Inson buyraklarida mineralo-organik nanozarrachalarni aniqlash va tavsiflash

Tsui-Yin Vong^1,2,*, Cheng-Yeu Vu^1,2,3,* va boshqalar

Ektopik kalsifikatsiya insonning turli kasalliklari, jumladan ateroskleroz, saraton,surunkalibuyrakkasallik, vaqandli diabetmellitus. Ohaklangan qon tomirlarida mineral nanozarrachalar aniqlangan bo'lsa-da, bu zarralarning tabiati va inson organizmidagi roli noaniqligicha qolmoqda. Bu erda biz birinchi marta insonni ko'rsatamizbuyrakoxirgi bosqichdan olingan to'qimalarsurunkalibuyrakkasallikyoki buyrak saratoni bilan og'rigan bemorlarda 50 dan 1500 nm gacha bo'lgan yumaloq, ko'p qatlamli mineral zarrachalar mavjud, sog'lom nazoratchilarda esa hech qanday zarrachalar kuzatilmaydi. Mineral zarralar, asosan, konvolyutsiyalangan kanalchalarni o'rab turgan hujayradan tashqari matritsada, Henlening yig'uvchi kanallari va halqalarida, shuningdek, tubulalarni ajratuvchi hujayralar sitoplazmasida joylashgan bo'lib, suyaklar va ektopik kalsifikatsiyadagi mineralga o'xshash polikristalli kaltsiy fosfatdan iborat. Thebuyrakmineral nanozarrachalar tarkibida albumin, fetuin-A va apolipoprotein A1 kabi tana suyuqliklarida ektopik kalsifikatsiyani inhibe qiluvchi bir qancha sarum oqsillari mavjud. Mineral-organik nanozarrachalar nafaqat kalsifikatsiyalangan konlarda, balki mikroskopik kalsifikatsiyadan mahrum bo'lgan joylarda ham topilganligi sababli, bizning kuzatishlarimiz nanozarrachalar odamlarda ohaklanish va buyrak toshlarining prekursorlari bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopik kalsifikatsiya ateroskleroz, saraton,surunkalibuyrakkasallik, va qandli diabet1-3. Oxirgi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, ateroskleroz vasurunkalibuyrakkasallikqon tomirlarining kalsifikatsiyasi belgilari bo'lgan bemorlarda kasallanish va o'lim xavfi ortib bormoqda, bu ektopik kalsifikatsiya inson salomatligi uchun zararli ekanligini ko'rsatadi1,3. Keksa odamlarda ham istalmagan kalsifikatsiya kuzatiladi va 60 yoshdan oshgan ko'pchilik odamlarda qon tomirlarida kalsifikatsiya belgilari namoyon bo'ladi4. Shu sabablarga ko'ra, ektopik kalsifikatsiyani keltirib chiqaradigan omillarni aniqlash va samarali davolashni ishlab chiqish muhim maqsadlardir.

Ektopik kalsifikatsiyani tanadagi ohaklanishning inhibitorlari va induktorlari o'rtasidagi nomutanosiblik sifatida aniqlash mumkin. Kalsifikatsiya inhibitörleri albumin, fetuin-A, osteopontin va matritsa GLA oqsili kabi sarum oqsillarini, shuningdek, pirofosfat kabi kichik birikmalarni o'z ichiga oladi, giperfosfatemiya va yallig'lanish esa kalsifikatsiyaning asosiy induktorlarini ifodalaydi5-7. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, kalsifikatsiya induktorlari qon tomirlarining kalsifikatsiyasi paytida suyak shakllanishiga o'xshash hujayrali jarayonni faollashtiradi7,8. Rivojlanayotgan suyaklarda mineralizatsiyani keltirib chiqaradiganlarga o'xshash matritsa pufakchalari kaltsiylangan yumshoq to'qimalarda ham aniqlangan7-9. Ushbu matritsa pufakchalari, ehtimol, osteoblastga o'xshash hujayralarga differensiallanib, kalsifikatsiyani keltirib chiqaradigan tomir silliq mushak hujayralari tomonidan chiqariladi7.

Ektopik kalsifikatsiya belgilarini ko'rsatadigan yumshoq to'qimalarda mineral nanozarrachalar (NP) aniqlangan. Price va boshqalar. bifosfonat etidronat yoki D vitamini bilan davolash qilingan kalamushlarning zardobida fetuin-A va matritsa GLA oqsili kalsifikatsiya inhibitörlerini o'z ichiga olgan minerallar-oqsil komplekslari borligini aniqladi10,11. Xuddi shunday, Jahnen-Dechent va boshqalar. Kalsifikatsiya qiluvchi peritonit bilan og'rigan bemorlarning astsit suyuqligida kalsiprotein zarralari (CPP) deb ataladigan fetuin-A ni o'z ichiga olgan mineral komplekslarni aniqlash mumkinligini kuzatdilar12. Bertazzo va boshqalar tomonidan yaqinda o'tkazilgan tadqiqot. aterosklerotik va revmatik isitma bilan og'rigan bemorlarning aorta klapanlari va koronar arteriyalarida mineral NP mavjudligini ko'rsatdi13. Mineral zarrachalarning shakllanishiga oid tadqiqotlar odatda insonning yurak-qon tomir tizimiga qaratilgan bo'lsa-da, zarralar boshqa to'qimalarda topilishi mumkinmi yoki bu mavjudotlar salomatlik yoki kasallikda rol o'ynaydimi yoki yo'qmi, noaniq qolmoqda.

