc1 transkripsiya faollashuvini tekshirish uchun RAW264.7 xujayralari NFATc1-javob beruvchi lusiferaza reportyor konstruksiyasi bilan barqaror transfektsiya qilindi (Cheng va boshq., 2018; van der Kraan va boshq., 2013). Transfektsion hujayralar har bir quduq uchun 1,5 × 105 hujayra zichligida 48 teshikli plastinkalarda o'stirildi va turli konsentratsiyalarda CDP bilan oldindan ishlov berildi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)1 soat davomida. Oldindan ishlov berishdan so'ng hujayralar 24 soat davomida GST-rRANKL (100 ng/ml) bilan rag'batlantirildi va ishlab chiqaruvchining protokoliga (Promega) muvofiq lusiferaza reportyor tahlil tizimi yordamida lusiferaza faolligi o'lchandi.

2.8|Kantitativ teskari transkripsiya-polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR) tahlili

Jami RNK ishlab chiqaruvchining protokoliga (Thermo Fisher Scientific) muvofiq Trizol reagenti yordamida hujayralardan ajratilgan. Qo'shimcha DNK 1 ug RNK shabloni va oligo-dT primerlari bilan Moloney murin leykemiya virusi teskari transkriptazasi yordamida sintez qilindi. Muayyan ketma-ketliklarni polimeraza zanjiri reaktsiyasini kuchaytirish quyidagi dastur yordamida amalga oshirildi: 5 daqiqa davomida 94 daraja, keyin 40 soniya davomida 94 daraja 30 tsikl, 40 soniya davomida 60 daraja va 40 soniya davomida 72 daraja va yakuniy uzaytirish bosqichi 72 daraja haroratda 5 daqiqa. Muayyan primerlarning batafsil ma'lumotlari 1-jadvalda ko'rsatilgan. Nisbiy xabarchi RNK darajalari Hmbs uy xo'jaligi geni ifodasini normallashtirish orqali hisoblangan.

2.9|Western blot tahlili

BMMlar M-CSF bilan to'liq muhitda oltita teshikli plastinkalarda o'stirildi va belgilangan vaqtlarda GST-rRANKL (100 ng/ml) bilan stimulyatsiya qilindi. Hujayralar radioimmunoprecipitatsiya lizis tamponida lizing qilindi va oqsillar natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi orqali hal qilindi va poli(viniliden ftorid) membranalariga o'tkazildi (GE Healthcare, Silverwater, Avstraliya). Membranalar 1 soat davomida 5 foizli yog'siz sutda to'sib qo'yildi va keyin 4 daraja haroratda kechasi yumshoq silkitib, turli xil o'ziga xos birlamchi antikorlar bilan tekshirildi. Membranalar yuvilgan va keyinchalik horseradish peroksidaza bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilingan. Keyin antikor reaktivligi kengaytirilgan xemiluminesans reagenti (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) yordamida aniqlandi va Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare) bilan vizualizatsiya qilindi.

2.10|Hujayra ichidagi ROSni aniqlash

Hujayra ichidagi ROS darajalari 2',7'-diklorofloressein diasetat uyali ROS aniqlash tahlili to'plami (Abcam, Melburn, Avstraliya) yordamida aniqlandi. BMM (har bir quduq uchun 5 × 103 hujayra) 96-quduqli plastinkalarda o'stirildi va 72 soat davomida RANKL (100 ng / ml), M-CSF (50 ng / ml) va CDP bilan ishlov berildi. Hujayra ichidagi ROS darajalari ROS ishtirokida floresan DCF ga oksidlanadigan 2',7'-diklorofloressein diasetat yordamida o'lchandi. Hujayralar Hank tamponida yuvildi va 10 mkM DCFH-DA bilan qorong'i joyda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Tasvirlar konfokal mikroskop yordamida olingan.

