Cistanche Tubulosa dan xalkon sintazasini klonlash, funktsional identifikatsiyalash va ekspression tahlili
Mar 22, 2024
Xulosa: Maqsad
Funktsiyani o'rganishCistanche tubulosa dan xalkon sintazava oq, qizil va binafsha gullarda CtCHS genining ifoda namunasi.
UsullariCtCHS geni RT-PCR yordamida klonlandi va bioinformatika tahlili o'tkazildi. PET{1}}a-CtCHS plazmidi IPTG orqali oqsil ifodasini qo'zg'atish uchun ichak tayoqchasiga o'tkazildi. CtCHS rekombinant oqsili p-coumaroyl CoA va malonil CoA substratlari bilan inkubatsiya qilindi va mahsulotlar HPLC va MS tomonidan aniqlandi. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidi CtCHS oqsilining hujayra osti lokalizatsiyasini kuzatish uchun Arabidopsis thaliana protoplastiga o'tkazildi. C. tubulosa gullaridagi CtCHS genining uchta rangdagi ifodasi qRT-PCR yordamida aniqlandi.
NatijalarCtCHS geni klonlandi. Ochiq o'qish ramkasining uzunligi (ORF) 1173 bp bo'lib, 390 aminokislotalarni kodlaydi va oqsilning molekulyar og'irligi 42 8000 edi.
30% EXINAKOSID VA 12% AKTEOSID BILAN ORGANIK SİSTANCHE EKSTRATI
CtCHS tarkibida kalkon sintazasida saqlanib qolgan Cys164, His303, Asn336 katalitik qoldiqlari mavjud edi. CtCHS oqsili E. coli da ifodalangan va rekombinant oqsilni olish uchun tozalangan. CtCHS oqsili naringenin xalkonini ishlab chiqarish uchun p-kumaroil CoA va malonil CoA ni katalizlashi mumkin. CtCHS oqsili asosan sitoplazmada lokalizatsiya qilingan. CtCHS geni binafsha va qizil gullarda yuqori darajada ifodalangan va nisbiy ifoda darajalari oq oq gullarga qaraganda mos ravishda 8,44 va 3,21 baravar yuqori edi.
Xulosa C. tubulosa gulidan CtCHS geni klonlandi va oqsil ifodalandi. CtCHS oqsili kalkon sintaza funktsiyasiga ega va CtCHS genining ifodasi quyuqroq gullarda yuqori bo'ladi, bu CtCHS geni C. tubulosa gul rangini tartibga solishi mumkinligini ko'rsatadi, bu C ning gul rangini tartibga solish mexanizmi bo'yicha keyingi tadqiqotlar uchun asos yaratadi. tubulosa.
Kalit so'zlar: Cistanche tubulosa (Shenk) Vayt; xalkon sintaza; ferment faolligini tahlil qilish; hujayra osti lokalizatsiyasi; ifoda tahlili
Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT - Pyreal o'simligi bo'lib, tabiiy ravishda Shinjonning janubida [1] Shinjonning Xetian hududida [2] tarqalgan. Quvur gullari yuqori dorivor ahamiyatga ega. Uning go'sht poyalari 2020 versiyasining manbalaridan biridir "Xitoy farmakopeyasi". [3] Quvur gullari kordonus go'shti bo'yicha tadqiqotlar ko'paydi, lekin uning gullari bo'yicha biologik tadqiqotlar nisbatan kam. Quvur gullarining gullash davri apreldan maygacha [4], asosan oqning uchta rangi bor. , qizil va binafsha rangli quvur gullari rangga boy, ammo ularning gul rangini tartibga solish mexanizmi haqida xabar berilmagan. va irsiy omillar [5] o'simlik gullari pigmenti asosan uchta toifani o'z ichiga oladi: flavonoidlar, karotin va lavlagi, eng keng tarqalgan Paeonia Lactiflora Pallning uchta navi sifatida.