Biz ilgari kuzatgan edikki, minerallar-organik NPS o'z-o'zidan odam va hayvonlar tanasi suyuqliklarida hosil bo'ladi14-28. Ushbu mineral NPlar dastlab nanobakteriyalar (NB) sifatida tasvirlangan va ular nafaqat er yuzidagi eng kichik hujayralar29, balki ko'plab kasalliklarning, jumladan Altsgeymer kasalligi, ateroskleroz, saraton,buyraktoshshakllanishi, polikistikbuyrakkasallik, va prostatit30–32. Biroq, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, NB aslida morfologiyasi, o'sishi, ko'payishi va subkulturasi bo'yicha umumiy bakteriyalarga taqlid qiluvchi tirik bo'lmagan mineral NPlardir15,18,22. Inson to'qimalarida NB deb ataladigan narsaga o'xshash mineral zarrachalar bo'lishi mumkinligi va bu zarralar kasallikda rol o'ynaydimi yoki yo'qligini tekshirish kerak.

Ushbu tadqiqotda biz kasal odamda mineral-organik NPlarni aniqlash va tahlil qilish uchun nanomaterial yondashuvni ishlab chiqdik.buyrakto'qimalar. Biz surunkali buyrak kasalligi va buyrak saratoni bilan og'rigan bemorlarning buyrak to'qimalarida in vitro tana suyuqliklarida o'z-o'zidan cho'kadigan biomimetik mineral zarrachalarga o'xshash ko'p qatlamli mineral NPlar mavjudligini ko'rsatamiz. Natijalarimiz ushbu minerallar-organik zarrachalarning biokimyoviy tarkibi, hosil bo'lish mexanizmi va biologik funktsiyasiga oid tanqidiy fikrlarni ochib beradi va ular ektopik ohaklanish mexanizmlarini va inson tanasida kasallikning boshlanishini yoritadi.

Natijalar

Biz surunkali buyrak kasalligi (n=2) yoki buyrak saratoni (n=18) bilan og'rigan odamlardan jarrohlik yo'li bilan olib tashlangan buyrak to'qimalarini ko'rib chiqdik; 1-jadvalga qarang; buyrak saratoni namunalari uchun, biz bo'lmaganlarga e'tibor qaratdik. -to'qimalarning saraton qismi). Sog'lom nazoratchilar sifatida biz shikastlangan yoki gematomasi bo'lgan, ammo buyrak funktsiyasi anormal bo'lmagan bemorlardan olingan buyrak biopsiyalarini o'rgandik (n=2; 1-jadval).

Sog'lom odamlarning buyrak to'qimalari normal gistologik xususiyatlarni ko'rsatdi va fon Kossa bo'yalganidan keyin ektopik kalsifikatsiya kuzatilmadi (1A, B-rasm). Boshqa tomondan, kasal odamlardan olingan va gematoksilin va eozin (H&E) bilan bo'yalgan buyrak to'qimalari to'qimalarning shikastlanishini ko'rsatdi (2A-C-rasm, o'qlar bilan ko'rsatilgan) va tekshirilgan kasal to'qimalarning 80 foizi minerallashgan konlarni aniqladi. fon Kossani bo'yash orqali (1C–T-rasm, 2E,F-rasm, kalsifikatsiya qora strelkalar bilan ko'rsatilgan qora material sifatida ko'rinadi; 1-jadvalga ham qarang). Korteks va medullada, shu jumladan distal burmalangan tubulalarni o'rab turgan hujayradan tashqari bo'shliqda, proksimal burmalangan kanalchalarda, Henle to'plash kanallari va halqalarida, shuningdek, kanalchalar va kanallarni ajratib turuvchi hujayralar sitoplazmasida ohaklangan konlar aniqlandi (1C-T va 1-rasm). 2E, F). Buyrak korpuskulasida kalsifikatsiya aniqlanmadi (2D-rasm).

