Clec12a kolitogenik kommensalning kengayishini cheklab, yallig'lanishni pasaytiradi

XULOSA

Mikrobiotani tartibga solish ichak salomatligi uchun juda muhim, ammo tug'ma immunitet tomonidan qo'llaniladigan mexanizmlar noaniqligicha qolmoqda. Bu erda biz C-tipi-lektin retseptorlari etishmovchiligi bo'lgan sichqonlarda Clec12a mikrobiotaga bog'liq bo'lgan og'ir kolitni rivojlantirganini ko'rsatamiz. Mikrobsiz sichqonlarga najas-mikrobiota transplantatsiyasi (FMT) tadqiqotlari Clec12a-/- sichqonlarida hosil bo'lgan kolitogen mikrobiotalarni aniqladi, ular gram-musbat organizm, Faecalibaculum kemiruvchilarning kengayishi bilan ajralib turadi. F. rodentium bilan davolash yovvoyi turdagi sichqonlarda kolitni yomonlashtirish uchun etarli edi. Ichakdagi makrofaglar Clec12a ning eng yuqori darajasini ifodalaydi. Clec12a-/- makrofaglarida sitokin va sekvensiya tahlili yallig'lanish kuchayganligini, ammo fagotsitoz bilan bog'liq genlarning sezilarli darajada kamayganligini aniqladi. Haqiqatan ham, Clec12a-/- makrofaglarning F. rodentiumni qabul qilish qobiliyati buzilgan. Tozalangan Clec12a F. rodentium kabi gram-musbat organizmlarga yuqori darajada bog'langan. Shunday qilib, bizning ma'lumotlarimiz Clec12a ni aniq yallig'lanishsiz potentsial zararli kommensallarning kengayishini nazorat qilish uchun tug'ma immunitetni nazorat qilish mexanizmi sifatida belgilaydi.

Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi

KIRISH

Mikrobiotaning tarkibi va funktsiyasi sutemizuvchilar salomatligi va kasalliklariga katta ta'sir ko'rsatishi mumkin (Fassarella va boshq., 2021). Bu yallig'lanishli ichak kasalligi (IBD) uchun yaxshi hujjatlashtirilgan, bu erda IBD ning sichqoncha modellarining aksariyati mikrobiota tarkibidagi o'zgarishlarga sezgir (Gkouskou va boshq., 2014). Mikrobiota barqarorligiga ta'sir ko'rsatadigan va ko'rsatuvchi omillarni tushunish mikrobiota asosidagi terapiyalar ishlab chiqilganligi sababli muhim bo'ladi (Sharma va boshq., 2020; Sorbara va Pamer, 2022). Mikrobiotaga diet, dori-darmonlar va immunitet tizimi kabi ko'plab parametrlar ta'sir qiladi. So'nggi yillarda adaptiv immunitet komponentlari, ayniqsa IgA, mikrobiota tarkibiga ta'sir ko'rsatishi ko'rsatildi (Nakajima va boshq., 2018; Okai va boshq., 2016; Yang va Palm, 2020). Biroq, o'ziga xos tug'ma immun retseptorlari gomeostatik mikrobiota tarkibiga qanday ta'sir qilishi haqida kamroq ma'lum.

Mikroblarni aniqlash va shilliq qavat immunitetini tartibga soluvchi genlardagi genetik polimorfizmlar IBD uchun muhim xavf allellari, shu jumladan ATG16L1 otofagiya oqsili (Cadwell va boshq., 2008; Liu va boshq., 2015; Rioux va boshq., 2007; Wellcome 2 Trust Case Control 07). ). ATG16L1T300A polimorfizmi bo'lgan shaxslarda miyeloid gen ifodasi o'zgarishlarini o'rganuvchi yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda, inhibitiv C tipidagi lektin retseptorlari (CLR), Clec12a bu hujayralarda sezilarli darajada bostirilganligi aniqlandi (Begun va boshq., 2015). Xuddi shu tadqiqot Clec12a otofagiya yo'li bilan bog'lanish orqali patogen infektsiyani himoya qilish funktsiyasini ko'rsatdi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, IBD bo'lgan odamlarda Clec12a regulyatsiyasi kasallikning og'irligiga va / yoki rivojlanishiga ta'sir qilishi mumkin. Ushbu dalillarga qaramay, kolit paytida Clec12a tomonidan qo'llaniladigan immunitetni tartibga solish mexanizmlari haqida juda kam narsa ma'lum.

C tipidagi lektinlar eruvchan yoki membrana bilan bog'langan molekulalarning turli guruhi bo'lib, ular xost yoki mikrobial kelib chiqadigan, lipidlar, oqsillar va uglevodlarni bog'lashga qodir (Brown va boshq., 2018). Mincle (Clec4e) va Dectin -1 (Clec7a) ichak gomeostazini saqlab qolish uchun mikrobiotaning o'ziga xos a'zolariga ta'sir qiluvchi ikkita CLRdir (Iliev va boshq., 2012; Martinez-Lopez va boshq., 2019). Biroq, 1,{12}} dan ortiq turli xil C tipidagi lektinlar mavjud bo'lsa, bu proteinlar oilasida hali ko'p narsalarni topish kerak. Clec12a tabiiy qotil retseptorlari oilasiga tegishli bo'lib, yallig'lanish signalizatsiya yo'llarini cheklashga qodir bo'lgan immun-tirozin inhibitör motivini (ITIM) o'z ichiga olgan ikkita C tipidagi lektinlardan biridir (Brown va boshq., 2018; Marshall va boshq., 2004). . Clec12a hujayra shikastlanishining signali bo'lgan siydik kislotasini taniydi (Neumann va boshq., 2014). Clec12a eng ko'p tug'ma immunitet hujayralarida namoyon bo'ladi va neytrofillarda u faollashuvni kamaytiradi va siydik kislotasi aniqlanganda yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarishni kamaytiradi (Neumann va boshq., 2014). Aksincha, Clec12a ko'p sklerozning otoimmün modeli va virusli infektsiyaga javoban I turdagi interferon signalini kuchaytirish paytida qon-miya to'sig'i orqali mono-yadroli fagotsitlarning (MNPs) o'tishiga ruxsat berish orqali yallig'lanishni kuchaytiradi (Li va boshq., 2019; Sagar va boshq. ., 2017). Clec12a shuningdek, plazmodial mahsulot, gemozoinni ham taniy oladi, bu plazmodium infektsiyasidan keyin miyada CD{29}} T hujayralarini ko'paytirishi ko'rsatilgan (Raulf va boshq., 2019). Shunday qilib, Clec12a immunitetda turli xil rollarga va noyob signalizatsiya qobiliyatiga ega bo'lgan nopok CLRni ifodalaydi, ammo uning ichakdagi roli noma'lumligicha qolmoqda.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Biz ilgari o'ziga xos ichak zamburug'lari purin metaboliti, siydik kislotasini qo'zg'atish orqali kolitni kuchaytirganini ko'rsatdik (Chiaro va boshq., 2017). Bundan tashqari, purin metabolizmi yaqinda inson ichak kasalligi bilan bog'liq edi (Zhu va boshq., 2019). Ushbu ma'lumotlar birgalikda siydik kislotasini aniqlash IBD bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Shunga asoslanib, biz ichakdagi Clec12a funktsiyasini o'rganishga kirishdik. Biz Clec12a etishmovchiligi bo'lgan hayvonlarning kolitga juda moyil ekanligini aniqladik, bu Clec12a yo'qligida hosil bo'lgan mikrobiota tarkibiga bog'liq. WT mikrobsiz hayvonlarga Clec12a-/- mikrobiotasining FMT kolitni kuchaytirishi uchun etarli edi va Clec12a-/- hayvonlarida kolitogen mikrobiotaning shakllanishi adaptiv immunitetdan mustaqildir. Kolitni kuchaytirishi mumkin bo'lgan tegishli mikroblarni aniqlash uchun Clec12a-/- hayvonlari turli antibiotiklar bilan davolandi va gram-musbat bakteriyalarni nishonga olganlar kasallikni engillashtirdi. 16S rDNK ketma-ketligi Faecalibaculum rodentium Clec12a-/- hayvonlarda sezilarli darajada ko'proq bo'lishini aniqladi va F. rodentiumning og'zaki gavajlari WT hayvonlarida kasallik patologiyasini kuchaytirish uchun etarli edi. Clec12a-/- hayvonlarning immun profilini aniqlash yo'g'on ichakdagi gomeostatik miyeloid hujayralarning sezilarli darajada kamayganligini aniqladi. F. rodentium bilan davolash qilingan makrofaglarning RNK ketma-ketligi Clec12a fagotsitozga yordam berishini aniqladi. Clec12a bir nechta ligandlarni bog'lashi ko'rsatilganligi sababli, biz Clec12a mikrobiotaning turli a'zolari bilan bog'lanishini so'radik. Clec12a-Fc termoyadroviy oqsilidan foydalanib, biz Clec12a mikrobiotaning gram-musbat a'zolari bilan eng yuqori darajada bog'lanishini aniqlaymiz. Birgalikda bu ma'lumotlar Clec12a mikrobiotaning kolitogen a'zolarini to'g'ridan-to'g'ri bog'lanish va fagotsitoz orqali boshqaradigan va yallig'lanish reaktsiyalarining oldini oladigan modelni taklif qiladi. Clec12a ifodasi kamaygan stsenariylarda gram-musbat patobiontlar yallig'lanishni kengaytirishi va rivojlanishi mumkin. Shunday qilib, bizning tadqiqotlarimiz Clec12a ni gomeostazni va sog'lom mikrobiotani saqlashni ta'minlash uchun muhim yallig'lanishni bostiruvchi sifatida aniqlaydi.

NATIJALAR

Clec12a-/- hayvonlar adaptiv immunitet tizimidan mustaqil ravishda kolitga juda sezgir

IBD bilan kasallangan odamlarda Clec12a ifodasining kamayishi haqida xabar berilgan va biz Clec12a ligandlaridan biri, siydik kislotasi ishlab chiqarishni blokirovka qilish kolitni yaxshilashi mumkinligini ko'rsatdik (Begun va boshq., 2015; Chiaro va boshq., 2017; Liu va boshqalar. ., 2015). Biroq, Clec12a kolitning hayvonlar modellarida hali o'rganilmagan. Shu maqsadda WT va Clec12a-/- C57BL/6 sichqonlari o'tkir DSS kolitiga qarshi kurashdi. Clec12a-/- hayvonlar WT hayvonlari bilan solishtirganda sezilarli darajada ko'proq vazn yo'qotdi, yo'g'on ichaklari qisqaroq bo'ldi va najasda yallig'lanish belgisi LCN2 sezilarli darajada ko'paydi, bu yallig'lanish va kasallikning yomonlashganini ko'rsatadi (1A-C-rasm). Buni qo'llab-quvvatlagan holda, gistologik tahlil WT bilan solishtirganda Clec12a-/- hayvonlarda epiteliya shikastlanishi, kript yo'qolishi va immun hujayralari oqimining ko'payishini aniqladi (1D, E-rasm). DSS kolit modelidagi natijalarga mos ravishda, CD4+ CD45RBhi hujayralarini TCRb-/- ga o'tkazish; Clec12a-/- er-xotin nokautli sichqonlar TCRb-/- sichqonlariga o'tkazilgan T hujayralari bilan solishtirganda vaqt o'tishi bilan ozroq vazn ortishiga va yo'g'on ichakning qisqarishiga olib keldi (1F, G-rasm). Birgalikda, bu natijalar Clec12a ning yo'qolishi ichak kasalliklarining yomonlashishiga olib kelishini ko'rsatadi.

