Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori Alpelisib Lou sindromi/Dent kasalligi uchun qanday ishlatiladi?

Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori alpelisib in vitro va Lou sindromi va Dent kasalligining sichqoncha modelida aktin tuzilishini tiklaydi va proksimal tubula disfunktsiyasini yaxshilaydi.

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dengiz Berkes^1,5, Jonatan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stiven P. Jekson², Valeriya Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6va Jennifer L. Gallop^2,6

Kalit SO'ZLAR: sitoskeleton; endositoz; lipidlar; proksimal tubula; buyrak Fankoni sindromi

Fosfatidilinositol [PI] 4,5-bisfosfat [PI(4,5)P2] 5-fosfataza OCRL ni kodlaydigan OCRL genidagi funksiyani yo‘qotish mutatsiyalari nuqsonli endositoz va proksimal kanalcha disfunktsiyasini keltirib chiqaradi. ichidaLowe sindromi va Dent kasalligi2. Qusur PI (4,5)P2 darajasining oshishi va aberrant aktin polimerizatsiyasi tufayli endosoma savdosini bloklaydi. PI 3-fosfat [PI(3)P] yaqinda aktin yoʻlida PI(4,5)P2 bilan koaktivator sifatida aniqlangan. Bu erda biz gipotezani sinab ko'rdikfosfoinositid 3-kinaz(PI3K) ingibitorlari OCRL yo'qolishi natijasida kelib chiqqan endositik nuqsonni fosfoinositid signallarini aktin mexanizmiga qayta muvozanatlash orqali qutqarishi mumkin. Keng diapazonli PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)inhibitor kopanlisib va ​​sinf IA p110a PI3K(fosfoinositid 3-kinaz) alpelisib inhibitoriin vitroda OCRL etishmovchiligi bo'lgan inson buyrak hujayralarida aberrant aktin polimerizatsiyasining kamayishi. PI 3,4,{3}}trisfosfat, PI(4,5) P2 va PI(3)P darajalari alpelisib bilan davolash bilan kamaydi va PI3K katalitik subbirligi p110a siRNK nokdatu aktin fenotipini fenokopiya qildi. Insoniylashtirilgan OcrlY/- sichqoncha modelida alpelisib endosomal aktinning bo'yalishini kamaytirdi, shu bilan birga proksimal tubula hujayralari plazma membranasida stress tolasi arxitekturasini va megalin darajasini tikladi, bu past molekulyar og'irlikdagi oqsillarni in vivo jonli ravishda yaxshilangan endositik o'zlashtirishda aks ettirilgan. Shunday qilib, bizning topilmalarimiz fosfoinositid lipidlari, aktin polimerizatsiyasi va proksimal tubuladagi endositik savdo o'rtasidagi bog'liqlikni qo'llab-quvvatlaydi va alpelisibni qayta ishlash uchun kontseptsiyani isbotlaydi.Lowe sindromi / Dent kasalligi2.

Tarjima bayonoti

Lowe sindromi va Dent kasalligi2, fosfoinositid lipid 5-fosfataza OCRL mutatsiyalari natijasida kelib chiqqan, proksimal tubula disfunktsiyasi va past molekulyar og'irlikdagi proteinuriya bilan namoyon bo'ladi, faqat qo'llab-quvvatlovchi yordam mavjud. Bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatadikifosfoinositid 3-kinaz alpelisib inhibitoriHozirgi vaqtda saraton kasalligini davolash uchun tasdiqlangan OCRL yo'qolishi bilan bog'liq bo'lgan aberrant fosfoinositid muvozanatini va aktin fenotipini yumshatadi, bu hujayra tizimlarida endotsitik mexanizm va so'rilish qobiliyatini sezilarli darajada yaxshilaydi va Lowe sindromi/Dent kasalligi 2 uchun insoniylashtirilgan sichqoncha modeli. Ko'rinib turgan xavfsizlik profilini hisobga olgan holda, alpelisib giyohvand moddalarni qayta ishlash uchun istiqbolli nomzoddirLowe sindromi va Dent kasalligi.

Buyrakning proksimal kanalchalarini (PT) qoplaydigan epiteliya hujayralari glomerulus orqali filtrlangan muhim moddalarni tiklaydigan va qayta ishlovchi retseptorlar vositasida samarali endolizosomal yo'lga ega. Endolizosomalarga ta'sir qiluvchi tug'ma kasalliklar siydikda erigan moddalar va past molekulyar og'irlikdagi (LMW) oqsillarning yo'qolishi bilan PT disfunktsiyasini (buyrak Fankoni sindromi) keltirib chiqaradi, ko'pincha metabolik va o'sish asoratlari va surunkali buyrak kasalligi rivojlanishi bilan murakkablashadi.¹OCRLdagi inaktivatsiya mutatsiyasi Dent kasalligi 2 (MIM #300555), PT disfunktsiyasi, buyrak toshlari va progressiv buyrak etishmovchiligi bilan tavsiflangan kasallik va Louning okuloserebrorenal sindromi (MIM #309000) bilan bog'liq bo'lib, u qo'shimcha ravishda PT disfunktsiyasi va buyrak etishmovchiligi, konjenital katarakt, kognitiv nogironlik va gipotoniya kabi tizimli ko'rinishlarga.^2-4Dent kasalligi 2 va Lou sindromi uchun hozirgi davolash usullari faqat yordam beradi.

1-rasm|PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)ingibitorlar OCRL etishmovchiligi bo'lgan inson buyragi (HK2) hujayra modelidagi endosomalardagi aberrant aktin birikmasini engillashtiradi. (a) PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 va PI(3)P oʻrtasidagi konversiyani koʻrsatuvchi ushbu tadqiqot uchun tegishli fosfoinositid lipidlarini konversiyalash bosqichlari qalin, eng mos fermentlar bilan konvertatsiyalar qattiq chiziqlarda, boshqalari esa kesilgan chiziqlarda. PI(4,5)P2 Lou sindromida OCRL dan fosfataza faolligi yo'qligi sababli ko'tariladi va PI ning fosfatidilinositol 4-kinazlari (PI4Ks) va PI(4) tomonidan fosforlanishi natijasida hosil bo'ladi. P 5-kinaz (PIP5K). PI(4,5)P2 PI(3,4,5)P3 hosil qilish uchun I sinf PI3Ks tomonidan fosforlanadi. PI(3,4,5)P3 ni PTEN yordamida PI(4,5)P2 ga yoki SH-2 orqali PI(3,4)P2 ga fosforillanishi mumkin – tarkibida inositol 50 polifosfat (SHIP) 1 va 2, sinaptojanin 1 va 2, shuningdek, OCRL, garchi bu (davomi)

1-rasm|(davomi) kichik deb o'ylagan. PI(3,4)P2 inositol polifosfat-4-fosfataza turi IA (INPP4A) yordamida PI(3)P ga fosforsizlanadi va B. PI(3)P ham endosomalarda PI ning III sinf bo'yicha fosforillanishi orqali hosil bo'ladi. PI3K(fosfoinositid 3-kinaz), vakuolyar saralovchi oqsil Vps34. (b) Yuklash nazorati sifatida tubulinli yovvoyi tipdagi (WT) HK2 nazorat hujayralari bilan solishtirganda, HK2 OCRL CRISPR nokaut (KO) hujayra liniyasida OCRL ifodasi yo'qolishini ko'rsatadigan g'arbiy dog'lar. (c-e) Airyscan vakilining konfokal mikrografigi va dimetilsulfoksid (DMSO) bilan ishlov berilgan HK2 WT yoki OCRL KO hujayralari uchun erta endozoma antijeni 1 (EEA1)/aktin moslashuvining miqdorini aniqlash (jami aniqlangan EEA1+ vesikulalarining ulushi sifatida ifodalangan) (d) yoki ko'rsatilgan inhibitor va 4 foizli formaldegid fiksatori yordamida o'rnatiladi. Barcha holatlarda tasvirlar EEA1 (sariq), phalloidin (aktin, magenta) va 40,6-diamidino{ uchun immuno-belgilangan Airyscan tomonidan qayta ishlangan konfokal hujayralar to'plamidan bitta z-bo'lagini tasvirlaydi. {14}}fenilindol (DAPI) (koʻk rang). Barlar=5 mm. Miqdor ko'rsatkichlarida chiziqlar o'rtacha ± SEMni ko'rsatadi va har bir ma'lumot nuqtasi alohida hujayra hisoblanadi. Barcha tajribalarda muolajalar fiksatsiyadan 16 soat oldin qo'llanilgan. Barcha miqdorlarda statistik ahamiyatlilik Kruskal-Vallis (KW) Dunning ko'p taqqoslash testi bilan dispersiya tahlili bilan baholandi. (c) DMSO yoki 100 nM kopanlisib bilan ishlov berilgan WT yoki KO hujayralari aktin-endosomalarning oʻzaro bogʻlanishidan xalos boʻlganligini koʻrsatadi. KVt testi: ***P < 0.0{{50}}1,="" bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" dmso="" va="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" va="" ko="" kopanlisib="" ikkalasi="" ham="" ***p="">< 0.001,="" wt="" kopanlisib="" va="" ​​ko="" kopanlisib="" p="0.44" (ahamiyatli="" emas="" [ns]).="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso="" va="" ko="" kopanlisib="" uchun="" mos="" ravishda="" n="52," 85,="" 67="" va="" 63="" hujayralar.="" (d)="" dmso="" yoki="" 10="" mm="" alpelisib="" bilan="" ishlov="" berilgan="" wt="" yoki="" ko="" hujayralari="" aktin-endosomalarning="" o'zaro="" bog'liqligini="" saqlab="" qolishni="" ko'rsatadi.="" kvt="" testi:="" ***p=""><0,001, bir="" nechta="" taqqoslashlar;="" wt="" dmso="" va="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" va="" ko="" alpelisib="" ikkalasi="" ham="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" ko="" alpelisibga="" qarshi.="" p=""> 0,99 (ns). WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO va KO alpelisib uchun mos ravishda N=31, 30, 43 va 41 hujayralar. (e) DMSO, 10 mM GSK2636771 yoki 10 mM idealalisib bilan ishlov berilgan WT yoki KO hujayralari, bu ikkala birikma ham aktin-endosomalarning o'zaro bog'liqligini sezilarli darajada kamaytira olmasligini ko'rsatadi. KVt testi: ***P <0,001, bir="" nechta="" taqqoslashlar;="" wt="" dmso="" ko="" dmsoga="" qarshi,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" ko="" gskga="" qarshi,="" *p="0,04," ko="" dmso="" ko="" idealalisibga="" qarshi,="" p=""> 0,99 (ns). WT DMSO, WT GSK2636771, WT idealalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 va KO idealalisib uchun mos ravishda N=159, 130, 203, 122, 131 va 145 hujayralar. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun www.kidney-international.org saytida ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang.

Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori alpelisib Lou sindromi/Dent kasalligi uchun qanday ishlatiladi?

LMW proteinuriyasi Lou sindromi/Dent kasalligi 2da kuzatilgan izchil xususiyat bo'lib, OCRL retseptorlari vositachiligidagi endositozga ta'sir qilishini ko'rsatadi.⁵OCRL fosfatidilinositol (PI) 4,5-bisfosfat [PI(4,5)P2] 5- fosfataza OCRL ni kodlaydi,⁶PI (4,5) P2 ni buzish orqali endolizosomal yo'lda lipid identifikatorini nazorat qiladi (1a-rasm). PI(4,5)P2 ning OCRL orqali yetishmovchiligi fibroblastlardagi klatrin bilan qoplangan pufakchalarning qoplanmaganligi, natijada paydo bo'lgan aberrant erta endozomaga o'xshash organellalardan polimerlangan, filamentsimon aktinning "kometa" tuzilmalarining shakllanishi bilan bog'liq.^7-9Boshqa hujayra turlarida, ayniqsa buyrakning PT hujayralarida, OCRL etishmovchiligi aberrant endolizosomal organellalarni o'rab turgan F-aktin "savat" tuzilmalariga olib keladi.¹⁰Ortiqcha F-aktin endositik va endolizosomal yo'l orqali membrana savdosini bloklaydi va ko'p ligand retseptorlari megalinning apikal membranaga qayta aylanishini kamaytirish tavsiya etiladi, bu esa endolizosomal yo'l ichidagi nuqsonni kuchaytiradi.¹¹Aberrant F-aktinning asosiy roli bilan kelishilgan holda, OCRL mutatsiyalari natijasida yuzaga kelgan nuqsonli endositik assimilyatsiya aktin mexanizmini latrunkulin B bilan nishonga olish yoki aktinni tartibga soluvchi oqsillarni yo'q qilish, shuningdek, kichik, interferent RNK (siRNK) vositachiligida kamayishi bilan engillashtiriladi. PI(4,5)P2 sintezini sozlash uchun PI(4)P 5-kinaz^7,10(1a-rasm).

Aktin polimerizatsiyasi nafaqat PI (4,5) P2 dan, balki boshqa fosfoinositid lipidlaridan ham kelib chiqadi deb tobora ko'proq tushunilmoqda. Masalan, PI(3,4,5)P3 Rho tipidagi GTPase Racni faollashtiradi va PI(3)P boshqa Rho tipidagi GTPase Cdc42 ning quyi oqimida aktin polimerizatsiyasini rag'batlantirish uchun PI(4,5)P2 bilan birgalikda harakat qiladi.^12-14Ushbu fosfoinositidlarning o'zaro konversiyasi lipidlarning endotsitik va endosoma yo'llari orqali harakatlanishi bilan bog'liq. PI(4,5)P2 plazma membranasida I sinf fosfatidilinositol- 30 -kinaz (PI3K) tomonidan PI(3,4,5)P3 ga fosforlanadi va asta-sekin PI(3,4)P2 va PI ga fosforillanadi. (3)P yoki PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P endosomalarda boyitiladi, bu erda ularning faoliyati uchun zarur bo'ladi va asosan III sinf PI3K bo'yicha PI fosforillanishi orqali hosil bo'ladi.fosfoinositid 3-kinaz), Vps34¹⁶(1a-rasm). OCRL etishmovchiligi bo'lgan retinal pigmentli epiteliya (RPE) hujayra chizig'ida hosil bo'lgan aktin kometalari PI3K () bilan davolash orqali kamayadi.fosfoinositid 3-kinaz)wortmannin va Vps34-IN1 inhibitörleri, PI(3)P va PI(4,5)P2 ning mos kelishi orqali aktinning koregulyatsiyasini ko'rsatadigan biokimyoviy tadqiqotlarga muvofiq.¹⁴

OCRL bemor va nokaut (KO) hujayralarida aktin mexanizmlarini nishonga olishda kuzatilgan endositozning qutqarilishi,^7,10aktinni PI3K tomonidan yuqori oqim bilan tartibga solish bilan birga (fosfoinositid 3-kinaz)faoliyat¹⁴va PI konvertatsiyasining yuqori darajada o'zaro bog'liqligi I sinf PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)Lou sindromida inhibitorlar foydali bo'lishi mumkin. Saraton terapiyasi uchun ishlab chiqilgan bunday inhibitorlar klinik foydalanish uchun tasdiqlangan¹⁷va shuning uchun giyohvand moddalarni qayta ishlatish uchun potentsial mos keladi. Kopanlisib kabi birikmalar bo'lsa-da¹⁸keng o'ziga xoslik va yon ta'sirga ega, so'nggi muvaffaqiyatlar aniqroq inhibitorlar uchun ko'rsatildi. Idelalisib,¹⁹qaysi PI3K (fosfoinositid 3-kinaz)p110d subunit, surunkali limfotsitik limfoma uchun tasdiqlangan va p110a ga qaratilgan alpelisib ko'krak saratonida foydalanish uchun tasdiqlangan.^20,21Bundan tashqari, alpelisib PROS/CLOVES sindromi bo'lgan bolalarda klinik foyda ko'rsatdi.²²PIK3A faollashuvi natijasida yuzaga keladigan kam uchraydigan o'sish sindromi.

Bu erda biz I sinf PI3K( degan gipotezani sinab ko'rdik.fosfoinositid 3-kinaz)ingibitorlar o'rnatilgan uyali va sichqoncha modellari yordamida OCRL yo'qolishi sababli endositik nuqsonni qutqarishi mumkin.^10,11,23Biz PI3K ni inhibe qilishini ko'rsatamiz (fosfoinositid 3-kinaz)kopanlisib yoki alpelisib orqali faollik yoki alpelisib-maqsadli katalitik bo'linma p110a siRNK vositachiligida kamayishi OCRL etishmovchiligi bo'lgan inson buyragi (HK2) hujayralarida ortiqcha aktin polimerizatsiyasini kamaytiradi. Klinik foydalanish uchun eng o'ziga xos birikma sifatida alpelisibga e'tibor qaratsak, u aktin polimerizatsiyasini kamaytiradi va insoniylashtirilgan Ocrl dan PT hujayralarida endolizosomal yo'l orqali so'rilishini yaxshilaydi.^Y/-sichqonlar in vitro. Bundan tashqari, alpelisibni in vivo jonli davolash proteinuriyani engillashtiradi, PT disfunktsiyasini kamaytiradi va insoniylashtirilgan Ocrlda megalinning hujayra darajasini qutqaradi.^Y/-sichqonlar. Ushbu natijalar alpelisibni giyohvand moddalarni qayta ishlashga nomzod sifatida qo'llab-quvvatlaydiLowe sindromi va Dent kasalligi 2.

2-rasm|Alpelisibning aktinga ta'siri dozaga ta'sir qiladi va PI3K siRNK tomonidan takrorlanadi.fosfoinositid 3-kinaz)p110a. (a) Airyscan vakilining konfokal mikrografigi (4 foizli formaldegid fiksi yordamida o‘rnatilgan va erta endozoma antijeni 1 [EEA1] uchun immuno-belgilangan, sariq; aktin [phalloidin], qizil; va 4{{40}},{{ 5}}diamidino{6}}fenilindol [DAPI], zangori; barlar=5 mm) va dimetilsulfoksid (DMSO) bilan ishlangan yovvoyi turdagi (WT) yoki nokaut (KO) inson buyragi (HK2) hujayralarining miqdorini aniqlash yoki 16 soat davomida alpelisibning ko'rsatilgan dozalari aktin-endosomalarning o'zaro bog'liqligini dozaga mos ravishda qutqarishini ko'rsatadi. Barcha holatlarda chiziqlar o'rtacha ± SEMni ko'rsatadi va nuqtalar alohida hujayralarni ko'rsatadi. WT nazorati uchun N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 va 67 hujayralar, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , va KO 2,5, 5, 10, 15, 25 va 50 mM alpelisib. Dunnning ko'p taqqoslash testi bilan Kruskal-Wallis (KW) testi bilan baholangan statistik ahamiyatlilik: umumiy ***P <0,001, bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" dmso="" va="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" va="" 50="" mm="" alpelisib="" hammasi="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" qarshi="" ko="" dm10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" va="" wt="" 10="" va="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (muhim emas [ns]). (b) p110a uchun Western blot va skrambl (Scram.) yoki p110a siRNK bilan ishlov berilgan WT yoki KO hujayralarining yuklanishni nazorat qiluvchi a-tubulini. (c) Airyscan vakili konfokal mikrografigi (4 foizli formaldegid fiksatori yordamida o‘rnatilgan va EEA1 uchun immunobellangan, sariq; aktin [phalloidin], to‘q qizil; va DAPI, zangori; barlar=5 mm) va ishlov berilgan WT yoki KO hujayralari miqdorini aniqlash skramble (S) yoki p110a siRNK bilan, bu p110a kamayishida EEA{60}}aktin qoplamasining kamayganini ko'rsatadi. Dunnning bir nechta taqqoslash testi bilan KW testi: ***P <0,001, bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" skramble="" va="" ko="" skramble,="" ko="" skramble="" va="" ko="" p110a="" sirna="" ikkala="" ***p="">< 0,001.="" n="79," mos="" ravishda="" 108,="" 93="" va="" 131="" katak.="" hk2,="" inson="" buyragi;="" pi3k,="" fosfatidilinositol-30="" -kinaz;="" sirnk,="" kichik,="" interferent="" rnk.="" ushbu="" rasmni="" ko'rishni="" optimallashtirish="" uchun="" www.kidney-international.org="" saytida="" ushbu="" maqolaning="" onlayn="" versiyasiga="">