Mineral cho'kmalarning tabiatini o'rganish uchun biz transmissiya elektron mikroskopi (TEM) orqali kuzatish uchun o'ta yupqa buyrak qismlarini tayyorladik. Mikroskopik mineral konlarni o'z ichiga olgan namunalarda mineral zarrachalar yoki granulalar buyrak epitelial hujayralari sitoplazmasida, bazal membrana ostidagi hujayradan tashqari matritsada va proksimal va distal burmalangan kanalchalar lümeni ichida aniqlangan (3A, B-rasm, zarrachalar kattalashgan). A1–A4 va B1–B4 panellarida). Mineral NPlar, shuningdek, Henle halqalari va yig'ish kanallari bilan qoplangan hujayralar ichida ham kuzatilgan (3C, D-rasm, C1, C2 va D1 panellarida kattalashtirilgan). Ba'zi zarralar buyrak hujayralarida hujayra ichidagi pufakchalar ichida topilgan (3A-rasm, A1 va A2 panellari). Bu erda qo'llaniladigan elektron mikroskopiya usuli ham mineral zarrachalarning ichki qismini tasavvur qilish imkonini berdi; ba'zi zarralar yorug'lik, elektron yorqin qatlamlar bilan almashinadigan elektron zich halqalarni saqlagan (3A-rasm, A3 va A4 panellari, 3C-rasm, C1 paneli). Bir nechta qon tomirlari, masalan, vasa recta rents (buyrakning to'g'ri arteriyalari), biz juda ko'p miqdordagi mineral NPlar bilan o'ralganmiz (3D-rasm, D1 paneli). Shunday qilib, mineral NPlar insonning barcha buyrak to'qimalarida ektopik kalsifikatsiya belgilarini ko'rsatadigan turli joylarda topilgan, ammo tekshirilgan sog'lom odamlarda zarrachalar topilmagan.

Buyrak to'qimalarida topilgan mineral zarralar bizning oldingi tadqiqotlarimizda tasvirlangan mineralo-organik NPlarga juda o'xshash ko'rinadi15,17 (va biz ularni bios24 deb ataganmiz). Ushbu imkoniyatni tekshirish uchun biz avval aytib o'tganimizdek, yog'ingarchilik usuli yordamida mineral organik NPlarni (yoki bionlarni) tayyorladik15. Bu usul kaltsiy va fosfat kabi cho'ktiruvchi ionlarni inson zardobi (HS) kabi tana suyuqligini o'z ichiga olgan hujayra madaniyati muhitiga (Dulbekko tomonidan o'zgartirilgan Eagle muhiti yoki DMEM) qo'shishdan iborat bo'lib, so'ngra hujayra madaniyati sharoitida inkubatsiya qilinadi (Usullarga qarang). Shu tarzda hosil bo'lgan zarralar (HS-NPS) sharsimon yoki ellipsoid bo'lib, silliq yoki kristalli mineral sirtni ko'rsatdi (4A-E-rasm), avvalroq tana suyuqliklarida tasvirlangan zarrachalarga o'xshash22,23, shuningdek, inson astsitlarida12 va kalsifikatsiyalangan arteriyalar13. Mineral zarralar umumiy morfologiyasi, ko'p qatlamli tuzilishi va sirt xususiyatlariga ko'ra buyrak to'qimalarida kuzatilgan mineral NP yoki granulalarga juda o'xshash edi (4F-J-rasm). HS dan olingan zarrachalar va buyrak granulalarining o'lchamlari ham taqqoslangan, diametri 50 dan 1500 nm gacha (4A-E,F-J-rasm). Yuqorida ta'kidlab o'tilganidek, ba'zi buyrak granulalari lipid membranasi bilan o'ralgan bo'lib, ehtimol hujayra ichidagi yuk pufakchalarini yoki hujayradan tashqari membrana pufakchalarini ifodalaydi (4H,I-rasm, membranalar o'qlar bilan belgilanadi); in vitroda tayyorlangan HS-NP namunalarida bunday membranali tuzilmalar yo'q edi (4A-E-rasm). Ushbu kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, buyrak granulalari sarumda yig'ilgan mineralo-organik NPlarga o'xshaydi.

Tanlangan hududdagi elektron diffraktsiya tahlilidan foydalanib, biz in vitroda oldindan tayyorlangan HS-NP ning mineral fazasi polikristalli nanomaterialdan iboratligini kuzatdik (4E-rasm, ichkariga qo'yilgan; zaif konsentrik halqalarga e'tibor bering). Xuddi shunday natijalar buyrak granulalari uchun (4J-rasm, ichki qism) va oldingi tadqiqotlarda tasvirlangan suyaklar va ektopik kalsifikatsiyalar uchun olingan33,35.