Xabar qilinishicha, Clec12a asosan tug'ma immun hujayralarida ifodalangan, CD8+ T hujayralarida juda kam ifodalangan. Shuning uchun, adaptiv immunitetning Clec12a-/- hayvonlarida kuzatilgan yomonlashgan kasallikka aloqadorligini aniqlash uchun, Clec12a-/- hayvonlar T va B hujayralarini olib tashlash uchun Rag-/- hayvonlariga o'tkazildi. Shunga qaramay, Clec12a-/- hayvonlar WT hayvonlari bilan solishtirganda kasallikni yomonlashtirdi, chunki ular WT nazoratiga qaraganda ko'proq vazn yo'qotdilar va yo'g'on ichaklari qisqaroq edi (1H, I-rasm). Xuddi shunday, Clec12a-/-; Rag-/- Rag-/- nazorati bilan solishtirganda yomonlashgan ichak kasalligi rivojlandi va juda ko'p vazn yo'qotdi va Clec12a-/- kabi WT va Rag-/-ga qaraganda qisqaroq yo'g'on ichakka ega (1H, I-rasm). S. cerevisiae bilan og'iz orqali davolash kolitni yomonlashtirish uchun siydik kislotasi darajasini oshirishi haqida avval xabar bergan edik. Biroq, WT va Clec12a-/- hayvonlarda qon zardobida yoki najasdagi siydik kislotasi darajasida hech qanday farq kuzatilmadi, bu Clec12A-/-da kuzatilgan kasallikning kuchayishi siydik kislotasining ko'payishi natijasi emasligini ko'rsatadi (S1-rasm). Shunday qilib, Clec12a-/- hayvonlarda kuzatilgan yomonlashgan kolit rivojlanishi adaptiv immunitet tizimiga bog'liq emas.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Clec12a-/- hayvonlarda yomonlashgan kolit mikrobiotaga bog'liq

Kolit qisman mikrobiota tarkibidagi o'zgarishlar tufayli yuzaga kelishi ma'lum (Kubinak va boshq., 2015; Rey va Dittel, 2015). Clec12a-/- hayvonlarida yomonlashgan kolitga yordam beruvchi mikrobiota bor yoki yo'qligini aniqlash uchun FMTlar WT yoki Clec12a-/- sichqonlaridan mikrobsiz WT hayvonlariga o'tkazildi. Transplantatsiyadan to'rt hafta o'tgach, hayvonlarning yarmi birgalikda, qolgan yarmi esa alohida bo'lib qoldi. Keyin har bir guruhda o'tkir DSS kolitlari qo'zg'atildi (2A-rasm). Clec12a-/- FMT olgan hayvonlar va birga yashaydigan hayvonlar WT sichqonlaridan FMT olgan hayvonlarga qaraganda sezilarli darajada ko'proq vazn yo'qotgan (2B-rasm) va yo'g'on ichaklari sezilarli darajada qisqaroq bo'lgan (2C-rasm). Bundan tashqari, gistologik tahlil Clec12a-/- mikrobiota bilan transplantatsiya qilinganidan keyin ko'proq epiteliya shikastlanishi va yallig'lanish oqimini aniqladi (2D, E-rasm). O'rnatilgan mikrobial jamoalar Bray-Kurtis (PERMANOVA, p=0.0001), vaznsiz (PERMANOVA,=0.0062) va og'irligi bo'yicha 16S rRNK geni sekvensiyasi orqali aniqlangan guruhlar orasida ajralib turardi. Unifrac masofalari (PERMANOVA, p=0.0001). Guruh ichidagi mikrobiota o'xshashligi har bir FMT genotipidan mikroblarning olinishini ko'rsatadigan bir xil ko'rsatkichlar bo'yicha birgalikda joylashgan hayvonlarda eng katta edi (2-rasm FH). Bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, Clec12a-/- hayvonlarda yomonlashgan kolit Clec12a yo'qligida boyitilgan o'ziga xos mikroblar tomonidan boshqariladi; va bu mikroblar, hatto o'rnatilgan WT mikrobiota mavjud bo'lganda ham, kolitogenik fenotipning dominant haydovchilariga aylandi.

Clec12a-/- hayvonlarda hosil bo'lgan mikrobiota tarkibi adaptiv immunitetga bog'liq emas

Immunitet tizimi mikrobiota tarkibini belgilash uchun muhimdir. FMT tajribasi shuni ko'rsatdiki, Clec12a-/- kolit rivojlanishining yomonlashishiga yordam beradigan mikrobiota tarkibining o'zgarishiga olib keladi. Biz birinchi navbatda immunitet bo'limidagi Clec12a-/- etishmovchiligi ichak mikrobiotasini qayta shakllantirishga qodirligini aniqlashni xohladik. Shu maqsadda mikrobiotani standartlashtirish uchun WT yoki Clec12a-/- sichqonlarining suyak iligi halokatli nurlangan WT SPF qabul qiluvchi sichqonlarga o'tkazildi, so'ngra 8- haftalik immunitetni tiklash davri (3A-rasm). Bu vaqt ichida transplantatsiya qilingan immun tizimlar mikrobiota tarkibini differentsial shakllantirib, qabul qiluvchining ichida rivojlanishga vaqt topadi. Mikrobiotadagi prokolitogen o'zgarishlar ushbu immun haykaldan kelib chiqqanligini aniqlash uchun biz FMTlarni WT yoki Clec12a-/- kimerik sichqonlarning najaslari va qo'zg'atilgan DSS kolitlari yordamida amalga oshirdik (3A-rasm). Og'irlikni yo'qotishda sezilarli o'zgarishlar bo'lmasa-da (3B-rasm), Clec12a-/- kimerik sichqonlardan FMT olgan hayvonlarning yo'g'on ichaklari WT sichqonlaridan FMT olgan hayvonlarga nisbatan ancha qisqaroq bo'lgan (3C-rasm), bu kasallikning yomonlashganini ko'rsatadi. Bundan tashqari, WT va Clec12a-/- FMT qabul qiluvchilari birgalikda joylashtirilganda, yo'g'on ichaklar WT FMT olgan hayvonlarga qaraganda ancha qisqaroq bo'lgan (3C-rasm). Shunday qilib, gematopoetik bo'limda Clec12a-/- etishmovchiligi dominant kolitogen mikrobiotaning shakllanishiga olib keladi.

Moslashuvchan immunitet tizimi Clec12a-/- hayvonlarda kolitogen mikrobiota hosil bo'lishi uchun zarur ekanligini qo'llab-quvvatlash uchun biz Rag-/- yoki Rag- /- najaslari yordamida FMT o'tkazdik; Clec12a-/- - avval tasvirlanganidek. Rag-/- olgan hayvonlar; Clec12a-/- FMT Rag-/- hayvonlardan FMT olgan hayvonlarga qaraganda ko'proq vazn yo'qotdi va yo'g'on ichaklari sezilarli darajada qisqaroq bo'lgan, bundan tashqari, birgalikda yashaydigan hayvonlarda ham kasallik yomonlashgan (3D, E-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, tug'ma immunitet tizimidagi Clec12a etishmovchiligi kolitni kuchaytirishi mumkin bo'lgan mikrobiotaning shakllanishiga olib keladi.

Clec12a Faecalibaculum rodentiumning kengayishini bostiradi

Biz Clec12a-/- hayvonlarida kasallik qo'zg'atuvchi tegishli organizmlarni aniqlash uchun bir qator turli antibiotiklardan foydalandik. Birinchidan, eritromitsin, ampitsillin, neomitsin va gentamitsinni o'z ichiga olgan keng spektrli antibiotiklarning kuchli kokteyli bilan davolash Clec12a-/- va WT hayvonlarida kasallikning og'irligini sezilarli darajada kamaytirdi, bu mikrobiotaning bakterial populyatsiyasi kasallik uchun tegishli ekanligini ko'rsatadi ( 4A-rasm; S2-rasm). Keyinchalik, noyob bakteriyalar taksoniga qaratilgan turli antibiotiklardan foydalangan holda, qaysi bakterial populyatsiyalar kasallik uchun eng mos ekanligini yanada qisqartirdik. Xususan, biz gram-manfiy bakteriyalarga qaratilgan aminoglikozid bo'lgan gentamitsinni va asosan gramm-musbat bakteriyalarga qaratilgan sefalosporin - sefalotinni tanladik. Ushbu dorilar DSS kolitida Clec12a-/- hayvonlarga qo'llanilgan. Gentamitsin bilan davolash kasallikning og'irligida farq qilmasa ham, sefalotin olgan hayvonlar o'z vaznini saqlab qolishdi va soxta davolash qilingan hayvonlarga qaraganda sezilarli darajada uzunroq yo'g'on ichakka ega bo'lishdi (4B, C-rasm), bu Clec12a-/- mikrobiota ichida yashovchi gram-musbat organizmlarning o'ynashini ko'rsatadi. kasallik patologiyasini kuchaytirishda muhim rol o'ynaydi.

Keyinchalik biz mikrobiotadagi tarkibiy o'zgarishlarni aniqlash uchun SPF WT va Clec12a-/- najasning 16S rRNK genini ketma-ketligini amalga oshirdik. WT va Clec12a-/- hayvonlar filogenetik bo'lmagan va filogenetik mo'l-ko'llik ko'rsatkichlari, mos ravishda Bray-Kurtis va vaznli-UniFrac bo'yicha sezilarli darajada farqlanadi (S3A-C-rasm). Alfa xilma-xillik ko'rsatkichlari boylikda (kuzatilgan xususiyatlar) sezilarli farqlarni aniqlamadi, bu Clec12a-/- ko'proq turlarga ega emasligini ko'rsatadi (4D-rasm). Biroq, Clec12a yo'qligida tenglik va Shannon xilma-xillik indekslari ortdi, bu Clec12a-/- sichqonlarida bakteriyalarning mutanosib taqsimlanishi o'zgarganligini ko'rsatadi (4E, F-rasm) va Clec12a ichakdagi mikrobiota tuzilishini tartibga solish uchun muhimligini qo'llab-quvvatlaydi.

Mikrobiomalar tarkibini (ANCOM) tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, differensial ravishda ko'p bo'lgan ASV (amplikon ketma-ketligi variantlari) orasida Faecalibaculum jinsida (Erysipelotrichaceae oilasi) tasniflangan ASV WT bilan solishtirganda Clec12a-/- najas ichida sezilarli darajada kengaytirilgan (rasm). 4G, H). Bizning tahlilimizdagi ASV vakili ketma-ketligidan foydalangan BLAST, Faecalibaculum rodentium bakteriyalarining ketma-ketliklariga 100% o'xshashligini ko'rsatdi. Ushbu ma'lumotlar Clec12a-/- hayvonidagi gramm-musbat bakteriyalar kolitogen fenotip uchun mas'ul ekanligini va ayniqsa, gram-musbat organizm F. rodentiumni kasallikning kuchayishi bilan bog'liqligini tasdiqlaydi.

Shunga asoslanib, biz F. rodentium kolitni kuchaytirishi mumkinligi haqidagi farazni sinab ko'rdik. Biz WT SPF hayvonlarini 1 x 108 CFU jonli yoki sobit F. rodentium bilan og'iz orqali gavaj orqali oldindan davolash qildik va F. rodentium kolonizatsiyasining yuqori darajasini ta'minlash uchun DSS ning o'tkir modeli davomida har kuni davolanishni davom ettirdik. Tirik va qoʻzgʻalmas F. rodentium olgan hayvonlar koʻproq vazn yoʻqotgan va yoʻgʻon ichaklari transport vositasida davolangan hayvonlarga qaraganda ancha qisqaroq boʻlgan (4I, J-rasm), bu F. rodentium darajasining ortishi kasallikni yomonlashtirishi mumkinligini koʻrsatadi.

Clec12a fagotsitozni kuchaytirganda makrofaglarning yallig'lanish reaktsiyasini cheklaydi.

Kasallik bo'lmaganda Clec12a hujayrali ifodasini aniqlash uchun biz ko'p rangli oqim sitometriyasi yordamida lamina propriadagi (LP) tug'ma va adaptiv immun hujayralarini profilladik. Oldingi hisobotlarga muvofiq, Clec12a asosan miyeloid nasl bilan cheklangan, limfotsitlarda juda oz yoki umuman ifodalanmagan (5A-rasm) (Han va boshq., 2004; Pyz va boshq., 2008; Sobanov va boshq., 2001). Ichak neytrofillari, makrofaglar va dendritik hujayralar Clec12a ifodasining o'xshash darajalarini ko'rsatdi (S4A-rasm), makrofaglar esa Clec12a ni ifodalovchi ichak to'qimalarida hujayralarning eng katta foiziga ega (5A-rasm). Klassik faollashuv orqali yallig'lanishni rag'batlantirish, shuningdek, to'qimalarning shikastlanishiga javoban reparativ mexanizmlarni boshlash uchun makrofaglarning ikki tomonlama rolini hisobga olgan holda, biz Clec12a kolit paytida ushbu dixotomiyaga qanday ta'sir qilishi mumkinligini so'radik. Makrofaglar juda xilma-xil bo'lsa-da, ularni CD38 va EGR2 ifodalash orqali M1 yallig'lanish va M2 reparativ makrofaglarga bo'lish mumkin. Biz Clec12a-/- hayvonlarda kolit paytida yo'g'on ichak LPda M1 makrofaglari ko'paygan va M2 makrofaglari kamayganligini ko'rsatamiz (5-rasm B, C, S4B-rasm). Ushbu ma'lumotlar Clec12a ichakdagi makrofag reaktsiyalarini tartibga solishini ko'rsatadi.

Clec12a mikrobial ligandlarga javoban makrofag biologiyasiga qanday ta'sir qilishini yaxshiroq tushunish uchun WT yoki Clec12a-/- hayvonlardan ajratilgan suyak iligidan olingan makrofaglar (BMDM) LPS, Pam3CysK va Flagellinni o'z ichiga olgan turli xil mikrobial ligandlar bilan davolash qilindi. Ushbu namunalarning barchasida sitokin tahlili o'tkazildi. Sinovdan o'tgan ko'plab sitokinlar ushbu sharoitda induktsiya qilinmagan, ammo MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a va IL-6 ushbu madaniyatlarda doimiy ravishda aniqlangan ( 5D-rasm). Clec12a-/- BMDM'lar ko'plab mikrobial ligandlarga javoban bu sitokinlarning sezilarli darajada yuqori ifodasiga ega edi va eng katta farqli javoblar TLR2 agonisti Pam3CysK ga javoban kuzatildi. Ushbu ma'lumotlar Clec12a ning steril yallig'lanish paytida yallig'lanish reaktsiyalarini yumshatishdagi ma'lum roliga mos keladi (Neumann va boshq., 2014).

