Cistanche Tubulosa apoptoz va glial hujayradan olingan neyrotrofik omilni tartibga solish orqali dopaminerjik neyronlarni himoya qiladi: in Vivo va in vitro

Parkinson kasalligi (PD) nigrostriatal dopaminning kamayishi patologik belgisi bo'lgan neyrodegenerativ kasallikdir. An'anaviy xitoy tibbiyotida (TCM) klinik amaliyotda Cistanche tubulosa nano kukuni PDga terapevtik ta'sir ko'rsatadi. Terapevtik mexanizmni aniqlash uchun ushbu tadqiqot MTT tahlilidan foydalangan holda MES23.5 hujayralarida va 1-metil-4-fenil-1da MPP plyus induktsiyalangan toksiklikning turli dozalarining himoya ta'sirini sinab ko'rdi. ,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) tomonidan qo'zg'atilgan PD sichqonlari (avtomobillar). Sitomorfologiya va tirozin gidroksilaza (TH) ifodasini baholash uchun immunohistokimyodan foydalanilgan. TH, glial hujayra chizig'idan kelib chiqqan neyrotrofik omil (GDNF) va uning retseptorlari ifodasini aniqlash uchun transport vositalaridagi xatti-harakatlar testlari, dopamin, immunohistokimyoda yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) testlari va western blot tahlillari ishlatilgan. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, cistanche tubulosa nano kukuni MPP plus bilan ishlov berilgan hujayralarning hayotiyligini yaxshilagan, TH ifodasini oshirgan va apoptotik hujayralar sonini kamaytirgan. Bu, shuningdek, dozaga bog'liq holda MPP plus - davolash qilingan hujayralardagi Bcl2 oqsilining ekspressiyasini oshirdi va Bax proteini ifodasini bostirdi.

Bunga qo'chimcha,cistanchetubulosa nanopowder avtomobil sichqonlarida xulq-atvor kamchiliklarini yaxshiladi, suzishning statsionar davomiyligini qisqartirdi, spontan faollik qobiliyatini oshirdi va GDNF, GDNF oilasi retseptorlari alfa (GFR 1) va qora moddaning hujayralarida Ret ifodasini oshirdi. SN).

Bundan tashqari, GDNF, GFR 1 va Ret ning protein ifodasi turli dozalarda davolashdan keyin ortdi.cistanchetubulosa nanopowder, yuqori dozali va avtomobil guruhlari o'rtasida sezilarli farq bilan. Bcl2 va Baxning protein ifodasi in vivo va in vitro o'xshash edi, bu shuni ko'rsatdicistanchetubulosa nanopowder neyronlarda anti-apoptotik ta'sirga ega.

Cistanche violacea mahsulotini bosing

Kirish

Parkinson kasalligi (PD) keksa odamlarda paydo bo'ladigan keng tarqalgan neyrodegenerativ kasallik bo'lib, degeneratsiya tufayli qora rangdagi (SN) dopaminerjik neyronlarning yo'qolishining patologik ko'rinishi bilan namoyon bo'ladi. Kasallikning og'irligi SNda dopamin (DA) neyron hujayralarining yo'qolishi bilan bog'liq bo'lib, bu neyrodegenerativ jarayon har qanday alomatlar paydo bo'lishidan oldin ko'p yillar davomida o'sib boradi (Sawle va Myers, 1993). Kasallikning progressiv tabiati asosiy neyrodegenerativ jarayonni blokirovka qilish orqali terapevtik aralashuv uchun qiziqarli imkoniyatlarni taklif qiladi. Shuning uchun DA neyronlarining omon qolishiga neyrotrofik omillarning terapiya bilan bog'liq kuchli va o'ziga xos ta'sirini izlash katta qiziqish uyg'otadi.

Neyrotrofik omillar asab o'sishi, nevrologik rivojlanish, aksonal yo'l-yo'riq va neyronal funktsiyani rag'batlantiradigan nerv o'sish omili (NGF), miyadan olingan neyrotrofik omil (BDNF) va glial hujayradan olingan neyrotrofik omil (GDNF) kabi muhim oqsillardir. Dopaminerjik neyronlarning tiklanishini himoya qiluvchi va targ'ib qiluvchi barcha neyrotrofik omillar orasida GDNF eng kuchli ta'sirga ega (Hong va boshq., 2008; Rangasamy va boshq., 2010; Allen va boshq., 2013). GDNF in vitro DA neyronlariga kuchli neyrotrofik ta'sirga ega ekanligi ko'rsatilgan (Lin va boshq., 1993) va in vivo neyroprotektiv ta'sir ko'rsatadi. GDNF nigral DA neyronlarini kalamushlarda jarrohlik yoki toksin bilan qo'zg'atilgan aksotomiyadan so'ng zararlangan hujayralar o'limidan qutqarishi ko'rsatilgan (Beck va boshq., 1995; Kearns va Gash, 1995; Sauer va boshq., 1995) va qisman bundan keyin ham. sichqonlarda N-metil{13}}fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinni (MPTP) tizimli qo'llash (Tomac va boshq., 1995). Neyronal apoptozning ko'payishi va turli patologik omillar tomonidan qo'zg'atilgan neyrotrofik omillarning himoya ta'sirining pasayishi dopaminerjik neyronlarning degeneratsiyasiga asoslanadi (Holden va boshq., 2006).

cistanchetubulosa - Cistanche jinsining bir nechta o'simliklaridan olingan o'simlik dori. Bu an'anaviy xitoy tibbiyotida (TCM) androgen gormonlari bilan chambarchas bog'liq bo'lgan buyrak etishmovchiligi sindromi uchun asosiy terapevtik variant. Bugungi kunga qadar ko'plab klinik va asosiy tadqiqotlarcistanchetubulosa neyrodegenerativ kasalliklarning faoliyatini ko'rsatdi. Shunday qilib, PDni davolashda TCM buyrakni tonuslantiruvchi retseptlarni aniqlash PD uchun muqobil klinik davolashni ta'minlashi mumkin. Echinacoside (ECH) dorivor o'tlar tarkibida mavjud bo'lgan asosiy bioaktiv komponentdircistanchetubulosa. Tadqiqotlar Cistanche va ECH, verbascoside (VER) va icariin (ICA) glikozidlarining Altsgeymer kasalligi (AD), PD va boshqa qon tomir demansli bemorlarga terapevtik ta'sirini ko'rsatdi (Urano va Tohda, 2010; Vang va boshq., 2013). ; Wu va boshqalar, 2014). Wu va boshqalar. (2014) bu cistanche taklif qildi. ECH va akteozidni o'z ichiga olgan tubulosa ekstraktlari amiloid cho'kmasini blokirovka qilish va xolinergik va hipokampal dopaminerjik neyronal funktsiyani bekor qilish orqali A -42 sabab bo'lgan kognitiv disfunktsiyani yaxshilagan. Tao va boshqalar. (2015) sistanche tubulosa (Ph Gs-Ct) dan olingan feniletanoid glikozidlar kalamush modellarining miya to'qimalarida AQP4 ning oqsil va mRNK ifodasini kamaytirish orqali yuqori balandlikdagi miya shishishining oldini olishini aniqladi.

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Xitoy o'simlik birikmalari, shu jumladan uchta tarkibiy qismcistanchetubulosa, epimedium va rizoma poligonal, neyrotrofik omillarning ifodasini tartibga solish orqali dopaminerjik neyronlarning shikastlanishini engillashtirdi va dopamin darajasini oshirdi (Wu va boshq., 2013).