U oq kabi ko'rinadi va rangning asosiy rangi qizil rangni o'z ichiga oladi va chiroyli kompetentsiya gullarni binafsha rangga aylantiradi - qizil [8]. Gul rangi ko'plab manzarali o'simliklarning muhim xususiyati bo'lib, pushti hasharotlarni o'ziga tortadigan asosiy omildir [9]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, u naslga o'tadi. Hasharotlarning eng ko'p tashrif buyurishi quyuq binafsha rangli sistanche o'simlikidir [10]. Tsitanozavr gullaridagi tsistanoidlarning sintetik genetik tadqiqotlari bo'yicha biologik tadqiqotlar uchun bu kolba gul kordonini bo'yashni boshqarish mexanizmini aniqlashtirish, genetik muhandislik texnologiyasining rangini yaxshilash uchun nazariy asoslarni ta'minlash, uning boy ranglarini targ'ib qilish, ko'rishni oshirish, ilovalar doirasini kengaytirish.
ning biosintetik yo'liflavonoidlarbilan boshlanadifenilpropanoid yo'li. Fenilalanin birinchi navbatda fenilalaninammialaz (PAL) ta'sirida sinnamik kislotaga aylanadi va sinnamik kislota 4-sinnamik kislota bilan gidroksillanadi. Ferment (sinnamik kislota-4-gidroksilaza, C4H) va 4-kumarat koenzim A ligaza (4-kumarat koenzim A ligaza, 4CL) 4-kumaroil-KoA hosil qilish reaksiyasini katalizlaydi. [11]. Bir molekula 4-kumaroil-CoA va uchta molekula malonil-KoA xalkonsintaza (CHS) tomonidan katalizlanib, naringenin xalkonini hosil qiladi.flavonoid birikmalari.Xalkon izomeraza, flavanon{0}}gidroksilaza, dihidroflavonol 4-reduktaza va boshqalarning asosiy skeleti izoflavonlar, flavonollar, antosiyaninlar va boshqalar kabi turli flavonoidlarni hosil qiladi [12]. Flavonoidlarning biosintetik yo'lidagi asosiy ferment sifatida CHS o'simliklardagi flavonoidlarning tarkibini tartibga soladi va o'simlik gullari rangini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi [13]. Masalan, Gentiana scabra Bunge CHS ning transkripsiyadan keyingi genini susaytirishi antosiyaninlarning biosintezini inhibe qilishi va korolla loblarining o'ziga xos oqlanishiga olib kelishi mumkin [14]. Actinidia eriantha Benthning CHS genini o'chirish. CHS gulbarglardagi antosiyanin miqdorini kamaytiradi va qizil gulbarglarning rangi ochroq bo'lishiga olib keladi [15]. Shu sababli, ushbu tadqiqotda CtCHS geni Cistanche deserticola gullaridan klonlandi va unda CtCHS funktsiyasini o'rganish uchun bioinformatika tahlili, prokaryotik ekspressiya va tozalash, ferment faolligi tahlili, subhujayra lokalizatsiyasi tahlili va gullarning uchta rangida ekspresyon tahlili o'tkazildi. oqsil va CtCHS genining ekspresyon modeli CtCHS va Cistanche deserticola gul rangi o'rtasidagi munosabatlarni oldindan o'rganish uchun ishlatilgan, bu Cistanche deserticola gul rangini tartibga solish mexanizmini o'rganish uchun asos yaratdi.
1 Materiallar va asboblar
1.1 Materiallar
Cistanche tuberosa gullari 2018-yilning may oyida Shinjonning Xotan prefekturasining Yutian tumanidan yig‘ilgan. Namuna olishda tasodifiy tamoyilga amal qilingan va yaxshi fiziologik holatga ega va o‘simlik balandligi bir xil bo‘lgan Cistanche tuberosa gullari tanlangan. Pekin universiteti farmatsiya fakulteti professori Tu Pengfey tomonidan oq, qizil va binafsha rangdagi uchta gulli Cistanche deserticolaning uchta shtammi olingan va ular Cistanche tubulosa (Schenk) Wight deb aniqlangan. Ular tezda suyuq azotda muzlatilgan, quruq muzda saqlangan va Pekinga olib ketilgan. E. coli DH5 kimyoviy jihatdan vakolatli hujayralar Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd.dan sotib olindi va E. coli BL21 (DE3) kimyoviy jihatdan vakolatli hujayralar Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.dan sotib olindi; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd kompaniyasidan sotib olingan. Malonil-KoA Sigma kompaniyasidan, 4-kumaroyl-CoA, naringenindan sotib olingan. -kalkon Shanxay Yuanye Biotechnology Co., Ltd.dan, naringenin esa Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.dan sotib olindi.
