Cistanche Tubulosa dan xalkon sintazasini klonlash, funktsional identifikatsiyalash va ekspression tahlili
Mar 25, 2024
Xulosa: Maqsad Guanhuaroucongrongdan kalkon sintazasining funktsiyasini o'rganish (Cistanche tubulosa) va oq, qizil va binafsha gullarda CtCHS genining ekspressiyasi.
Usullar CtCHS geni RT-PCR yordamida klonlandi va bioinformatika tahlili o'tkazildi. PET{1}}a-CtCHS plazmidi IPTG orqali protein ekspressiyasini qo'zg'atish uchun ichak tayoqchasiga o'tkazildi. CtCHS rekombinant oqsili p-kumaroil CoA va malonil CoA substratlari bilan inkubatsiya qilindi va mahsulotlar HPLC va MS tomonidan aniqlandi. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidi CtCHS oqsilining hujayra osti lokalizatsiyasini kuzatish uchun Arabidopsis thaliana protoplastiga o'tkazildi. ning gullarida CtCHSgene ning ifoda namunasiC. tubulosauch rang bilan qRT-PCR tomonidan aniqlandi.
Natijalar CtCHS geni klonlandi. Ochiq o'qish ramkasi (ORF) uzunligi 1173 bp bo'lib, 390 aminokislotalarni kodlaydi va oqsilning molekulyar og'irligi 42 8000 edi. CtCHS tarkibida kalkon sintazasida saqlanib qolgan Cys164, His303, Asn336 katalitik qoldiqlari mavjud edi. CtCHSprotein E. coli da ifodalangan va rekombinant oqsilni olish uchun tozalangan. CtCHS oqsili naringenin xalkonini ishlab chiqarish uchun p-kumaroil CoA va malonil CoA ni katalizlashi mumkin. CtCHS oqsili asosan sitoplazmada lokalizatsiya qilingan. CtCHS geni binafsha va qizil gullarda aniq ifodalangan va nisbiy ifoda darajalari oq gullarga qaraganda mos ravishda 8,44 va 3,21 baravar yuqori edi.
Xulosa CtCHS geni gulidan klonlanganC. tubulosava oqsil ifodalangan. CtCHSprotein kalkon sintaza funktsiyasiga ega va CtCHS genining ifodasi quyuqroq gullarda yuqori bo'ladi, bu CtCHSgene C. tubulosa gul rangini tartibga solishi mumkinligini ko'rsatadi, bu esa keyingi tadqiqotlar uchun asos yaratadi.C. tubulosa gul rangini tartibga solish mexanizmi.
Kalit so‘zlar:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; xalkon sintaza; ferment faolligini tahlil qilish; hujayra osti lokalizatsiyasi; ekspression tahlil
30% EXINAKOSID VA 12% AKTEOSIDLI TABIY ORGANIK SİSTANCHE EKSTRAKTINI OLISH UCHUN SHU YERGA BOSING
Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik sistanche eksportchisi:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Biosintetikflavonoidlar yo'lifenilpropanoid yo'lidan boshlanadi.Fenilalaninostida dastlab sinnamik kislotaga aylanadifenilalanin ammialazaning ta'siri(PAL) va sinnamik kislota 4-sinnamik kislota bilan gidroksillanadi. Ferment (sinnamik kislota-4-gidroksilaza, C4H) va 4-kumaratkoenzim A ligaza (4-kumaratkoenzim A ligaza, 4CL) 4-kumaroil-KoA hosil qilish uchun reaksiyani katalizlaydi [11] ]. Bir molekula 4-kumaroil-KoA va uch molekula malonil-KoA xalkonsintaza (CHS) tomonidan katalizlanadi, bunda flavonoid birikmalarga ega boʻlgan naringenin xalkon hosil boʻladi. dihidroflavonol 4-reduktaza va boshqalar izoflavonlar, flavonollar, antosiyaninlar va boshqalar kabi turli flavonoidlarni hosil qiladi [12]. Flavonoidlarning biosintetik yo'lidagi asosiy ferment sifatida CHS o'simliklardagi flavonoidlarning tarkibini tartibga soladi va o'simlik gullari rangini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi [13]. Masalan, Gentiana scabra Bunge CHS ning transkripsiyadan keyingi genini susaytirishi antosiyaninlarning biosintezini inhibe qilishi va korolla loblarining o'ziga xos oqlanishiga olib kelishi mumkin [14]. Actinidia erianthaBenthning CHS genini o'chirish. CHS gulbarglardagi antosiyanin miqdorini kamaytiradi va gulbarglarni qizil rangga aylantiradi. Gulbarglari ochroq rangga aylanadi[15]. Shuning uchun, ushbu tadqiqotda CtCHS geni Cistanche tubulosa gullaridan klonlandi va CtCHS funktsiyasini o'rganish uchun bioinformatika tahlili, prokaryotik ekspressiya va tozalash, ferment faolligini tahlil qilish, subhujayra lokalizatsiya tahlili va gullarning uchta rangidagi ekspression tahlili o'tkazildi. oqsil va CtCHS genining ekspression naqshlari CtCHS va Cistanche tubulosa gullari rangi o'rtasidagi munosabatlarni oldindan o'rganish uchun ishlatilgan, bu esa ularning tartibga solish mexanizmini o'rganish uchun asos yaratgan.Cistanche tubulosa gul rangi.