Biz energiya-dispersiv rentgen spektroskopiyasi (EDX) yordamida HS-NP va buyrak granulalarining kimyoviy tarkibini o'rgandik. HS-NPs uglerod (C), kaltsiy (Ca), kislorod (O) va fosfor (P) ning asosiy cho'qqilarini ko'rsatdi (4K-rasm), kaltsiy fosfat mineralining mavjudligi bilan mos keladi. HS-NPlarda kremniyning past cho'qqisi (Si) ham qayd etilgan (4K-rasm), ehtimol kichik zarracha tarkibiy qismini ifodalaydi. Buyrak granulalarida, shuningdek, kremniy va temirning (Fe) qo'shimcha cho'qqilari bilan bir qatorda, kaltsiy fosfat mineralini ko'rsatadigan uglerod, kaltsiy, kislorod va fosforning cho'qqilari ko'rsatilgan (4L-rasm). Uran cho'qqilari (U) namunani tayyorlashda kontrastli reagent sifatida ishlatilgan uranil asetat bilan bog'liq edi (buyrak granulalari kabi mineral zarralarning ba'zi namunalarida uran mavjudligi va 4M-rasmdagi nazorat to'qimalarida uning yo'qligi yuqori darajadagi uranil asetat bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Uranning fosfatga yaqinligi, avval xabar qilinganidek35). Zarrachalarni o'rab turgan buyrak to'qimalarining nazorat EDX spektrlari uglerod va kislorodning cho'qqilarini ko'rsatdi (4M-rasm), bu kaltsiy va fosfor asosan mineral zarrachalarda topilganligini ko'rsatadi.

Kaltsiy: HS-NP va buyrak granulalarining fosfor (Ca:P) nisbati 0,65 dan 1,18 gacha o'zgardi. Bu nisbatlar stexiometrik gidroksiapatit uchun kuzatilgan 1,67 ning nazariy qiymatidan farq qiladi, ammo baribir turli kristallanish darajalarida kuzatilgan kaltsiy fosfat va apatit kristallari uchun ilgari ko'rilgan diapazondadir15. Bu topilmalar birgalikda buyrak granulalari kaltsiy fosfat NPlaridan iborat ekanligini tasdiqlaydi.

Turli xil oqsillar organizmda tizimli ravishda ektopik kalsifikatsiyani inhibe qilishi aniqlangan36,37. Bundan tashqari, sintetik NPs yuzasida topilgan protein korona zarrachalarning biotarqalishini va hujayralarga ta'sirini aniqlaydi deb ishoniladi38,39. Boshqa tomondan, inson buyragi to'qimalarida topilgan mineralo-organik NPlarning oqsil tarkibi to'liq tushunilmagan. Biz ilgari albumin, fetuin-A va apolipoprotein-A1 (apo-A1) tana suyuqliklarida hosil bo'lgan mineralo-organik NPlar bilan o'zaro ta'sir qiluvchi asosiy oqsillar ekanligini aniqladik17,20. Bu erda biz buyrak granulalari ichida ushbu oqsillarning mavjudligi va ultrastrukturaviy joylashuvini tekshirish uchun immunogold belgilaridan foydalandik.

Biz HS-NP va buyrak granulalarida zardob oqsillari mavjudligini tekshirish uchun inson sarum albumini (HSA), inson zardobi fetuin-A (HSF), inson apo-1A va butun HS ga qarshi poliklonal antikorlardan foydalandik. Poliklonal antikorlarning o'ziga xosligi (oldingi ta'riflanganidek tayyorlangan25) Western blotting yordamida tekshirildi (5-rasm). Poliklonal antikorlarning har biri in vitroda tayyorlangan HS-NPlar hamda inson buyragi to‘qimalarida topilgan mineral granulalar bilan ijobiy reaksiyaga kirishdi (6A,B-rasm, A1-A3 va B1-B3 panellari; qora nuqta). Antikorlar asosan elektron zich qatlamlar yoki HS-NP va buyrak granulalarining qorong'u yadrosi bilan reaksiyaga kirishdi (6A, B-rasm), bu qorong'u joylarda elektron yorqin joylarga nisbatan yuqori darajadagi oqsillarni o'z ichiga olishi mumkinligini ko'rsatadi. Birlamchi antikorsiz bajarilgan salbiy nazorat hech qanday reaksiyaga olib kelmadi (6A-rasm, B, panellar A4 va B4, nazorat). Biz buyrak granulalari nafaqat morfologiyasi va mineral tarkibi, balki sarumda mavjud bo'lgan asosiy kalsifikatsiya inhibitörleri bilan bog'lanishiga asoslanib, HS-NPga o'xshash mineralo-organik NPlarni ifodalaydi degan xulosaga keldik.