1.2 Asboblar
Nanodrop 2000C spektrofotometri (Thermo Fisher kompaniyasi, AQSh); gradient PCR asbobi (Eppendorf kompaniyasi, Germaniya); CFX 96 lyuminestsent miqdoriy PCR asbobi, UVP gel tasvirlagichi, gel elektroforez asbobi, oqsil elektroforezi asbobi (BioRad kompaniyasi, AQSh) ;EnSpire
Mikroplata o'quvchi (PerkinElmer kompaniyasi, AQSh); doimiy haroratli inkubator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D katta quvvatli to'liq haroratli osilator (Taicang eksperimental uskunalar fabrikasi); THZ-82Suv hammomi doimiy harorat osilatori (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra toza ish stoli (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); yuqori bosimli bug 'sterilizatori (TOMY kompaniyasi, Yaponiya); Milli Q toza suv asbobi (Millipor, AQSH); LC-20Yuqori samarali suyuqlik fazali xromatograf (Shimadzu kompaniyasi, Yaponiya); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (Thermo Fisher kompaniyasi, AQSh); FV1200 lazerli konfokal mikroskop (Olympus kompaniyasi, Yaponiya).
2 Eksperimental usullar
2.1 RNK ekstraktsiyasi va cDNK sintezi. Cistanche deserticola gullari suyuq azotda maydalangan va keyin RNK ekstraktsiyasi tahliliga duchor bo'lgan.
Jami RNK to'plam (Norgen, Cat 17200) yordamida ekstraksiya qilingan, RNK kontsentratsiyasi va sifati NanoDrop 2000C tomonidan aniqlangan va cDNKning teskari transkripsiya sintezi uchun A260/A280 nisbati 1,8 dan 2,1 gacha bo'lgan RNK namunalari tanlangan. M-MLV teskari transkriptaza (Promega, M170B) malakali umumiy RNKni cDNKga teskari transkripsiya qilish uchun ishlatilgan. Eksperimental operatsiyalar ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi.
2.2 CtCHS genini klonlash
Bizning tadqiqot guruhimizning Cistanche deserticola gullari transkriptomasi [16] maʼlumotlariga asoslanib, toʻliq ochiq oʻqish ramkasi boʻlgan CtCHS skriningdan oʻtkazildi va SnapGene dasturi gen ketma-ketligiga asoslangan maxsus primerlarni loyihalash uchun ishlatilgan (1-jadval). PCR amplifikatsiyasi shablon sifatida Cistanche deserticola gul cDNK yordamida amalga oshirildi. Kuchaytirish tizimi 2×Phanta Max Bufer 25 mkL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 mkl, yuqori va quyi oqim primerlari (10 mkmol/L) har biri 2 mkl, cDNA 2 mkl, Phanta Max Super Fidelity edi.
DNK polimeraza 1 mkl, ddH2O 17 mkl. Reaktsiya shartlari: 3 daqiqa davomida 95 daraja oldindan denatürasyon; 15 soniya davomida 95 daraja denaturatsiyaning 25 tsikli, 15 soniya davomida 55 daraja tavlanish va 1 daqiqa davomida 72 daraja uzaytirish; va reaktsiyani 72 daraja 5 daqiqaga uzaytirish. PCR mahsuloti 1% agaroz gel elektroforezi bilan aniqlandi va DNKni tozalash to'plami (Novizan, Cat DC301-01) gelni qayta tiklash uchun ishlatilgan, so'ngra qayta tiklangan DNK tezkor klonlash to'plami (Novizan, Cat) yordamida tozalangan. C601-01). DNK fragmenti pCE2 TA/Blunt-Zero vektori bilan bog'langan, Escherichia coli DH5 vakolatli hujayralariga aylantirilgan va 37 darajada bir kechada kultivatsiya qilingandan so'ng, bitta klon shtammlari tanlab olingan va ketma-ketlik uchun kompaniyaga yuborilgan.
1-jadval Primer ketma-ketligi
2.3 Bioinformatika tahlili
Proteinning fizik va kimyoviy xususiyatlarini tahlil qilish uchun ProtParam onlayn dasturidan foydalaning; oqsilning gidrofilligi/hidrofobikligini tahlil qilish uchun Prot Scale onlayn vositasidan foydalaning; oqsilning ikkilamchi tuzilishini bashorat qilish uchun onlayn SOPMA vositasidan foydalaning; oqsilning uchinchi darajali tuzilishini bashorat qilish uchun SWISS-MODEL onlayn tahlil dasturidan foydalaning; TMHMM onlayn dasturidan foydalaning Proteinning transmembran tuzilishini taxmin qiling; CtCHS homologiyasini boshqa turlarning CHS aminokislotalar ketma-ketligi bilan solishtirish uchun DNAMAN dasturidan foydalaning; filogenetik daraxtni qurish uchun MEGA-X dasturidan foydalaning, qo'shni qo'shilish (NJ) va Puasson tuzatish yordamida evolyutsiya masofasi Bootstrap usuli yordamida hisoblanadi va Bootstrap takrorlash soni 1000 marta.