1 Materiallar va asboblar
1.1 Materiallar
Cistanche tubulosa gullari 2018-yil may oyida Shinjonning Xotan prefekturasi, Yutian tumanidan yig‘ilgan. Namuna olishda tasodifiy tamoyilga amal qilingan va yaxshi fiziologik holatga ega va barqaror o‘simlik balandligiga ega Cistanche tubulosa gullari tanlangan. Pekin universiteti farmatsevtika fakulteti professori Tu Pengfey tomonidan oq, qizil va binafsha rangdagi uchta gulli Cistanche tubulosa ning uchta shtammi olindi va Cistanche tubulosa (Schenk) Wight deb aniqlandi. Ular tezda suyuq azotda muzlatilgan va keyin quruq muz omborida Pekinga olib ketilgan. E. coli DH5 kimyoviy jihatdan vakolatli hujayralar Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd.dan sotib olindi va E. coli BL21 (DE3) kimyoviy jihatdan vakolatli hujayralar Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.dan sotib olindi; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd kompaniyasidan sotib olingan. Malonil-KoA Sigma kompaniyasidan, 4-kumaroyl-CoA, naringenindan sotib olingan. -kalkon Shanxay Yuanye Biotechnology Co., Ltd.dan, naringenin esa Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.dan sotib olindi.
1.2 Asboblar
Nanodrop 2000C spektrofotometri (Thermo Fisher kompaniyasi, AQSh); gradient PCR asbobi (Eppendorf kompaniyasi, Germaniya); CFX 96 floresan miqdoriy PCR asbobi, UVP gel tasvirlagichi, gel elektroforez asbobi, oqsil elektroforezi asbobi (BioRad kompaniyasi, AQSh) ;EnSpire
Mikroplata o'quvchi (PerkinElmer kompaniyasi, AQSh); doimiy haroratli inkubator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D katta quvvatli to'liq haroratli osilator (Taicang eksperimental uskunalar fabrikasi); THZ-82Suv hammomi doimiy harorat osilatori (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra toza ish stoli (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); yuqori bosimli bug 'sterilizatori (TOMY kompaniyasi, Yaponiya); Milli Q toza suv asbobi (Millipore, AQSH); LC-20Yuqori samarali suyuqlik fazali xromatograf (Shimadzu kompaniyasi, Yaponiya); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (Thermo Fisher kompaniyasi, AQSh); FV1200 lazerli konfokal mikroskop (Olympus kompaniyasi, Yaponiya).
2 Eksperimental usullar
2.1 RNK ekstraktsiyasi va cDNK sintezi.
Cistanche tubulosa gullari suyuq azotda maydalangan va keyin RNK ekstraktsiyasi tahliliga duchor bo'lgan.
Jami RNK to'plam (Norgen, Cat 17200) yordamida ekstraksiya qilindi, RNK kontsentratsiyasi va sifati NanoDrop 2000C tomonidan aniqlandi va cDNKni sintez qilish uchun teskari transkripsiya uchun A260/A280 nisbati 1,8 dan 2,1 gacha bo'lgan RNK namunalari tanlandi. M-MLV teskari transkriptaza (Promega, M170B) malakali umumiy RNKni cDNKga teskari transkripsiya qilish uchun ishlatilgan. Eksperimental operatsiyalar ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi.