Shunday qilib, bor-yo'qligi hali ma'lum emascistanchetubulosa tomonidan qo'zg'atilgan neyroprotektiv ta'sirlar uzoq davom etadi va GDNF qo'llash orqali nigral DA neyronlarini qutqarish PD hayvonlarining simptomatologiyasi uchun ahamiyatga ega bo'lgan motor harakatlarini sezilarli darajada saqlab qolish imkonini beradi. Ushbu tadqiqotda TCM buyrakni tonlash retsepti ishlatilgan,cistanchetubulosa nanopowder, u Xitoyda milliy patentni (patent raqami: 2011103028541) olgan va ilgari PDda ma'lum bir terapevtik ta'sir ko'rsatdi. Shuning uchun ushbu tadqiqot neyroprotektiv va regenerativ ta'sirini o'rganish uchun mo'ljallangancistanchetubulosa davolash va MES23.5 hujayralari va xulq-atvori aniq kalamushlarda apoptozni tekshirish va maqsadli testlar batareyasi bilan o'lchangan GDNF ni tartibga solish.

Materiallar va usullar

Materiallar, reagentlar va uskunalar

cistanchetubulosa Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Pekin, Xitoydan sotib olingan. ECH, VER va ICA oziq-ovqat va giyohvand moddalarni nazorat qilish milliy institutidan, Xitoydan kelgan. MES23.5 dopaminerjik neyron hujayra liniyasi Pekin, Xitoy, Kapital tibbiyot universiteti Neyrobiologiya laboratoriyasi professori Biao Chenning sovg'asi edi. Ellikta C57BL/6 erkak sichqon (har biri 20–25 g) Shanxay, Xitoy, Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (litsenziya raqami: SCXK2012-0002) dan sotib olingan.

MPP plus, MTT va glutamin Sigma-Aldrichdan (Karlsbad, CA, AQSh) sotib olindi; DMEM/F12 o'rta va homila sigir zardobi Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, AQSh) dan sotib olindi; va MPTP, DA standarti va homovanil kislotasi (HVA) standarti Sigma-Aldrichdan (Karlsbad, CA, AQSh) sotib olindi. -aktin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF oilasi retseptorlari alfa (GFR 1) va Ret antikorlari Cell Signaling Technology, Inc. (Beverli, MA, AQSh) dan sotib olingan; 3,3'-diaminobenzidin (DAB) bo'yash reaktivi to'plami Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Xitoy) dan sotib olindi; va SDS-PAGE gel namunalarini tayyorlash to'plami, ultrasezuvchan kuchaytirilgan kimilyuminesans (ECL) aniqlash to'plami va bicinchoninic kislota (BCA) tahlili Beyotime Biotexnologiya institutidan (Pekin, Xitoy) sotib olindi.

Ushbu tadqiqotda quyidagi asboblardan foydalanildi: ELX800 mikroplastinka o'quvchi (Bio Tek Winooski, VT, AQSh); CO2 inkubatori (Heraeus, Hanau, Germaniya); Gel DOC 2000 gel tasvirini tahlil qilish tizimi, elektroforez xujayrasi va elektroforez tanki (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh); DU-650 oqsil analizatori (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, AQSH); 5417R yuqori tezlikda ishlaydigan sovutgichli sentrifuga (Eppendorf, Gamburg, Germaniya); SXQM dual planetary ball tegirmon (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Xitoy); MM400 mikser tegirmoni (Retsch GmbH, Haan, Germaniya); Agilent 1200 yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AQSH); PowerPac Basic elektroforez, PowerPac Basic transmembran uzatish tizimi, Universal Hood II xemiluminesans tasvirlagichi, S1000 Thermal Cycler RNK teskari transkripsiya tizimi (Bio-Rad); Motic Med 6.0 to'qima va hujayra tasvirini tahlil qilish tizimi (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Xitoy).

tayyorlashcistanchetubulosa nano kukuni

cistanchetubulosa tortilgan, keyin tozalangan va suvsizlangan. An'anaviy maydalashdan keyin,cistanchetubulosa nozik kukuni 200-to‘rli elakdan o‘tkazildi va muzlatilgan holda quritildi. Tayyorlash uchun harorat bilan boshqariladigan vakuum va yuqori energiyali shar tegirmoni ishlatilgancistanchetubulosa nano chang. Birinchidan, xomcistanchetubulosa nanopowder karbid silliqlash sharlari bilan to'ldirilgan vakuumli shar-frezalash idishiga joylashtirildi. Tegirmon to'plari va cistanche tubulosa nano kukunlari o'rtasidagi nisbat 15: 1 dan 5: 1 gacha bo'lgan. Nozik kukunni olish uchun yuqori energiyali shar tegirmonining tezligi va davomiyligi mos ravishda 300 rpm va 20 minutga o'rnatildi. Nozik kukun nano o'lchamdagi materiallarni qayta ishlash uchun tortilgan va mikser tegirmonida 25 / s chastotali va uch marta takrorlash uchun 20 s tebranish bilan ishlov berilgan. PBS 25 mg / ml eritma eritmasini tayyorlash va tayyorlash uchun ishlatilgan, keyin 30 daqiqa ultratovush, avtoklavlash va nihoyat -20 darajada saqlash.

Faol komponentlar sifatini nazorat qilishcistancheHPLC tomonidan tubulosa

ECH va VER tarkibida plomba sifatida oktadesilsilan bilan bog'langan kremniy dioksidi, mobil faza A sifatida metanol va B harakatchan fazasi sifatida 0,1 foiz chumoli kislotasi eritmasi bilan gradientli elyusiya mavjud. Aniqlash to'lqin uzunligi 330 nm edi. ICA plomba sifatida oktadesilsilan bilan bog'langan kremniy dioksidi va mobil faza sifatida asetonitril-suv (30:70) bilan gradient elyusiyasini o'z ichiga oladi. Aniqlash to'lqin uzunligi 270 nm edi. Namuna, nazorat va salbiy nazorat sinov uchun har biri 10 mkl sifatida o'lchandi.

Hujayra madaniyati va MPP plyus ishlov berilgan hujayralarning hayotiyligini o'lchash uchun MTT tahlili

MES23.5 hujayralari 5 foizli homila buzoq zardobi, 1 foiz glutamin, 2 foiz 50× Sato eritmasi va 2 foizli penitsillin/streptomitsinli DMEM/F12 muhiti bilan emlangan. Ular to'yingan namlik bilan 5 foizli CO2 inkubatorida 37 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Hujayralar ajratildi va 0,25 foizli tripsin bilan o'tkazildi va hujayra suspenziyasi logarifmik o'sish bosqichida yig'ib olindi. Zichligi 1 × 105 bo'lgan izolyatsiya qilingan hujayralar polilizin bilan qoplangan 96-quduq plitalariga ekilgan, so'ngra turli yakuniy konsentratsiyalar (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 va 800 mkmol/) qo'shilgan. L) MPP plus ommaviy axborot vositalari. 24 soat va 48 soat davomida normal madaniyat muhiti bilan inkubatsiya qilingan MES23.5 hujayralari in vitro tajribalarida salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Turli davolash guruhlaridagi hujayralar MTT reaktivi bilan 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Quduqlardagi eritma keyinchalik tashlab yuborildi va 150 mL DMSO qo'shildi va 10 daqiqa davomida tebrandi. 570 nm to'lqin uzunligidagi har bir namunaning absorbsiyasi avtomatik mikroplastinka o'quvchi yordamida o'lchandi. Hujayra hayotiyligi ulushi (foiz )=eksperimental guruhning oʻrtacha absorbsiyasi/salbiy nazorat guruhining oʻrtacha absorbsiyasi × ​​100 foiz.

