Nima uchun Cistanche PC12 hujayralarining apoptoziga ta'sir qiladi?

Cistanche ning PC12 hujayralarining apoptoziga ta'siri

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tian Jiyu¹, Chen Jianzong¹, Chen Xiaoli², Yang Xao³

¹An'anaviy xitoy tabobati kafedrasi,²Xijing kasalxonasi farmatsiya bo'limi,³PLA Neyrobiologiya instituti, 4-harbiy tibbiyot universiteti, Sian 710033, Xitoy

Abstrakt

MAQSAD:ta'sirini o'rganish uchunCistanche1- metil-4-fenilpiridinyum (MPP plyus) bilan induktsiyalanganPC12 hujayralari apoptozi.

USULLARI: PC12 hujayralari200 mkmol/L MPP plus yoki MPP plus turli konsentratsiyalari bilan birlashtirilganCistancheYangi Zelandiyadan Oq quyon sarumi. ning ta'siriCistancheyoqilganPC12 hujayralarining apoptozioqim sitometriyasi, elektron mikroskopiya va floresan mikroskopiya yordamida aniqlangan.

NATIJALAR:Ekvivalent dozada oziqlangan quyonlardan olingan sarumCistancheyoki ikki baravar ekvivalent dozadaCistancheaniq himoya ta'siriga ega bo'ldiPC12 hujayralarivaPC12 hujayralarining apoptoz tezligiBu ikki zardob bilan inkubatsiya qilinganlar mos ravishda 2,8 va 10,2 foizni tashkil etdi, bu ko'rinib turibdiki, ulardagidan past edi.PC12 hujayralarifaqat MPP plus davolash bilan (18,6 foiz, P<0>

Xulosa:Cistanchehimoya qila oladiPC12 hujayralaridanapoptozMPP plus tomonidan qo'zg'atilgan.

Kalit so‘zlar:CistancheDesertikola, 1-metil-4-fenilpiridiy,PC12 hujayralari, apoptoz

Kirish

Parkinson kasalligining patogenezi (Parkinson kasalligi, PD) asosiy qora dopaminerjik neyronlarning shikastlanishi va yo'qolishidir.apoptozmuhim sabab bo'lishi mumkin. Biz Xitoy tibbiyotini aniqlash uchun oqim sitometriyasi (FACS), transmissiya elektron mikroskopiyasi va yadro shakli tahlilining floresan bo'yalishi va boshqa usullardan foydalanamiz.CistancheCistanche ning neyronlarga ta'sirini o'rganish uchun dori zardobi va neyrotoksin 1-metil-4-fenilpiridinyum (1-metil-4-fenil{3}}fenilpiridinyum, M PP plus) bilan ishlov berilgan PC12 hujayralari harakat.

ning ta'siriCistanchePC12 hujayralarining apoptozi haqida

1. Materiallar va usullar

1.1 Materiallar

PC12 hujayralariYaponiya hayot fanlari fondidan sotib olingan; RP-MI1640 madaniyat muhiti, buzoq zardobi va kalamush dumi kollageni Gibco'dan sotib olindi; MPP plus, Annexin V-FITC, PI, PBS, hujayra madaniyati flakonlari va madaniyat plitalari Sigma'dan sotib olindi; Xitoy tibbiyotiCistancheXi'an qaynatma bo'lagi fabrikasidan sotib olindi; Yangi Zelandiya katta quloqli oq quyon (erkak, tana vazni 2,5 ~ 3 kg) maktab hayvonot markazi tomonidan taqdim etilgan; Hoechst33342 Biyuntian kompaniyasidan sotib olindi; Paraformaldegid uy sharoitida toza edi; LD4- 2-toifa sentrifuga (Pekin tibbiy santrifuga zavodi) asboblar Floresan mikroskop (Laika kompaniyasi), invertli mikroskop (Olympus kompaniyasi), JEM-2000EX transmissiya elektron mikroskopi (Yaponiya), CO2 doimiy harorat inkubatori (Bu yerda -cus HERAcell, Germaniya), Coulter EPICS oqim sitometri (Beck-man Coulter, AQSh).