Kasal inson buyraklarida HSA va HSF ni o'z ichiga olgan mineral granulalar mavjudligini tasdiqlash uchun immunofloressens mikroskopiya ishlatilgan. Ushbu texnikadan foydalanib, inson buyrak to'qimalari ko'rsatdi

turli sohalarda, shu jumladan buyrak kanalchalarini o'rab turgan interstitium, shuningdek, tubulalarni ajratuvchi hujayralar sitoplazmasida ikkita oqsil uchun ijobiy bo'yash (7A-rasm, A1 va A2 panellari). Bu hududlarda ham albumin, ham fetuin-A ni o'z ichiga olgan oqsil agregatlari, biroq oqsillarning bo'yalishi bilan solishtirganda kamroq miqdorda bo'lsa ham aniqlandi (7A-rasm va panel A3, sariq rangda birlashtirilgan bo'yash). Shunisi e'tiborga loyiqki, biz immunofloressensiya yordamida aniqlangan oqsil bo'yalishi fon Kossa bo'yog'i yordamida kuzatilgan ektopik kalsifikatsiya namunasi bilan chambarchas mos kelishini payqadik (7A,B-rasm, kalsifikatsiya B dagi strelkalar bilan ko'rsatilgan qora material sifatida ko'rinadi). Ushbu natijalar tekshirilgan inson buyrak to'qimalarida mineralo-organik zarralar mavjudligini qo'shimcha ravishda qo'llab-quvvatlaydi.

Munozara

Sintetik NPlar va inson hujayralari o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tushunishda yutuqlarga erishilgan bo'lsa-da, biz tana suyuqliklarida o'z-o'zidan paydo bo'ladigan mineralo-organik NPlarning ta'siri haqida ancha kam bilamiz. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, bu zarralar biologik suyuqliklarda kaltsiy va fosfat kontsentratsiyasi to'yinganlikdan oshib ketganda hosil bo'ladi15,16. Shuningdek, biz bu zarralar immun hujayralar tomonidan o'zlashtirilganligini, lekin faqat katta zarrachalar yallig'lanishga qarshi immunitet reaktsiyalarini qo'zg'atishini kuzatdik23. Biroq, bu zarrachalarning inson to'qimalarida tarqalishi va ularning organizmda qandaydir fiziologik yoki patologik rol o'ynashi hozirgacha tekshirilmagan.

Ushbu tadqiqotda biz birinchi marta buyrak kasalligi yoki buyrak saratoni bilan og'rigan odamlarning buyraklarida mineral-organik NPlarni aniqladik. Aniqlangan mineral-organik NPlar suyak mineraliga o'xshash yomon kristallangan kaltsiy fosfatni, shuningdek, tana suyuqliklarida tizimli kalsifikatsiya inhibitörleri sifatida ishlaydigan albumin, fetuin-A va apo-A1ni o'z ichiga oladi. Natijalarimiz qon tomir to'qimalarda va tana suyuqliklarida mineral-oqsil komplekslarining mavjudligini tavsiflovchi oldingi hisobotlarga mos keladi12,13,34,40. Biz kuzatgan zarrachalar mikroskopik kalsifikatsiyaga ega bo'lmagan joylarda topilganligi sababli, bizning kuzatishlarimiz shuni ko'rsatadiki, zarralar inson to'qimalarida ektopik kalsifikatsiyaning prekursorlari bo'lishi mumkin. Oldingi tadqiqotlarimizda ta'riflanganidek, qulay sharoitlarda mineral-organik NPlar asta-sekin o'sib borishi va zarrachadan plyonkaga o'tish imkoniyatini hisobga olgan holda, bu erda keltirilgan kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, mineral prekursorlar kattaroq hosil bo'lishiga olib kelishi mumkin. in vivo mineral konlar, masalan, Randallning blyashka va buyrak toshlari.

Buyrakning turli anatomik tuzilmalarida mineral ektopik kalsifikatsiyalar va mineraloorganik NPlar topilganligi haqidagi kuzatishlarimiz ushbu organdagi ektopik kalsifikatsiyalar haqidagi oldingi topilmalar bilan mos keladi41. Evan va boshqalarning kuzatishlari shuni ko'rsatdiki, nefrolitiazli bemorlarning buyraklarida mineralizatsiya asosan Henle qovuzloqlarining interstitsial to'qimalarida boshlanishi va sodir bo'lishi mumkin40,42. Ushbu mualliflar ushbu sohada hosil bo'lgan mineral konlar uroteliyning bazal tomonidan chiqib ketishi va buyrak toshlarining paydo bo'lishiga olib kelishi mumkinligini kuzatdilar. Bizning kuzatishlarimiz shuni ko'rsatadiki, Henle halqalariga qo'shimcha ravishda, buyrakning boshqa joylarida mineral NPlar bo'lishi mumkin, ular oxir-oqibat inson buyragida katta mineral konlarni hosil qilish uchun rivojlanishi mumkin. Shuningdek, biz qon aylanishida hosil bo'lgan mineral NPlarning buyrak to'qimalariga o'tishi va buyraklarda ektopik kalsifikatsiya va tosh shakllanishiga olib kelishi mumkinligini tekshirmoqdamiz.