2.11|Statistik tahlillar

Barcha ma'lumotlar, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, uch nusxada o'tkazilgan kamida uchta tajribani ifodalaydi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalanadi. Natijalar orasidagi farqlarning ahamiyatini aniqlash uchun bir tomonlama dispersiya tahlili va keyin Student-Nyuman-Keuls post hoc testlari qo'llanildi, p < 0.05="" muhim="" deb="">

3|NATIJALAR

3.1|CDP RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastogenez va osteoklast sintezini inhibe qiladi

CDP yoki yo'qligini aniqlash uchun(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklast shakllanishini bostirishi mumkin, biz birinchi navbatda sichqonchani BMMlari yordamida osteoklastogenez tahlilini o'tkazdik (Liu va boshq., 2013; Song va boshq., 2016). BMMlar CDP kontsentratsiyasining ortishi bilan 5 kun davomida RANKL va M-CSF bilan davolandi. CDP kontsentratsiyasida CDP TRAcP-musbat ko'p yadroli hujayralar sonini kamaytirdi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)5 µM yoki undan yuqoriga yetdi (1a,b-rasm). CDP ni baholash uchun(Cistanchedesertikolapolisakkarid)toksikligi va bu natijalar hujayra o'limi yoki sonining aksi emasligini tasdiqlang, biz MTS tahlilini o'tkazdik. BMMlar CDP ning turli dozalari bilan 48 soat davomida RANKL va M-CSF bilan davolandi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid). CDP 15 µM yoki undan kam konsentratsiyada BMM proliferatsiyasiga ta'sir qilmadi (1c-rasm).

CDP ta'sirini sinab ko'rish uchun(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklast sintezida osteoklastlar RANKL va M-CSF bilan davolashda, CDP ning turli dozalari bilan yoki bo'lmasdan induktsiya qilingan.(Cistanchedesertikolapolisakkarid). Osteoklastlar har bir osteoklastdagi yadrolar sonini baholash uchun rodamin-phalloidin va DAPI bilan bo'yalgan (2a-rasm). Har ikkala osteoklast soni va osteoklastdagi yadrolarning o'rtacha soni CDP dan keyin kamaydi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)davolash (5–10 µM; 2b,c-rasm). Shuning uchun, CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastogenez va osteoklast sinteziga dozaga bog'liq ravishda inhibitiv ta'sir ko'rsatdi.

3.2|CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastik gidroksiapatitning rezorbsiya faolligini susaytiradi

CDP ta'sirini aniqlash uchun gidroksiapatit rezorbsiyasi tahlili o'tkazildi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklast funktsiyasi haqida (3a-rasm). 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng, har bir quduqdagi osteoklastlar soni o'zgarmadi, gidroksiapatitning rezorbsiya maydoni nazorat guruhlari bilan solishtirganda 5 va 10 mkM CDP bilan ishlov berish natijasida sezilarli darajada kamaydi (3b, c-rasm). Ushbu natijalar CDP ekanligini ko'rsatadi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)har qanday sitotoksik ta'sirsiz osteoklast shakllanishi va osteoklastning rezorbsiya faolligiga kuchli inhibitiv ta'sir ko'rsatadi.

3.3|CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklast marker gen ifodasini inhibe qiladi

CDP ning inhibitiv ta'sirini qo'shimcha tekshirish(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklastogenez va osteoklastik suyak rezorbsiyasi bo'yicha BMMlar 5 kun davomida turli xil CDP konsentrasiyalari bilan RANKL va M-CSF bilan davolandi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid). Keyin osteoklast marker genlarining ifodasini aniqlash uchun RT-PCR o'tkazildi. Osteoklastogenezda muhim transkripsiya omili bo'lgan Nfatc1 ifodasi CDP tomonidan inhibe qilingan.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)dozaga bog'liq holda (4a-rasm). Bundan tashqari, CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)(5 va 10 mkM) Mmp9, Ctsk va Acp5 ni o'z ichiga olgan suyak rezorbsiyasi bilan bog'liq genlarning ifodasini pasaytirdi (4b-d-rasm).

3.4|CDP NFATc1 faolligini va quyi oqimdagi oqsil ifodasini bostiradi

CDP ta'sirini tekshirish(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan NFATc1 faolligi bo'yicha lusiferaza muxbiri tahlili o'tkazildi. CDP bilan davolash(Cistanchedesertikolapolisakkarid), 5 mkM va undan yuqori konsentratsiyalarda RANKL tomonidan qo'zg'atilgan NFATc1 faolligini sezilarli darajada inhibe qildi (5a-rasm). Bundan tashqari, western blot tahlili CDP ekanligini ko'rsatdi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL va M-CSF bilan 3 va 5 kun davomida davolangan BMMlarda NFATc1 va c-Fos ning protein ifodasini sezilarli darajada bostirdi (5b-rasm). Bundan tashqari, V-ATPase-d2 va CTSK kabi osteoklast funktsiyasi bilan bog'liq oqsillarning ifodasi CDP mavjudligida pastga tushirildi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)nazorat guruhlari bilan solishtirganda. Biroq, CDP RANK ifodasiga hech qanday ta'sir ko'rsatmadi (5b-rasm).