1.2 Usul

PC12 hujayralari100 ml/l buzoq zardobini o'z ichiga olgan RPMI1640 hujayra madaniyati muhitida yetishtirildi. Hujayra madaniyati kolbasi va kultura plitasi foydalanishdan oldin 0,2 g / L kalamush dumi kollagen bilan qoplangan. Madaniyatli hujayralar 37 darajaga joylashtirildi, 50 ml/L CO2 inkubatorida 3 kun davomida muhitni almashtiring. Bir qatlamli madaniyat hujayralari birlashmoqchi bo'lganida, 1,25 g / L tripsin va subkultura bilan hazm qiling. Subkultura hujayralari logarifmik o'sish bosqichiga kirganda, siz dori-darmonlarni qo'shishingiz mumkin. Quyonning tana vazniga ko'ra, hayvonning ekvivalent dozasi tana sirtining maydoniga qarab o'zgartiriladi. Xitoyning an'anaviy tibbiyotiCistanchemuzlatilgan quritilgan kukun shaklida tayyorlanadi, u ishlatilganda distillangan suv bilan suyultiriladi va hayvon kuniga ikki marta 3 kun davomida yuboriladi (Chinese Experimental Formula Chinese Journal of Science, 1998; 4:13-15), 1 Oxirgi igdan keyin soat, uyqudan qon olish, tunda 4 daraja haroratda, 2500 rp/min 25 daqiqa davomida santrifüjlash, sarumni ajratish, 56 daraja, 30 daqiqa va 0 da inaktivatsiya. 22 mkm filtrli membrana bilan sterilizatsiya. va saqlash -20 daraja. Xuddi shu sharoitda quyon nazorati bo'sh sarum, sarumning 1/2, 1 va 2 marta ekvivalent dozasi tayyorlandi. Tajriba 5 guruhga bo'lingan: A guruhi bo'sh quyon edi Sarum guruhi, B guruhi zardobning 2 marta ekvivalent dozasi plyus MPP plyus guruhi (gavaj dozasi cistanche xom preparati 6,4 g / kg), C guruhi ekvivalent. zardobning dozasi plyus MPP plyus guruhi (gavaj dozasi cistanche xom preparati 3,2 g/kg), D guruhi zardobining yarim ekvivalent dozasi plus MPP plyus guruhi (dozada Cistanche xom preparati 1,6 g/kg), E guruhi bo'sh quyon zardobi plus MPP plus guruhidir. 12 soat davomida subkultura Kelajakda hujayralarni teskari mikroskop ostida kuzating va qo'shilishdan oldin preparatni qo'shing. Har bir guruhning sarum tarkibi 10 foizni tashkil qiladi. 3 kun davomida kultivatsiyadan so'ng MPP plyus 200 mkmol/L yakuniy konsentratsiyaga qo'shiladi. 37 daraja haroratda, 50 ml/L CO2 kulturasida joylashtiriladi va 24 soatlik inkubatsiyadan keyin tekshiring.

1.2.1 PC12 hujayrali floresan bo'yashni kuzatish

Madaniyatga Hoechst33342 qo'shingPC12 hujayralari10 mg/l yakuniy konsentratsiyada, 37 darajada 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, 40 g/l paraformaldegid va madaniyat muhitini 13 da aralashtiring: paraformaldegidning yakuniy kontsentratsiyasini 10 g/l qilish uchun 5-10 fiksatsiyadan keyin min, supernatantni tashlang, PBS bilan yuving va floresan mikroskop ostida kuzating.

1.2.2 Transmissiya elektron mikroskop yordamida kuzatish

24 soatlik dori bilan davolashdan so'ng, hujayralar yig'ilib, santrifüj trubasiga o'tkazildi, 1500 r / min tezlikda, 4 daraja 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi va ikki marta 10 mmol / L PBS bilan yuvildi. 1500 rpm/daqiqada 4 daraja santrifüj qiling, Supernatantni tashlang, sekin-asta 25 ml/L glutaraldegidni trubaning devori bo'ylab qo'shing va 4 gradusda 2 soat davomida mahkamlang, to'g'ri pipetka bilan hujayra bo'laklarini tozalang, yuving 3 marta PBS bilan, har safar 5 daqiqa, 4 daraja osmiy kislotasidan keyin 1 soat davomida fiksatsiya qiling Post-gradient aseton degidratatsiyasi, epoksi qatronini namlash va qo'shish, LKB{16}} ultra yupqa mikrotom bilan kesilgan, uranil asetat bilan bo'yalgan. qo'rg'oshin sitrat, transmissiya elektron mikroskop tomonidan kuzatilgan va suratga olingan.

1.2.3 Oqim sitometriyasini aniqlash

M PP plyus 24 soat davolash, 106 yopishgan hazm qilishPC12 hujayralari1,25 g/L tripsin bilan, PBS bilan ikki marta yuving, 490 mkL bog‘lovchi bufer qo‘shing, hujayralarni yaxshilab aralashtiring va 5 mkL Annexin V-FI TC qo‘shing. Hujayra suspenziyasiga 10 mkL erigan PI ni aralashtiring, muloyimlik bilan aralashtiring, sinovni joylashtiring. trubkani 4 daraja haroratda joylashtiring, qorong'ida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling va oqim sitometrida aniqlang. Har bir guruhda 4 ta takroriy quduq mavjud.