3-rasm|Fosfatidilinositol (PI) 4, 5-bisfosfat [PI(4,5)P2] darajasi OCRL nokauti (KO) va PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 bilan ko'tariladi. , va PI (3) P alpelisib davolash bilan bostiriladi. Barcha tajribalarda ko'rsatilgan muolajalar fiksatsiyadan 16 soat oldin qo'llanilgan. Miqdor ko'rsatkichlarida chiziqlar o'rtacha ± SEMni ko'rsatadi va har bir ma'lumot nuqtasi alohida hujayradan olingan. Barcha miqdorlarda statistik ahamiyatlilik Kruskal-Vallis (KW) Dunning ko'p taqqoslash testi bilan dispersiya tahlili bilan baholandi. Barcha rasmlarda bar=20mm. (a) Dimetilsulfoksid (DMSO) yoki 10 mM alpelisib bilan ishlangan, so'ngra plazma membranasi fiksi bilan biriktirilgan va PI (3,4,5) uchun immuno-belgilangan yovvoyi tipdagi (WT) yoki KO inson buyragi (HK2) hujayralarining vakillik keng maydonli mikrograflari. )P3 (qizil) va 40,6-diamidino{27}}fenilindol (DAPI) (koʻk), oʻrtacha hujayrali PI(3,4,5)P3 yorliqlash intensivligi miqdori bilan, alpelisibning samaradorligini koʻrsatadi. PI(3,4,5)P3 sintezida davolash. WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO va KO alpelisib uchun mos ravishda N=96, 128 va 109 hujayralar. KVt (davomi)

3-rasm|(davomi) test: umumiy ***P < 0.001,="" bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" dmso="" va="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" va="" wt="" alpelisib="" va="" ​​ko="" dmso="" va="" ko="" alpelisib="" hammasi="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" dmso,="" 1{93}}="" mm-="" yoki="" 50-mm="" alpelisib="" bilan="" 16="" soat="" davomida="" ishlov="" berilgan,="" so‘ngra="" golji="" fiksatori="" bilan="" fiksatsiyalangan="" va="" m="" ch="" yordamida="" etiketlangan="" wt="" yoki="" ko="" hk2="" hujayralarining="" reprezentativ="" konfokal="" mikrografiyalari.="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" zond="" (magenta)="" va="" dapi="" (koʻk),="" alpelisib="" konsentrasiyalari="" oraligʻi="" bilan="" ishlov="" berilgan="" hujayralarda="" aniqlangan="" pi(3)p-musbat="" nuqtalar="" sonini="" aniqlash="" bilan="" ,="" ko'rsatilgandek,="" pi="" (3)="" p-musbat="" nuqtalarni="" ko'rsatadigan="" dozaga="" javob="" beradigan="" tarzda="" kamayadi.="" wt="" nazorati="" uchun="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" va="" 215="" hujayralar,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" va="" ko="" 2,5,="" mos="" ravishda="" 5,="" 10,="" 25="" va="" 50="" mm="" alpelisib.="" kw="" testi:="" umumiy="" ***p=""><0,001, bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" dmso="" va="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" wt="" 10="" va="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" qarshi="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" hammasi="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" va="" ko="" 2,5="" va="" 5="" mm="" alpelisib="" ikkalasi="" ham="" p=""> 0,9999 (muhim emas [ns]); KO DMSO ga nisbatan KO 10 mM alpelisib **P=0.0049; KO DMSO ga nisbatan KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) WT yoki KO HK2 hujayralarining DMSO yoki 10 mM alpelisib bilan ishlov berilgan, so'ngra plazma membranasi fiksi bilan biriktirilgan va PI (4,5) P2 (sariq) va DAPI (ko'k) uchun immuno-belgilangan, miqdorini ko'rsatgan holda vakillik keng maydonli mikrografiyalari. o'rtacha hujayrali PI (4,5) P2 yorliqlash intensivligi, KO hujayralarida plazma membranasi PI (4,5) P2 ortib borayotganini ko'rsatadi, bu alpelisib bilan davolash bilan kamayadi, ayniqsa KO hujayralarida. WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO va KO alpelisib uchun mos ravishda N=126, 112, 85 va 116 hujayralar. KW testi: umumiy ***P <0,001, bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" dmso="" ko="" dmso="" va="" ko="" dmso="" va="" ko="" alpelisib="" ikkalasi="" ham="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" va="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" dmso="" yoki="" 10="" mm="" alpelisib="" bilan="" ishlov="" berilgan,="" so'ngra="" 4="" foizli="" formaldegid="" fiksi="" bilan="" fiksatsiyalangan="" va="" pi(4,5)p2="" (sariq)="" va="" dapi="" (ko'k)="" uchun="" immuno-belgilangan,="" miqdorini="" aniqlash="" bilan="" ishlangan="" wt="" yoki="" ko="" hk2="" hujayralarining="" keng="" maydonli="" mikrografiklari.="" pi(4,5)p2-musbat="" punktalar="" soni,="" ko="" hujayralarida="" pi(4,5)p2="" punktalarining="" ko'payishini="" ko'rsatadi,="" bu="" alpelisib="" bilan="" davolash="" orqali="" kamayadi,="" ayniqsa="" ko="" hujayralarida.="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" va="" ko="" alpelisib="" uchun="" mos="" ravishda="" n="75," 65,="" 52="" va="" 69="" hujayralar.="" kw="" testi:="" umumiy="" ***p=""><0,001, bir="" nechta="" taqqoslash;="" wt="" dmso="" ko="" dmso="" va="" ko="" dmso="" va="" ko="" alpelisib="" ikkalasi="" ham="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" va="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, ixtiyoriy birliklar. Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun www.kidney-international.org saytida ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang.

Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori alpelisib Lou sindromi/Dent kasalligi uchun qanday ishlatiladi?

1. NATIJALAR

1.1 I sinf PI3K ingibitorlari OCRL-KO HK2 hujayralarida aktin agregatsiyasini kamaytiradi

Biz CRISPR-Cas9 genini tahrirlashdan HK2 hujayra liniyasidagi OCRL ni nokaut qilish (KO) uchun I PI3K (sinf) ni sinab ko'rish imkonini berdik.fosfoinositid 3-kinaz)Endolizosomal bo'linmalarda xarakterli aktin agregatsiyasining ingibitorlari.^7,9,10,14Western blotting KO HK2 hujayralaridan lizatlarda OCRL ifodasining 98.0± 0.7 foizga qisqarishini tasdiqladi (1b-rasm). OCRL KO HK2 hujayralarida aktin savat fenotipini takrorladi, bu F-aktin va erta endozoma antijeni 1 (EEA1) o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikning kuchayishi bilan ko'rsatilgan, Airyscan konfokal mikroskopining z-stoklarida aniqlangan (1c-e-rasm). OCRL KO hujayralarida kuzatilgan bu o'zaro bog'liqlik keng diapazonli PI3K (kopanlisib) (C) bilan davolash orqali qaytarildi.fosfoinositid 3-kinaz)p110a va d va kamroq darajada p110b va g izoformlarini maqsad qilgan inhibitor (1c-rasm). HK2 butun hujayrali ekstraktlarini g'arbiy tozalash orqali biz PI3K (fosfoinositid 3-kinaz)p110 tartibga soluvchi subbirliklari a, b va d yovvoyi tipdagi (WT) va KO hujayralarida yaxshi ifodalangan, faqat p110g izoformining iz darajalari mavjud (qo'shimcha rasm S1A).

Biz PI3K ni ajratib oldik(fosfoinositid 3-kinaz)p110a ning selektiv inhibitori bo'lgan alpelisib (A) va mos ravishda p110b va p110d ning selektiv inhibitörleri GSK2636771 (G) va idealalisib (I) yordamida F-aktinni inhibe qilishning o'ziga xosligi (qo'shimcha rasm S1A). Alpelisib bilan davolash kopanlisib bilan solishtirganda endosomal aktin polimerizatsiyasini xuddi shunday qisqartirgan bo'lsa-da (1d-rasm), GSK2636771 va idelalisib aktin to'planishiga ozgina ta'sir ko'rsatdi (1e-rasm). I sinf PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)ingibitorlar MTT tahliliga asoslanib, o'zgartirilmagan hujayralarga nisbatan OCRL KO ga toksikligi oshgani yo'q (Qo'shimcha rasm S1B).

1.2 Alpelisib va ​​p110a nokdaun HK2 hujayralarida aktin fenotipini qutqaradi

Keyingi tadqiqotlarimiz uchun biz alpelisibga e'tibor qaratdik, chunki u eng selektiv va eng kam zaharli PI3K (fosfoinositid 3-kinaz)ingibitor hozirgacha ishlab chiqilgan va hozirda PROS/CLOVES sindromi bo'lgan bolalarda PI3K Ia sinfining mozaik ortiqcha faollashuvini davolashda qo'llaniladi.²²Alpelisib OCRL KO HK2 hujayralarida aktin savatlarini dozaga mos ravishda kamaytirdi (2a-rasm). Ta'sirlar 10 mM dozada davolanishdan keyin 4 soat o'tgach, aniq toksikliksiz kuzatildi (Qo'shimcha rasm S2). PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)alpelisib tomonidan inhibisyon aktinning bo'yalishining kamayishi manbai bo'lgan, biz siRNK yordamida uning maqsadi p110a subunitini ayniqsa kamaytirdik (2b-rasm). Boshqaruv (ketma-ketlik bilan shifrlangan) siRNK bilan davolash bilan solishtirganda, p110a ga qarshi siRNK WT va OCRL KO HK2 hujayralarida p110a oqsilining mos ravishda 78,3±4,8 foiz va 68,9±7,7 foiz kamayishiga olib keldi, bu aktinning sezilarli kamayishi bilan aks ettirilgan. 2c-rasm).