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

RNK-seq WT yoki Clec12a-/- F. rodentium bilan ishlangan BMDM-larda Clec12a ushbu hujayralarning ushbu o'ziga xos bakterial organizmga javoblarini qanday tartibga solayotganini aniqlash uchun amalga oshirildi. Biz farqli javobni F. rodentium taʼsiriga duchor boʻlgan Clec12a-/- BMDMʼlarni avtomobil boshqaruvi orqali WT BMDMʼlari bilan solishtirish orqali baholadik. Differensial ravishda ifodalangan genlarni boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, Clec12a etishmovchiligi bo'lgan makrofaglar F. rodentium bilan sinovdan o'tganda hujayra siklini nazorat qilishda ishtirok etadigan genlarda sezilarli o'sishga ega (S5A-rasm). Hujayra aylanishi fagotsitoz bilan uzviy bog'liq bo'lib, fagotsitoz va yallig'lanish reaktsiyasi bilan bog'liq genlarda sezilarli pasayish kuzatildi (5E-rasm) (Luo va boshq., 2005). Clec12a va Salmonellalar bo'yicha yaqinda o'tkazilgan tadqiqotga muvofiq, bu ma'lumotlar normal ichak rezidenti F. rodentiumga javoban Clec12a yo'qligida fagotsitozning nuqsonli ekanligini ko'rsatadi (Begun va boshq., 2015). Buni tekshirish uchun WT va Clec12a-/- hayvonlardan peritoneal makrofaglar to'plangan va F. rodentium etiketli Sybr®-yashil bilan birgalikda o'stirilgan. Clec12a-/- makrofaglar har bir hujayrada sezilarli darajada kamroq mikroblarga ega edi (5F, G-rasm; S5B-rasm), bu Clec12a etishmovchiligi kamroq organizmlarning o'zlashtirilishiga olib keladi va RNK-seq ma'lumotlar to'plamida fagotsitozning kamayishi bilan mos keladi. Birgalikda bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, Clec12a umumiy mikrobial ligandlarga ochiq yallig'lanish reaktsiyalarini yumshatish va makrofag bakteriyalarini qabul qilishni rag'batlantirishda ikki tomonlama rol o'ynaydi.

Clec12a gram-musbat kommensallarga ustunlik qiladi

Fagotsitoz mikroblarning bog'lanishi, so'ngra ichkilashtirish va o'ldirish bilan boshlanganligi sababli, biz Clec12a mikrobiotaning o'ziga xos a'zolari, masalan, F. rodentium bilan bog'lana olgan deb taxmin qildik. Ushbu imkoniyatni hal qilish uchun murin Clec12a ning hujayradan tashqari bog'lovchi domenini va inson IgG1 ning Fc qismini (Clec12a-Fc) o'z ichiga olgan termoyadroviy oqsil yaratilgan (6A-rasm) (Maglinao va boshq., 2014; Neumann va boshq., 2014; Raulf). va boshq., 2019). Protein tozalangan va gomeostatik ichakda mavjud bo'lgan turli gramm-musbat va gramm-manfiy bakteriyalar, jumladan F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, va qo'ziqorin kommensal Candida albicans, oqim sitometriyasi orqali. Salmonella enterica ham kiritilgan edi, chunki oldingi tadqiqotlar Clec12a S. enterica hujayraga kirishi bilan bog'lanishi mumkinligini ko'rsatdi (Begun va boshq., 2015). Clec12a bir nechta filogenetik jihatdan farq qiluvchi bakteriyalar, jumladan F. rodentium bilan turli darajada bog'langan, ammo zamburug'lar emas, C. albicans (6B-rasm). Clec12a gramm-musbat organizmlar F. rodentium va Roseburia sp. oilasining Lachnospiraceae a'zosi bilan eng ko'p bog'langan va B. animalis, B. uniformis va S. enterica bilan eng kam ta'sirlashgan (6B-rasm), bu Clec12a jonini ko'rsatadi. gram-musbat organizmlarni afzal ko'rgan holda mikrobiotaning o'ziga xos a'zolari bilan bog'lanadi. Bizning ma'lumotlarimiz birgalikda Clec12a ni immun tizimi tomonidan ichak mikrobial hamjamiyatini o'rganish va mikrobiotani to'g'ridan-to'g'ri bog'lash va fagotsitoz orqali kesish va ichak sog'lig'ini saqlash uchun juda muhim bo'lgan ko'p gramm-musbat mikroblarga ochiq yallig'lanish reaktsiyalarining oldini olish uchun ishlatiladigan mexanizm ekanligini aniqlaydi.

MUHOKAZA

Ichakdagi gomeostaz, zarar etkazuvchi yallig'lanishni boshlamasdan, kommensal mikroblarni cheklash mexanizmlarini talab qiladi (Macpherson va boshq., 2000). IgA, so'nggi yillarda, ichak immuniteti mikrobiotani nazorat qilishning muhim usullaridan biri sifatida paydo bo'ldi (Pabst va Slack, 2020). Haqiqatan ham, IgA mikroblar va / yoki ularning mahsulotlari bilan bevosita bog'lanishga va ularni proto-tipik yallig'lanishni qo'zg'atmasdan ichakdan yo'q qilishga qodir. Ushbu ikki tomonlama xususiyatlarga ega bo'lgan boshqa immun molekulalar hozirgacha o'rganilmagan. C tipidagi lektinlar turli xil oqsillar, uglevodlar va lipid molekulalarini mikrobial va xost mahsulotlaridan taniy oladigan turli xil oqsillarni o'z ichiga oladi (Brown va boshq., 2018; Drouin va boshq., 2020). Biroq, bir nechtasi ichak immuniteti va mikrobiota kontekstida o'rganilgan (Iliev va boshq., 2012; Martinez-Lopez va boshq., 2019). Shunday qilib, bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu Clec12a etishmovchiligi kasallikning og'irligini keltirib chiqaradigan mikrobiota tarkibini o'zgartiradigan birinchi namoyishdir.

cistanche foydalari - immunitet tizimini mustahkamlaydi

Clec12a asosan monosodyum urat (MSU) yoki siydik kislotasini tan olish kontekstida o'rganilgan, bu ko'pincha hujayra o'limining belgisidir (Kono va boshq., 2010; Neumann va boshq., 2014). Siydik kislotasi NLRP3 yallig'lanishi orqali yallig'lanish reaktsiyalarini faollashtirishga qodir, shuning uchun hujayra o'limi paytida to'qimalarni yo'q qilishning oldini olish uchun bu yallig'lanishni nazorat qilish kerak (Martinon va boshq., 2006). Clec12a bu yallig'lanish reaktsiyasini Syk signalizatsiyasini pasaytirish orqali muvozanatlashi ko'rsatilgan (Marshall va boshq., 2004). Shunga mos ravishda, steril yallig'lanish modelida Clec12a va artritning otoinflamatuar modelida yo'q qilinishi neytrofillarning faollashishi va kasallikning yomonlashishiga olib keladi, bu Clec12a ni muhim yallig'lanish tormozi qiladi (Redelinghuys va boshq., 2016). Biroq, yaqinda Clec12a virusli infektsiyaga javoban I turdagi interferon signalizatsiyasini kuchaytirishi va antibakterial avtofagiya yo'li orqali Salmonellalarning qabul qilinishiga vositachilik qilishi ko'rsatildi (Begun va boshq., 2015; Li va boshq., 2019). Bu shuni ko'rsatadiki, Clec12a faqat yallig'lanishni cheklash uchun emas, balki kontekstga qarab turli xil rollarni o'ynashi mumkin. Ichaklar kasallik bo'lmasa ham ko'p miqdorda immunitet hujayralari mavjudligi bilan ajralib turadi. Bu immunitetni rivojlantirish va patogen organizmlarning kolonizatsiyasini oldini olishda muhim rol o'ynaydigan mikrobiotaning mavjudligi bilan bog'liq. Mikrobiota patogenlarni ham taniydigan TLRlar tomonidan aniqlangan bir xil sirt naqshlariga ega va shuning uchun ichak immunitet tizimi bu begona organizmlarga yallig'lanishni to'xtatish uchun qattiq tartibga solish mexanizmlariga ega bo'lishi kerak (Blander va boshq., 2017).

Biz dastlab Clec12a bilan qiziqdik, chunki Saccharomyces cerevisiae ichak qo'ziqorinlari kolitni yomonlashtirish uchun siydik kislotasini keltirib chiqarishini aniqladik (Chiaro va boshq., 2017). Bundan tashqari, boshqa tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, mikrobiota purin metabolizmini qo'zg'atish orqali ichak kasalliklariga ta'sir qilishi mumkin, buning sut emizuvchilardagi yakuniy mahsuloti siydik kislotasi (Zhu va boshq., 2019). Ushbu ma'lumotlar Clec12a kabi siydik kislotasini sezish mexanizmlari ichak gomeostazasiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatadi. Biroq, biz qon zardobida yoki najasda siydik kislotasi darajasida hech qanday o'zgarishlar kuzatilmadi, bu Clec12a-/- hayvonida kasallikning kuchayishi siydik kislotasining ko'payishi bilan bog'liq emasligini ko'rsatadi. Biroq, Clec12a-/-da kolitning kuchayishi mikrobiota tarkibiga bog'liq. Shunday qilib, bizning ma'lumotlarimizga asoslanib, Clec12a-/- ifodasining kamayishi IBD bemorlarida mikrobiota tarkibiga ta'sir qilishi mumkin (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman va boshq., 2011; Vijay Kumar va boshq., 2010). Qizig'i shundaki, biz gram-musbat organizmlarga qaratilgan antibiotiklar Clec12a-/- hayvonlarda kolitning og'irligini yaxshilashga qodir ekanligini aniqladik. Bu ichak yallig'lanishi paytida kengaygan gram-manfiy Enterobacteriaceae ni aniqlagan bir nechta hisobotlardan farqli o'laroq, bu kolit rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan gram-musbat organizmlarning kengayishini aniqlagan bir nechta tadqiqotlardan biridir. Ushbu modelda kolitning og'irligiga ta'sir qiladigan yagona organizm bo'lmasa-da, Clec12a-/- hayvonlarda F. rodentiumning keskin kengayishi kuzatildi. F. rodentium Firmicutes (Bacillota) filasining gramm-musbat, oksidaza va katalaza-manfiy a'zosi (Chang va boshq., 2015). F. rodentium ning hatto WT sichqonlariga har kuni kiritilishi kolitni kuchaytiradi, bu ichakdagi F. rodentium miqdorining ko'payishi zararli ekanligini va Clec12a-/-da kolitning kuchayishini qo'llab-quvvatlaydi. Yaqinda e'lon qilingan hisobot F. rodentium epiteliya almashinuvini oshirishi va yallig'lanish reaktsiyalarini pasaytiradigan epiteliya ichidagi fermentlarning ekspressiyasini bostirishi mumkinligini ko'rsatdi va shuning uchun F. rodentium ichakda kengayganida biz ko'radigan yomonlashgan kasallikka mos keladi (Cao va boshq., 2022). Odamlar F. rodentium (Zagato va boshq., 2020) ga o'xshash organizm bilan mustamlaka qilinganligi sababli, keyingi tadqiqotlar ushbu F. rodentiumga o'xshash bakteriyalarning kolit bilan bog'liq inson fiziologiyasi jihatlariga ta'sirini aniqlashi kerak.