MPP plyus muhitining tegishli konsentratsiyalari MES23.5 hujayralarida 24 soatlik davolash uchun in vitro madaniyati bilan bir xil yondashuvdan foydalangan holda qo'shildi. Davolanishdan so'ng, quduqdagi eritma tashlanadi. Turli konsentratsiyali (10, 50, 100, 200, 250, 500 va 1000 ug/ml) muhitlarcistanchetubulosa nanopowder turli quduqlardagi MES23.5 hujayralariga qo'shildi va 24 soat va 48 soat davomida inkubatsiya qilish uchun qoldirildi. 24 soat va 48 soat davomida normal madaniyat muhiti bilan inkubatsiya qilingan MES23.5 hujayralari salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Transport vositasi sifatida MPP plus muhiti bilan inkubatsiya qilingan MES23.5 hujayralari ishlatilgan. O'lchovlar har bir namuna uchun uch nusxada amalga oshirildi. Hujayra hayotiyligini hisoblash uchun tegishli davolash va nazorat guruhlarining absorbsiyasi o'lchandi.

Immunotsitokimyo bilan o'lchangan TH ifodasi

Qachoncistanchetubulosa nanopowder 100, 200 va 250 ug / ml da bo'lgan, hujayraning omon qolish darajasi sezilarli darajada oshdi (2G-rasm). Shunday qilib, keyingi tajribalarda biz uchta kontsentratsiyani sinab ko'rdik: past dozali, o'rta dozali va yuqori dozali guruhlar. Har biri uchun uchta replikatsiya sinovdan o'tkazildicistanchetubulosa guruhlari. Sterillangan, polilizin bilan qoplangan qoplamalar 6-quduq plitalariga joylashtirildi. Keyinchalik, har bir quduqqa 5 × 104 hujayra ekilgan va 24 soat davomida inkubatsiya qilingan. Oddiy nazorat guruhida an'anaviy yangi muhit almashtirildi va 24 soat davomida inkubatsiya qilish uchun qolgan davolash guruhlarida 100 mkmol / L MPP plyus muhitining yakuniy konsentratsiyasi almashtirildi. Keyin an'anaviy yangi muhitlar oddiy nazorat va avtomobil guruhlarida almashtirildi va yakuniy konsentratsiyalari 100, 200 va 250 ug/mlcistanchetubulosa nanopowder hujayralar bilan 24 soat davomida past, o'rtacha va yuqori dozalarda inkubatsiya qilindi.cistanchenavbati bilan tubulosa davolash guruhlari. Turli guruhlardagi MES23.5 xujayralari supernatantni olib tashlash uchun PBSda uch marta yuvildi va 15 daqiqa davomida 4 foizli paraformaldegidda fiksatsiya qilindi. PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar peroksidaza blokatori bilan 37 daraja haroratda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin yana PBS bilan yuvildi. 10 daqiqa davomida hujayra o'tkazuvchanligi uchun 0,2 foizli Triton X-100 eritmasi ishlatilgan, so'ngra PBS bilan yuvilgan.

Har bir namunaga oddiy echki zardobi qo'shildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin oddiy echki zardobi olib tashlandi va har bir namunaga PBSda 1:400 nisbatda suyultirilgan asosiy antikor qo'shildi va bir kechada 4 daraja inkubatsiya qilindi. Salbiy nazorat guruhidagi hujayralar kechasi 4 daraja PBS bilan inkubatsiya qilindi. PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar 20 daqiqa davomida 37 daraja namlik kamerasida biotin bilan belgilangan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Keyin har bir namuna PBSda yuviladi va 20 daqiqa davomida 37 daraja haroratda horseradish peroksidaza-streptavidin konjugatlari (ishchi eritma C) bilan etiketlanadi. PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar taxminan 1-10 daqiqa davomida qorong'ida DAB reagenti bilan bo'yalgan va jigarrang rangning rivojlanishi yorug'lik mikroskopi ostida kuzatilgan.

Keyin har bir namuna ikki marta distillangan suvda 1-2 daqiqa davomida yuvildi va yadrolar gematoksilin eritmasi bilan 0.5-1 daqiqa davomida bo'yaldi. Har bir namunani suvda yaxshilab yuvib bo'lgach, hujayralar farqlash uchun 1 foizli xlorid kislota spirtiga va 1 foiz suvli ammiakga botirildi, so'ngra hujayralarni suvda yaxshilab yuvib tashladi. Keyin har bir namunadagi hujayralar 2 daqiqa davomida 70 foizli etanolda, 2 daqiqa davomida 80 foizli etanolda, 2 daqiqa davomida 90 foizli etanolda, ikki marta 90 foizli etanolda, 2 daqiqa davomida 95 foizli etanolda va ikki marta 100 foizli etanolda suvsizlandi. Keyin hujayralar ksilen eritmasiga ikki marta 2 daqiqa davomida botirildi va neytral smolalar bilan shisha slaydga o'rnatildi. Yorug'lik mikroskopi ostida har bir namunada jigarrang zarrachalarning intensivligi bilan ko'rsatilgan dopaminerjik neyronlardagi tanlangan oqsillarning ifodasini aniqlash va oqsil tarkibini o'rtacha kulrang qiymati bo'yicha yarim miqdoriy aniqlash uchun 5-10 ta samarali ko'rish maydonlarini tasodifiy tanlash va tasvirni olish amalga oshirildi. .

Oqim sitometriyasi bilan o'lchangan MES23,5 hujayralarning apoptoz tezligi

Yopishqoq hujayralar bir marta PBS bilan yuvilgan. Hujayra izolyatsiyasi uchun xona haroratida EDTAsiz tripsin eritmasining tegishli miqdori qo'shildi va yopishgan hujayralar ajralib chiqishi uchun eritma muloyimlik bilan pipetlandi. Keyin tripsinatsiyani to'xtatish uchun hujayra madaniyati muhiti qo'shildi. Aralash yangi santrifüj trubasiga o'tkazildi va keyin ajratilgan hujayralarni to'plash uchun 1500 aylanish tezligida 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Supernatantni tashlaganingizdan so'ng, hujayra pelleti PBS yordamida muloyimlik bilan qayta suspenziya qilindi va hujayralar hisoblandi. Taxminan 1 × 105 dan 5 × 105 gacha qayta suspenziya qilingan hujayralar 5 daqiqa davomida 1500 aylanish tezligida santrifüj qilindi va supernatant tashlandi. Besh mikrolitr Annexin V-FITC bog'lovchi eritmasi hujayralarni muloyimlik bilan qayta suspenziya qilish uchun hujayra pelletiga qo'shildi. Yana 5 mL Annexin V-FITC qo'shildi va yaxshilab aralashtirildi. Besh mikrolitr propidiy yodid eritmasi oqim sitometriyasidan biroz oldin xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilish orqali hujayrani bo'yash uchun ishlatilgan.