1.3 Alpelisib bilan ishlov berilgan HK2 hujayralarida PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 va PI(3)P darajasining pasayishi

Fosfoinositid lipidlarini OCRL KO va alpelisib bilan davolashdan qanday ta'sir qilishini o'rganish uchun biz HK2 hujayralarini PI (3,4,5) P3, PI (3) P va PI (4,5) P2 ga qarshi antikorlar yoki protein domenlari bilan bo'yadik. plazma membranasi yoki hujayra ichidagi bo'yash uchun optimallashtirilgan fiksatsiya shartlari.^24,25PI (3, 4, 5) P3 plazma membranasida diffuz lokalizatsiyaga ega va alpelisib bilan davolash (10 mM) WT va OCRL KO hujayralarida PI (3,4,5) P3 uchun bo'yashning kuchli pasayishiga olib keldi. uning ta'sir mexanizmidan va IA PI3K sinfining o'ziga xosligidan kutilgan (fosfoinositid 3-kinaz)p110a (3a-rasm). PI(3,4,5)P3 asta-sekin fosforsizlanishi kutilmoqda, chunki membranalar endotsitozlanadi va endosomalarga o'tadi.^14,26,27Hujayra ichidagi PI (3) P saqlanib qoladigan hujayralarni mahkamlash orqali,²⁵WT va OCRL KO hujayralarida PI(3)P punktalari ham alpelisib bilan davolashda (16-soatlik davolash uchun 10 mm dan past konsentratsiyadan ko'rinadigan dozaga mos ravishda) kamayganligini aniqladik (3b-rasm). va qo'shimcha rasm S2C). Kutilganidek, HK2 hujayralarida OCRL ning KO plazma membranasida (3c-rasm) va hujayra ichidagi (3d-rasm) WT hujayralari bilan solishtirganda PI (4,5) P2 darajasining sezilarli o'sishiga olib keldi.^10,28Alpelisib bilan davolash ikkala bo'linmada OCRL KO tomonidan ishlab chiqarilgan PI (4,5) P2 ko'tarilishini sezilarli darajada kamaytirdi, WT hujayralarida esa bu ta'sir ko'rsatmadi (3c va d-rasm). Alpelisib PI 4-kinaz b ni 50 foiz ingibitor kontsentratsiyasi 0,5 mM bilan inhibe qilishi xabar qilingan.¹⁹Bu PI (4,5)P2 ni kamaytirishning mumkin bo'lgan manbaidir. Birgalikda, bizning ma'lumotlarimiz alpelisib PI (4,5) P2 va PI (3) P darajalariga bispesifik ta'sir ko'rsatish orqali OCRL KO endosomalarida aktin birikmasini inhibe qilishini ko'rsatdi.

4-rasm|Alpelisib madaniy insoniylashtirilgan Ocrl tarkibida Oralning aktin nuqsonlarini engillashtiradi^Y/-sichqoncha PTC (m PTC). (a) OcrlY/þ yoki Ocrl ning vakillik maksimal intensivligi Z-proyeksiyali konfokal mikrograflar^Y/-m PTClar 16 soat davomida dimetilsulfoksid (DMSO) yoki 10 mM alpelisib bilan ishlov beriladi, so'ngra 4 foizli formaldegid fiksi bilan biriktiriladi va aktin (phalloidin) (oq) va 40,{4}}diamidino-2-fenilindol uchun immunobelirlanadi. (DAPI) (ko'k), har bir holatda stress tolalari mavjud bo'lgan daraja miqdori bilan, stress tolalari Ocrl da yo'qolganligini ko'rsatadi.^Y/-m PTClar alpelisib davolash orqali qutqariladi. Chiziqlar ± SEM vositalarini ko'rsatadi va ma'lumotlar nuqtalari har bir tasvirlash hududini ko'rsatadi: har bir holat uchun N=5 tasvirlash hududi (har birida taxminan 15-20 hujayra mavjud). Muhimlik Xolm-Sidakning ko'p taqqoslash testi, **P=0.001, ko'p taqqoslash bilan oddiy 1-dispersiyani tahlil qilish (ANOVA) bilan baholandi; Ocrl Y/þ DMSO va Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO va Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (muhim emas [ns]). Barlar=20mm. (b) 16 soat davomida DMSO yoki 10 mM alpelisib bilan ishlov berilgan va keyin 4 foizli formaldegid fiksi bilan fiksatsiyalangan va erta endozoma antijeni 1 (EEA1) (binafsha), aktin (binafsha rang) uchun immuno-belgilangan Ocrl m PTClarning yuqori kattalashtirishdagi vakili 3D sirt tasvirlari ( phalloidin, sariq) va DAPI (ko'k) va alpelisib tomonidan aktin-endosomal qoplamaning qutqarilishini ko'rsatadigan miqdorni aniqlash. Umumiy koʻrinishni koʻrsatuvchi pastroq kattalashtirilgan koʻrinishlar (davomi)

4-rasm|(davomi) bu hududlar S4B qo'shimcha rasmda va S1-S3 qo'shimcha filmlarida ko'rsatilgan. Chiziqlar o'rtacha ± SEMni bildiradi. OcrlY/þ DMSO, Ocrl uchun N=42, 47 va 45 tasodifiy tanlangan maydonlar^Y/-þ DMSO va Ocrl^Y/-þ alpelisib sharoitlari, mos ravishda, har bir holatda 4 ta sichqonchaning buyragidan birlashtirilgan. Muhimlik Kruskal-Wallis (KW) ANOVA tomonidan Dunnning bir nechta taqqoslash testi bilan sinovdan o'tkazildi: umumiy ***P < 0.001,="" bir="" nechta="" taqqoslash;="" ocrly/þ="" dmso="" va="">^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" va="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Barlar=1 mm. (c) OcrlY/þ yoki Ocrl ning vakili konfokal mikrograflari^Y/-m PTC DMSO yoki 10-mM alpelisib bilan ishlov beriladi, so‘ngra Golji fiksatsiyasi bilan o‘rnatiladi va m Ch-2xFYVE PI(3)P zond (magenta) va DAPI (ko‘k rang) yordamida etiketlanadi, miqdorini aniqlash bilan hujayralarda aniqlangan PI (3) P-musbat nuqtalar soni. OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl dan N=188, 177, 246 va 206 hujayralar^Y/-þ DMSO va Ocrl^Y/-þ alpelisib, mos ravishda; hujayralar har bir guruh uchun 3 ta og'iz buyraklaridan birlashtirildi. KVt testi: umumiy ***P < 0.001,="" bir="" nechta="" taqqoslash;="" ocrly/þ="" dmso="" va="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO va OcrlY/þ alpelisib va ​​Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib, hammasi ***P < 0.001.="" barlar="20" mm.="" (d)="" ocrly/þ="" yoki="" ocrl="" ning="" vakillik="" konfokal="">^Y/-m PTClar 16 soat davomida DMSO yoki 10 mM alpelisib bilan ishlov berilgan, keyin 4 foizli formaldegid fiksi bilan biriktiriladi va fosfatidilinositol (PI) 4,5-bisfosfat [PI(4,5) P2] (sariq) va DAPI uchun immunobelirlanadi. (koʻk), PI(4,5)P2-musbat nuqtalar sonining miqdori bilan, Ocrl da PI(4,5)P2 punktalarining ortganini koʻrsatadi^Y/-hujayralar, bu alpelisib bilan davolash orqali kamayadi. N=477, 444, 423 va 494 OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO va Ocrl^Y/-þ alpelisib, mos ravishda; hujayralar har bir guruh uchun 3 ta og'iz buyraklaridan birlashtirildi. KVt testi: umumiy ***P < 0.001,="" bir="" nechta="" taqqoslash;="" ocrly/þ="" dmso="" va="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO va OcrlY/þ alpelisib va ​​Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib, hammasi ***P < 0.001.="" barlar="20" mm.="" ushbu="" rasmni="" ko'rishni="" optimallashtirish="" uchun="" www.kidney-international.org="" saytida="" ushbu="" maqolaning="" onlayn="" versiyasiga="">

1.4 Alpelisib hujayra ichidagi fosfoinositidlarni kamaytiradi va Ocrl dagi sitoskeletal nuqsonlarni yumshatadi.^Y/-m PTC

Keyinchalik biz alpelisibning insoniylashtirilgan Ocrldefificient sichqoncha modeli (Ocrl) dan olingan PT hujayralarining asosiy hujayralarida bir xil ta'sirga ega ekanligini tekshirdik.^Y/-), bu bemordan olingan hujayralarda kuzatilgan anormal aktin polimerizatsiyasi va endositik nuqsonni takrorlaydi.^10,11Sichqoncha PTC (m PTC) sinf I PI3K(fosfoinositid 3-kinaz) WT va Ocrl da HK2 hujayralarining tartibga soluvchi subbirliklari^Y/-sichqonlar va MTT tahlillari bilan baholanganda alpelisibga o'xshash toksiklik profilini ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm S3). Konfokal mikroskop yordamida tasvirlash Ocrl dan m PTClarda normal F-aktin stress tolasi arxitekturasining ajoyib buzilishini aniqladi.^Y/-OcrlY/þ sichqonlari bilan solishtirganda, aktinni tartibga soluvchi oqsillarning normal hujayra joylashuvidan endosomalarga ko'chirilishi bilan bog'liq, chunki aktinning katta to'plamlari bu organellalarni o'rab oladi va savdo nuqsonining kelib chiqishi hisoblanadi.^10,29Ocrl bilan davolash^Y/- Alpelisib (10 mM) bilan m PTClar stress tolasi arxitekturasini tikladi (4a-rasm).

Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori alpelisib Lou sindromi/Dent kasalligi uchun qanday ishlatiladi?

Asosiy muammo sifatidaLowe sindromi va Dent kasalligi2 - endosomal savdoning kamayishi va natijada megalin degradatsiyasi, biz endosomal aktinni stress tolalaridan ajratishga harakat qildik. Biz hujayralar bo'ylab lazerli skanerlash konfokal z-steklarini to'pladik, 3D sirt renderlarida binoni naqshini qayta tikladik va punktat aktin tuzilmalarini va ularning endosoma tuzilmalari bilan bir-biriga yopishish darajasini aniqlash uchun o'lcham shakli/parametrlaridan foydalandik (Qo'shimcha rasm S4 va filmlar S1). –S3). Ushbu tahlil shuni ko'rsatdiki, alpelisib bilan davolash stress tolasi arxitekturasidan farqli ravishda EEA1 bilan bo'yalgan endosomalarda F-aktinning aberrant polimerizatsiyasini kamaytirdi (4b-rasm). Ocrl dan olingan m PTC^Y/-sichqonlar WT OcrlY/þ sichqonlaridan olingan m PTC bilan solishtirganda PI (3) P (kamaygan) va PI (4,5) P2 (ko'tarilgan) uchun hujayra ichidagi bo'yashda sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi (4c va d-rasm). Ocrl dan m PTCni davolash^Y/- alpelisibli sichqonlar hujayra ichidagi PI (3) P va PI (4, 5) P2 bo'yashining sezilarli darajada pasayishiga olib keldi (4c va d-rasm).