Tug'ma immunitet hujayralari orasida Clec12a rolini qo'llab-quvvatlagan holda, biz kolitogen mikrobiota hali ham adaptiv immunitet tizimiga ega bo'lmagan Clec12a-/- hayvonlarda shakllanganligini kuzatdik. Ichakdagi Clec12a ni ifodalovchi hujayralarning eng yuqori foizi makrofaglar edi, bu bizni ushbu hujayralardagi Clec12a funktsiyasiga e'tibor qaratishimizga olib keldi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Clec12a virusli infektsiyaga javoban I turdagi interferon ishlab chiqarishning muhim vositachisidir (Li va boshq., 2019). Biroq, Clec12a bakterial ligandlarning keng spektriga javoblarga qanday ta'sir qilishi baholanmagan; Bu juda ko'p TLR ligandlari mavjud bo'lgan ichaklarda juda muhimdir. Bu erda biz Clec12a ichakdagi makrofag reaktsiyalarini yumshatishga xizmat qilishini va mikrobiotaga javoban gomeostazni ta'minlash funktsiyalarini ko'rsatamiz. F. rodentium bilan inkubatsiya qilingan makrofaglarning RNK-seqlari Clec12a etishmovchiligi ushbu kommensal bakteriyalarga javoban hujayra tsikli va fagotsitoz nuqsonlariga olib kelishini ta'kidladi. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqot shuni ko'rsatdiki, Clec12a-/- makrofaglar Salmonellalarga javoban otofagiyani kamaytirgan (Begun va boshq., 2015). Bizning ma'lumotlarimiz ushbu topilmalarni maqtadi va kengaytiradi, shunda Clec12a invaziv bo'lmagan kommensal organizmlarni boshqarish uchun ham ishlaydi. F. rodentiumning epiteliy biologiyasiga taʼsir etishi boshqalar tomonidan koʻrsatilgan, bu esa F. rodentium xostga yaqin joylashganligini va shuning uchun immunitet tizimi tomonidan qattiq nazorat qilinishi kerakligini koʻrsatadi. Bizning ma'lumotlarimiz Clec12a F. rodentiumni fagotsitozni tartibga solish orqali nazorat qilishini tasdiqlaydi. Fagotsitoz ligand yoki mikrobning jismoniy bog'lanishi bilan boshlanadi va C tipidagi lektinlar bir nechta ligandlar bilan bog'lanishi mumkin, bu bizni Clec12a to'g'ridan-to'g'ri ichak bakteriyalari bilan bog'lanishi mumkinligini tekshirishga olib keldi. Qizig'i shundaki, Clec12a gram-musbat F. rodentium va Roseburia organizmlari bilan eng yuqori darajada bog'langan va gramm-manfiy organizmlar A. muciniphila va B. uniformis bilan juda kamroq bog'langan va C. albicans bilan umuman bog'lanmagan. Ushbu ma'lumotlar Clec12a mikrobiotaning o'ziga xos a'zolarini bog'lashga moyilligini ko'rsatadi. Bu bizga Clec12a ning qo'shilishi va keyingi fagotsitoz mikrobiotaning ma'lum a'zolarini nazorat qilishi va ularning kengayishining potentsial zararli ta'sirini oldini oladigan modelni yaratishga imkon beradi. Bu Clec12a ning ikki tomonlama funktsiyasini ta'kidlaydi, bu mikrobial ligandlarga qarshi yallig'lanishni to'xtata oladi, shu bilan birga mikrobiotaning o'ziga xos a'zolarini tan oladi va nazorat qiladi. Shunday qilib, Clec12a tug'ma immunitet tizimi oshqozon-ichak traktida gomeostazni ta'minlash uchun foydalanadigan noyob usulni ifodalaydi.

RASMLAR AFSONALARI

Shakl 1. Clec12a adaptiv immunitet tizimidan mustaqil ravishda ichak kasalliklarini cheklaydi

(A) Kolitning og'irligini baholash uchun WT yoki Clec12a-/- C57BL/6 o'ziga xos patogensiz (SPF) sichqonlar ichimlik suvida 7 kun davomida 2,5% dekstran natriy sulfat (DSS) ad libitum bilan davolandi. Har kuni vazn yo'qotish foizi baholandi. O'rtacha +/- SEM, ma'lumotlar ikki tomonlama ANOVA va Śídákning ko'p taqqoslash testidan foydalangan holda uchta mustaqil tajribadan birlashtiriladi.

(B) Qurbonlik paytida ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) o'lchandi. Tarqalish grafigi - o'rtacha +/- SEM, ma'lumotlar juftlashtirilmagan t-testi yordamida uchta mustaqil tajribadan birlashtiriladi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi

(C) Yallig'lanish ko'rsatkichi sifatida ko'rsatilgan hayvonlarning fekal lipokalin-2 (ng/ml) o'lchandi. Chiziqli grafik o'rtacha +/- SEM bo'lib, ma'lumotlar juftlashtirilmagan t-testi yordamida ikkita mustaqil tajribadan birlashtiriladi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi

(D) H&E vakili DSS qo'zg'atgan kolitdan keyin ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak qismlarini bo'yadi.

(E) ko'rsatilgan hayvonlar uchun gistologiya ballari yo'g'on ichak bo'limlaridan olingan

(D). Chiziqli grafik o'rtacha +/- SEM bo'lib, juftlashtirilmagan t-testidan foydalangan holda taqqoslanadi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

(F) Surunkali kolitni baholash uchun kolitning T hujayralarini o'tkazish modeli amalga oshirildi. TCRb-/- va Clec12a-/- ;TCRb-/- hayvonlarning vazni har hafta o'lchandi. Grafikda tajriba davomida ko'rsatilgan hayvonlarning vazn yo'qotish foizi ko'rsatilgan. Oʻrtacha +/- SEM, 2-yoʻl ANOVA bilan solishtirganda.

(G) (I) dan ko'rsatilgan hayvonlarning koloniya uzunligi qurbonlik paytida o'lchandi. Chiziqli grafik o'rtacha +/- SEM bo'lib, juftlashtirilmagan t-testidan foydalangan holda taqqoslanadi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- yoki Rag-/-; Clec12a-/- C57BL/6 SPF sichqonlari o'tkir kolit uchun baholandi. Belgilangan hayvonlar 7 kun davomida 2,5% ad libitum DSS bilan ta'minlangan. Har kuni vazn yo'qotish foizi baholandi. O'rtacha +/- SEM, ma'lumotlar ikkita mustaqil tajribaning vakili. Ikki tomonlama ANOVA va Śídákning ko'p taqqoslash testi.

(I) Qurbonlik paytida ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) o'lchandi. Chiziqli grafik - o'rtacha +/- SEM, ma'lumotlar juftlashtirilmagan t-testlaridan foydalangan holda ikkita mustaqil tajribaning vakili. Har bir nuqta bitta sichqonchani bildiradi * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p <0,001; **** p <0,0001

Shakl 2. Clec12a-/- hayvonlarida hosil bo'lgan mikrobiota yomonlashgan kolitni keltirib chiqaradi

A) Fekal mikrobiota transplantatsiyasi (FMT) WT yoki Clec12a hayvonlaridan najas supernatantlarini mikrobsiz WT sichqonlariga o'tkazish orqali amalga oshirildi. Mikrobiotalarni to'rt hafta davomida bir hil holga keltirishga ruxsat berildi, shundan so'ng WTFMT sichqonlarining yarmi va Clec12a-/-FMT sichqonlarining yarmi birgalikda joylashtirildi va yana to'rt hafta aralashtirishga ruxsat berildi. Keyin barcha guruhlar ichimlik suvida 2,5% DSS ad libitum olishdi va 7-kuni qurbonlik qilishdi.

B) Ko'rsatilgan hayvonlarning vazn yo'qotish foizi har kuni baholandi. Grafik o'rtacha +/- SEMni ko'rsatadi, ma'lumotlar Ikki tomonlama ANOVA va Śídákning ko'p taqqoslash testi yordamida ikkita mustaqil tajribadan birlashtiriladi.

C) Qurbonlik paytida ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) o'lchandi. Tarqalish grafigi - Dunnett ko'p taqqoslash testi bilan oddiy bir tomonlama ANOVA yordamida solishtirilgan o'rtacha +/- SEM. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

D) H&E vakili FMT va DSS qo'zg'atgan kolitdan keyin ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak qismlarini bo'yadi.

E) Gistologiya ballari (D) yo'g'on ichak bo'limlaridan hosil qilingan. Chiziqli grafik o'rtacha +/- SEM bo'lib, juftlashtirilmagan t-testidan foydalangan holda taqqoslanadi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

F) WTFMT, Clec12a-/- FMT yoki birgalikda yashaydigan hayvonlarning 16S rRNK geni ketma-ketligidan vaznli Unifrac masofalari. Barcha nuqtalarni ko'rsatadigan quti va mo'ylovli chizmalar (ikkita masofani taqqoslash) va Kruskal-Vallis testi yordamida taqqoslash.

G) WTFMT, Clec12a-/- FMT yoki birgalikda yashaydigan hayvonlarning 16S rRNK genini ketma-ketligidan og'irlashtirilmagan Unifrac masofalari. Barcha nuqtalarni ko'rsatadigan quti va mo'ylovli chizmalar (ikkita masofani taqqoslash) va Kruskal-Vallis testi yordamida taqqoslash.

H) WTFMT, Clec12a-/- FMT yoki birgalikda yashaydigan hayvonlarning 16S rRNK gen sekvensiyasidan Bray-Kurtis masofalari. Barcha nuqtalarni ko'rsatadigan quti va mo'ylovli chizmalar (ikkita masofani taqqoslash) va Kruskal-Vallis testi yordamida taqqoslash.

3-rasm: Clec12a-/- hayvonlarda hosil bo'lgan mikrobiota tarkibi adaptiv immunitetdan mustaqil

A) Keyinchalik FMT bilan suyak iligi tiklanishini ko'rsatadigan sxematik diagramma. C57Bl/6 WT sichqonlari halokatli nurlangan va WT yoki Clec12a-/- suyak iligi bilan qayta tiklangan. 8 haftadan so'ng, bu sichqonlardan najas olindi va (A) da tushuntirilganidek, WT mikrobsiz sichqonlarga o'tkazildi. Dastlab qayta tiklangan kimerik hayvonlarga ichimlik suvida 2,5% DSS ad libitum berildi.

B) (F) dan FMT sichqonlarining vazn yo'qotish foizi har kuni baholandi. Ikki tomonlama ANOVA va Tukey bir nechta taqqoslash testidan foydalangan holda o'rtacha +/- SEM.

C) Qurbonlik paytida ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) o'lchandi. Tarqalish grafigi - o'rtacha +/- SEM, juftlashtirilmagan t-testi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi

D) adaptiv immun tizimining mikrobial shakllanish va kolit zo'ravonligidagi rolini baholash uchun FMTlar najasli supernatantlarni Rag-/- yoki Rag-/- dan o'tkazish orqali amalga oshirildi; Clec12a-/- SPF hayvonlarini (A) da tasvirlanganidek WT mikrobsiz sichqonlarga kiriting. Sichqonlarga 7 kun davomida 2,5% DSS bilan ishlov berildi. Har kuni vazn yo'qotish foizi baholandi. Grafik ikki tomonlama ANOVA va Tukey ko'p taqqoslash testidan foydalangan holda o'rtacha +/- SEM hisoblanadi.

E) (F) da ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) qurbonlik paytida o'lchandi. Oddiy bir tomonlama ANOVA va Dunnet ko'p taqqoslash testi yordamida taqqoslangan o'rtacha +/-, SEM. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p <0,001; **** p <0,0001

Shakl 4. Clec12a kolitni yomonlashtiradigan mikrob bo'lgan Faecalibaculum kemiruvchilarning kengayishini cheklaydi.

A) WT yoki Clec12a-/- C57BL/6 SPF sichqonlariga 0 konsentratsiyasida antibiotik kokteyli (A) (neomitsin, gentamitsin, ampitsillin, eritromitsin), sefalotin yoki gentamitsin (B, C) berildi. O'n to'rt kun davomida 5 g / l. Etti kundan keyin hayvonlarga qurbonlikka qadar ichimlik suvida 2,5% DSS berildi. Qurbonlik paytida ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) o'lchandi. Tarqalish grafigi - o'rtacha +/- SEM, juftlashtirilmagan t-testi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

B) Ko'rsatilgan hayvonlarning vazn yo'qotish foizi har kuni baholandi. Grafik ikki tomonlama ANOVA va Tukey ko'p taqqoslash testidan foydalangan holda o'rtacha +/- SEM hisoblanadi

C) Qurbonlik paytida o'lchangan ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm). Tarqalish grafigi - o'rtacha +/- SEM, juftlashtirilmagan t-testi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

D) WT yoki Clec12a-/- najasdan kuzatilgan xususiyatlar, 16S rRNK ketma-ketligi alfa xilma-xilligi. Mann-Whitney testidan foydalangan holda solishtirganda o'rtacha +/- SEM.

E) WT yoki Clec12a-/- najasdan Pielou tengligi, 16S rRNK ketma-ketligi alfa xilma-xilligi. Mann-Whitney testidan foydalangan holda solishtirganda o'rtacha +/- SEM.

F) Shennon entropiyasining o'rtacha +/- SEM, Mann-Whitney testi yordamida taqqoslangan.

G) WT va Clec12a-/- najasdan ANCOM tahlili. Taksonomik nomlar Genom Taksonomiyasi Ma'lumotlar bazasi (GTDB) dan foydalangan holda ASVlarning eng yaxshi tasnifi hisoblanadi.

H) Faecalibaculum rodentium ASV ning nisbiy ko'pligi. Mann Whitney yordamida solishtirilgan * p < {0}}.05; ** p < 0.01; *** p <0,001; **** p <0,0001

I) C57Bl/6 WT SPF sichqonlari F. rodentiumning 1x108 CFU bilan og'iz orqali uch kun davomida oldindan davolash qilingan. Keyin hayvonlar F. rodentiumning kunlik gavajini olishda davom etib, 7 kun davomida ichimlik suvida 2,5% DSS oldilar. Har kuni vazn yo'qotish foizi baholandi. O'rtacha +/- SEM, Ma'lumotlar Ikki tomonlama ANOVA va Tukey ko'p taqqoslash testi yordamida to'rtta alohida tajribadan iborat.

J) Qurbonlik paytida ko'rsatilgan hayvonlarning yo'g'on ichak uzunligi (sm) o'lchandi. Chiziqli grafik o'rtacha +/- SEM bo'lib, ma'lumotlar Dunnet ko'p tuzatish testi bilan oddiy bir tomonlama ANOVA yordamida solishtirganda to'rtta alohida tajribadan to'plangan. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p <0,001; **** p <0,0001

Shakl 5. Clec12a yallig'lanishni cheklaydi va makrofaglarda fagotsitozga yordam beradi.