In vitro uchun Western Blot tahlili

Hujayralar oddiy guruhga, MPP plus davolash guruhiga, past dozaga bo'lingancistanchetubulosa davolash guruhi, o'rtacha dozacistanchetubulosa davolash guruhi, va yuqori dozacistanchetubulosa davolash guruhi. Bcl2 va Bax ifodasi har birida o'lchandi. Hujayralarni yig'ib olishdan oldin har bir guruhda modellashtirish va davolash uchun 6-quduq plastinkasidagi har bir quduqqa jami 1 × 105 hujayradan foydalanilgan. RIPA buferi, proteaza inhibitori va fosfataza inhibitori bo'lgan aralash lizat hujayralarni muz ustida 3{17}} daqiqa davomida lizislash uchun qo'shildi. Santrifüjdan so'ng, supernatant oqsil tahlili uchun ishlatilgan. Umumiy protein miqdori BCA tahlili yordamida aniqlandi va 10 foiz SDS-PAGE bilan ajratildi. Ajratilgan oqsillar membranaga o'tkazildi va 2 soat davomida xona haroratida 5 foizli yog'siz sutni blokirovka qiluvchi bufer bilan inkubatsiya qilindi. Keyin membrana birlamchi antikorda (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200 suyultirish) 4 daraja kechada inkubatsiya qilindi. Yuvish bosqichidan so'ng, membrana ikkilamchi antikorda (0,5 mg / ml, 1: 5000 suyultirish) 4 gradusda 1 soat davomida, so'ngra an'anaviy ishlab chiqish uchun ECL ishlab chiqaruvchisida 2 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Quantity One dasturi oqsil ifodasini yarim miqdoriy tahlil qilish uchun ishlatilgan.

Hayvonlarni eksperimental modellashtirish va dori vositalarini boshqarish

Ellikta o'ziga xos patogensiz 8-haftalik erkak sichqon tasodifiy besh guruhga bo'lingan: oddiy guruh, MPTP davolash guruhi (Avtomobil), past dozalicistanchetubulosa davolash guruhi, o'rtacha dozacistanchetubulosa davolash guruhi, va yuqori dozacistanchetubulosa davolash guruhi. Hayvonlar oziq-ovqat va suvdan erkin foydalanish imkoniyati bilan 20-22 daraja haroratda joylashtirildi. Oddiy guruhdagi sichqonlarga ketma-ket etti kun davomida qorin bo'shlig'iga teng miqdorda oddiy fiziologik eritma yuborildi. Boshqa davolash guruhlaridagi sichqonlarga transport vositalarini o'rnatish uchun ketma-ket etti kun davomida MPTP (30 mg / kg / kun) intraperitoneal AOK qilingan.

PD modellashtirish jarayonida sichqonlar past dozada, o'rtacha dozada va yuqori dozadacistanchetubulosa davolash guruhlari 4 g / kg / kun, 8 g / kg / kun va 16 g / kg / kun ekvivalent klinik hajmlari intragastral kiritilgan.cistanchetubulosa nanopowder, navbati bilan, ketma-ket 14 kun. Nazorat va transport vositalari guruhlaridagi sichqonlarga 14 kun ketma-ket ekvivalent hajmdagi normal sho'r suvning intragastrik tarzda kiritildi. Barcha eksperimental protseduralar TCM Fujian universitetining axloqiy qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va laboratoriya hayvonlaridan foydalanish va parvarish qilish bo'yicha xalqaro miqyosda qabul qilingan tamoyillarga muvofiq amalga oshirilgan. Ushbu tadqiqotda hayvonlarning azoblanishini minimallashtirish uchun barcha harakatlar qilingan.

Xulq-atvor testlari

Suzish testi (Chju va boshq., 2014)

Sichqonlarda tana harakatlarini muvofiqlashtirish Suzish testi bilan o'lchandi. Sichqonlar alohida-alohida 10 sm suv bo'lgan suv idishiga (balandligi 25 sm va diametri 10 sm) joylashtirildi va ularning 5 daqiqadan ortiq statsionar davomiyligini qayd etish uchun tinch muhitda sinovdan o'tkazildi.

Ochiq dala testi (Kawai va boshqalar, 1998)

Lokomotor faollik ochiq maydon testi yordamida o'lchandi. Sichqonlar jim va zaif yoritilgan muhitda sinovdan o'tkazildi va alohida-alohida 30 sm × 30 sm × 15 sm shaffof akril idishga quyida 6 sm × 6 sm ajratish panjarasi bilan joylashtirildi. Sichqonlarga atrof-muhitga moslashish uchun 10 daqiqa vaqt berildi, so'ngra o'rtacha qiymatlarni olish uchun to'r sonining ambulatsiyasi va individual sichqonlarning boqish chastotasi ketma-ket besh marta o'lchandi.

Miya to'qimalaridan namuna olish

To'qimalardan namuna olishdan oldin, sichqonlar suvga erkin kirish huquqi bilan adlibitum bilan oziqlangan va ketma-ket 14 kun davomida dori aralashuvini olgan. Har bir guruhdan to'rtta sichqon tanlab olindi va tezda boshi kesildi. Har bir hayvondan SN (Bregma: -2,75 mm -2,92 mm) ajratilgan va muzga joylashtirilgan. Miya to'qimalari qonni olib tashlash uchun 0,9 foiz muzdek sovuq natriy xlorid eritmasi bilan yuvildi va -80 darajada saqlashdan oldin filtr qog'ozida quritildi. Har bir guruhdan to'rtta sichqon qorin bo'shlig'iga behushlik qilindi va ularning ko'krak qafasi ochildi. Keyin har bir hayvonning chap qorinchasiga infuzion igna kiritildi. Qon aylanish tizimidagi qonni olib tashlash uchun o'ng atrium qo'shimchasi kesilib, ketma-ket perfuziyani ta'minlash uchun jigar rangpar bo'lgunga qadar hayvonga 4 daraja normal sho'r suv quyiladi. O'ng atriumning oqava suvlari aniq bo'lgach, har bir hayvonga 4 foizli paraformaldegid fiksatori yuborildi. Perfuziyadan so'ng, har bir hayvonning miya to'qimalari ehtiyotkorlik bilan ajratildi va 24 soat davomida 4 foizli paraformaldegidda mahkamlandi. So'ngra qattiq miya to'qimalari suv ostida yuviladi, etanol eritmalarining bosqichma-bosqich seriyasida suvsizlanadi va ksilen eritmasida tozalanadi. Shundan so'ng kerosinni botirish va joylashtirish amalga oshirildi.

HPLC tomonidan o'lchangan DA miqdorining o'zgarishi

Har bir guruhdagi nano kukunli SN 0,9 foiz natriy xlorid eritmasi (1:9 nisbat) bo'lgan muz hammomiga joylashtirildi. Miya to'qimasi ultratovushli hujayra disruptor yordamida bir hil holga keltirildi va supernatantni olish uchun 4 daraja 20 daqiqa davomida 1200 rpm da santrifüj qilindi. HPLC uchun 30 daraja ustun haroratida Hypersil AA-ODS ustuni (2,1 mm × 200 mm, 5 mkm) ishlatilgan. Flüoresansni aniqlash 280 nm lex va 340 nm lem da amalga oshirildi. In'ektsiya hajmi 10 mkl edi.