1.5 Alpelisib Ocrl dagi endositik qabul qilishni yaxshilaydi^Y/-m PTC

Keyinchalik alpelisibning m PTCda kuzatilgan sitoskeletal va vesikulyar nuqsonlarga ta'siri endotsitik qabul qilish qobiliyatining o'zgarishiga olib keldimi yoki yo'qligini baholadik. Alpelisibning ligandning bog'lanishi va/yoki ichkilashtirilishiga ta'sirini farqlash uchun m PTClar avval yorliqli sigir zardobi albumini (BSA) bilan inkubatsiya qilindi, probning endotsitik retseptorlari bilan bog'lanishini induktsiya qilish uchun, keyin esa o'sish muhiti bilan inkubatsiya qilindi. albuminning ichkilashtirilishiga rioya qiling (5a-rasm). Ocrl^Y/-hujayralar Alexa 488-sigir zardobidagi albuminining plazma membranasi bilan bog‘lanishini, shuningdek, OcrlY/þ hujayralari bilan solishtirganda albuminning ichkilashuvining buzilishini ko‘rsatdi. Alpelisib bilan davolash albuminning Ocrl bilan bog'lanishini va so'rilishini saqlab qoldi.^Y/-hujayralar, endositik assimilyatsiyaning 50 foizini umumiy qutqarish bilan (5b va c-rasm). Ushbu ma'lumotlar albuminning umumiy qabul qilinishini o'lchash bilan qo'llab-quvvatlandi (qo'shimcha raqamlar S5a va b). Biz ichkilashtirilgan/bog'langan Alexa 488- sigir zardobidagi albumin nisbati turli sharoitlarda o'xshash bo'lib qolganini ta'kidladik (5d-rasm), bu albuminning kamayishi asosan noto'g'ri ichkilashtirish jarayoni emas, balki bog'lanishning buzilishi bilan bog'liqligini anglatadi.

1.6 Alpelisib Ocrl da PT disfunktsiyasini va retseptorlari vositachiligidagi endositozni yaxshilaydi.^Y/- sichqonlar

Biz alpelisibning PT disfunktsiyasiga potentsial terapevtik ta'sirini in vivo sinovdan o'tkazdik. Og'iz sichqonlari transport vositasi yoki alpelisib (kuniga 50 mg / kg tana vazni) bilan 6 hafta davomida og'iz gavaj orqali qo'llangan (6a-rasm). Ushbu rejim samaradorlik va xavfsizlikni ko'rsatadigan oldingi in vivo tadqiqotlarga muvofiq tanlangan.^22,30Insulin qarshiligi va giperglikemiyaga olib kelishi ma'lum bo'lgan alpelisib qo'llanilishiga muvofiq,²²alpelisib bilan davolash Ocrl Y/þ va og'iz orqali glikozuriyaning sezilarli darajada oshishiga olib keldi.^Y/-dori dozalash uchun biomarker sifatida ko'rib chiqilishi mumkin bo'lgan sichqonlar (qo'shimcha jadval S1). 6 haftalik alpelisib davolashdan so'ng, Ocrl^Y/-sichqonlarda LMW oqsillari CC16 (-34 foiz) va albumin (-38 foiz) ning siydik bilan chiqarilishi transport vositasida ishlov berilgan nazoratlar bilan solishtirganda (6b va c-rasm) sezilarli darajada kamayganini ko‘rsatdi. siydik va boshqa ko'rsatkichlar ta'sirlanmagan (qo'shimcha jadval S1). Ikkala genotipning Alpelisib bilan davolash qilingan sichqonlari, yuqorida tavsiflanganidek, nazorat sichqonlariga nisbatan o'sish tezligining o'xshash pasayishini ko'rsatdi.²²Shunga qaramay, transport vositasi va davolangan sichqonlar tana vazniga ega bo'lishdi, bu preparat postnatal rivojlanishga jiddiy ta'sir qilmasligini ko'rsatadi (6d-rasm va qo'shimcha jadval S1).

Alpelisibning LMW proteinuriyasiga ta'siri PT hujayralarida retseptorlar vositachiligidagi endositozning tiklanishini aks ettiradimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz sichqonchaning buyragida Cy{1}}belgilangan b-laktoglobulinning in vivo qabul qilinishini kuzatdik. Alpelisib bilan davolash qilingan Ocrl^Y/-sichqonlar Cy{0}}yorlig'i bilan belgilangan b-laktoglobulinni o'zlashtirishning sezilarli darajada qutqarilishini ko'rsatdi, bu transport vositasi bilan ishlov berilgan OcrlY/þ sichqonlarida kuzatilgan ichkilashtirish darajasiga yaqin (6e-rasm). Bu alpelisib bilan davolash qilingan Ocrl buyrak lizatlarining immunobelingi va g'arbiy blotlanishi bilan kuzatilganidek, PT hujayralarida endotsitik retseptor megalinning ifodalanishida sezilarli qutqarish bilan aks ettirilgan.^Y/-sichqonlar; AQP1 PT markerining ifodasida hech qanday o'zgarish bo'lmaganiga e'tibor bering (6f va g-rasm va S5C va D qo'shimcha rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)alpelisib inhibitoriPT endositik mexanizmining sezilarli yaxshilanishiga olib keladi va Lowe sindromi uchun insoniylashtirilgan sichqoncha modelida LMW proteinuriyasini kamaytiradi.

5-rasm|Alpelisib insoniylashtirilgan Ocrl ning endositik so'rilishini yaxshilaydi^Y/-sichqoncha PTC (m PTC). (a) Alexa 488-sigir zardobidagi albuminini (BSA) m PTCga bog'lanishini va ichkilashtirilishini tekshirish uchun foydalanilgan puls-ta'qib tajribasini tasvirlovchi sxema. Hujayralar Alexa 488-BSA (0,2 mg/ml) 1 soat davomida 4 daraja haroratda BSA ning hujayra sirti retseptorlari (puls) bilan bog'lanishiga imkon berish uchun ta'sir qilindi va keyin hujayra muhitida 37 darajagacha qizdirildi. fiksatsiyadan oldin 20 daqiqa davomida ligandning ichkilashishini ta'minlash uchun (chase). (b) OcrlY/þ yoki Ocrl ning vakillik konfokal mikrograflari^Y/-m PTClar 16 soat davomida dimetilsulfoksid (DMSO) yoki 10 mM alpelisib bilan ishlov berilgan va Alexa 488-BSA (yashil) puls-chasse eksperimentidan o‘tkazilgan, 40,6-diamidino{ uchun o‘rnatilishi va etiketlanishi. {6}}fenilindol (DAPI) (ko‘k). Tajribaning impuls bosqichi har bir holat uchun yuqori panelda, quyida ta'qib qilish bilan ko'rsatilgan. Barlar=20 mm. (c) hujayra yuzasi Alexa 488-BSA (i) va ichki Alexa 488-BSA (ii) miqdorini aniqlash, har bir hujayra uchun o'rtacha FL floresan intensivligi sifatida baholanadi. Alpelisib Ocrlda kuzatilgan qutqarilgan BSA bog'lanishini va ichkilashtirishni qutqaradi^Y/-hujayralar. OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO va Ocrl uchun N=209, 228, 186 va 196 hujayralar^Y/-alpelisib shartlari, mos ravishda (i) va N=203, 183, 199 va 233 katakchalarda OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib sharoitlari, mos ravishda (ii), har bir holatda har bir holatda 2 ta sichqonchaning buyragidan birlashtirilgan; har bir ma'lumot nuqtasi alohida hujayradagi o'rtacha FL floresan intensivligini ifodalaydi. Muhimligi Kruskal-Uollis (KW) dispersiya tahlili (ANOVA) bilan Dunnning bir nechta taqqoslash testi bilan tekshirildi: (i) hujayra yuzasi BSA uchun, umumiy ***P < 0.001,="" bir="" nechta="" taqqoslashlar:="" ocrly/þ="" dmso="" va="">^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" va="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (muhim="" emas="" [ns]);="" (ii)="" ichkilashtirilgan="" bsa="" uchun,="" umumiy="" ***p=""><0,001, bir="" nechta="" taqqoslashlar:="" ocrly/þ="" dmso="" va="">^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" va="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" hujayra="" yuzasi="" alexa="" 488-="" bsa="" va="" ichkilashtirilgan="" alexa="" 488-bsa="" fl="" floresan="" intensivliklari="" o'rtasidagi="" nisbatning="" miqdori,="" har="" bir="" holat="" o'rtasidagi="" nisbatlarda="" sezilarli="" farqlarni="" ko'rsatmaydi.="" har="" bir="" nuqta="" taxminan="" 15–20="" katak="" (n="13," 13,="" 10="" va="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="" ocrl="" uchun="" tasodifiy="" tanlangan="" maydonlar)="" o‘z="" ichiga="" olgan="" maydondagi="" nisbatning="" o‘rtacha="" qiymatini="">^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib sharoitlari, mos ravishda, har bir holatda, har bir holatda 2 ta sichqonchaning buyragidan birlashtiriladi). Muhimlik KW ANOVA tomonidan Dunnning bir nechta taqqoslash testlari bilan tekshirildi: umumiy P=0.46 (ns), bir nechta taqqoslashlar: OcrlY/þ DMSO va Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-DMSO va Ocrl^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO va OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Ushbu rasmni ko'rishni optimallashtirish uchun www.kidney-international.org saytida ushbu maqolaning onlayn versiyasiga qarang.