3.5|CDP RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastogenez paytida ROS ishlab chiqarishni yo'q qilish uchun antioksidant fermentlarning ifodalanishiga yordam beradi.

CDPga bog'liq osteoklastogenez inhibisyonining asosiy mexanizmini o'rganish uchun BMMlar PBS yoki CDP bilan birga RANKL (100 ng / ml) va M-CSF (50 ng / ml) bilan davolash qilindi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)72 soat davomida. Biz CDP ning RANKL tomonidan rag'batlantirilgan hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishga ta'sirini ko'rib chiqdik. Hujayra ichidagi ROS darajalari RANKL bilan davolash orqali oshirildi, bu CDP tomonidan zaiflashtirildi (5 va 10 mkM; 6a-rasm). ROS-musbat hujayralar soni va ROS bo'yash intensivligi dozaga bog'liq ravishda CDP bilan davolash orqali kamaydi (6b, c-rasm). Western blot tahlili shuni ko'rsatdiki, CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL va M-CSF bilan 3 kun davomida davolangan BMMlarda induksiyalanuvchi azot oksidi sintaza (NOS2) ifodasini bostirish bilan birga tioredoksin (TRX1) va glutation reduktaza (GSR) ifodasini kuchaytirdi (6d-rasm).

CDP bo'lsa, batafsilroq o'rganish uchun(Cistanchedesertikolapolisakkarid)ROS ishlab chiqarishni kamaytirish orqali osteoklast differentsiatsiyasini bostirdik, keyin hujayralardagi yuqori ROS holatiga taqlid qilish uchun BMMlarni peroksid (10 mkM) bilan davolashdik. BMMlar RANKL va M-CSF tomonidan 3 kun davomida induktsiya qilindi va western blot tahlili va RT-PCR natijalari nazorat guruhlari bilan solishtirganda peroksid NFATc1 va c-Fos ifodasini oshirganligini ko'rsatdi. 5-rasmdagi natijalarga muvofiq, NFATc1 va c-Fos ifodasi CDP tomonidan bostirildi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid)peroksid esa CDP ning inhibitiv ta'sirini qutqardi (6e, f-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, CDP ROS ishlab chiqarishni tozalash orqali NFATc1 va c-Fos ifodasini bostirgan.

3.6|CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastogenez paytida MAPK yo'llarini bostiradi

Keyinchalik, biz CDP ta'sirini tekshirdik(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL vositachiligidagi TRAF6 ifodasi va MAPK yo'lini faollashtirish bo'yicha davolash. Sarumsiz muhitda 2 soat davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, BMMlar CDP bilan yoki CDPsiz RANKL bilan 60 daqiqa davomida stimulyatsiya qilindi. CDP (10 µM) bilan stimulyatsiya TRAF6 ifodasiga hech qanday ta'sir ko'rsatmadi va 10 va 20 daqiqada JNK2 va ERK1/2 ning zaiflashgan fosforillanishiga ta'sir ko'rsatmadi (7-rasm). Bundan tashqari, p38 fosforillanishi CDP tomonidan sezilarli darajada inhibe qilingan(Cistanchedesertikolapolisakkarid)nazorat guruhlari bilan solishtirganda 60 daqiqa davolash (7-rasm). Ushbu ma'lumotlar CDP ekanligini ko'rsatadi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan MAPK signalizatsiya yo'llarini bostiradi, bu uning osteoklast shakllanishi va faoliyatiga inhibitiv ta'siriga mos keladi.