TH, GDNF, GFR 1 va Ret ifodasi immunohistokimyo tomonidan aniqlangan

Har bir hayvondan alohida miya toʻqimalarining kerosin boʻlaklari (qalinligi 5 mkm) ajratilib, shisha slaydlarni tekislash va yopishtirish uchun 40 daraja iliq suv hammomiga joylashtirildi. Barcha to'qimalar slaydlari 3-6 soat davomida 60 graduslik pechda inkubatsiya qilindi, so'ngra ksilen dewaxing, gradient etanol dehidratsiyasi va limon kislotasi tamponida inkubatsiya qilish va mikroto'lqinli pechda 20 daqiqa davomida isitish orqali antigen olish. Keyin to'qima slaydlari xona haroratida 3 foizli H2O2 eritmasida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. PBSda uch marta yuvilgandan so'ng, to'qima slaydlari 20 daqiqa davomida xona haroratida yopiq kamerada normal sarum bilan inkubatsiya qilindi. Immunogistokimyoviy binoni ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq o'tkazildi. Motic Med 6.0 tasvir analizatori ijobiy bo'yalgan hujayralardagi integratsiyalangan optik zichlik qiymatini hisoblash uchun ishlatilgan.

Sichqonlarning miya to'qimalarida Western Blot tahlili

Ushbu tadqiqot tirozin gidroksilaza (TH), GDNF, GFR 1, Ret, Bcl2 va Baxning protein ifodasini baholadi. Har bir guruhdan olingan miya lizatasi muz ustida 3{10}} daqiqa davomida gomogenlashtirildi, so'ngra past haroratda, 20,000 rpm, 4 daraja 5 daqiqada santrifüj qilindi. supernatantni yig'ish uchun min. Protein namunalari yuqorida tavsiflanganidek, 10 foizli SDS-PAGE jeli yordamida doimiy bosim ostida ajratildi. Birlamchi antikor kontsentratsiyasi: TH 0,15 mg/ml, GDNF 0,5 mg/ml, GFR 1 0,8 mg/ml, Ret 0,63 mg/ml, Bcl-2 0,34 mg/ml va Bax 0,11 mg/ml. Jarayon yuqoridagi kabi edi.

Statistik tahlil

Ushbu tadqiqot ma'lumotlarni qayta ishlash va tahlil qilish uchun SPSS 20.0 statistik dasturidan foydalanildi. Parametr qiymatlari o'rtacha ± standart og'ish (x¯

± S). Bir faktorli ma'lumotlarni tahlil qilish uchun ANOVA ishlatilgan. Guruhlarni solishtirish uchun LSD yoki Games-Howell testi ishlatilgan. P < 0.05 (yoki P < 0,01) statistik jihatdan muhim farq deb hisoblandi.

Natijalar

ning faol komponentlaricistanchetubulosa nano kukuni

200–400 nm skanerlash oralig'ida, ECH incistanchetubulosa va VER 330 nm da maksimal yutilish cho'qqisiga ega bo'lib, u 20 daqiqa ichida paydo bo'ldi. ICA 270 nm da maksimal yutilish cho'qqilariga ega edi va 20 daqiqadan so'ng paydo bo'ldi (1A-rasm). Natijalar salbiy namunalar aniqlashga xalaqit bermasligini ko'rsatdi (1B-rasm). Namunalar va nazorat bir xil xromatografik cho'qqilarga ega edi va salbiy namunada yo'q edi. Bu namunadagi boshqa ingredientlar o'lchanadigan komponentga xalaqit bermasligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, uchta komponent va qo'shni cho'qqilar ajralishning asosiy chizig'iga etib borishi mumkin va ajratish darajasi 1,5 dan katta edi.

cistanchetubulosa nanopowder kamaytirilgan MPP plus - MES23.5 hujayralarida induktsiya qilingan sitotoksiklik

MES23.5 hujayralarining hayotiyligi MPP plus konsentratsiyasining ortishi bilan sezilarli darajada kamaydi. Shakl 2F turli konsentrasiyalarda MPP plus muhim sitotoksisitesini ko'rsatadi.

cistanchetubulosa nanopowder MPP plus - induktsiya qilingan sitotoksiklikni pasaytirdi va MES23.5 hujayralarining hayotiyligini oshirdi. 2G-rasm buni ko'rsatadicistanchetubulosa nano kukunining 10-250 ug/ml dozalari MPP plus bilan ishlov berilgan MES23.5 hujayralariga dozaga bog'liq himoya ta'sirini ko'rsatdi.

ning sitomorfologik ta'siricistanchetubulosa nano kukuni

Oddiy MES23.5 hujayralari yaxshi hujayra yopishishiga ega edi va aniq hujayra chegaralari va sinapslari bilan shpindel shaklida edi. MPP plus - shikastlangan MES23.5 hujayralari zaif hujayra yopishishi va qisqarishini ko'rsatdi va ularning ko'plari qisqargan sinapslar bilan ommaviy axborot vositalarida to'xtatildi. Bu hujayralar to'plangan, kichraygan va dumaloq bo'lib, ichida vakuolalar bo'lgan va yadrolar parchalangan yoki parchalangan.cistanchetubulosa nanopowder turli dozalarda MES23.5 xujayralarining sitomorfologiyasini turli darajada yaxshiladi, hujayra yopishishini va avtomobil guruhining sinaptik klirensini yaxshilash orqali. MES23.5 hujayralari yuqori dozadacistanchetubulosa davolash guruhi oddiy nazorat guruhiga o'xshash morfologiyani ko'rsatdi (2A-E-rasmlar).

ning ta'siricistanchetubulosa nanopowder TH ifodasi va hujayralardagi apoptoz

3-rasmda transport vositalari guruhidagi TH oqsili ifodasining sezilarli darajada kamayishi ko'rsatilgan. TH oqsilining ifodasi turli dozalarda davolangan guruhlarda turlicha oshdicistanchetubulosa. Biroq, LSD testi davolash qilingan uchta guruh o'rtasida sezilarli farq yo'qligini ko'rsatdi.

4-rasmda oqim sitometriyasi yordamida apoptozni baholash natijalari ko'rsatilgan. Avtotransport guruhidagi apoptoz darajasi boshqa guruhlarga qaraganda sezilarli darajada yuqori edi. Turli dozalarda davolash qilingan hujayralarcistanchetubulosa nanopowder avtomobil guruhi bilan solishtirganda apoptotik tezligining turli darajada pasayishini ko'rsatdi. O'rta va yuqori dozadagi hujayralarcistanchetubulosa davolash guruhi boshqasiga nisbatan apoptotik tezligida eng sezilarli yaxshilanishga ega edicistanchetubulosa davolash guruhlari. LSD testi shuni ko'rsatdiki, davolash qilingan ikki guruh o'rtasida sezilarli farq yo'q, lekin ular uchun past dozali guruh o'rtasida sezilarli farq bor.

ning ta'siricistanchetubulosa nanopowder Hujayralarda Bcl2/Bax Protein ifodasi

Shakl 5 shuni ko'rsatadiki, vosita guruhining hujayralarida Bcl2 oqsilining ifodasi oddiy nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada past bo'lgan. Aksincha, avtotransport guruhining hujayralarida Bax proteinining ifodasi oddiy nazorat guruhiga qaraganda ancha yuqori edi.cistanchetubulosa davolash guruhlari MPP plus - davolash qilingan MES23.5 hujayralarida Bcl2 oqsilining ko'payishi va Bax oqsili ifodasining pasayishini ko'rsatdi. Davolangan uchta guruh o'rtasida LSD testida sezilarli farqlar mavjud edi. Ushbu ta'sirlar dozaga bog'liq edi.