Keyinchalik aniqlash uchun UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS ishlatilgan. Suyuq faza sharoitlari Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 ustuni (100 mm × 3.0 mm, 1,7 mkm), ustun harorati 40 daraja, naringenin edi. , xalkon va naringenin. Nazorat qiluvchi moddaning yuklanish hajmi 4 mkl, ferment reaktsiyasi mahsulotining yuklanish hajmi esa 7 mkl. Harakatlanuvchi faza sifatida suv (A)-asetonitril (B) ishlatiladi. Elutsiya gradienti: 0 dan 5 minutgacha, 30% B; 5 dan 15 minutgacha. , 30% ~ 60% B; 15 ~ 20 min, 60% ~ 100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Volumetrik oqim tezligi 0,3 ml/min. Mass-spektrometriya shartlari: elektrosprey ion manbai, tashuvchi gaz sifatida azot, qobiq gaz bosimi 3,5 MPa, yordamchi gaz bosimi 1,0 MPa, püskürtme bosimi 3500 V, kapillyar harorat 350 daraja, yordamchi gaz isitish harorati 200 daraja, musbat va salbiy ionlarni skanerlash rejimlari. ion diapazoni m/z 100-1500, toʻliq MS ruxsati 35 000, dd-MS2 ruxsati 17 500, (N)
CE/steped nce 35, 60 ga o'rnatiladi.
2.6 CtCHS oqsilining hujayra osti lokalizatsiyasi
CtCHS ketma-ketligi va uzluksiz klonlash printsipi asosida Kpn Ⅰ va BamH Ⅰ fermentlarni kesish joylari bo'lgan primerlar ishlab chiqilgan va mos keladigan maqsadli fragmentlar PCR orqali kuchaytirilgan. pCAMBIA1300-35S-GFP plazmidi Kpn Ⅰ va BamH Ⅰ cheklovchi endonukleazlar bilan hazm qilindi va maqsadli fragment va vektor uzluksiz klonlash to'plami (Novizan, Cat C115-01) orqali ulandi va keyin uzatildi. E. coli DH5 vakolatli hujayralariga. , ketma-ketlik uchun bitta klon shtammlarini tanlang va to'g'ri shtammlardan plazmidlarni ajratib oling. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS va pCAMBIA 1300-35S-GFP plazmidlari PEG4000 yordamida Arabidopsis thaliana protoplastlariga aylantirildi va 8-10 soat davomida kam yorugʻlik ostida yetishtirildi. CtCHS oqsilining hujayra osti lokalizatsiyasi lazer konfokal mikroskop ostida kuzatildi.
2.7 CtCHS ifoda naqsh tahlili
CtCHS ketma-ketligiga asoslanib, DNAMAN real vaqtda flüoresans miqdoriy primerlarini loyihalash uchun ishlatilgan, F-box ichki mos yozuvlar geni sifatida. Primer ketma-ketliklar 1-jadvalda ko'rsatilgan. Turli rangdagi Cistanche deserticola gullarida CtCHS ning nisbiy ifodasi real vaqtda flüoresan miqdoriy PCR orqali aniqlangan. SYBR Green floresan bo'yoq usuli bilan o'lchash uchun TransStart Green qPCR SuperMix (to'liq oltin, AQ101-02) dan foydalaning, reaksiya tizimi: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 mkl, yuqori va quyi oqim primerlari (10)
mkmol/L) {0}}, har biri 2 mkL, cDNK shabloni 0,5 mkl, nukleotidazsiz suv 4,1 mkL, reaksiya uchun ikki bosqichli usuldan foydalanilgan va reaksiya jarayoni usulga asoslangan. Dong Xianjuan va boshqalar. [18]. Har bir namunada 3 ta biologik nusxa mavjud bo'lib, tajriba uch marta takrorlandi. Eksperimental ma'lumotlar Exceldan 2 ga qadar tahlil qilindi
CtCHS ning nisbiy ifodasi -DCt usuli yordamida hisoblab chiqilgan va GraphPad Prism 8 ahamiyatlilik tahlilini o'tkazish va histogrammalarni chizish uchun ishlatilgan.