4|MUHOKAZA

"Cho'l jenshen" nomi bilan tanilgan Cistanche so'nggi paytlarda immunitetni modulyatsiya qilish va qarish va oksidlovchi stress paytida himoya qilish qobiliyati bilan ko'pchilikning e'tiborini tortdi (Jia va boshq., 2012; Snytnikova va boshq., 2012). Cistanche ning asosiy faol komponentlari bo'lgan fenilpropanoid bilan almashtirilgan glikozidlar makrofaglarda NO faolligini inhibe qilishi ko'rsatilgan (Ahn, Chae, Chin va Kim, 2017). Bundan tashqari, aCistancheekstrakti ishemiyadan keyin reperfüzyon qilingan miyokarddagi oksidlovchi stressni pasaytirdi va kardioproteksiyaga olib keladigan apoptotik yo'llarni inhibe qilishda muhim rol o'ynadi (Yu, Li va Cao, 2016). Cistanche, CDP ning muhim tarkibiy qismi sifatida(Cistanchedesertikolapolisakkarid)turli farmakologik funktsiyalarga ega. Bizning hozirgi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, CDP ROS ishlab chiqarishni, shuningdek NFAT va MAPK faollashuvini susaytirish orqali RANKL bilan faollashtirilgan osteoklastlarning differentsiatsiyasi va faollashuvini bostiradi.

Kislota fosfataza sifatida TRAcP turli hujayralarda mavjud va osteoklastlar va alveolyar makrofaglarda ko'p (Snipes, Lam, Dodd, Grey va Cohen, 1986). TRAcP osteoklastlarning xarakterli fermenti bo'lib, uning ifodasi osteoklastlar faoliyati va suyak rezorbsiyasining ko'rsatkichi sifatida qaraladigan osteoklast funktsiyasi bilan chambarchas bog'liq (Minkin, 1982). Bizning tadqiqotimizda CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)TRAcP-musbat hujayralar sonini inhibe qildi, bu RANKL tomonidan qo'zg'atilgan osteoklastogenez CDP tomonidan bloklanganligini ko'rsatadi.(Cistanchedesertikolapolisakkarid). Suyak matritsasining osteoklastlar tomonidan degradatsiyasi katepsin K (CTSK) va MMPlarga bog'liq (Gruber, 2015). Bu erda CDP Mmp9, Ctsk va Acp5 kabi osteoklast funktsional genlarining ifodasini sezilarli darajada pasaytirdi.

Osteoklastlarning differentsiatsiyasi va funktsiyasi bir nechta signalizatsiya yo'llari bilan tartibga solinadi (Boyle, Simonet va Lacey, 2003). RANK bilan bog'langandan so'ng, RANKL TRAcP va CTSKni o'z ichiga olgan osteoklastga xos gen ekspressiyasiga ta'sir qiluvchi osteoklast shakllanishi uchun muhim transkripsiya omili bo'lgan NFATc1 ifodasini faollashtirish uchun TRAF6 adapter oqsilini jalb qiladi (X. Feng, 2005; Takayanagi va boshq., 2002). Ushbu tadqiqotda biz CDP ekanligini aniqladik(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklastlarda RANK va TRAF6 ifodasiga hech qanday ta'sir ko'rsatmadi. Biroq, CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)BMMlarning osteoklastogenezi paytida RANKL tomonidan qo'zg'atilgan NFATc1 faollashuvini inhibe qildi. Bundan tashqari, elektronlarni etkazib berish jarayonida mitoxondriya tomonidan ishlab chiqarilgan ROS osteoklastlarning ko'payishi va differentsiatsiyasiga yordam berishi va suyak matritsasi degradatsiyasini tartibga solishi ko'rsatildi (Ha va boshq., 2004). Yaqinda o'tkazilgan tadqiqot shuni ko'rsatdiki, RANKL Bach1 yadroviy importini qo'zg'atdi va Nrf2 vositachiligida antioksidant ferment ishlab chiqarishni susaytirdi, shu bilan sichqonlarda hujayra ichidagi ROS ifodasini va osteoklastogenezni kuchaytirdi (Kanzaki va boshq., 2017). Bundan tashqari, homosistein tomonidan hujayra ichidagi ROS hosil bo'lishining ortishi osteoklastlarning shakllanishi va faolligini kuchaytirdi (Koh va boshq., 2006). Tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, CDP NOS2 ifodasini inhibe qilish va TRX1 va glutation reduktaza kabi antioksidant fermentlarning ekspressiyasini rag'batlantirish orqali osteoklastlarda ROS to'planishini kamaytiradi. Hujayra ichidagi ROS to'planishini kuchaytirish uchun BMMlarni peroksid bilan davolashganimizda, ROS ortishi NFATc1 ifodasini yaxshilashi mumkin bo'lgan natijalar ROS NFATc1 dan yuqori oqim ekanligini ko'rsatdi. Shuningdek, biz peroksid CDP ning NFATc1 ifodasiga inhibitiv ta'sirini saqlab qolganligini aniqladik. Shunday qilib, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, CDP NFATc1 ifodasini inhibe qilish uchun ROS to'planishini bostiradi, so'ngra osteoklast shakllanishi va funktsiyasini bostiradi.