Xulq-atvor testlari

Suzish testi natijalari shuni ko'rsatdiki, transport vositalari guruhidagi sichqonlar nisbatan uzoq statsionar vaqtga ega bo'lib, vaqt o'tishi bilan ko'paygan. 14-kuni, avtomobil guruhidagi sichqonlar normal nazorat guruhidagi sichqonlarga qaraganda ancha uzoqroq statsionar vaqtga ega edi. Past dozada sichqonlarning statsionar davomiyligicistanchetubulosa davolash guruhi avtomobil guruhidagi sichqonlarnikidan sezilarli darajada farq qilmadi. Biroq, yuqori dozada sichqonlarning statsionar davomiyligicistanchetubulosa davolash guruhi avtomobil guruhidagi sichqonlarga qaraganda ancha kam edi.

Ochiq maydon testining natijalari shuni ko'rsatadiki, sichqonlarda MPTP-induktsiyasi natijasida zarar ko'rganidan so'ng, transport vositalari guruhidagi sichqonlar etishtirish chastotasi bilan ko'rsatilgandek, o'z-o'zidan faollik qobiliyatining sezilarli darajada pasayishini ko'rsatdi. 14-kun administratsiyasidan keyincistanchetubulosa nanopowder, o'rtacha va yuqori dozali davolash guruhlaridagi sichqonlar transport vositalari guruhidagi sichqonlarga nisbatan ancha yuqori tarbiya chastotalariga ega edi (6A, B-rasmlar).

ning ta'siricistanchetubulosa Nanopowder Sichqonlardagi DA tarkibidagi

SN ning DA tarkibidagi o'zgarishlar HPLC tomonidan aniqlandi. Avtotransport guruhining miyasida DA tarkibi sezilarli darajada kamayganligi aniqlandi. Past dozada PD sichqonlarining miyasida DA tarkibicistanchetubulosa davolash guruhi avtomobil guruhidagi sichqonlardan sezilarli darajada farq qilmadi. Biroq,cistanchetubulosa bilan davolash PD sichqonlari miyasida DA darajasini dozaga bog'liq holda oshirdi. PD sichqonlarining miyalari yuqori dozada davolanadicistanchetubulosa avtomobil guruhidagi sichqonlarning miyasiga qaraganda ancha yuqori DA tarkibiga ega edi (6C-rasm).

ning ta'siricistanchetubulosa nanopowder sichqonlarda TH ifodasi

TH-musbat hujayralar soni va MPTP bilan qo'zg'atilgan PD sichqonlarining SN-dagi TH oqsili ifodasi darajasi nazorat guruhidagi sichqonlarga nisbatan pastroq edi. dan keyincistanchetubulosa bilan davolash, MPTP bilan qo'zg'atilgan PD sichqonlarining SN dagi TH-musbat hujayralar soni va TH oqsili ifodasi darajasi oshib, yuqori dozalar o'rtasidagi sezilarli farq bilan.cistanchetubulosa davolash guruhi va LSD testi bo'yicha avtomobil guruhi; va uchta davolangan guruh o'rtasida sezilarli farqlar mavjud edi (7-rasm).

ning ta'siricistanchetubulosa nanopowder sichqonlarda GDNF va uning retseptorlari, GFR 1 va Retning oqsil ifodasi haqida

Ijobiy bo'yalgan hujayralardagi GDNF va uning retseptorlari GFR 1 va Retning protein ifodasi immunohistokimyo yordamida baholandi. Western blot tahlili sichqonlarning turli guruhlari SNdagi protein ifoda darajasini baholash uchun ishlatilgan. Turli guruhlar uchun topilmalar ikkita aniqlash usulidan foydalangan holda o'xshash edi. GDNF va uning retseptorlari oqsillari GFR 1 va Ret ning transport vositalari guruhidagi sichqonlarning SN dagi ijobiy bo'yalgan hujayralarida ifodalanishi oddiy nazorat guruhidagi sichqonlarga qaraganda ancha past edi. Turli dozalardacistanchetubulosa davolash GDNF-, GFR 1- va Ret-musbat hujayralar sonini oshirdi (8A-S-rasmlar).

Avtotransport guruhidagi sichqonlarning SNdagi GDNF, GFR 1 va Ret ning protein ifodasi nazorat guruhidagi sichqonlarga qaraganda ancha past edi. Davolash konsentratsiyasini oshirishcistanchetubulosa nanopowder bu oqsillarning ifodasini sezilarli darajada oshirdi. Yuqori dozada sichqonlarning SNida GDNF, GFR 1 va Retning protein ifodasicistanchetubulosa davolash guruhi avtomobil guruhidagi sichqonlarga qaraganda sezilarli darajada yuqori edi (P < 0.01; 8T, U-rasm).

ning ta'siricistanchetubulosa nanopowder sichqonlarda Bcl2/Bax ning oqsil ifodasi

Oddiy nazorat guruhidagi sichqonlar bilan solishtirganda, transport vositasi guruhidagi (P < 0.01) sichqonlarning SNida Bcl2 proteini ifodasi sezilarli darajada kamaydi va Bax proteini ifodasi sezilarli darajada yaxshilandi. Yuqori dozacistanchetubulosa bilan davolash Bcl2 protein ifodasini sezilarli darajada oshirdi va avtomobil sichqonlarining miyasida Bax proteini ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi (P < 0.01; 9-rasm). LSD testi shuni ko'rsatdiki, o'rta va yuqori dozali guruhlar o'rtasida sezilarli farq yo'q, lekin ular uchun past dozali guruhlar o'rtasida sezilarli farq bor.

Munozara

PD va apoptoz

PD - bu neyrodegenerativ kasallik. Chjan va boshqalarga ko'ra. (2005), tarqalishi 55 yoshdan oshgan Xitoy aholisida 10,7 foizni va 65 yoshdan oshganlarda 1,67 foizni tashkil etadi. Global qarishning tezlashishi bilan PD bilan kasallanganlar soni har yili ortib bormoqda va bu bemorlarning oilalariga katta moliyaviy yuk bo'lib bormoqda. va umuman jamiyat.

Miyada dopaminerjik neyronlar asosan DA sintezi va sekretsiyasida ishtirok etadi. Ular markaziy asab tizimida keng tarqalgan va asosan SNda joylashgan (80 foiz). TH DA sintezi uchun tezlikni cheklovchi asosiy ferment hisoblanadi.

Shunday qilib, TH faolligini inhibe qilish DA sintezini kamaytiradi (Huot va Parent, 2007). PD ning asosiy patologik va biokimyoviy o'zgarishlari SNdagi dopaminerjik neyronlarning apoptozi, nigrostriatal DA ning sezilarli darajada kamayishi va dopaminerjik neyronlarda Lyui jismlarining shakllanishi (Dexter va Jenner, 2013). PD etiologiyasi bog'liq bo'lgan genetik omillar, atrof-muhit omillari va asab tizimining qarishini o'z ichiga oladi (Allam va boshq., 2005). PD patogenezi zamonaviy tibbiyotda noaniq bo'lib qolmoqda. 1960-yillarning oxiridan boshlab levodopani almashtirish terapiyasi PDni davolashda muvaffaqiyatli qo'llanildi va PD davolashda asosiy burilish nuqtasi sifatida e'tirof etildi. Biroq, ushbu terapiyaning uzoq muddatli qo'llanilishi nojo'ya ta'sirlarni keltirib chiqaradi va terapiya PDning asosiy sabablarini davolamaydi (Del Sorbo va Albanese, 2008). Shuning uchun dopaminerjik neyronlarni himoya qilishga qaratilgan yangi dorilar yoki davolash usullari bo'yicha faol tadqiqotlar PDni davolash uchun juda muhimdir.