2.2 CtCHS genini klonlash
Bizning tadqiqot guruhimizning Cistanche tubulosa gullari transkriptomi ma'lumotlariga asoslanib [16], to'liq ochiq o'qish ramkasiga ega CtCHS ko'rib chiqildi va SnapGene dasturi gen ketma-ketligiga asoslangan maxsus primerlarni loyihalash uchun ishlatilgan (1-jadval). PCR amplifikatsiyasi shablon sifatida Cistanche tubulosa gul cDNK yordamida amalga oshirildi. Kuchaytirish tizimi 2×Phanta Max Bufer 25 mkL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 mkl, yuqori va quyi oqim primerlari (10 mkmol/L) har biri 2 mkl, cDNA 2 mkl, Phanta Max Super Fidelity DNK Polimeraz 1 mkl, ddH2O 17 mL. Reaktsiya shartlari: 3 daqiqa davomida 95 daraja oldindan denatürasyon; 15 soniya davomida 95 daraja denaturatsiyaning 25 tsikli, 15 soniya davomida 55 daraja tavlanish va 1 daqiqa davomida 72 daraja uzaytirish; reaktsiyani 72 daraja 5 daqiqaga uzaytirish. PCR mahsuloti 1% agaroz gel elektroforezi bilan aniqlandi va DNKni tozalash to'plami (Novizan, Cat DC301-01) gelni qayta tiklash uchun ishlatilgan, so'ngra qayta tiklangan DNK tezkor klonlash to'plami (Novizan, Cat) bilan tozalangan. C601-01). DNK fragmenti pCE2TA/Blunt-Zero vektori bilan bog'landi, Escherichia coli DH5 vakolatli hujayralariga aylantirildi va 37 darajada bir kechada kultivatsiya qilingandan so'ng, bitta klon shtammlari tanlandi va ketma-ketlik uchun kompaniyaga yuborildi.
1-jadval Primer ketma-ketligi
2.3 Bioinformatika tahlili
Proteinning fizik va kimyoviy xususiyatlarini tahlil qilish uchun ProtParam onlayn dasturidan foydalaning; oqsilning gidrofilligi/hidrofobikligini tahlil qilish uchun Prot Scale onlayn vositasidan foydalaning; oqsilning ikkilamchi tuzilishini bashorat qilish uchun onlayn SOPMA vositasidan foydalaning; oqsilning uchinchi darajali tuzilishini bashorat qilish uchun SWISS-MODEL onlayn tahlil dasturidan foydalaning; TMHMM onlayn dasturidan foydalaning Proteinning transmembran tuzilishini taxmin qiling; CtCHS homologiyasini boshqa turlarning CHS aminokislotalar ketma-ketligi bilan solishtirish uchun DNAMAN dasturidan foydalaning; filogenetik daraxtni qurish uchun MEGA-X dasturidan foydalaning, qo'shni qo'shilish (NJ) va Puasson tuzatish yordamida evolyutsiya masofasi Bootstrap usuli yordamida hisoblanadi va Bootstrap takrorlash soni 1000 marta.
2.4 CtCHS prokaryotik ifodasi va tozalanishi
CtCHS ketma-ketligi asosida BamHⅠ va XhoⅠ cheklash joylari bilan primerlarni loyihalashtiring va PCR mos keladigan maqsadli fragmentlarni kuchaytiradi. PET{0}}a vektori va maqsadli fragment BamHI endonukleazlari yordamida hazm qilindi va Klonlangan shtamm ketma-ketlashtiriladi va to'g'ri ketma-ketlikdan so'ng plazmid ekstraksiya qilinadi. Sekvensiya bilan tasdiqlangan pET{1}}a-CtCHS plazmidi Escherichia coli BL21 (DE3) vakolatli hujayralariga o'tkazildi. Ding Ning va boshqalarning usuliga murojaat qiling. [17] izopropil bilan
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) past haroratda oqsil ifodasini induktsiya qilish uchun ishlatilgan va Ni2+ yaqinlik xromatografiya ustuni (Cytiva, Cat 17531901) orqali tozalangan. Protein ultrafiltrlash trubkasida (Millipore, 30 000) sentrifugalash orqali konsentratsiyalangan va tuzsizlangan. 20 mmol/L KPB buferida (pH 8,0, 1 mmol/LEDTA o'z ichiga oladi) saqlang va uzoq muddatli saqlash uchun -80 daraja muzlatgichda saqlang.
2.5 CtCHS ferment faolligini tahlil qilish
CtCHS ferment reaktsiyasi tizimi: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 mkl, 1 mmol/l malonil-KoA 10 mkl, 5 mmol/L 4-kumaroil-KoA 2 mkl, CtCHS rekombinanti oqsil 20 mkL, suv hammomida 37 daraja haroratda 12 soat davomida reaksiyaga kirishgandan so'ng, aralashma uch marta 800 mL etil asetat bilan ekstraksiya qilindi, azot oqimi bilan quritildi va keyin 100 mkl metanolda eritildi. Mahsulotni aniqlash uchun yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalaning. Shartlar: Ultimate LP-C18 ustuni (250 mm × 4,6 mm, 5 mkm), ustun harorati 30 daraja, namuna hajmi 10 mkl va oqim sifatida suv (A) va asetonitril (B). Faza, elutsiya gradienti: 0~10
min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20 ~ 25 min, 60% ~ 70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Hajmli oqim tezligi 1 ml/min va aniqlash 290 nm to‘lqin uzunligida.