Ushbu tadqiqotda aniqlangan bir nechta buyrak granulalari hujayra ichidagi yoki hujayradan tashqari pufakchalarda topilgan (4H, I-rasm) va ular suyak va tishlarda kalsifikatsiyani keltirib chiqaradigan matritsa pufakchalariga o'xshaydi7,8. Biz yaqinda inson va hayvonlar zardobidan ajratilgan pufakchalar in vitro25 mineral NP va mikroskopik cho'kmalarning hosil bo'lishiga olib kelishini kuzatdik. Schlieper va boshqalar.34, shuningdek, arteriyalarda topilgan mineral zarralar membrana tuzilmalari bilan bog'liqligini kuzatdilar va matritsa pufakchalari yoki apoptotik tanalar ushbu to'qimalarda mineral zarrachalarning yadrolarini ifodalashi mumkinligini taklif qildilar. Xuddi shunday, Xan va boshqalar. idyopatik buyrak toshlari bo'lgan odamning buyraklarida topilgan kaltsiy fosfat konlari kollagen tolalari va matritsa pufakchalari bilan bog'liqligini xabar qildi9. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, buyrak to'qimalarida aniqlangan mineralo-organik NPlar membrana pufakchalari bilan bog'liq mexanizm orqali hosil bo'lishi mumkin, bu aterosklerotik arteriyalarda ko'rinadigan holatga o'xshaydi7,8. Boshqa tomondan, yaqinda o'tkazilgan tadqiqot ayollarning ko'krak arteriyalarida topilgan ektopik kalsifikatsiyani osteogenik yoki apoptotik hujayra belgilari bilan bog'liq emasligini ko'rsatdi43, bu kalsifikatsiya mexanizmi tegishli organ yoki biologik kontekstga xos bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, inson buyragi to'qimalarida ionlarning (masalan, kaltsiy va fosfat) va kalsifikatsiya inhibitörlerinin (masalan, albumin, fetuin-A va apo) fiziologik kontsentratsiyasini ushlab turmaslik tufayli, bu erda tasvirlangan mineral-organik NPlar ham paydo bo'lishi mumkin. -A1) inson tanasi suyuqliklarida.

Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, mineral-organik NPlarning elektron zich qatlami va yadrosi zarrachalarning elektron lyuks joylariga nisbatan yuqori darajadagi oqsillar va organik molekulalarni o'z ichiga olishi mumkin (6A, B-rasm). Ushbu elektron zich qatlamlar TEM ostida ushbu materialning kristalli tabiatidan ko'rinib turibdiki, minerallashgan ko'rinadi (4A-J-rasmga qarang). Boshqa mualliflar, jumladan, Ryall41 va Evan va boshq.44, elektron-yorug'lik qatlami minerallarni, elektron zich qatlamlar esa organik molekulalarga mos kelishi mumkinligini taklif qilishdi. Ushbu talqinlar hech bo'lmaganda qisman har bir tadqiqotda namunalarni qayta ishlash va tekshirish usuli, shuningdek ishlatilgan boshlang'ich to'qimalarning tabiati bilan bog'liq bo'lishi mumkin.

Ektopik kalsifikatsiyada rol o'ynashdan tashqari, mineral-organik zarralar buyrak to'qimalarida yallig'lanishni keltirib chiqarishi mumkin. Biz yaqinda shuni ko'rsatdikki, mineral-organik NPlar inson makrofaglari tomonidan yallig'lanishga qarshi interleykin-1 sekretsiyasini qo'zg'atolmasa-da, 1 mkm dan katta mineral agregatlar buni qila oladi23. Kristalli materiallarga javoban interleykin{6}} ajralib chiqishi inflamasomalar deb ataladigan hujayra ichidagi molekulyar komplekslarning faollashuviga tayanishi ko'rsatilgan45-47. Bundan tashqari, mineral zarrachalar o'smalarni saqlaydigan buyraklarda aniqlangan va saraton va yallig'lanish o'rtasidagi bog'liqlik hozirda yaxshi tan olingan48. Agregatlangan mineral zarralar yallig'lanishni faollashtirishi va buyraklar yoki boshqa to'qimalarda yallig'lanish va saraton rivojlanishiga hissa qo'shishi mumkinligi tekshirilishi kerak.

Ektopik kalsifikatsiyadan tashqari, bu erda tasvirlangan mineral granulalar boshqa kasallik jarayonlarida ishtirok etishi mumkin. Misol uchun, biz ilgari mineral NPlar tana suyuqliklaridagi turli xil oqsillar bilan bog'lanishi va bu organik molekulalarni tana suyuqliklaridan tushirishi mumkinligini ilgari taklif qilgan edik20,26. Boshqa tomondan, inson tanasi normal sharoitda kalsifikatsiya inhibitorlari va retikuloendotelial tizim (ya'ni, makrofaglar) mavjudligiga tayanib, mineral NPlarning shakllanishi va to'planishiga to'sqinlik qilishi mumkin. Shunday qilib, mineral NPlar faqat tizimli yoki mahalliy kaltsiy gomeostazi buzilganda va inson tanasida himoya mexanizmlari ishlamay qolganda to'planishi mumkin.