Statistik ishlov berish: ma'lumotlar x ±s bilan ifodalanadi, bir nechta guruhlar o'rtasidagi taqqoslash Kruskal-Uollis testi bilan amalga oshiriladi va juftlik bilan taqqoslash Mann-Uitni testi bilan amalga oshiriladi va P.<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

Cistanche ning PC12 hujayralarining apoptoziga ta'siri

2. Natijalar

2.1 Flüoresan mikroskopda PC12 hujayralarini kuzatish

Odatda o'stirilganPC12 hujayralariHoechst33342 tomonidan bo'yalganidan keyin bir xil floresans chiqarishi mumkin va apoptotik hujayra yadrosida zich bo'yalgan granüler massali floresans va nuqtali oq floresansni ko'rish mumkin. Oddiy guruhdagi aksariyat hujayralarning yadrosi nisbatan bir xil. Moviy lyuminestsent, zaif ko'rinadigan nuqta shaklidagi quyuq nuqta shaklidagi floresans, uning quyuqlashgan nuqta shaklidagi floresansi MPP plyus nazorat hujayralariga qaraganda zaifroq. Odatda o'sgan hujayralar Hoechst bo'yalganidan keyin bir xil ko'k floresansni ko'rsatadi va yadro morfologiyasi muntazamdir (1A-rasm); MPP plyusdan so'ng yadro xromatini konsentratsiyalangan yoki juda kondensatsiyalangan ko'rinadi, tartibsiz nuqta floresansini ko'rsatadi yoki chegaralangan; kech hujayra yadrolari bo'laklarga bo'linadi (1B-rasm). Ekvivalent doza va ekvivalent dozadan 2 baravar ko'p hujayralardagi hujayralarCistanchedorivor sarum plyus M PP plyus guruhi me'yorga yaqin edi (1C, D-rasm).

1-rasmPC12 hujayralariHoechst33342(Ho) bilan bo'yalgan

A : Boshqarish: Xromatin bir tekis taqsimlanadi va muntazam bo'yaladi ; B : MPP plyus ishlov beriladi: Yadro membranasida xromatinning kondensatsiyasi va chegaralanishi; C : EkvivalentCistancheplus MPP plus davolash ed;D : Ikki marta ekvivalent Cistanche plus MPP plus ishlov berilgan, xromatin normal.

2.2 Proyeksiyali elektron mikroskop yordamida kuzatish

Oddiy madaniyatliPC12 hujayralariYagona yadro xromatini, tiniq va toʻliq yadro membranasi, koʻp sitoplazmatik mitoxondriyalar va toʻliq organellalarga ega (2A-rasm). MPP plyus bilan davolashdan so'ng, PC12 hujayralari sezilarli darajada o'zgardi, hujayra membranasi buzilmagan, sirt mikrovilluslari yo'qolgan va sitoplazma konsentrlangan, Xromatin kondensatsiyalangan, singan, yuqori darajada kondensatsiyalangan va yadro membranasining ichki yuzasida to'plangan. xususiyatlariapoptoz, asosan erta va o'rta bosqichdagi apoptotik hujayralarda (2B, C-rasm). Har bir guruhda apoptotik hujayralar mavjudCistanchezardoblar yaqqol pasayadi, yadro xromatini bir tekis taqsimlanadi, yadro membranasi tiniq va to'liq, organellalari esa buzilmagan, 2A-rasmda ko'rsatilgan hujayraga yaqin.

2.3 Oqim sitometriyasi test natijalari

Hujayra membranasining ichki tomonida joylashgan fosfatidilserin (PS) erta bosqichda hujayra membranasining tashqi tomoniga ko'chib o'tgan.apoptoz. Har bir guruhning apoptotik darajasi (2,3 ± 0,11) foiz, (2,8 ± 0,21) foiz, (1{{10}},2 ± {{ 14}},60) foiz , (16,0 ± 0,87) foiz va (18,6 ± 0,67) foiz. B, C, D guruhlarini E guruhi P bilan solishtirganda darajali test tahlili<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

2-rasmPC12 hujayralariultrastruktura EM ×6000

Javob: MPP plyus bir xil tarqalgan xromatinsiz, engil elektron zich sitoplazma, normal organella tuzilishi va buzilmagan hujayra membranasi; B, C: 200 mkmol/LM PP plyus ta'sirida. Erta apoptotik faza, periferik xromatin kondensatsiyasi, deyarli normal sitoplazma tuzilishi (B). Kechki post-otik faza, keyingi xromatin kondensatsiyasi, sitoplazmatik elektron zichligi oshishi, normal organellalar tuzilishining yo'qligi va hujayra membranasi yaxlitligini buzish (C).