Keyinchalik aniqlash uchun UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS ishlatilgan. Suyuq faza sharoitlari Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 ustuni (100 mm × 3.0 mm, 1,7 mkm), ustun harorati 40 daraja, naringenin- xalkon va naringenin nazorati. Mahsulotning yuklanish hajmi 4 mkL, ferment reaktsiyasi mahsulotining yuklash hajmi esa 7 mkl. Harakatlanuvchi faza sifatida suv (A)-asetonitril (B) ishlatiladi. Elutsiya gradienti: 0 dan 5 minutgacha, 30% B; 5 dan 15 min., 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Oqim tezligi 0,3 ml/min. Mass-spektrometriya shartlari: elektrosprey ion manbai, tashuvchi gaz sifatida azot, qobiq gaz bosimi 3,5 MPa, yordamchi gaz bosimi 1,0 MPa, püskürtme bosimi 3500 V, kapillyar harorat 350 daraja, yordamchi gaz isitish harorati 200 daraja, musbat va salbiy ionlarni skanerlash rejimlari. ion diapazoni m/z 100-1500, toʻliq MS ruxsati 35 000, dd-MS2 ruxsati 17 500, (N)
CE/steped nce 35, 60 ga o'rnatiladi.
2.3 Bioinformatika tahlili
Proteinning fizik va kimyoviy xususiyatlarini tahlil qilish uchun ProtParam onlayn dasturidan foydalaning; oqsilning gidrofilligi/hidrofobikligini tahlil qilish uchun Prot Scale onlayn vositasidan foydalaning; oqsilning ikkilamchi tuzilishini bashorat qilish uchun onlayn SOPMA vositasidan foydalaning; oqsilning uchinchi darajali tuzilishini bashorat qilish uchun SWISS-MODEL onlayn tahlil dasturidan foydalaning; TMHMM onlayn dasturidan foydalaning Proteinning transmembran tuzilishini taxmin qiling; CtCHS homologiyasini boshqa turlarning CHS aminokislotalar ketma-ketligi bilan solishtirish uchun DNAMAN dasturidan foydalaning; filogenetik daraxtni qurish uchun MEGA-X dasturidan foydalaning, qo'shni qo'shilish (NJ) va Puasson tuzatish yordamida evolyutsiya masofasi Bootstrap usuli yordamida hisoblanadi va Bootstrap takrorlash soni 1000 marta.
2.4 CtCHS prokaryotik ifodasi va tozalanishi
CtCHS ketma-ketligi asosida BamHⅠ va XhoⅠ cheklash joylari bilan primerlarni loyihalashtiring va PCR mos keladigan maqsadli fragmentlarni kuchaytiradi. PET{0}}a vektori va maqsadli fragment BamHI endonukleazlari yordamida hazm qilindi va Klonlangan shtamm ketma-ketlashtiriladi va to'g'ri ketma-ketlikdan so'ng plazmid ekstraksiya qilinadi. Sekvensiya bilan tasdiqlangan pET{1}}a-CtCHS plazmidi Escherichia coli BL21 (DE3) vakolatli hujayralariga o'tkazildi. Ding Ning va boshqalarning usuliga murojaat qiling. [17] izopropil bilan
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) past haroratda oqsil ifodasini induktsiya qilish uchun ishlatilgan va Ni2+ yaqinlik xromatografiya ustuni (Cytiva, Cat 17531901) orqali tozalangan. Protein ultrafiltrlash trubkasida (Millipore, 30 000) sentrifugalash orqali konsentratsiyalangan va tuzsizlangan. 20 mmol/L KPB buferida (pH 8,0, 1 mmol/LEDTA o'z ichiga oladi) saqlang va uzoq muddatli saqlash uchun -80 daraja muzlatgichda saqlang.