A) Immunofenotiplash WT va Clec12a-/- hayvonlarda yo'g'on ichak lamina propriasidan (cLP) ajratilgan hujayralarda oqim sitometriyasi orqali amalga oshirildi. Issiqlik xaritasi tug'ma va adaptiv immun hujayralarida Clec12a ifodasi chastotasini ko'rsatadi

B) Chiziqli grafikda ko'rsatilgan hayvonlarning cLP dan pre-gate, CD38+ hujayralari (M1 makrofaglar) chastotasi ko'rsatilgan. O'rtacha +/- SEM, juftlashtirilmagan t-test yordamida solishtirilgan. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

C) Chiziqli grafikda ko'rsatilgan hayvonlarning cLP dan pre-gate, EGR2+ hujayralari (M2 makrofaglar) chastotasi ko'rsatilgan. O'rtacha +/- SEM, juftlashtirilmagan t-test yordamida solishtirilgan. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

D) BMDMlar WT va Clec12a-/- uzun suyaklaridan olingan va 7 kun davomida M-CSF (20ng/mL) ishtirokida yetishtirilgan. 8-kuni BMDMlar 24 soat davomida LPS (100ng/ml), MDP (10mg/mL), Pam3cysk (1mg/ml) yoki Flagellin (1mg/ml) bilan pulsatsiya qilindi. Media to'plangan va sitokin ishlab chiqarish uchun tahlil qilingan. Issiqlik xaritasi ko'rsatilgan sitokinlarning Clec12a-/- dan WT bo'yicha Log2 marta o'zgarishini ko'rsatadi.

E) WT va Clec12a-/- sichqonlaridan BMDMlar (A) da bo'lgani kabi ajratildi va madaniyatlandi va keyin 24 soat davomida 10 MOIda F. rodentium bilan birgalikda o'stirildi. BMDMlar yuvilgandan so'ng, RNK yig'ildi va RNK ketma-ketligi uchun tayyorlandi. Clec12a-/- tartibga solinmaganlar orasida boyitilgan eng yaxshi 10 ta soddalashtirilgan GO atamasi (Biologik jarayon) toifalari

F) Peritoneal makrofaglar WT va Clec12a-/- sichqonlaridan ajratildi va keyin fagotsitozni baholash uchun Sybr yashil rangga bo'yalgan F. rodentium bilan kokultura qilindi. Chapda: WT makrofaglari. O'ngda: Clec12a-/- makrofaglar. Yorqin maydon (chap ustunlar), flüoresans (o'rta ustunlar) va birlashtirilgan (o'ng ustunlar) dan vakillik tasvirlari tasvirlangan. Sariq strelka uchlari makrofaglar tomonidan yutilgan F. rodentium hujayralari misollarini bildiradi. masshtab satri=20 mkm. Tasvirlar ikkita alohida tajribaning vakili.

G) Shtrixli grafikda (F) ko‘rinib turganidek, bitta hujayradagi organizmlar ko‘rsatilgan. Har bir hujayradagi F. rodentium miqdorini aniqlash uchun 250 WT hujayra va 269 Clec12a-/- hujayra hisoblangan.

6-rasm: Clec12a mikrobiotaning o'ziga xos a'zolari bilan bevosita bog'lanadi.

A) Clec12a-inson IgG1-Fc sintez oqsili yoki bo'sh vektor (faqat Fc qismi) tasvirlangan sxematik diagramma B) Clec12a-Fc ning turli bakteriyalar yoki C. albicans bilan differensial bog'lanishini ifodalovchi oqim sitometrik tahlilining gistogrammalari.

QO'SHIMCHI RASMLAR AFSONALARI

Qo'shimcha rasm 1. Clec12a yo'qligi siydik kislotasi darajasini buzmaydi.

A) WT va Clec12a-/- C57Bl/6 sichqonlari o'rtasida purin almashinuvini baholash uchun ko'rsatilgan hayvonlarning sarum siydik kislotasi (µM) o'lchandi. Tarqalish grafigi - o'rtacha +/- SEM, ma'lumotlar juftlashtirilmagan t-testidan foydalangan holda uchta mustaqil tajribadan birlashtiriladi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

B) WT va Clec12a-/- C57Bl/6 sichqonlari orasida siydik kislotasining ichak orqali chiqarilishini baholash uchun ko'rsatilgan hayvonlarning najas siydik kislotasi (µM) o'lchandi. Tarqalish grafigi - o'rtacha +/- SEM, ma'lumotlar juftlashtirilmagan t-testidan foydalangan holda uchta mustaqil tajribadan birlashtiriladi. Har bir nuqta bitta sichqonchani ifodalaydi.

Qo'shimcha rasm 2. WT va Clec12a-/- mikrobiotalar differentsial kasallikni keltirib chiqaradi

Neomitsin, gentamitsin, ampitsillin va eritromitsindan tashkil topgan antibiotik kokteyli bilan davolash qilingan WT va Clec12a-/- hayvonlarning vazn yo'qotish foizi.

Qo'shimcha rasm 3. Mikrobiota tarkibiga Clec12a ta'sir qiladi.

A) umumiy mikrobiota munosabatlarini ko'rsatadigan Bray-Kurtis masofalariga asoslangan dastlabki 3 o'qning PCoA chizmalari va har bir guruh ichidagi o'xshashlikni miqdoriy jihatdan aniqlaydigan mos keladigan quti va mo'ylovli chizmalar va Mann-Uitni testi bilan taqqoslangan.

B) Mann-Whitney testi yordamida solishtirganda, og'irlikdagi Unifrac masofalariga asoslangan PCoA chizmalari va guruh ichidagi o'xshashliklarni aniqlaydigan mos keladigan quti va mo'ylovli chizmalar.

C) Bray-Kurtis va og'irlikdagi Unifrac masofalari bilan WT va Clec12a-/- najas mikrobiota uchun PERMANOVA test natijalarini ko'rsatadigan jadval.

Qo'shimcha rasm 4: Makrofaglardagi Clec12a yallig'lanishni cheklaydi.

A) Skripka syujetlarida (A) ko'rsatilgan immun hujayralarining geometrik o'rtacha lyuminestsent intensivligi (MFI) tasvirlangan. O'rtacha +/- SEM, bir nechta taqqoslash uchun Dunn tuzatishi bilan Kruskal-Wallis testi. Harflar sezilarli darajada farq qiladigan guruhlarni bildiradi.

B) DSS kolitidan keyin WT yoki Clec12a-/- sichqonlarining cLP dan M1 va M2 makrofaglarning reprezentativ oqim sitometriya chizmalari. Hujayralar jonli, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ va CD64+da oldindan yopilgan. 5A-rasmdan

Qo'shimcha rasm 5. Clec12a hujayra siklini nazorat qilishni barqarorlashtiradi va makrofaglarda fagotsitozni tartibga soladi.

A) F. rodentiumga javoban WT bilan solishtirganda Clec12a-/- yuqori tartibga solinadigan genlar orasida boyitilgan eng yaxshi 10 ta soddalashtirilgan GO atamasi (Biologik jarayon) toifalari. F. rodentium bilan birgalikda o'stirilgan WT va Clec12a-/- sichqonlaridan BMDMlar ajratilgan va 7A-rasmdagi kabi tahlil qilingan.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200 ta makrofaglar hisoblangan. Chiziqli grafikda quduqlar boʻylab hisoblash va taʼsir qilishning izchilligini koʻrsatish uchun 4 ta alohida quduqdagi F. rodentiumning oʻrtacha sonini koʻrsatadi. O'rtacha +/- SEM juftlashtirilmagan t-testi yordamida taqqoslangan.

MAQDAT

Ushbu loyiha uchun Clec12a-/- hayvonlarini taqdim etgani uchun Gordon Braunga minnatdorchilik bildiramiz. Ushbu ish Helen Hay Whitney Jamg'armasi (KSO), Yuta NRSA Mikrobial Patogenez T32 O'quv Granti (KSO), CCFA Katta Tadqiqot mukofoti (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 va NCCAM124317 va Edward Malward (NCCAM1R0430) tomonidan qo'llab-quvvatlandi. Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER mukofoti (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Patogenesis Award (JLR), American Astma Foundation (JLR), Margolis Foundation (JLR), MS Society Center granti (JLR) va WM Keck Foundation (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), Amerika Saraton Jamiyati Tadqiqot Granti (RMO), Kimmel Scholar mukofoti (RMO), R01AG047956 (RMO) va NIAID R01AI141202 (ASI). Bu ish Yuta universiteti Flow Cytometry Facility tomonidan qoʻshimcha ravishda Milliy saraton instituti tomonidan 5P30CA042014-24-sonli mukofot orqali qoʻllab-quvvatlandi. Yuta universiteti qoshidagi Yuqori samarali hisoblash markazining yordami va resurslari minnatdorchilik bilan qabul qilinadi.

MUALFOLAR HISSALARI

TRC tadqiqotni rejalashtirishga yordam berdi, sichqoncha va immunologik tajribalarning ko'pini o'tkazdi, ma'lumotlarni raqamlarga birlashtirdi va qo'lyozmani yozishga yordam berdi. RB mikrobsiz tajribalar o'rnatdi va barcha mikrobsiz hayvonlarni ushlab turdi. ESV immunologik ichak lamina propria tajribalarida yordam berdi. KSO sichqonchani yig'ishda yordam berdi va tushuncha va yo'nalish berdi. KMB sichqonchani yig'ish va oqim sitometriyasida yordam berdi. MCN sichqonchani yig'ishda yordam berdi. WV termoyadroviy oqsil va tozalash uchun konstruktsiyani yaratishda yordam berdi. TJ fagotsitoz tahlillari bilan yordam berdi. JH fagotsitoz mikroskopining slaydlarini tahlil qildi. MH termoyadroviy oqsilni tozalash va ishlatishda yordam berdi. KAK bakterial izolatlarni beradi. ROC immunologiya tajribasi va tushunchasini taqdim etdi. WZS tadqiqotni rejalashtirishga yordam berdi, bioinformatika tahlillarini o'tkazdi, raqamlarni tayyorlash va statistikada yordam berdi va qo'lyozmani yozishga yordam berdi. JLR tadqiqotni rejalashtirish va yo‘naltirishga yordam berdi, eksperimental dizayn va natijalarni nazorat qildi, hamkorlar va reagentlarni tashkil qildi, tadqiqot uchun mablag‘ yig‘di va qo‘lyozmani yozishga yordam berdi.

USULLARI

Sichqoncha shtammlari

Bu erda ishlatiladigan barcha sichqoncha chiziqlari C57BL/6 fonida edi. Clec12a-/- sichqonlari Gordon Braun (Ekseter universiteti Tibbiy mikologiya bo'yicha tibbiy tadqiqot kengashi markazi) tomonidan taqdim etilgan va ular ilgari tasvirlangan protokolga muvofiq genotip bo'lgan (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- va TCRb-/- (Jekson Laboratories, 002118) Jekson Laboratoriesdan olingan va sichqoncha koloniyamizda bir necha avlodlar davomida saqlangan. Barcha in vivo kolit tajribalari uchun 8 dan 12-haftalik jinsi mos keladigan sichqonlar ishlatilgan. Erkak va urg'ochi sichqonlardan foydalanilgan. Sichqonchalar maxsus patogensiz sharoitlarda saqlangan.

Bakterial va qo'ziqorin shtammlari

Quyidagi organizmlar DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH kompaniyasidan olingan: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM # 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM # 26074). Bacteroides uniformis Amerika turi madaniyati to'plamidan (ATCC® 8492™) sotib olingan. Roseburia sp (shtamm belgisi JLR.KK002) Schaedler agarida spora bilan boyitilgan mikrobiotani o'z ichiga olgan C57BL/6 sichqonlaridan ajratilgan. Spora oldingi boyitish yuqorida ta'riflanganidek amalga oshirildi va sichqonlar JLR.KK002 najasdan ajratilgunga qadar bizning gnotobiotik muassasamizda ushbu mikrobiota bilan bir necha avlodlar davomida saqlangan (Browne va boshq., 2016). Biz PCR bilan kuchaytirdik va Sanger 16S rRNK genini ketma-ketlashtirdik va keyin uni SILVA ACT xizmati va SILVA ma'lumotlar bazasi bilan tasnifladik (Pruesse va boshq., 2012). Salmonella typhimurimum ST2 shtammi ishlatilgan. Candida albicans shtammi sc5314 ishlatilgan. PhyLo11b sintetik jamoasida ishlatiladigan bakteriya shtammlari quyida tasvirlangan.