Biz bu yerda ishlab chiqilgan nanomaterial yondashuv hayvon va inson to‘qimalarida mineralo-organik NP hosil bo‘lishini o‘rganishda foydalanish mumkinligini taklif qilamiz. Masalan, albumin, fetuin-A va apo-A1 kabi kalsifikatsiya inhibitori oqsillariga qarshi ko'tarilgan antikorlar hayvonlar modellari to'qimalarida mineralo-organik NP shakllanishini aniqlash va tavsiflash uchun mineral tahlil bilan birgalikda ishlatilishi mumkin. Ushbu yondashuv yordamida olingan natijalar tanadagi mineral zarrachalar shakllanishi va ektopik kalsifikatsiya holatini aks ettiruvchi biologik parametrlarni aniqlash uchun inson tanasi suyuqliklarida o'tkazilgan klinik o'lchovlarga qo'llanilishi mumkin. Biz ushbu bilim inson kasalliklari va ektopik kalsifikatsiya bilan bog'liq sharoitlarni oldini olish va davolash uchun yangi terapevtik strategiyalarni ishlab chiqishga olib kelishini kutamiz.

Usullari

Buyrak to'qimalari.Inson to'qimalaridan foydalanish va ushbu tadqiqotda o'tkazilgan tajribalar Chang Gung memorial kasalxonasining institutsional tekshiruv kengashi tomonidan tasdiqlangan; usullar va tajribalar tasdiqlangan ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. Bemorlardan yozma rozilik olindi. Sog'lom buyrak to'qimalari buyrak kasalligi tarixi bo'lmagan travma va gematomali bemorlarning biopsiyalaridan olingan (n=2); buyrak to'qimalari, shuningdek, buyrak saratoni bilan og'rigan bemorlardan (n=20) va transplantatsiya operatsiyasi paytida buyraklari olib tashlangan yoki biopsiya qilingan buyrak kasalligining oxirgi bosqichidagi bemorlardan (n=2) olingan (1-jadval). Buyrak saratoni to'qimalari uchun ushbu tadqiqotda to'qimalarning saraton bo'lmagan qismi ajratilgan va tahlil qilingan.

Gistologik tahlil.Buyrak to'qimalari kerosin bloklariga o'rnatildi. Bloklar qismlarga bo'lingan va to'qimalarning bo'laklari kerosinni olib tashlash uchun 30 daqiqa davomida 70 daraja issiq plastinkada isitilgan. Qolgan kerosinni to'liq olib tashlash uchun bo'limlar ksilenning yangi eritmasiga 15 daqiqa davomida uch marta botirildi. Bo'limlar har safar 5 daqiqa davomida 95 foiz, 80 foiz va 70 foiz etanol bilan regidratlangan. Regidratlangan namunalar 5 daqiqa davomida ikki marta distillangan suv (ddH2O) bilan yuviladi. Hujayra yadrolari gematoksilin bilan 8 daqiqa davomida bo'yalgan. Bo'yoq namunalardan 10 daqiqa davomida iliq suv bilan chiqariladi. Buyrak namunalari ddH2O da yuvilib, 95 foizli etanolga 10 marta botirildi. Etanol bilan ishlangan namunalar 1 daqiqa davomida eozin Y bilan qarama-qarshi bo'yalgan. Namunalar har safar 10 daqiqa davomida 95 foiz va 100 foiz etanol bilan suvsizlandi, so'ngra 10 daqiqa davomida ksilenda suvsizlanish bosqichi o'tkazildi. Yakuniy suvsizlangan buyrak namunalari 50% glitserinli shisha slaydlarga o'rnatildi va raqamli kamera bilan jihozlangan yorug'lik mikroskopida kuzatildi.

Parafinsizlangan va regidratlangan namunalar H&E bo'yash uchun ta'riflanganidek tayyorlangan. Regidratlangan qismlar kumush nitrat (5 foiz) bilan bo'yalgan, so'ngra 20 daqiqa davomida UV nuriga ta'sir qilgan. Eritma 15 daqiqa davomida ddH2O bilan yuviladi. Bo'limlar 5 daqiqa davomida natriy tiosulfat (5 foiz) bilan bo'yalgan, so'ngra 15 daqiqa davomida ddH2O bilan yuvilgan. Bo'limlar 5 minut davomida yadroviy tez qizil (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MI) bilan bo'yalgan. Bo'yalgan namunalar ksilenda 10 daqiqa davomida suvsizlantirishdan oldin har biri 10 daqiqa davomida 95 foiz va 100 foiz etanol bilan ketma-ket suvsizlandi. Buyrak namunalari shisha slaydlarga o'rnatildi va yuqorida aytib o'tilganidek tekshirildi.