Oldingi tadqiqotlarda terminal deoksinukleotidil transferaza vositachiligida dUTP nick end yorlig'ini qo'llash PD bilan og'rigan bemorlarning SNidagi dopaminerjik neyronlarning 0,6% -4,8 foizi apoptozni ko'rsatishini ko'rsatdi (Mochizuki va boshq., 1996). Elektron mikroskop apoptotik xususiyatlarni, shu jumladan dopaminergik hujayralardagi xromatik kondensatsiya va apoptotik jismlarni ko'rsatdi (Anglade va boshq., 1997). Tompkins va boshqalar. (1997) PD, AD va diffuz Lewy tanasi kasalligi (DLBD) bilan og'rigan bemorlarning miya to'qimalarining otopsilarining ultrastrukturaviy tahlilini o'tkazdi. Ular PD va DLBD kasalliklarida SN ning zich qatlamida apoptotik tanalarni topdilar, bu PD va shunga o'xshash kasalliklarda neyronal apoptozning ishonchli dalillarini taqdim etdi. Shuning uchun dopaminerjik neyronlarda apoptozning kamayishi yoki bostirilishi PD davolash uchun asosiy hisoblanadi.

Oldingi tadqiqotlar MPTP PDga o'xshash simptomlarni keltirib chiqarishini ko'rsatdi. MPTP qon-miya to'sig'ini kesib o'tadi va astrositlarda B tipidagi monoamin oksidazlar tomonidan metabollanadi. Keyinchalik u zaharli MPP plyusga aylanadi, u DA tashuvchisi oqsillarini qabul qilish orqali dopaminerjik neyronlarning mitoxondriyalarida to'planadi. Shunday qilib, u mitoxondrial nafas olish zanjirining kompleks I faolligini va ATP sintezini inhibe qiluvchi ortiqcha kislorodli erkin radikallarni hosil qiladi. Ushbu hodisalar erkin radikal shakllanishi va oksidlovchi stress reaktsiyalarini yanada kuchaytiradi va oxir-oqibat dopaminerjik neyronlarning nasli va o'limiga olib keladi.

Shunday qilib, ushbu tadqiqot MPP plyusdan MES23.5 dopaminerjik neyronlarida in vitro transport vositasini yaratish va o'zaro tekshirish uchun transport vositasi sichqonchasini induktsiya qilish uchun MPTP dan foydalangan. MTT tahlili natijalariga ko'ra, MPP plus MES23.5 hujayralarining hayotiyligini sezilarli darajada kamaytirdi, bu MPP plus dopaminerjik neyronlar uchun sitotoksik ekanligini ko'rsatdi. Natijalar ham buni ko'rsatdicistanchetubulosa anti-apoptotik oqsillarning ifodasini samarali ravishda kuchaytirdi va MPP plus-induktsiyali apoptozning ko'payishini inhibe qildi.

D va GDNF

GDNF neyrotrofik omil bo'lib, birinchi marta Lin va boshqalar tomonidan ajratilgan. (1993). Lin va boshqalar. (1993) shuningdek, GDNF kalamushlarning o'rta miyasidagi dopaminerjik neyronlarga o'ziga xos oziqlanish ta'siriga ega ekanligini ko'rsatdi. GDNF, neurturin (NTN), sezgi (PSP) va artemin (ART) GDNF oilasini tashkil qiladi. Ular tarkibiy jihatdan o'xshash va funktsional jihatdan bog'liq bo'lgan sekretor oqsillardir (Kotzbauer va boshq., 1996; Baloh va boshq., 1998; Milbrandt va boshq., 1998; Woodbury va boshq., 1998).

GDNF retseptorlari ikkita komponentdan iborat. Birinchi komponent, GFR, glikosilfosfatidilinositol (GPI) ning tashqi membranasiga mahkamlanadi va konneksin yuzasiga mahkamlanadi. Ikkinchi komponent Ret proteinidir. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, GFR ning to'rt xil turi mavjud: GFR 1, GFR 2, GFR 3 va GFR 4. GFR 1 - GDNF ning yuqori afinitetli retseptorlari (Onochie va boshq., 2000; Chen va boshq., 2001; Lindahl va boshqalar, 2001). Ret oqsili GDNF ning funktsional retseptoridir. GDNF ning gomodimer molekulasi komplekslar hosil qilish uchun bevosita GFR 1 bilan bog'lanadi va Ret bilan o'zaro ta'sir qiladi, natijada Retning dimerizatsiyasi va faollashishi sodir bo'ladi. Retning avtofosforilatsiyasi tufayli Ret bir nechta umumiy TH signalizatsiya yo'llarini faollashtiradi. Ret oqsili yo'q bo'lganda, GDNF mRNK ifodasi va C-fosning funktsional faolligiga qo'shimcha ravishda MAPK, PI-3 va PLC-ning protein fosforlanishiga olib keladi, GFR 1 retseptorlari oqsili (He va boshq., 2008).

Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, GDNF dopaminerjik neyronlarga eng kuchli himoya ta'siriga ega (Rangasamy va boshq., 2010; Campos va boshq., 2012). Dopaminerjik neyronlarga zarar etkazish uchun MPTP va 6-gidroksidopamin (6-OHDA) dan foydalanadigan transport vositalarida GDNF apoptozni kamaytirish va ildiz hujayralarining differentsiatsiyasini qo'zg'atish uchun aksonal o'sishni rag'batlantirish orqali dopaminerjik neyronlarni himoya qiladi (Lucas va boshq., 2012; Littrell va boshqalar, 2013). Lin va boshqalar. (1993) GDNF neyronlarda DA ning o'zlashtirilishini rag'batlantirish uchun dopaminerjik neyronlarning hayotiyligini, differentsiatsiyasini va aksonal o'sishini rag'batlantirishini ko'rsatdi. Tadqiqot shuni ko'rsatdiki, GDNF nafaqat o'tkir toksiklikni oldini oldi, balki dopaminerjik neyronlarda MPP plus yoki 6-OHDA ning uzoq muddatli toksikligini engillashtirdi, bundan tashqari stressli yoki shikastlangan hujayralardagi hujayra o'limining oldini oldi (Yu va boshq., 2010). Bundan tashqari, GDNF dopaminerjik neyronlarni retrograd degeneratsiyadan qutqarish uchun o'rta miyada (Lindsay, 1995) dopaminerjik neyronlarga nisbatan nerv ildiz hujayralarining ko'payishi va differentsiatsiyasini rag'batlantirdi (Hong-Juan va boshq., 2011).

Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, SNdagi GDNF ifodasi hayvonlarning transport vositalarida sezilarli darajada kamaygan (Yang va boshq., 2010). Bu PD kalamushlarida patogenez mexanizmlaridan biri bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. 5-15 ug/d GDNFni MPTP qo'zg'atgan transport vositasining lateral qorinchasiga yoki striatumiga ketma-ket uch oy davomida yuborish transport vositasida dopaminerjik tizimning nigrostriatal tiklanishiga yordam berdi (Grondin va boshq., 2002). Hayvonlar uchun transport vositalarida PD uchun GDNF davolashni o'rganish shuni ko'rsatdiki, GDNF ning miyaning turli qismlariga, masalan, SN, kaudat yadrosi va lateral qorinchalarga intraserebral in'ektsiya, PD hayvonlar modellari bilan bog'liq yaxshilangan harakat buzilishlari, shu jumladan, motor faolligining pasayishi, mushaklarning qattiqligi va tremor (Grondin va boshq., 2002).