DSS tomonidan qo'zg'atilgan eksperimental kolit

7 kun davomida ichimlik suviga 2,5% yoki 3% (w/v) 36,000-50,000MVt dekstran natriy sulfat (DSS) (MP Biomedicals) qo'shilishi bilan kolit paydo bo'ldi. Kolitning og'irligi har kuni tana vaznining o'zgarishi, najasning mustahkamligi va najas qonidagi o'zgarishlar orqali kuzatildi. Monotsitlarni qutqarish tajribasi uchun barcha sichqonlar 5 kun davomida 2,5% DSS oldi, undan keyin muntazam suv berildi; vazn monitoringi hayvonlarni yig'ib olishning 10-kunigacha davom etdi. 20% dan ortiq vazn yo'qotish uchun jiddiylik chegarasi jiddiylik chegarasi sifatida belgilandi. Eksperimental so'nggi nuqtalarda MLN va yo'g'on ichak olib tashlandi. Uzunligini aniqlash uchun yo'g'on ichak ko'richakdan to'g'ri ichakgacha o'lchandi. Keyin to'qimalar gistologiya, RNK ekstraktsiyasi yoki oqim sitometrik tahlili uchun qayta ishlandi.

Yo'g'on ichak gistologiyasi va skoring

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Lipokalin-2 (LCN-2) Elishay

Protokol ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq amalga oshirildi (Fischer Scientific DY1857-05). Qisqacha aytganda, najas 100 mg / ml konsentratsiyada HBSS 1X da to'plangan, tortilgan va pyuresi qilingan. Keyinchalik katta qoldiqlarni olib tashlash uchun namunalar 50 xg da 5 daqiqa davomida aylantirildi. Keyin supernatant olib tashlandi va yangi naychaga joylashtirildi va bakteriyalarni granulalash uchun 8000 xg da 5 daqiqa davomida aylantirildi. Keyin bu supernatant hayvonlarning kasalligiga qarab suyultirildi, lekin odatda 1:100- 500 (sog'lom) – 1:500-1000 (DSS bilan ishlov berilgan) oralig'ida bo'ldi. Siydik kislotasini o'lchash Siydik kislotasi kontsentratsiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi (Invitrogen™ Amplex™Red Urik/Urikase faolligini tahlil qilish to'plami, cat# A22181). Qisqacha aytganda, qon WT yoki Clec12a-/- sichqonlaridan kardiyak ponksiyon orqali oltin yuqori sarum ajratuvchi naychalarga to'plangan. Naychalar 30 daqiqa davomida ivishiga ruxsat berildi va keyin 10 daqiqa davomida 1300 xg da aylantirildi. Sarum olib tashlandi va 1,5 ml Eppendorf naychalariga joylashtirildi, muzlatib qo'yildi va sinovgacha -80 daraja Selsiyda saqlanadi. Fekal siydik kislotasi WT va Clec12-/- sichqonlaridan yangi najas granulalarini olish orqali amalga oshirildi. Granulalar tortildi va qayd etildi, so'ngra 1 ml 1x reaktsiya tamponida pyure qilindi. Jismoniy ezilgandan so'ng, katta qoldiqlarni olib tashlash uchun quvurlar 50 xg da 5 daqiqa davomida aylantirildi. Qolgan najasli atala siydik kislotasi uchun tahlil qilindi.

T-hujayra o'tkazish eksperimental kolit

WT taloqlari ajratilgan va 10% homila sigir zardobi, penitsillin va streptomitsinni o'z ichiga olgan RPMIda pyure qilingan. Hujayralarni ajratish uchun hujayralar 367 xg da aylantirildi. Olingan pellet 1x qizil qon tanachalari lizis tamponida 5 daqiqa davomida qorong'ida, xona haroratida to'xtatildi. Keyin hosil bo'lgan oq qon hujayralari CD4+ T-hujayralarini ajratish uchun Miltenyi CD4+ MACS ustunidan o'tkazildi. Keyin T-hujayralari CD4 va CDRB bilan bo'yalgan va FACS Aria Fusion (BD Biosciences) da saralangan. CD4+ CDRBhi hujayralari to'plangan va TCRb-/- yoki TCRb-/- ga yuborilgan; Clec12a-/- sichqonlar intraperitoneal (IP). Har bir sichqoncha 5 x 105 hujayra oldi. Kolitning og'irligi va rivojlanishi har hafta vazn yo'qotishni baholash orqali kuzatildi. Eksperimental yakuniy nuqtada MLN va yo'g'on ichaklar olib tashlandi va kasallikning og'irligini baholash uchun yo'g'on ichaklar ko'richakdan to'g'ri ichakgacha o'lchandi.

Yo'g'on ichakning lamina propriasidan leykotsitlarni ajratish

Murin yo'g'on ichaklari o'rib olindi va muz ustidagi 6-quduq plastinkalarida 1X PBSga joylashtirildi. Ko'zga ko'rinadigan yog 'va biriktiruvchi to'qimalar olib tashlandi va ko'richak yo'g'on ichakdan kesildi. Yo'g'on ichaklar ochilib, 6- quduq plastinkasiga qayta joylashtirilgunga qadar yo'g'on ichakdan shilliq va najas ehtiyotkorlik bilan olib tashlandi. Barcha yo'g'on ichaklarni yoyib, qirib tashlangandan so'ng, har bir yo'g'on ichak pichoq bilan petri idishi qopqog'ida kubiklarga bo'linib, alohida 5{32}} mL naychaga solingan. 1{35}} ml oldindan qizdirilgan dissotsiatsiya eritmasi (1X HBSS, Ca+ va Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES va 30 mM EDTA) qo'shildi va naychalar qisqa vaqt ichida vortekslandi. Yo'g'on ichak taxminan 25 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. 37 gradusda 150 aylanish tezligida silkitib, eritmalar IEC ajralishidan loyqa holga kelguncha. Namunalar 3 marta chayqatildi va 15 soniya davomida vortekslandi, so'ngra IEC kabi immunitetga ega bo'lmagan hujayralarni olib tashlash uchun 50 ml konusning ustiga 100 mM filtr ustiga quyildi va filtrlar 2 ml muzli 1X PBS bilan qisqa vaqt davomida yuvildi. Qolgan to'qimalar filtrda forseps bilan yig'ildi va yangi 50 ml konusga o'tkazildi. 15 ml oldindan isitiladigan hazm qilish eritmasi (Ca+ va Mg bilan 1X HBSS, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, cat # 4942078001], 0,5 mg/ml DNKaz I [Worthington Biochemical, cat # 902] va 0,5 mg/ml kollagenaza D [Millipore-Sigma, cat # 11088866001]) qo'shildi, namunalar qisqa vaqt ichida vortekslandi va keyin 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. 37 daraja haroratda 150 aylanish tezligida yoki eritma bulutli bo'lgunga qadar chayqatiladi. Keyin namunalar 3 marta chayqatiladi va 15 soniya davomida vortekslanadi. Qolgan immunitetli cLP hujayralarini to'plash uchun hazm qilingan to'qimalar 10 ml 1X PBS o'z ichiga olgan 50 ml konussimon naychadagi 40 mM filtr ustiga quyiladi. Namunalar keyin yuviladi va 2 ml muzli 1X PBS bilan filtrlanadi va 800 xg da 10 daqiqa davomida 4 darajada aylantiriladi. Keyinchalik, supernatant olib tashlandi va vakuum bilan tashlanadi. Keyin hujayralar 500 ml to'liq RPMIda qayta suspenziya qilindi va Tripan ko'k eksklyuziv binoni bilan hisoblandi.

Oqim sitometriyasi

CLP dan ajratilgan leykotsitlar yashovchanlik uchun zombi bo'yoq 510 (AmCyan) yordamida 10 daqiqa davomida RT da qorong'uda bo'yalgan. Keyin namunalar Fc retseptorlari CD-16/32 bilan 20 daqiqa davomida 4 daraja qorong'ilikda bloklandi. 5 daqiqa davomida 367 xg da aylantirilgandan so'ng, dekantatsiya qilingan hujayralar 30 daqiqa davomida qorong'i joyda 4 daraja bo'yalgan. Barcha antikorlar, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, 1:250 nisbatda suyultirilganda ishlatilgan. Myleloid paneli CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR{37}}APC (hujayra ichidagi, 1:50). T-hujayralari quyidagilar bilan ajralib turardi: Zombie bo'yoq 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (hujayra ichidagi 1:50), IL{{ 50}}PE (hujayra ichidagi 1:50), IFN-g (BV605) (hujayra ichidagi 1:50), RORgt-PE610 (hujayra ichidagi 1:50), IL{61}}A-BV785 (hujayra ichidagi 1:50). Bo'yashdan so'ng, hujayralar har biri 5 daqiqadan 2 marta kolonnali tampon bilan yuvildi (1X HBSS, Ca2+, Mg{2+ va HEPES, EDTA, FBS). Hujayralar, agar hujayra ichidagi bo'yash kerak bo'lmasa, 2% PFA bilan O / N o'rnatildi va oqim sitometrida ishlashdan oldin 2X ustunli buferda yuvildi. Agar hujayra ichidagi bo'yash zarur bo'lsa, FoxP3 / Transkripsiya faktorining bo'yash buferi to'plami (Tonbo Biosciences) va protokoliga rioya qilingan. Keyin barcha namunalar 300 ul kolonnali buferda qayta suspenziya qilindi va UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) bilan kompensatsiyalangandan va bitta dog 'boshqaruvidan foydalangandan so'ng BD LSR Fortessa da ishladi.

IgA bo'yash bakteriyalari

Bakteriyalar har ml HBSS uchun 100 mg najas konsentratsiyasida HBSS w/ Ca2+ va Mg2+ ichiga maydalash orqali najas granulalaridan ajratilgan. Keyinchalik katta qoldiqlarni olib tashlash uchun pyure najas 50 xg da 5 daqiqa davomida aylantirildi. Supernatant olib tashlandi va yangi naychaga joylashtirildi. Keyin u 8000 xg da 5 minut davomida aylantirilib, bakteriyalarni pellet qildi. Supernatant olib tashlandi va granulalar HBSS w/ Ca{2+ va Mg2+ bilan yuvildi. Nihoyat, granulalar HBSSda 100mg/ml konsentratsiyada qayta suspenziya qilindi va uning 10uL 96-quduq plastinkasiga joylashtirildi va HBSS w/ Ca2+ va Mg2+ bilan bloklandi. RT da 20 daqiqa davomida 10% FBS. Keyin 100uL anti-IgA (PE) to'g'ridan-to'g'ri namunaga qo'shildi va qorong'ida 4 C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar HBSS+FBS eritmasida 2 marta yuvildi va oxirgi marta HBSS+1x Sybr®-green da qayta suspenziya qilindi va RT da qorong'i joyda 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilish uchun ruxsat berildi. Keyin namunalar to'g'ridan-to'g'ri oqim sitometrida o'qildi.

Suyak iligi izolyatsiyasi

Yuqorida aytib o'tilganidek, suyak iligi izolyatsiya qilingan. Qisqacha aytganda, C57Bl/6 Wild turi yoki Clec12a-/- hayvonlarining uzun suyaklari chiqarib olingan va qog'oz sochiq bilan yumshoq ishqalanish orqali tozalangan. Hayvonlarni qayta ishlash paytida toza suyaklar muz ustida saqlangan. Suyaklarning uchlari ilik paydo bo'lishi uchun biroz qirqilgan. Suyak 18 g igna bilan teshilgan 0,5 ml Eppendorf trubasiga (ochilgan uchi pastga qaragan holda) kiritildi. Keyin bu 0.5 ml Eppendorf trubkasi 1,5 ml Eppendorf trubasiga joylashtirildi va 13,000 x g tezlikda 1 daqiqa davomida aylantirildi. Suyak iligi orqali aylantirilgandan so'ng, ishlab chiqaruvchi tavsiyalariga ko'ra, RBC-lizis buferi (Biolegend) yordamida RBC-lizis qilindi. RBC lizisidan so'ng hujayralar to'liq Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ni o'z ichiga olgan: 10% FBS, 1mg/ml Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x muhim bo'lmagan aminokislotalar, 1mM natriy piruvatida qayta suspenziya qilindi. Keyin hujayralar pellet hujayralari uchun 367 xg da besh daqiqa davomida aylantirildi. Izolyatsiya qilingan hujayralar keyinchalik BMDMlarni ishlab chiqish yoki monositlarni yanada izolyatsiya qilish uchun ishlatilgan.

Suyak iligidan olingan makrofaglar

Leykotsitlar suyak iligi izolyatsiyasidan ajratilgan, to'liq DMEMda to'xtatilgan va gemositometrda tripan ko'k istisno bo'yash orqali hisoblangan. Hujayralar to'qima madaniyati bilan ishlangan 10 sm idishlarga 5-8 x 106 hujayra/plastinka konsentratsiyasida 10 ml to'liq muhit + M-CSF (20ng / ml) ichida qo'yildi. Yangi media, jumladan M-CSF 4-kun va 7-kunlari mavjud mediaga qoʻshildi. Toʻliq farqlangan BMDMlar 7-9 kunlar oraligʻida eksperimental foydalanish uchun ishlatilgan.

Monotsitlar izolyatsiyasi

Suyak iligi yuqorida aytib o'tilganidek, WT va Clec12a-/- hayvonlardan olingan. Monotsitlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq monositlarni izolyatsiya qilish to'plami (BM), sichqoncha (Miltenyi Biotec) va LS MACS ustuni bilan ajratilgan.