6-rasm|Alpelisib OcrlY/L sichqonlarining proksimal tubula (PT) funktsiyasini yaxshilaydi, ligandlarni qabul qilish va megalin ifodasini tiklaydi. (a) Eksperimental o'rnatish. Og'iz sichqonlari 6 hafta davomida karboksimetilselüloza 1 foiz (avtomobil) yoki alpelisib (tana vazniga 50 mg / kg) kunlik og'iz dozasi bilan davolandi. Davolanishning oxirgi kunida sichqonlarga Cy{4}}belgili b-laktoglobulin (N=6 Ocrl) yuborildi.^Y/-, yoki 8 Ocrl^Y/-har bir guruh uchun sichqonlar). (b-d) Ko'rsatilgan D qiymatlari ±SEM holati uchun BL dan D42 gacha bo'lgan o'rtacha o'zgarishlarni ko'rsatadi. (b) Klara hujayra oqsili 16 (CC16), (c) albumin siydik chiqishi (ikkalasi ham 15 soat ichida) va (d) tana massasi ko'rsatilgan vaqt nuqtasida transport vositasi yoki alpelisib bilan davolash qilingan OcrlY/- sichqonlarda o'lchandi. Har bir nuqta 1 sichqonchani ifodalaydi. Muhimlik 2-quyruqli juftlashtirilgan Student t-testi bilan baholandi; (b) CC16da (davomi)

6-rasm|(davomi) asosiy ko'rsatkichga nisbatan chiqish o'zgarishi; þ avtomobil, P=0.9802 (ahamiyatli emas [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; (c) albumin chiqishi boshlang'ichga nisbatan o'zgarishi; þ avtomobil, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0.0006; (d) tana massasining boshlang'ichga nisbatan o'zgarishi; þ avtomobil, ***P < 0.0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0.0083." (e)="" cy{13}}belgilangan="" b-laktoglobulin="" (magenta)="" dum="" venasiga="" kiritilgandan="" 15="" minut="" o‘tgach="" va="" 40,{17}}diamidino-2-fenilindol="" (dapi)="" (ko‘k)="" uchun="" etiketlangan="" konfokal="" mikrografiklar,="" bundan="" tashqari,="" ocrl="" sichqoncha="" buyraklaridan="" (n="412," 500="" va="" 588="" tubulalar,="" ocrly/şş="" avtomobili="" uchun="" mos="" ravishda,="" fl="" floresan="" signallarining="" miqdorini="" aniqlash,="">^Y/-þ transport vositasi va Ocrl^Y/-þ alpelisib) har bir davolash guruhi uchun 3 sichqon uchun. b-laktoglobulinni qabul qilish alpelisib bilan davolash orqali qutqariladi. Barlar ¼ 20 mm. Miqdor ko'rsatkichlarida har bir nuqta tubula maydoni bilan normallashtirilgan FL floresan intensivligini ifodalaydi; chizilgan ma'lumotlar o'rtacha ± SEMni ko'rsatadi. Muhimlik Kruskal-Vallis (KW) testi, so'ngra Dunnning ko'p taqqoslash testi bilan baholandi; ***P <0,001, bir="" nechta="" taqqoslashlar;="" ocrly/þþ="" avtomobil="" va="">^Y/-þ transport vositasi va Ocrl^Y/-þ avtomobil va Ocrl^Y/-þ alpelisib, ikkalasi ham ***P < 0.001.="" (f)="" og'iz="" sichqonlarining="" butun="" buyrak="" lizatlarida="" megalin="" darajasini="" western="" blotting="" va="" densitometriya="" tahlili.="" a-tubulin="" yuklash="" nazorati="" sifatida="" ishlatilgan.="" ocrl-da="" kamaytirilgan="" megalin="">^Y/-alpelisib tomonidan qutqariladi. Densitometriya tahlili miqdorini aniqlashda har bir nuqta 1 sichqonchani (N=4 OcrlY/şş avtomobil va Ocrl) ifodalaydi.^Y/-þ avtomobil va N=3 Ocrl^Y/-þ alpelisib sichqonlari); chiziqlar o'rtacha ± SEMni bildiradi. Muhimlik 2-tailed unpaired Student t-testlari bilan baholandi: OcrlY/þþ avtomobil va Ocrl^Y/-þ transport vositasi; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ avtomobil va Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Og'iz buyraklaridan olingan AQP1+ PTs (magenta) dagi megalin (sariq) intensivligining miqdorini aniqlash va yuqori kattalashtirishga ega bo'lgan vakil konfokal mikrograflar, shuningdek, alpelisib davolashdan keyin megalin darajasini saqlab qolishni ko'rsatadigan DAPI (ko'k) uchun etiketlangan. Barlar=20 mm. Miqdor ko'rsatkichlarida har bir nuqta tubula maydoni bilan normallashtirilgan FL floresan intensivligini ifodalaydi; chizilgan ma'lumotlar o'rtacha ± SEMni ko'rsatadi; N=142, 191 va 266 tubulalar, mos ravishda, OcrlY/şş avtomobil uchun, Ocrl^Y/-þ transport vositasi va Ocrl^Y/-har bir davolash guruhi uchun 3 sichqon uchun alpelisib. Muhimligi KW dispersiya tahlili va keyin Dunnning ko'p taqqoslash testi bilan baholandi; umumiy ***P < 0.001,="" bir="" nechta="" taqqoslashlar;="" ocrly/þþ="" avtomobil="" va="">^Y/-þ transport vositasi va Ocrl^Y/-þ avtomobil va Ocrl^Y/-þ alpelisib, ikkalasi ham ***P < 0.001.="" ushbu="" rasmni="" ko'rishni="" optimallashtirish="" uchun="" www.kidney-international.org="" saytida="" ushbu="" maqolaning="" onlayn="" versiyasiga="">

Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori alpelisib Lou sindromi/Dent kasalligi uchun qanday ishlatiladi?

2. MUHOKAZA

Hozirgi vaqtda PT disfunktsiyasini keltirib chiqaradigan nuqsonli endositozni engillashtiradigan davo yo'qLowe sindromi va Dent kasalligi2. Bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatadiki, alpelisib PI(4,5)P2 va PI(3)P darajasini pasaytirish orqali aberrant aktin fenotipini engillashtiradi, bu esa hujayra tizimlarida endotsitik mexanizm va so'rilish qobiliyatini sezilarli darajada yaxshilaydi va sichqonchaning insoniylashtirilgan modelini yaratadi. Lou sindromi/Dent kasalligi 2. Bu natijalar fosfoinositid lipidlari, aktin polimerizatsiyasi va endotsitik savdo o'rtasidagi bog'liqlikni qo'llab-quvvatlaydi, bu muhim gomeostatik jarayonlarda ishtirok etuvchi yuqori faol epiteliya hujayralari uchun bevosita tegishli (7-rasm). Samarali terapiya yo'qligi va ushbu PI3K sinfining aniq xavfsizligini hisobga olgan holda (fosfoinositid 3-kinaz)ingibitorlar, alpelisib dorilarni qayta ishlash uchun istiqbolli nomzoddirLowe sindromi va Dent kasalligi.

LMW proteinuriyasi bo'lgan bemorlarda uchraydigan eng izchil xususiyatdirLowe sindromi va Dent kasalligi2 OCRL dagi mutatsiyalarni inaktivatsiya qilish tufayli.⁴Ushbu LMW oqsillarini osongina aniqlash va miqdorini aniqlash mumkin, bu PT hujayralarida nuqsonli retseptor vositachiligidagi endositozning ishonchli biomarkerini taklif qiladi.1 LMW proteinuriyasi ayniqsa dolzarbdir, chunki u boshqa eritmalarga (masalan, glyukoza, fosfat, aminokislotalar) klassik "buyrak Fankoni sindromi" ning bir qismi - hech bo'lmaganda endolizosomal yo'lning tug'ma kasalliklarida.¹Bu erda biz alpelisib plazma membranasidagi megalin retseptorlarining tiklangan darajalari tufayli in vitro va in vivo PT hujayralarining apikal endositik qabul qilish qobiliyatini qutqarishini ko'rsatamiz. Bu ta'sir siydikda LMW oqsillarini (CC16 va albumin) yo'qotishning sezilarli darajada kamayishi bilan namoyon bo'ladi.^Y/-sichqonlar 6 hafta davomida alpelisib bilan davolashdi. Alpelisibning bu ta'siri o'zlarining apikal farqlanishini saqlaydigan va fiziologiya va kasalliklarda retseptorlar vositachiligidagi endositozni tekshirish uchun juda mos keladigan m PTClarda kuzatilgan.⁹ Xususan, biz Ocrl-da inson INPP5B-ni ifodalovchi insoniylashtirilgan sichqoncha modelidan m PTC oldik.^Y/-; Inpp5b^-/-fon, bu bizga OCRL faoliyatining yo'qolishining o'ziga xos oqibatlarini tekshirishga imkon beradi.^11,23

Endositozning alpelisib tomonidan qutqarilishi uning aktin mexanizmlariga ta'siri bilan izohlanadi, bu OCRL KO HK2 hujayralari va m PTClarda aniq isbotlangan. Shunday qilib, bizning kuzatishlarimiz OCRL bemorlarida va KO hujayralarida erta endosomal yo'lda fosfoinositid balansi va F-aktin nazorati o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rsatadigan oldingi tadqiqotlarni tasdiqlaydi va kengaytiradi.^7,10OCRL faolligining funktsional yo'qolishi PI (4,5) P2 ning degradatsiyasini buzadi, bu esa, o'z navbatida, klatrin bilan qoplangan pufakchalarni yo'q qilishga olib keladi, natijada turli xil hujayralar, shu jumladan PT hujayralarida aberrant endosomal organellalar paydo bo'ladi.^7-10Biz yaqinda ko'rsatdikki, ortiqcha F-aktin megalin multiligand retseptorlari PT hujayralarining apikal membranasiga qayta ishlanishini kamaytiradi, bu esa nuqsonli endositoz va LMW proteinuriyasini keltirib chiqaradi.¹¹

Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, alpelisibning endosomal aktinga ta'sir qilish mexanizmi alpelisib inhibisyonining bispesifik ta'siridan kelib chiqadi: birinchi navbatda PI (3, 4, 5) P3 ishlab chiqarish va uni PI (3) P ga aylantirish, ikkinchidan PI(4,5)P2 ishlab chiqarish. PI(4,5)P2 darajasining pasayishi OCRL etishmovchiligiga to'g'ridan-to'g'ri qarshi turadi va fosfatidilinositol 4-fosfat 5-kinaz darajasini pasaytirish orqali ortiqcha aktinni yumshatish va endotsitik oqimni oshirish bo'yicha oldingi ishlarga mos keladi. , PI(4,5)P2 hosil qiluvchi ferment.¹⁰Alpelisib PI(4,5)P2 hosil qiluvchi PI4Kb kinazida 0,5 mM 50% ingibitor kontsentratsiyasiga ega, bu mas'ul bo'lishi mumkin yoki OCRL kombinatsiyasi natijasida fosfoinositid balansiga umumiy ta'sir ko'rsatishi mumkin. KO va alpelisib bilan davolash. Biz IA PI3K sinfini aniqladik(fosfoinositid 3-kinaz)alpelisib tomonidan inhibisyon aktin inhibisyonu bilan bog'liq, chunki p110a ning siRNK vositachiligida kamayishi alpelisib davolash va kopanlisibga o'xshash aktin to'planishini inhibe qiladi (bu PI4Ksni inhibe qilish haqida xabar berilmagan). RPE hujayralarida biz PI(3,4)P2 ni PI(3)P ga aylantiruvchi INPP4A siRNAsi OCRL KO hujayralarida aktin birikmasini inhibe qilishini, PI(3,4,5) ni inhibe qilish yo'lini ta'minlashini ilgari kuzatgan edik. P3 ishlab chiqarish endosomal PI (3) P ning pasayishiga. Biz ba'zi PI (3)P ning qolganligini ko'rsatdik, ehtimol III PI3K, Vps34 sinfi tomonidan erta endosomada hosil bo'lgan hovuz, chunki biz endosoma savdosi alpelisib davolash bilan bostirilgandan ko'ra kuchaytirilganligini aniqladik. PI metabolizmining murakkab tartibga solinishi va uning OCRL inaktivatsiyasiga aloqadorligi yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda ham ta'kidlangan, bu erda fosfoinositid 3- fosfataza PTENning katalitik bo'lmagan funktsiyalari PLCXD orqali PI (4,5)P2 degradatsiyasini faollashtiradi, hujayra fenotiplari va so'rilishini yumshatadi. zebrafish modelidagi ligandlar.³¹

PI(4,5)P2 va PI(3)P darajalarini alpelisib bilan davolash orqali aktin fenotipini yumshatish SNX9 ni faollashtirish uchun jalb qilishda PI(4,5)P2 va PI(3)P ning sinergik ta’siriga mos keladi. Ocrl endosomalaridagi aktin apparati,¹⁴endosomalarda aktin faollashuvining molekulyar regulyatsiyasini manipulyatsiya qilish uchun alpelisib o'ziga xosligining juda samarali mosligini taklif qiladi. O'z navbatida, ilgari ko'rsatilgandek, endosomal aktin birikmasining kamayishi, o'z navbatida, OCRL etishmovchiligi bo'lgan hujayralardagi PT endositozining yaxshilanishiga olib keladi.¹⁰Fosfoinositidlar almashinuvi orqali aktinning regulyatsiyasi alpelisib bilan kuzatilgan terapevtik ta'sirning haqiqiy manbai ekanligini yaxshiroq tushunish uchun qo'shimcha tavsiflash kerak bo'ladi.^Y/-sichqoncha modeli. Chunki I sinf PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)hujayra o'sishi, ko'payishi, omon qolish, metabolizm va autofagiyani boshqaradigan yo'llarni tartibga soladi;³²endositik qutqarish PI (3,4,5)P3 ga bevosita ta'sir qilish va I sinf PI3K tomonidan modulyatsiyalangan boshqa yo'llarga qo'shma ta'sir qilish bilan bog'liqligini istisno qila olmaymiz. PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)ingibitorlar, shuningdek, OCRL mutatsiyalari bo'lgan bemorlarning nevrologik va boshqa klinik ko'rinishlarini engillashtirishi mumkin.⁴

PROS/CLOVES sindromi bo'lgan bolalarda alpelisibni qo'llashning so'nggi tajribasi shuni ko'rsatadiki, preparat yaxshi muhosaba qilish potentsialiga ega. Alpelisib og'iz orqali qabul qilinadi, tanlab PI3K izoformini nishonga oladi (fosfoinositid 3-kinaz)sinf I va pan-PI3K inhibitörleri bilan solishtirganda kichik toksiklik profilini ko'rsatadi. Chunki alpelisib PI3K ni to'liq bloklamaydi(fosfoinositid 3-kinaz)faolligi, shuning uchun signalizatsiya yo'lining funktsiyalarini saqlab turish, ayniqsa uzoq muddatli foydalanish uchun mos bo'lishi mumkin. Qizig'i shundaki, alpelisibni qo'llash natijasida kelib chiqadigan giperglikemiya dietani o'zgartirish orqali boshqarilishi mumkin.²²PT disfunktsiyasi Dent kasalligi 2 va Lou sindromi bo'lgan yosh chaqaloqlarda kuzatiladigan buyrak kasalligining birinchi ko'rinishi bo'lganligi sababli, metabolik profil va o'sishning yaxshilanishiga olib keladigan bunday PT disfunktsiyasini erta davolash surunkali buyrak kasalligiga o'tishni sekinlashtirishi mumkin va shuning uchun hayot davomiyligi va sifatiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi.³³OCRL mutatsiyasining kasallikning namoyon bo'lishi ayniqsa keng bo'lsa-da, 2-Dent kasalligining Lou sindromi bo'lgan genotipli bemorlarning katta kogortalariga asoslangan yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar mutatsiya turining yoki mutatsiyaning joylashuvining buyrakning omon qolishiga sezilarli ta'sirini tasdiqlamadi.³⁴Birgalikda bizning ma'lumotlarimiz Lou sindromi/Dent kasalligi 2da PT disfunktsiyasini davolash uchun alpelisibni qayta ishlatish potentsialini ta'kidlaydi va shu bilan insoniy klinik sinovlarda tez va tejamkor foydalanish uchun asos yaratadi.

3. METODLAR

3.1 To'liq ma'lumotni Qo'shimcha usullarda topish mumkin.

HK2 hujayralari, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, kopanlisib, alpelisib, GSK2636771 yoki idelalisib bilan ko'rsatilgan konsentratsiyalarda 16 soat davomida davolandi. Proteinlar hujayralar yoki buyrak to'qimalaridan standart usullar yordamida ekstraksiya qilingan va g'arbiy blot nashr etilgan yoki sotiladigan antikorlar yordamida amalga oshirilgan. siRNK nokdatu tahlildan 72 va 24 soat oldin 2 ta transfeksiya yordamida amalga oshirildi. Biz yosh va jinsga mos keladigan OcrlY/þ dan foydalandik; Inpp5b^{- /-}; va Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- BAC-INPP5B ifodasini o'z ichiga olgan sichqoncha zambillari. 8 haftalik Ocrl sichqonlaridan olingan buyraklardan m PTC ning birlamchi kulturalari yaratildi va Oral m PTC larning endotsitik sig'imi albuminni qabul qilishni o'lchash yo'li bilan baholandi. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, Alpelisib muolajalari 16 soat davomida 10 mM edi. M PTCda albuminning o'zlashtirilishi apikal bog'lanish va natijada qabul qilishni baholash uchun "pulse-chase" protokoli yordamida baholandi. m PTClar bir kechada tegishli birlamchi antikor va 45 daqiqa davomida mos FL florofor bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar va/yoki Alexa{9}} Phalloidin bilan bo'yalgan. M PTCda PI(3)P bo'yash FYVE domen probi yordamida amalga oshirildi. Tasvir tahlili CellProfifiler yordamida aktin/EEA1 qoplamasi va punktalar sonini o'lchash uchun maxsus quvurlardan foydalangan holda, immunofluoresans intensivligini va stress tolasi darajasini hisoblash uchun aniqlangan qirralarni o'lchash uchun ImageJ yordamida amalga oshirildi. Miqdoriy ma'lumotlar o'rtacha o'rtacha ± standart xato sifatida ifodalangan. In vivo tajribalar uchun 6 haftalik sichqonlarga transport vositasi yoki alpelisib 50 mg / kg tana vazniga ishlov berildi. Siydik har 14 kunda to'plangan va hayvonlar 42 kunlik davolanishdan so'ng, qon va buyraklar bilan birga qurbon qilingan. Og'iz sichqonlarining PT endotsitik qobiliyati b-laktoglobulinni qabul qilishni o'lchash yo'li bilan tekshirildi.

4. OShKOR QILISh

JLG o'z laboratoriyasida talabalik uchun AstraZeneca tomonidan moliyalashtiriladi. SPJ maslahat kengashlarida va Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics va Adrestia Therapeutics kompaniyalarining aktsiyadorlik huquqiga ega va Ahren Innovation Capital kompaniyasining ilmiy hamkori hisoblanadi. Boshqa barcha mualliflar hech qanday raqobatdosh manfaatlar yo'qligini e'lon qilishmagan.

5. MAQSAT

Bu ish Yevropa Tadqiqot Kengashi granti 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Trust New18 Research tomonidan qo'llab-quvvatlandi. (j) JLG-ga va SPJ-ga 206388/Z/17/Z Wellcome Investigator mukofoti va biz Wellcome Trust (092096) va CRUK (C6946/A14492) tomonidan Gurdon instituti tomonidan moliyalashtirilganligini tan olamiz. Biz Sistinoz tadqiqot fondi (Irvine, CA), Shveytsariya milliy fan fondi (loyiha granti 310030_189044), UZH klinik tadqiqotlar ustuvor dasturi (KFSP) RADIZ (Nodir kasalliklar tashabbusi Tsyurix), Shveytsariyaga minnatdormiz.

Qo'llab-quvvatlash uchun Milliy tadqiqotlar bo'yicha vakolatlar markazi (NCCR) Buyrak gomeostazini nazorat qilish (Kidney.CH) va NIDDK/NIH va Lou sindromi Trust/Buyuk Britaniya Oral sichqonlarning rivojlanishini qo'llab-quvvatlash uchun. Biz Robert L. Nussbaumni (Invitae korporatsiyasi va UCSF, San-Fransisko, Kaliforniya) va Mariya Antonietta De Matteisni (Teleton Genetika va Tibbiyot instituti, Federiko II Neapol universiteti, Neapol, Italiya) Oral sichqoncha koloniyasi asoschilari bilan ta'minlaganliklari uchun minnatdorchilik bildiramiz;

va Erik Olinger (UZH, Tsyurix) samarali muhokamalar uchun. Nadine Näegele va Daniela Nieriga siydik yig'ish va tahlil qilish jarayonida texnik yordam ko'rsatganliklari uchun minnatdorchilik bildiramiz; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Parij) biz bilan in vivo davolash uchun Alpelisib tayyorlash bo'yicha batafsil protokolni baham ko'rgani uchun; va reagentlar bilan ta'minlash uchun Renata Kozyraki va Per Verroust. Shuningdek, Tsyurix universiteti (Syurix, Shveytsariya) Mikroskopiya va tasvirni tahlil qilish markaziga va Tsyurix integrativ kemiruvchilar fiziologiyasi (ZIRP) muassasasiga tasvirni olish uchun asbob-uskunalar taqdim etgani va in vivo tajribalar davomida texnik yordam bergani uchun minnatdorchilik bildiramiz.