2.5 CtCHS ferment faolligini tahlil qilish
CtCHS ferment reaktsiyasi tizimi: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 mkl, 1 mmol/l malonil-KoA 10 mkl, 5 mmol/L 4-kumaroil-KoA 2 mkl, CtCHS rekombinanti oqsil 20 mkL, suv hammomida 37 daraja haroratda 12 soat davomida reaksiyaga kirishgandan so'ng, aralashma uch marta 800 mL etil asetat bilan ekstraksiya qilindi, azot oqimi bilan quritildi va keyin 100 mkl metanolda eritildi. Mahsulotni aniqlash uchun yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalaning. Shartlar: Ultimate LP-C18 ustuni (250 mm × 4,6 mm, 5 mkm), ustun harorati 30 daraja, namuna hajmi 10 mkl va oqim sifatida suv (A) va asetonitril (B). Faza, elutsiya gradienti: 0~10
min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20 ~ 25 min, 60% ~ 70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Hajmli oqim tezligi 1 ml/min va aniqlash 290 nm to‘lqin uzunligida.
Keyinchalik aniqlash uchun UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS ishlatilgan. Suyuq faza sharoitlari Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 ustuni (100 mm × 3.0 mm, 1,7 mkm), ustun harorati 40 daraja, naringenin- xalkon va naringenin nazorati. Mahsulotning yuklanish hajmi 4 mkL, ferment reaktsiyasi mahsulotining yuklash hajmi esa 7 mkl. Harakatlanuvchi faza sifatida suv (A)-asetonitril (B) ishlatiladi. Elutsiya gradienti: 0 dan 5 minutgacha, 30% B; 5 dan 15 min., 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Oqim tezligi 0,3 ml/min. Mass-spektrometriya shartlari: elektrosprey ion manbai, tashuvchi gaz sifatida azot, qobiq gaz bosimi 3,5 MPa, yordamchi gaz bosimi 1,0 MPa, püskürtme bosimi 3500 V, kapillyar harorat 350 daraja, yordamchi gaz isitish harorati 200 daraja, musbat va salbiy ionlarni skanerlash rejimlari. ion diapazoni m/z 100-1500, toʻliq MS ruxsati 35 000, dd-MS2 ruxsati 17 500, (N)
CE/steped nce 35, 60 ga o'rnatiladi.
2.6 CtCHS oqsilining hujayra osti lokalizatsiyasi
CtCHS ketma-ketligi va uzluksiz klonlash printsipi asosida Kpn Ⅰ va BamH Ⅰ fermentlarni kesish joylari bo'lgan primerlar ishlab chiqilgan va mos keladigan maqsadli fragmentlar PCR orqali kuchaytirilgan. pCAMBIA1300-35S-GFP plazmidi Kpn Ⅰ va BamH Ⅰ cheklovchi endonukleazlar bilan hazm qilindi va maqsadli fragment va vektor uzluksiz klonlash to'plami (Novizan, Cat C115-01) orqali ulandi va keyin uzatildi. E. coli DH5 vakolatli hujayralariga. , ketma-ketlik uchun bitta klon shtammlarini tanlang va to'g'ri shtammlardan plazmidlarni ajratib oling. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS va pCAMBIA 1300-35S-GFP plazmidlari PEG4000 yordamida Arabidopsis thaliana protoplastlariga aylantirildi va 8-10 soat davomida kam yorugʻlik ostida yetishtirildi. CtCHS oqsilining hujayra osti lokalizatsiyasi lazer konfokal mikroskop ostida kuzatildi.
2.7 CtCHS ifoda naqsh tahlili
Haqiqiy vaqtda lyuminestsent miqdoriy primerlar CtCHS ketma-ketligiga asoslangan DNAMAN yordamida ishlab chiqilgan, F-box ichki mos yozuvlar geni sifatida. Primer ketma-ketliklar 1-jadvalda ko'rsatilgan. Turli rangdagi Cistanche tubulosa gullarida CtCHS ning nisbiy ifodasi real vaqt rejimida lyuminestsent miqdoriy PCR orqali aniqlangan. SYBRGreen floresan bo'yoq usuli bilan o'lchash uchun TransStart Green qPCR SuperMix (to'liq oltin, AQ101-02) dan foydalaning. Reaktsiya tizimi: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 mkl, yuqori va quyi oqim primerlari (10 mkmol/L) 0, har biri 2,2 mkL, cDNK shabloni 0,5 mkl, 4,1 mkl nukleotidazsiz suv ishlatilgan ikki bosqichli usul yordamida reaksiya uchun. Reaktsiya jarayoni Dong Xianjuan va boshqalarning usuliga asoslangan edi. [18]. Har bir namunada 3 ta biologik nusxa mavjud bo'lib, tajriba uch marta takrorlandi. Eksperimental ma'lumotlar Excel yordamida tahlil qilindi, CtCHS ning nisbiy ifodasi 2−DDCt usuli yordamida hisoblab chiqilgan va GraphPadPrism 8 ahamiyatlilik tahlilini o'tkazish va histogrammalarni chizish uchun ishlatilgan.