F. rodentium BMDM ko-kulturasi va RNKseq

F. rodentium kulturalari OD 600nm (1 OD 600nm=1 x 10^8 hujayra/ml yordamida) bilan hisoblangan, steril PBSda 2 marta yuvilgan va 1 x 106 hujayra/ml toʻliq differensiallangan BMDMlar bilan birgalikda oʻstirilgan. MOI 10 6-quduq toʻqima madaniyati plastinkalarida. 24 soatlik hamkorlikdan so‘ng media to‘plandi va keyingi foydalanishgacha -20 C da saqlanadi. BMDMlar sovuq, steril PBS, 2x bilan yuvilgan. Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNK-stabilizatsiya reagenti to'g'ridan-to'g'ri har bir quduqqa qo'shildi. Quduqlar 1,5 Eppendorf naychalariga yig'ilgan hujayra qirg'ichlari bilan qirib tashlandi va RNK ekstraktsiyasigacha -20 darajada muzlatildi. RNK ekstraktsiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Direct-zol RNK miniprep to'plami (Zymo Research cat # R2070) yordamida amalga oshirildi va Huntsman Saraton Instituti yuqori o'tkazuvchanlik genomikasi yadro qurilmasi tomonidan tayyorlangan ketma-ketlik kutubxonalari. Namunalardan rRNKni kamaytirish uchun birinchi marta umumiy RNK NEBNext rRNK Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400) bilan gibridlangan. Tarmoqli RNK ketma-ketlik kutubxonalari Illumina uchun NEBNext Ultra II Directional RNK Library Prep Kit (NEB, cat# E7760L) yordamida tayyorlangan. Tozalangan kutubxonalar D1000 ScreenTape tahlili (Agilent, cat# 5067-5582 va 5067-5583) yordamida Agilent Technologies 4150 TapeStation tizimida malakaga ega boʻldi. Adapter bilan o'zgartirilgan molekulalarning molyarligi Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, cat # 07960140001) yordamida miqdoriy PCR bilan aniqlangan. Individual kutubxonalar Illumina ketma-ketligi tahliliga tayyorgarlik ko'rish uchun 5 nM ga normallashtirildi va NovaSeq 6000 da juftlashtirilgan 150-sikl ketma-ketligi bilan ketma-ketlashtirildi.

Sitokin tahlili

BMDM yuqorida tavsiflanganidek izolyatsiya qilingan va o'stirilgan. To'liq differentsiatsiyalangan BMDM'lar 12-quduq to'qima madaniyati plitalarida 1 x 105 hujayra/quduqqa qo'yilgan. BMDMlar 100ng / ml LPS bilan rag'batlantirildi; 1 ug/ml Pam3Cysk; yoki 1ug/ml flagellin. Hujayralar 24 soat davomida rag'batlantirildi, media to'plandi va tahlil qilish uchun -20 C da saqlanadi. Sitokinlar LEGENDplex™ Sichqoncha yallig'lanish paneli (13-plex) bilan tahlil qilindi (Biolegend, cat# 740150). Ma'lumotlar LEGENDplex™ ma'lumotlarni tahlil qilish dasturi yordamida tahlil qilindi.

16s rRNK genini tartiblash

Alohida sichqonlardan najas granulalari yoki yonbosh ichak tarkibi to'plangan va 250 mg 0,15 mm granat boncuklari (MoBio, cat# {{5) bo'lgan 2 ml hajmli vintli qopqoqli naychalarda {0}} darajada darhol muzlatilgan. }}). DNK Power Fecal DNK Isolation Kit (MoBio yoki QIAGEN) yordamida ekstraksiya qilingan va toʻplam yoʻriqnomasiga koʻra, Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products) da 4 daraja munchoq urishning 1 daqiqali 2 tsiklini oʻz ichiga olgan. 16S rRNK genining V3 va V4 hududlari V3/4 mintaqasi 16S rRNK geni nishonga olish ketma-ketligini (3' dan 5' gacha tasvirlangan) o'z ichiga olgan primerlar yordamida PCRning bir bosqichi bilan kuchaytirildi, undan keyin nukleotid yostig'i 2- Illumina primer ketma-ketligi, 8- nukleotid indeksi ketma-ketligi va qolgan Illumina adapter ketma-ketligi boʻyicha. V3/{23}}S-maqsadli ketma-ketliklar Takaxashidan (Takahashi va boshq., 2014), indekslar esa Kozichdan (Kozich va boshq., 2013) olingan. Ishlatilgan oligonukleotidlarning toʻliq ketma-ketligi (indekslar Xs bilan belgilangan): Prok16SV34_uchun: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Vahiy: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. PCR tsiklining shartlari quyidagicha edi: 2 daqiqa davomida 98 daraja boshlang'ich denatürasyon; 20 sek 98 daraja denatürasyon, 20 soniya 51,5 daraja tavlanish, 20 soniya 72 daraja kengaytmaning 26 tsikli; va 2 daqiqaga bitta yakuniy 72 daraja kengaytma. Har bir PCR (har bir namuna uchun uch nusxada amalga oshiriladi) Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, cat# M0492L), har bir primerdan 5 pmol va 50 ng shablon DNK yordamida 25 ul hajmda amalga oshirildi. Kuchaytirilgandan so'ng, har bir namunadan uch nusxadagi PCRlar birlashtirildi, kuchaytirishni tasdiqlash uchun 5 ul agaroz jelida ishlatildi va qolgan hajm Axygen AxyPrep MAG PCR tozalash boncuklari (Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53) yordamida tozalandi. }}) imtiyozli ketma-ketlikda bo'ladigan har qanday primer dimerni samarali ravishda olib tashlash uchun suvda 62,5% gacha suyultiriladi. Suyultirilgan boncuklar PCR reaktsiyalarining 1,8X hajmiga qo'shildi, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq tozalandi va tozalangan amplikonlar 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,0 bilan elutildi. So‘ngra amplikonlar mikroplata o‘quvchida piko-yashil dsDNK tahlili (ThermoFisher, mushuk #P11495) yordamida miqdori aniqlandi, so‘ngra tozalangan va indekslangan individual ketma-ketlik kutubxonalari teng ravishda ko‘paytirildi (ng DNK bo‘yicha) va Illumina MiSeq asbobida juftlashgan uchida ketma-ketlashtirildi. Huntsman Saraton Institutining Yuqori ishlab chiqarish genomikasi umumiy resurs ob'ektida 300 tsikl rejimi.

Bioinformatika ketma-ketlik ma'lumotlarini qayta ishlash

16S rRNK geni xom o'qishlari demultiplekslashtirildi, bu indekslarda 0 nomuvofiqlikka imkon berdi, keyin biz ilgari tasvirlab berganimizdek QIIME2 (Bolyen va boshq., 2019) doirasida qayta ishlandi va tahlil qilindi (Stephens va boshq., 2021). Qisqacha aytganda, demultiplekslangan va sifatli filtrlangan ketma-ketliklar avval Cutadapt plagini bilan primer va bog'lovchi ketma-ketliklardan kesilgan, keyin DADA2 bilan noaniq qilingan (Callahan va boshq., 2016; Martin, 2011). Keyinchalik taksonomiyalar ASV-larga xususiyat-klassifikator plaginidagi tasniflash usuli bilan, kuchaytirilgan V3/4 hududiga kesilgan GTDB mos yozuvlar to'plamiga (release89) qarshi tayinlangan va fit-klassifikator-naive-bayes usuli bilan o'qitilgan (Bokulich va boshq. , 2018; Parks va boshqalar, 2018; Pedregosa va boshqalar, 2011). Xilma-xillik ko'rsatkichlari, masofalar va beta xilma-xillik guruhlarining statistik ahamiyati QIIME2 doirasida hisoblab chiqilgan (Anderson, 2001).

BMDM larning RNK-seq uchun xom o'qishlar birinchi sifatli va adapter yordamida kesilgan, so'ngra transkript soni Salmon yordamida GRCm38 (mm10) yig'ilishidan olingan transkriptomga nisbatan miqdoriy aniqlangan (Patro va boshq., 2{{ 16}}17). Transkript darajasidagi miqdorlar vaqt paketidan foydalangan holda R ga o'qildi va "~ Genotip + Davolanish + Genotip: Davolash" dizayn formulasidan foydalangan holda DESeq2 bilan differentsial ekspressiya tahlilidan oldin genlar darajasini hisoblash uchun umumlashtirildi (Love va boshq., 2014; Love va boshq., 2020). F. rodentiumga differensial javoblar har bir genotipning tirik F. rodentium bilan davolashga boʻlgan munosabati oʻrtasidagi tafovutni transport vositasi bilan ishlangan hujayralar orqali ifodalagan. Sezilarli darajada differentsial ifodalangan genlar p-qiymati < 0,05 va log2 marta o'zgarishi > |0,58| (1,5 marta o'zgartirish). Keyinchalik klasterProfiler to'plamidan foydalangan holda gen ontologiyasi (GO) atamalarini boyitishni sinab ko'rish uchun sezilarli darajada pastga va yuqori tartibga solinadigan genlar ro'yxati ishlatilgan, shu jumladan GO terminlarining ortiqchaligini kamaytirish va asosiy biologik jarayonlarni aniqlash uchun soddalashtirish funktsiyasi (S, 2020; Wu va boshq. ., 2021).

F. rodentium DSS chaqiruvi

F. rodentium avval tavsiflanganidek o'stirildi va steril PBSda 1 x 109 CFU/ml gacha miqdori aniqlandi. F. rodentium birinchi marta steril PBSda 2 marta yuvish va keyin 1 ml 10% Fomalin-PBSda 10 daqiqa davomida qayta suspenziya qilish orqali o'rnatildi. Keyin hujayralar og'iz gavajiga tayyorlash uchun 10 ml steril PBSda yana ikki marta yuvildi. Non-fiksatsiyalangan hujayralar kabi yuviladi va gavaj qadar muz ustida saqlanadi. WT C57BL/6 SPF sichqonlari og'iz orqali 100 uL tarkibida PBS (avtomobil), F. rodentium (jonli) yoki F. rodentium (fiksatsiyalangan) bo'lgan eritma bilan og'iz orqali o'lchandi. -3 kundan 10 kungacha hayvonlarga 3,0% berildi. 0-7 kunlarida DSS; toza DSS suv har kuni almashtirildi. 20% dan ortiq vazn yo'qotish uchun jiddiylik chegarasi jiddiylik chegarasi sifatida belgilandi. Eksperimental so'nggi nuqtalarda MLN va yo'g'on ichak olib tashlandi. Uzunligini aniqlash uchun yo'g'on ichak ko'richakdan to'g'ri ichakgacha o'lchandi. Keyin to'qimalar gistologiya, RNK ekstraktsiyasi yoki oqim sitometrik tahlili uchun qayta ishlandi.

Fagotsitoz tahlili

Peritoneal makrofaglar qorin bo'shlig'iga 5 ml steril PBS yuborish orqali ajratildi. PBS har bir necha soniya ichida bo'shliqda muloyimlik bilan qo'zg'atildi. 2 daqiqadan so'ng, PBS 28 kalibrli igna yordamida tortib olindi va sovuq to'liq DMEMga yuborildi. Hujayralar 367 xg da aylantirildi va to'liq muhitda yuvildi. Keyin hujayralar gemositometr bilan hisoblab chiqildi va 2,5 x 105 hujayra/ml konsentratsiyada 12-quduq to'qima madaniyati plitalariga joylashtirildi. Hujayralar bir kechada yopishishiga ruxsat berildi. Ertasi kuni quduqlar aylantirilib, muloyimlik bilan aralashtirildi va muhit aspiratsiya qilindi. Keyin yopishgan hujayralar 500uL sovuq, steril, PBS bilan ikki marta yuvildi. 10 MOIda F. rodentiumni o'z ichiga olgan oldindan qizdirilgan to'liq DMEM keyin yopishtiruvchi (makrofaglar) ga qo'shildi. Keyin plitalar 200 xg da, xona haroratida uch daqiqa davomida yumshoq aylantirildi va keyin standart hujayra madaniyati sharoitida (37 C, 5% CO2) 90 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. F. rodentium faqat RNK ketma-ketligi uchun BMDMlarni birgalikda etishtirish uchun ta'riflanganidek tayyorlangan, yuvinishdan keyin hujayralar RT da 20 daqiqa davomida 1x Sybr® yashil rangda (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) qayta suspenziya qilingan. Keyin bakterial hujayralar 4000 rpm tezlikda 5 daqiqa davomida to'liq DMEM bilan qayta suspenziya qilingan va peritoneal makrofaglar uchun oldindan qizdirilgan. 90 daqiqalik hamkorlikdan so'ng, muhit aspiratsiya qilindi va hujayralar ikki marta sovuq, steril, PBS bilan yuvildi. Sybr® yashil bo'yalgan F. rodentium o'z ichiga olgan yopishgan hujayralar 10 daqiqa davomida 2% paraformaldegid (PFA) bilan mahkamlangan. PFA aspiratsiya qilindi va steril PBS hujayralarga joylashtirildi. Keyin hujayralar F. rodentiumning fagotsitozi uchun tasvirlangan

Makrofag tasvirini tahlil qilish

F. rodentium bilan ishlov berilgan makrofag madaniyatlarining yorqin va lyuminestsent tasvirlari EVOS m7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) yordamida olingan. Har bir madaniyat uchun uchdan beshtagacha alohida tasodifiy tasvirlar olindi, ular uch nusxada amalga oshirildi.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc termoyadroviy oqsil qurilishi ava tozalashyoqilgan

Sichqoncha Clec12a ning hujayradan tashqari domenlarini kodlovchi cDNKlar C57Bl/6 WT SPF suyak iligidan ajratilgan oq qon hujayralaridan PCR orqali kuchaytirildi va ketma-ketlik bilan tasdiqlandi. cDNKlar pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen) ifoda vektorida inson IgG1-Fc ning C terminali bilan birlashtirilgan. Clec12a yoki bo'sh vektorni o'z ichiga olgan konstruktsiyalar DMEM +10% FBS va Pen/strep (1mg/ml) bilan yetishtirilgan Lx293 hujayralariga transfektsiya qilindi. Yashirin sintezlangan oqsillar transfeksiyadan keyin 24-48 muhitdan olingan. Chiqindilarni/o'lik hujayralarni olib tashlash uchun media 367 xg da 5 daqiqa davomida aylantirildi va supernatant ishlatilgunga qadar -20 C da muzlatildi. Clec12a-Fc yoki faqat Fc termoyadroviy oqsillari Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific, Katalog raqami: 88804) bilan ajratilgan, Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Katalog raqami: 2227) bilan miqdori aniqlangan. va antiClec12a antikori (Novus Biologicals NBP2-27346SS) yordamida western blot bilan tasdiqlangan.