Fosfoinositid 3-kinaz inhibitori alpelisib Lou sindromi/Dent kasalligi uchun qanday ishlatiladi?

6. QO'SHIMCHA MATERIAL

Qo'shimcha fayl (PDF)

Qo'shimcha usullar va adabiyotlar.

S1-jadval. Alpelisib yoki vosita bilan davolash qilingan og'iz sichqonlarida vaqt o'tishi bilan tana vazni, siydik va qon parametrlari.

S1-rasm. HK2 hujayralarida p110 izoform ifodasi va dori dozasiga javob sitotoksiklik tahlillari.

2-rasm. PI3Kalpelisib inhibitoriaktin-endosomal qoplamani tiklaydi va HK2 hujayralarida dori bilan davolashdan 4 soat o'tgach, dozaga mos ravishda PI (3) P darajasini pasaytiradi.

S3-rasm. Ocrl mPTClarda p110 izoform ifodasi va alpelisib toksikligi.

S4-rasm. Ocrl mPTC-larda EEA1/aktinning bir-biriga mos kelishi tahlilining ish jarayoni.

S5-rasm. Alpelisib Ocrl da albuminni qabul qilishni tiklaydi^Y/-mPTC. Aqp1 ifodasi ta'sirlanmagan. Qo'shimcha fayl (filmlar)

Film S1. DMSO bilan ishlov berilgan OcrlY/þ mPTClarda EEA1/aktinning bir-biriga mos kelishining Imaris 3D renderlashi. 16 soat davomida DMSO bilan ishlov berilgan, so‘ngra 4 foizli formaldegid fiksi bilan biriktirilgan va EEA1 (binafsha), aktin (phalloidin; sariq) va DAPI (ko‘k) uchun immunobelgilangan OcrlY/+ mPTC konfokal to‘plamining 3D sirt tasviri. aktin/endosoma assotsiatsiyasi. Bar=5 mm.

Film S2. Imaris EEA1/aktinning 3D renderlashi Ocrl^Y/-DMSO bilan ishlov berilgan mPTClar. OcrlY/– mPTC konfokal toʻplamining 16 soat davomida DMSO bilan ishlov berilgan, soʻng 4 foizli formaldegid fiksi bilan biriktirilgan va EEA1 (binafsharang), aktin (phalloidin; sariq) va DAPI (koʻk) uchun immunobelgilangan 3D sirt tasviri. endosomal tuzilmalar yaqinida birlashuvchi aktin. Bar=5mm.

Film S3. Imaris EEA1/aktinning 3D renderlashi Ocrl^Y/- mPTClar alpelisib bilan davolanadi. 16 soat davomida 10 mM alpelisib bilan ishlov berilgan, so‘ng 4 foizli formaldegid fiksi bilan biriktirilgan va EEA1 (binafsharang), aktin (phalloidin; sariq) va DAPI (ko‘k) uchun immunobelgilangan OcrlY/– mPTC konfokal stekining 3D sirt tasviri. , endosomalar atrofidagi aktin punktat tuzilmalarini qutqarish tasvirlangan. Bar=5 mm.

ADABIYOTLAR

1. Van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Irsiy buyrak kasalliklaridan fiziologiyani o'rganish. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Loi M. Lou sindromi. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lyuis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Lowe sindromi. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, va boshqalar, tahrirlar. GeneReviews® [internet]. Sietl (WA): Vashington universiteti, Sietl; 1993-2020. Mavjud: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. 2001 yil 24 iyulda nashr etilgan; 2019-yil 18-aprelda yangilangan. 2019-yil 8-avgustda kirish.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-fosfataza OCRL.Lowe sindromi va Dent kasalligi2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Buyrak proksimal tubulasida xlorid tashuvchilar va retseptorlar vositachiligidagi endositoz. J Fiziol. 2015;593:4151–4164.

6. Chjan X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Lou sindromida protein yetishmasligi fosfatidilinositol-4,5-bisfosfat 5- fosfatazadir. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nandez R, Balkin DM, Messa M va boshqalar. Lou sindromi hujayralarini o'rganish natijasida aniqlangan klatrin bilan qoplangan chuqurlik dinamikasi va qoplamani ochishda OCRL ning roli. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Lowe sindromi oqsili OCRL1 ning uyali va fiziologik funktsiyalari. Trafik. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M va boshqalar. Avtofagosoma-lizosoma sintezi TLR9 vositachiligida va OCRL tomonidan boshqariladigan lizosomal javobni ishga tushiradi. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E va boshqalar. OCRL endosomal aktinning PtdIns4,5P (2) ga bog'liq regulyatsiyasi orqali erta endosomalar orqali savdoni nazorat qiladi. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A va boshqalar. OCRL etishmovchiligi insoniylashtirilgan sichqoncha modelida endolizosomal funktsiyani buzadiLowe sindromi va Dent kasalligi. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD va boshqalar. P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- va Rac uchun Gbetagamma tomonidan boshqariladigan guanin-nukleotid almashinuv omili. Hujayra. 2002;108:809–821.

13. Gallop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinositidlar va membrana egriligi Toca-1 va Snx9 ni tanlab olish orqali aktin polimerizatsiyasi rejimini o'zgartiradi. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Varrant A, Holst MR va boshqalar. Fosfoinositidlar va yuqori membrana egriligi bilan aktin polimerizatsiyasini nazorat qilish. J Cell Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T va boshqalar. PTEN PI(3,4)P2 signalini I sinf PI3K()ning quyi oqimida tartibga soladifosfoinositid 3-kinaz). Mol hujayra. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M va boshqalar. Xamirturush va sutemizuvchilar hujayralarida fosfatidilinositol 3-fosfatning lokalizatsiyasi. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD va boshqalar. PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)inson kasalliklarida yo'l. Hujayra. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO va boshqalar. BAY 80-6946 - yuqori selektiv vena ichiga yuboriladigan PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)o'simta hujayralari liniyalari va ksenograft modellarida kuchli p110alpha va p110delta faolligiga ega inhibitor. Mol saratoni. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C va boshqalar. Romanning xarakteristikasi va o'ziga xos PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)alfa inhibitori NVP-BYL719 va klinik sinovlar uchun bemorning tabaqalanish strategiyasini ishlab chiqish. Mol saratoni. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA va boshqalar. Klinik baholash uchun tanlangan kuchli va selektiv fosfatidilinositol-3 kinaz alfa inhibitori NVP-BYL719 kashfiyoti. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G va boshqalar. PIK3CA-mutatsiyaga uchragan, gormon retseptorlari-musbat rivojlangan ko'krak saratoni uchun Alpelisib. N Engl J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH va boshqalar. PIK3CA bilan bog'liq o'sish sindromi bo'lgan bemorlarda maqsadli terapiya. Tabiat. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM va boshqalar. Lowe sindromi/Dent kasalligi 2 buyrak tubulopatiyasi uchun sichqoncha modeli. J Am Soc Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J va boshqalar. Hujayralarda PtdIns (3,4,5) P (3) ni ko'rish uchun monoklonal antikor. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Immunotsitokimyoviy usullar PtdIns4P va PtdIns (4,5) P (2) ning bir nechta, aniq hujayrali hovuzlarini aniqlaydi. Biochem J. 2009;422:23-35.

26. U K, Marsland R III, Upadhyayula S va boshqalar. Klatrin vositachiligidagi endositik transportda fosfoinositid konversiyasining dinamikasi. Tabiat. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Bechora Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)hujayra signalizatsiyasi va vesikulyar savdodagi izoformlar. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P va boshqalar. Dent{2}} kasalligi bilan og'rigan bemorlarning OCRL mutatsiyaga uchragan fibroblastlari Lowe sindromi hujayralariga nisbatan INPP5B-mustaqil fenotipik o'zgaruvchanlikni namoyish etadi. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. Lou sindromida PIP{1}}fosfataza etishmovchiligi aktin polimerizatsiyasiga ta'sir qiladi. Men J Xum Genet. 2002;71:1420– 1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shoh J va boshqalar. O'simtaga xos PI3K(fosfoinositid 3-kinaz)bosh va bo'yin skuamoz hujayrali karsinomada nanopartikullarga mo'ljallangan etkazib berish orqali inhibisyon. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C va boshqalar. PTEN endosomal PtdIns (4,5) P2 ni PLC yo'li orqali fosfatazadan mustaqil ravishda kamaytiradi. J Cell Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jan S, Kiger AA. RAB GTPase va fosfoinositid regulyatsiyasi va funktsiyalari o'rtasidagi muvofiqlashtirish. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G va boshqalar. Noyob irsiy buyrak kasalliklari: muammolar, imkoniyatlar va istiqbollar. Lanset. 2014;383: 1844–1859 yillar. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M va boshqalar. OCRL mutatsiyalari bo'lgan bolalarda uzoq muddatli buyrak natijalari: katta xalqaro kohortning retrospektiv tahlili. Nefrol dial transplantatsiyasi. 2018;33:85–94.

Kimdan: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Mualliflik huquqi ª 2020, Xalqaro Nefrologiya Jamiyati. Elsevier Inc. tomonidan nashr etilgan. Bu CC BY litsenziyasi (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/) ostida ochiq kirish huquqiga ega maqola.

Institut, Kembrij universiteti, Tennis kort-roud, Cambridge CB2 1QN, Buyuk Britaniya. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; yoki Olivier Devuyst, Tsyurix universiteti, Fiziologiya instituti, Tsyurix, Shveytsariya. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Ushbu mualliflar bu ishga teng hissa qo'shgan.⁶Ushbu mualliflar tadqiqotni birgalikda boshqargan. 2019-yil 8-avgustda olingan; 2020-yil 1-mayda qayta koʻrib chiqilgan; 2020-yil 15-mayda qabul qilingan; 2020 yil 9 sentyabrda onlayn nashr etilgan