3. Munozara

M PP plyusning neyrotoksikligi ko'p komponentli ta'sirning murakkab jarayoni bo'lib, reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarish uchun mitoxondriya va sinaptik vesikulalarni dopamin bilan almashtirishga to'sqinlik qilish ta'sirini o'z ichiga oladi [1]. Hozirgi vaqtda ularning aksariyati mitoxondriyal hujayralar bilan bog'liq deb hisoblanadiapoptozva endogen Dofaminning neyrotoksik ta'siri apoptoz bilan bog'liq [,2] M PP plus tomonidan SN4741 qora rangli dopamin hujayra liniyasining apoptozini kuzatish jarayonida Kaspaza-1 va Kaspaza{ faollashuvi mavjud. {4}} [3] .1 mkmol/L MPP plyus adrenal neyroblastomaning SH-SY5Y hujayralariga ta'sir qiladi va bir necha kundan so'ng apoptoz bilan bog'liq Bcl{10}} proteini ifodasini oshirishi mumkin [4].Cistanche— Cistanche turkumi (Cistanche) turkumiga mansub quruq, qichitqi bargiCistanche. Cistanchening go'shtli poyasi Altsgeymer kasalligi va PDni davolashda yaxshi shifobaxsh ta'sirga ega. Sistanxning umumiy glikozidlari turli xil faol kislorodli erkin radikallarni samarali ravishda tozalashi va OH tufayli kelib chiqqan DNK oksidlanishini himoya qilishi mumkin. [5]. Sheng va boshqalar. [6] tadqiqot Cistanche tubulcoside B ekstrakti MPP plyus-induktsiyalangan sitotoksiklikni susaytirishi, hujayradagi reaktiv kislorod turlarining to'planishini susaytirishi va MPP plus-induktsiyasiga antagonistik ta'sir ko'rsatishi mumkinligini tasdiqladi.apoptozva oksidlovchi stress. Biz buni kuzatdikCistancheMPP plus-induced PC12 ga antagonistik ta'sir ko'rsatadi Hujayra ta'siriapoptoz, va himoya ta'siriPC12 hujayralaridozaning oshishi bilan ortadi.

Cistanche ning PC12 hujayralarining apoptoziga ta'siri

Malumot

[1] Lotharius J, O Malley KL. Parkinsonizmni qo'zg'atuvchi dori 1- metil-4-fenilpiridinyum hujayra ichidagi dopamin oksidlanishini qo'zg'atadi. Toksiklikning yangi mexanizmi [J]. J Biol Chem, 2000;275 (49):38581-38588.

[2] Maruyama W, Naoi M. Parkinson kasalligida hujayra o'limi [J]. J Neurol, 2002; 249 (S Suppl 2): ​​6-10.

[3] Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA va boshqalar. MPP (plyus), oksidlovchi va o'ziga xos neyrotoksikantlar tomonidan qo'zg'atilgan dopaminerjik hujayralar o'limi umumiy molekulyar mexanizmga ega [J]. J Neurochem, 2001;76(4): 1010-1021.

[4] Veech GA, Dennis J, Keeney PM va boshqalar. Buzilgan mitoxondriyal elektron tashish funktsiyasi oksidlovchi stress [J] orqali SH-SY5Y neyroblastoma va Parkinson kasalligi kibrid hujayralarida anti-apoptotik Bcl-2 va Bcl-XL oqsili ifodasini oshiradi. J Neurosti Res, 2000;6(1):693-700.

[5] Vang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Vu Lia va boshqalar. Erkin radikallarni in vitro tozalash va umumiy glikozidlar natijasida kelib chiqqan OH · induktsiyalangan DNK shikastlanishiga himoya ta'siri.Cistanche[J]. Xitoy farmatsevtika jurnali, 2001; 36(1): 29-32. Vang XW, Ji ang XY, Vu LY va boshqalar. Erkin radikallarni yo'q qiladigan va shikastlangan DNKni in vitroda himoya qiluvchi umumiy tsist dyuymli glikozidlarni o'rganish [J]. Chin Pharm, 2001;36(1):29-32.

[6] Sheng G, Pu X, Lei L va boshqalar. Tubulosid B dancistanchesalsa PC12 neyron hujayralarini 1-metil-4-fenilpiridiyion ta'siridan qutqaradi.apoptozva oksidlovchi stress [J].Play nta Med, 2002;68(11):966-970.

Kimdan: To'rtinchi Harbiy Tibbiyot Universiteti jurnali (J Fourth Mil Med Univ) 2004; 25(10)

Maqola identifikatori: 1000-2790 (2004) 10-0955-03