Clec12a-Fc-bog'lanish tahlili

Tozalangan konstruksiyalar HBSS w/ Ca2+ va Mg2+ tarkibida 0,4 mg/ml gacha suyultirildi. Bakteriyalar tegishli muhitda va aerob sharoitda o'stirildi va OD 600nm bilan normallashtirildi. Bakteriyalar HBSS w/ Ca2+ va Mg2+ bilan yuvildi va RTda 20 daqiqa davomida HBSS w/ Ca{{2+ va Mg2+ +10% FBS bilan bloklandi. Barcha binoni jarayonlari atmosfera sharoitida amalga oshirildi. 1 x 107 bakteriya xujayrasi dumaloq tubi 96-quduq plastinkasiga joylashtirildi, 3,000 xg da aylantirildi va dekanatsiya qilindi. 50uL konstruktsiyalar bakteriya hujayralariga joylashtirildi, muloyimlik bilan aralashtirildi va 1 soat davomida 4 ° C da inkubatsiya qilindi. Bakteriya hujayralari HBSS w/ Ca2+ va Mg2+ + 10% FBS, 2x bilan yuvildi. 50uL echki antiinson Fc (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) hujayralarga qo'shildi va qorong'i joyda 4 C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar avvalgidek yuvildi va tarkibida 1x Sybr® yashil (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) bo'lgan HBSS w/ Ca2+ va Mg2+ ga joylashtirildi. Hujayralar RT da qorong'ida 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va darhol BD LSR Fortessa oqim sitometrida o'qildi.

Nurlanish va suyak iligini qayta tiklash

Suyak iligi yuqorida aytib o'tilganidek, WT va Clec12a-/- hayvonlardan olingan. Qabul qilingan qabul qiluvchi sichqonlar -1-kuni 5{6}}0 Rad bilan halokatli nurlanishdi, keyin esa 0-kuni 400 Rad. Steril PBS (1 x 108 hujayra / ml) da to'xtatilgan suyak iligi hujayralari 28,5 o'lchovli igna orqali retro-orbital bo'shliqqa etkazilgan. Biz mikrobiota bilan qiziqdik, shuning uchun hayvonlar antibiotiklarga joylashtirilmadi va 8 haftadan so'ng mikrobiotani GF hayvonlariga o'tkazish uchun najas granulalari yig'ildi.

ADABIYOTLAR

Anderson, MJ (2001). Parametrik bo'lmagan ko'p o'lchovli dispersiyani tahlil qilishning yangi usuli. Avstraliya ekol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ va boshqalar. (2015). Crohn kasalligi xavfi variantining integratsiyalangan genomikasi

CLEC12A ning antibakterial otofagiyadagi rolini aniqlaydi. Hujayra vakili 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF va Artis, D. (2017). Yallig'lanishni mikrobiotaning uy egasi bilan o'zaro ta'siri bilan tartibga solish. Nat. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA va Caporaso, JG (2018). QIIME 2 ''sq2- xususiyat-klassifikator plagini yordamida marker-gen amplikon ketma-ketliklarining taksonomik tasnifini optimallashtirish. Mikrobioma 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Aleksandr, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F. va boshqalar. (2019). QIIME yordamida takrorlanadigan, interaktiv, kengaytiriladigan va kengaytiriladigan mikrobioma ma'lumotlar fani 2. Nat. Biotexnologiya. 37, 852-857. 10,1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA, and Whitehead, L. (2018). Immunitet va gomeostazda C tipidagi lektinlar. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/s41577-018-0004-8.

Braun, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Nevill, BA, Stares, MD, Goulding, D. va Lawley, TD (2016). "Madaniyatsiz" inson mikrobiotasini etishtirish yangi taksonlar va keng sporulyatsiyani ochib beradi. Tabiat 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., va boshqalar. (2008). Sichqoncha va inson ichak Paneth hujayralarida otofagiya va otofagiya geni Atg16l1 uchun asosiy rol. Tabiat 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Kallaxan, BJ, Makmurdi, PJ, Rosen, MJ, Xan, AW, Jonson, AJA va Xolms, SP (2016). DADA2: Illumina amplikon ma'lumotlaridan yuqori aniqlikdagi namuna xulosasi. Nat. 13-usul, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., and Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium eozinofilga bog'liq ichak epitelial gomeostazini boshqarish uchun retinoik kislota signalizatsiyasini o'zgartiradi. Hujayra xosti va mikrob 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhi, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Li, HK va Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. noyabr, sp. nov., laboratoriya sichqonchasining najasidan ajratilgan. Antoni Van Leuvenguk 108, 1309-1318. 10,1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., va boshqalar. (2017). Ichak mikobiotasi a'zosi sichqonlarda kolitni kuchaytiradigan purin almashinuvini modulyatsiya qiladi. Sci. Tarjima. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J. va Chiffoleau, E. (2020). C tipidagi lektinga o'xshash retseptorlar: hujayra o'limiga qarshi immunitetda bosh yoki quyruq. Old. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H. va Zoetendal, EG (2021). Ichak mikrobiomasining barqarorligi va chidamliligi: ichak salomatligini modulyatsiya qilish uchun buzilishlarga javobni tushuntirish. Ichak 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. va Eliopoulos, AG (2014). Yallig'lanishli ichak kasalliklarining sichqoncha modellarida ichak mikrobiotasi. Hujayra va infektsiya mikrobiologiyasidagi chegaralar 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Xan, YM, Chjan, MH, Li, N., Chen, TY, Chjan, Y., Wan, T. va Cao, XT (2004). KLRL1, yangi qotil hujayrali lektinga o'xshash retseptor, tabiiy qotil hujayra sitotoksikligini inhibe qiladi. Qon 104, 2858-2866. DOI 10.1182/qon-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., va boshqalar. (2012). Kommensal zamburug'lar va C tipidagi lektin retseptorlari Dectin{2}} o'rtasidagi o'zaro ta'sir kolitga ta'sir qiladi. Fan 336, 1314-1317. 10.1126/science.1221789.

Jeyson L. Kubinak, WZS, Rey Soto, Charisse Petersen, Tayson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rikkesha Bel1, Nadim J. Ajami, Jozef F. Petrosino, Linda Morrison4, Ueyn K. Potts, Piter E. Jensen, Rayan M. O' Konnel va Iyun L. Raund (2015). MHC o'zgarishi ichak infektsiyasiga moyillikni nazorat qiluvchi individual mikrobial jamoalarni shakllantiradi. Tabiat bilan aloqa. 0.1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. va Rok, KL (2010). Urik kislotasi sichqonlarda steril hujayralar o'limiga o'tkir yallig'lanish reaktsiyasini kuchaytiradi. J. Klin. Invest. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK va Schloss, PD (2013). MiSeq Illumina Sequencing Platformasida Amplikon ketma-ketligi ma'lumotlarini tahlil qilish uchun ikki indeksli ketma-ketlik strategiyasini va kuratsiya quvurini ishlab chiqish. Amaliy va atrof-muhit mikrobiologiyasi 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM va Round, JL (2015). T hujayralarida MyD88 signalizatsiyasi salomatlikni yaxshilash uchun mikrobiotani IgA vositachiligida nazorat qiladi. Cell Host Microbe 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS, and Ruland, J. (2019). Siydik kislotasi kristalli retseptorlari Clec12A I turdagi interferon reaktsiyalarini kuchaytiradi. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Li, JC, Jostins, L., Shah, T., va boshqalar. . (2015). Assotsiatsiya tahlillari yallig'lanishli ichak kasalliklari uchun 38 ta sezuvchanlik joylarini aniqlaydi va populyatsiyalar bo'ylab umumiy genetik xavfni ta'kidlaydi. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. va Anders, S. (2014). DESeq2 yordamida RNK-seq ma'lumotlari uchun qatlam o'zgarishi va dispersiyani o'rtacha baholash. Genom Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Sevgi, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Jonson, LK, Pirs, NT, Shepherd, L., Morgan, M. va Patro, R. (2020). Tximeta: RNK-seqda kelib chiqishni aniqlash uchun mos yozuvlar ketma-ketligi nazorat yig'indisi. Plos Hisoblash Biologiyasi 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC va Casadeval, A. (2005). Fc-va komplement-retseptorlarining faollashuvi makrofag hujayralarining hujayra siklining G1 dan SJ Immunolga o'tishini rag'batlantiradi. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H. va Zinkernagel, RM (2000). Ichak shilliq qavati IgA ning kommensal bakteriyalarga javob berishning ibtidoiy T hujayradan mustaqil mexanizmi. Fan 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH va Lepenies, B. (2014). C tipidagi lektin retseptorlarini bog'laydigan uglevodlarni va ularning hujayralarga xos maqsadli yo'naltirish va immun modulyatsiyasi uchun potentsialini tekshirish uchun platforma. Nazorat ostidagi nashr jurnali 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Uilyams, DL, Gordon, S. va Braun, GD (2004). Asosan granulotsitlar va monotsitlarda ifodalangan yangi odamning miyeloid inhibitori c-tipli lektinga o'xshash retseptorini (MICL) aniqlash va tavsiflash. J. Biol. Kimyo. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). Cutadapt adapter ketma-ketligini yuqori o'tkazuvchanlikdagi ketma-ketlikni o'qishdan olib tashlaydi. EMBNet.journal 17. Martines-Lopes, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP va boshqalar. (2019). Dendritik hujayralardagi Mincle-Syk o'qi orqali mikrobiotani aniqlash interleykin-17 va -22 ishlab chiqarishni tartibga soladi va ichak to'sig'ining yaxlitligini rag'batlantiradi. Immunitet 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A. va Tschopp, J. (2006). Gut bilan bog'liq siydik kislotasi kristallari NALP3 yallig'lanishini faollashtiradi. Tabiat 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., va boshqalar. (2018). IgA bakteriyalar o'rtasidagi simbiozni rag'batlantirish orqali ichak mikrobiotasining tarkibi va metabolik funktsiyasini tartibga soladi. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , va boshqalar. (2014). Clec12a siydik kislotasi kristallari uchun inhibitiv retseptor bo'lib, hujayra o'limiga javoban yallig'lanishni tartibga soladi. Immunitet 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Xasegava, M., Nakamura, T., Kurosava, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E. va boshqalar. al. (2016). Yuqori yaqinlikdagi monoklonal IgA ichak mikrobiotasini tartibga soladi va sichqonlarda kolitning oldini oladi. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O. va Slack, E. (2020). IgA va ichak mikrobiotasi: o'ziga xos bo'lishning ahamiyati. Shilliq qavat immunol. 13, 12-21. 10,1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA va Hugenholtz, P. (2018). Genom filogeniyasiga asoslangan standartlashtirilgan bakterial taksonomiya hayot daraxtini sezilarli darajada qayta ko'rib chiqadi. Nat. Biotexnologiya. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA va Kingsford, C. (2017). Qizil ikra transkript ifodasining tez va noto'g'ri miqdorini aniqlash imkonini beradi. Nat. 14-usul, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Mishel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., va boshqalar. (2011). Scikit-learn: Python-da mashinani o'rganish. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR va Brawn, GD (2008). Sichqoncha MICL (CLEC12A) ning xarakteristikasi va endogen ligand uchun dalillar. Yevro. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., va boshqalar. (2019). C tipidagi lektin retseptorlari CLEC12A plazmodial gemozoinni taniydi va miya bezgagi rivojlanishiga hissa qo'shadi. Hujayra vakili 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Rey, A. va Dittel, BN (2015). Immunitet tanqisligi va kolitning kasallik penetratsiyasi tufayli ichak mikrobiotasidagi disbiyoz o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik. Immunologiya 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA va boshqalar. (2016). MICL revmatoid artritda yallig'lanishni nazorat qiladi. Ann. Reum. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.