ERK, JNK va p38 MAPK oilasiga tegishli bo'lib, u osteoklastlarning differentsiatsiyasini tartibga solishda ham ishtirok etadi (Seger & Krebs, 1995). RANKL ERK, JNK va p38 ning fosforillanishini oshirish orqali MAPK yo'lini faollashtiradi (Mizukami va boshq., 2002). Biz bu CDPni namoyish qildik(Cistanchedesertikolapolisakkarid)MAPK yo'lidagi asosiy oqsillarning RANKL vositachiligida fosforillanishini bostirdi va shu bilan CDP ning osteoklast marker genlarining ekspressiyasiga inhibitiv ta'siriga hissa qo'shdi. Bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu CDP ning inhibitiv ta'sirini ko'rsatadigan birinchi tadqiqot(Cistanchedesertikolapolisakkarid)ROS ishlab chiqarish, NFAT va MAPK faollashuvi bo'yicha, CDP in vitro ta'sirining yangi mexanizmlarini ifodalaydi.

Xulosa qilib aytganda, biz CDP ni namoyish qildik(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklastogenez va gidroksiapatit rezorbsiyasini va Ctsk, Mmp9 va Acp5ni o'z ichiga olgan osteoklast marker genlarini ifodalashni susaytiradi. CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL vositachiligida ROS ishlab chiqarishni, shuningdek NFAT va MAPK faollashuvini bostirishga muvaffaq bo'ldi (8-rasm). Birgalikda, bizning natijalarimiz CDP ni ko'rsatadi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)ROS haddan tashqari ishlab chiqarish bilan birga osteoklast bilan bog'liq sharoitlarni davolash uchun nomzod dori vakili bo'lishi mumkin.

8-rasm CDP ning sxematik diagrammasi(Cistanchedesertikolapolisakkarid)osteoklastlarni farqlash funktsiyasi. CDP(Cistanchedesertikolapolisakkarid)RANKL tomonidan qo'zg'atilgan ROS ishlab chiqarishni, shuningdek NFATc1 va MAPK faollashuvini bostiradi, shuning uchun osteoklastogenezni inhibe qiladi. CDP,Cistanchedesertikolapolisakkarid; MAPK, mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaz; NFATc1, faollashtirilgan T hujayraning yadro omili; RANKL, yadro omili KB ligandning retseptor faollashtiruvchisi; ROS, reaktiv kislorod turlari [Rangli rasmni wileyonlinelibrary.com saytida ko'rish mumkin]

MAQDAT

Ushbu tadqiqot Xitoyning Tabiat fanlari jamg'armasi (81572164), Xitoyning Milliy asosiy texnologiyalarni tadqiq qilish va rivojlantirish dasturi (2017YFC1103300), Guangxi provintsiyasi tabiiy fanlar jamg'armasi (2016GXNSFAA380295) va Guangxi universiteti fan va texnologiya tadqiqot loyihasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi. Viloyat (KY2015YB054). Shuningdek, u qisman Guangxi ilmiy tadqiqot va texnologiyalarni rivojlantirish rejasi loyihasi (GKG13349003, 1598013-15), G'arbiy Avstraliya tibbiyot va sog'liqni saqlash tadqiqotlari infratuzilma fondi, Artrit Avstraliya jamg'armasi, G'arbiy Avstraliya universiteti (UWA) tadqiqot hamkorlik mukofotlari tomonidan qo'llab-quvvatlanadi. Avstraliya sog'liqni saqlash va tibbiy tadqiqotlar kengashi (NHMRC, № 1107828 va 1027932).

MANFATLAR to'qnashuvi

Mualliflar manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qiladi

Kimdan: 'CistanchedesertikolapolisakkaridDezhi Song va boshqalar tomonidan RANKL signalizatsiyasi va reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarishni inhibe qilish orqali osteoklastogenez va suyak rezorbsiyasini susaytiradi.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684