Biroq, GDNF bevosita qon-miya to'sig'idan o'ta olmaydi. Shuning uchun GDNF ning mahalliy miya in'ektsiyasi klinik qo'llashda katta xavf va qiyinchiliklarni o'z ichiga oladi. Ekzogen GDNFni boshqariladigan mikrosferalar, uzluksiz chiqariladigan kapsulalar va virusli genlar orqali joriy qilish uchun ilovalar hali ham o'rganilmoqda (Liang va boshq., 2010; Yang va boshq., 2010; Qiao va boshq., 2012). Miyaga ekzogen GDNFni kiritish uchun turli usullarning cheklovlarini hisobga olgan holda, endogen GDNF chiqarilishiga yordam beruvchi neyroprotektiv vositalar klinik qo'llash uchun muhimdir.

PD vacistanchetubulosa nano kukuni

PD ko'proq o'rta yoshli kattalar va qariyalarda uchraydi. TCM nazariyasi PD birinchi navbatda miyada joylashganligini va asosan hayotiy energiya va qon etishmovchiligidan tashqari, jigar va buyrak etishmovchiligi bilan bog'liq deb hisoblaydi. Ushbu nazariyaga ko'ra, PDni davolash buyrak va suyak iligini jonlantirishga qaratilgan bo'lishi kerak. Yang va boshqalar. (2010) randomizatsiyalangan, ikki marta ko'r va platsebo-nazorat qilinadigan klinik sinovlardan foydalangan va Madopar va buyrakni tonlash retseptlaridan foydalangan holda kombinatsiyalangan terapiya PD bilan og'rigan bemorlarning motor disfunktsiyasini engillashtirganini aniqladi. Davolash natijasi Madopar yordamida bitta terapiyadan ko'ra yaxshiroq edi. PDda TCM monoterapiyasi yoki birikma retseptining davolash samaradorligi PD hayvonlar modellarida va klinik ilovalarda tasdiqlangan. Buyraklarni tonlash va qon aylanishini rag'batlantirish uchun TCM ilovalari Madopar yordamida PD uchun monoterapiya dozasini kamaytirdi. Ba'zi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, TCM PD belgilarini va himoyalangan dopaminerjik neyronlarni yaxshilaydi, bu endogen GDNF ifodasini targ'ib qilish bilan chambarchas bog'liq bo'lishi mumkin (Hong-Juan va boshq., 2011; Qiao va boshq., 2012).

Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan buyrakni toniklashtiruvchi birikma,cistanchetubulosa nano chang, tarkibida Cistanche, epimedium va Rhizoma poligonal mavjud. Zamonaviy tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, Cistanche kimyoviy tarkibi MPTP tomonidan qo'zg'atilgan PD sichqonlarida SNdagi dopaminerjik neyronlarni himoya qiluvchi ECH bo'lib, DA va DA tashuvchisining kamayishiga to'sqinlik qiladi (Zhao va boshq., 2010). Bundan tashqari, u DA ning 6-OHDA sabab bo'lgan pasayishini oldini oladi va striatal dopaminerjik neyronlarni himoya qiladi (Chen va boshq., 2007). Epimedium kaspaza -3 faollashuvini inhibe qiladi va neyroprotektiv rollarni bajaradi (Liu va boshq., 2011). Epimedium flavonoidlari nerv ildiz hujayralarining ko'payishi va differentsiatsiyasini samarali ravishda rag'batlantiradi (Yao va boshq., 2010).

Ushbu tadqiqotda,cistanchetubulosa nanopowder dozaga bog'liq holda MPP plyus induktsiyalangan apoptozning ko'payishiga qarshi chiqdi. Bu in vitro vositada TH ifodasini sezilarli darajada yaxshiladi va dopaminerjik neyronlarda sezilarli anti-apoptotik ta'sir ko'rsatdi. MPTP tomonidan qo'zg'atilgan transport vositasi sichqonlari xulq-atvor buzilishlarini ko'rsatdi va o'rta miya to'qimalarida va PDning tipik patologik xususiyatlari bo'lgan DA darajalarida TH ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi. Turli dozalardacistanchetubulosa nanopowder statsionar vaqtni qisqartirdi, avtonom faoliyatni kuchaytirdi, xulq-atvor buzilishlarini yaxshiladi, miyada DA darajasini oshirdi va transport vositalarida TH ifodasini oshirdi. Bu natijalar shuni ko'rsatdicistanchetubulosa nanopowder dopaminerjik neyronlarga himoya ta'sirini ko'rsatdi va shu bilan transport vositalarining xatti-harakatlaridagi buzilishlarni yaxshilaydi. Turli dozalardacistanchetubulosa nanopowder avtomobil sichqonlari miyasida GDNF oqsili va uning retseptorlari oqsillari ifodasini oshirdi. Yuqori dozali sistanx tubulosa davolash Bcl2 ifodasini sezilarli darajada oshirdi va Bax ifodasini kamaytirdi, bu esa cistanche tubulosa nanopowder MPTP shikastlangan sichqoncha miyasida GDNF ifodasi va sekretsiyasini kuchaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, u dopaminerjik neyronlarda neyroprotektiv ta'sir ko'rsatishi va GDNF ning neyrotrofik qo'llab-quvvatlovchi rollari orqali neyronal apoptozni minimallashtirishi mumkin.

Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatdicistanchetubulosa nanopowder ham in vitro, ham in vivo sharoitda dopaminerjik neyronlarga himoya ta'sir ko'rsatdi va DA tarkibini yaxshilash uchun TH ifodasini oshirdi. Shuningdek, u MPTP tomonidan qo'zg'atilgan avtomobil sichqonlarida xulq-atvor buzilishlarini yaxshiladi, SNda GDNF va uning retseptorlari oqsillarining protein ifodasini tartibga soldi va PD sichqonlarida anti-apoptotik ta'sir ko'rsatdi. ning klinik ta'siri ostida yotgan mexanizmcistanchePDdagi tubulosa nanopowder miyadagi endogen GDNF tarkibini ko'paytirishni va shu bilan dopaminerjik neyronlarning shikastlanishini kamaytirishni o'z ichiga olishi mumkin.

Muallif hissalari

QX va WF ishning birinchi hammualliflari bo'lib, S-FY, Y-BC, WQ va S-YC eksperimental ishda qatnashgan, JC esa ishni ishlab chiqqan va boshqargan.

Manfaatlar to'qnashuvi to'g'risidagi bayonot

Mualliflarning ta'kidlashicha, tadqiqot manfaatlar to'qnashuvi sifatida talqin qilinishi mumkin bo'lgan tijorat yoki moliyaviy munosabatlar mavjud bo'lmaganda o'tkazilgan.

Minnatdorchilik

Ish Fujian provinsiyasi grantlari tabiiy fanlar fondi (loyiha 2015J01686), Xitoy Xalq Respublikasi Sogʻliqni saqlash va oilani rejalashtirish milliy komissiyasining Ilmiy tadqiqot jamgʻarmasi (WKJ-FJ-38 loyihasi), Chen Keji tomonidan qoʻllab-quvvatlandi. Integral tibbiyotni rivojlantirish jamg'armasi (loyiha CKJ2014012) va Fujian an'anaviy xitoy tibbiyot universitetining asosiy mavzusi (X{5}}loyihasi).

For more information:1950477648nn@gmail.com