Elektron mikroskopiya va EDX tahlili.Buyrak namunalari LGPS diseksiyon mikroskopi (Olimp, Tokio, Yaponiya) yordamida qalinligi 1 mm dan kam bo'lgan kichik bo'laklarga bo'lingan. To'qimalar 2,5 foiz glutaraldegid va 1 foiz paraformaldegid bilan 0.1 M kakodilat tamponida 4 daraja kechada mahkamlangan. Ruxsat etilgan namunalar uch marta 0.1 M kakodilat tamponida 8 foizli saxaroza (pH 7,2) bilan muz ustida 10 daqiqa davomida yuvildi. Yuvilgan to'qimalar muz ustida 2 soat davomida 1 foiz osmiy tetroksid va 1,5 foiz kaliy ferrosiyanidni o'z ichiga olgan fosfat tamponli sho'r suvda (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) inkubatsiya qilindi. To'qimalar ddH2O bilan muzda 10 daqiqa davomida uch marta yuvildi. Yuvilgan to'qimalar muz ustida ddH2O bilan uch marta yuvishdan oldin 1 soat davomida ddH2O tarkibida 1 foiz uranil asetat bilan bo'yalgan. Buyrak to'qimalari har safar 10 daqiqa davomida 30, 50, 70, 80 va 90 foizli etanol bilan suvsizlandi, etanol 70 foizga yetgan hollar bundan mustasno, bu holda namunalar bir kechada 4 daraja haroratda saqlanadi. To'qimalar 95% etanol bilan 5 daqiqa davomida suvsizlantirishdan oldin 15 daqiqa davomida 95% etanolda 1% fosfotungstik kislota bilan bo'yalgan. Namunalar 40, 57, 67 va 100 foiz propilen oksidiga har safar 10 daqiqa davomida etanolga botirildi, so'ngra yana 5 daqiqa davomida 100 foiz propilen oksidiga botirildi. Buyrak to'qimalariga har safar 1 soat davomida 50, 70 va 100 foizli Eponat 812 (Ted Pella, Redding, CA) bilan infiltratsiya qilingan. Eponat 812-koʻmilgan buyrak namunalari ikki marta 100 foizli Eponatga inkubatsiya qilish orqali tayyorlangan. O'rnatilgan namunalar qatron polimerizatsiyasini ta'minlash uchun bir kechada 60 daraja pechda inkubatsiya qilindi.

Yuqoridagi kabi olingan yuvilgan HS-NP granulalari glutaraldegid (2,5 foiz) va paraformaldegid (1 foiz) bilan ddH2O da 4 soat davomida 4 darajada mahkamlangan. Ruxsat etilgan granulalar har safar 10 daqiqa davomida ddH2O bilan uch marta yuvildi. Pelletlar 30, 50, 70, 80, 90, 95 va 100 foizli etanolda ketma-ket inkubatsiyalar bilan suvsizlandi, har safar 10 daqiqa davomida, etanol 70 foizga yetgan hollar bundan mustasno, bunda granulalar 4 daraja kechada saqlanadi. Boshqa etanol eritmalari faqat 10 daqiqa davomida granulalar bilan aloqa qildi. Suvsizlangan granulalar har birida 30 minut davomida etanol va LR muhitining (3:1, 1:1 va 1:3) turli nisbatlaridan foydalangan holda LR oq joylashtiruvchi vosita (Elektron Mikroskopiya fanlari, Hatfild, PA) bilan infiltratsiya qilindi. Pelletlar polimerizatsiyadan oldin bir kechada yangi LR muhiti (100 foiz) bilan infiltrlangan. LR muhiti bilan infiltrlangan pelletlar qatron polimerizatsiyasini ta'minlash uchun 2 kun davomida 60 daraja pechda inkubatsiya qilindi. Reichert Ultracut S mikrotomasi (Leica, Wetzlar, Germaniya) yordamida qalinligi 70-100 nm bo'lgan bo'laklarni hosil qilish uchun buyrak va HS-NP bloklari bo'lindi. 100 kV kuchlanishda ishlaydigan JEM 1230 transmissiya elektron mikroskopi (JEOL, Tokio, Yaponiya) ostida ko'rishdan oldin to'qimalarning qismlari 4 foizli uranil asetat bilan bo'yalgan. Xuddi shu tizim yordamida elektron diffraktsiya naqshlari olingan. Qo'llab-quvvatlash sifatida nikel panjaralari ishlatilgan.

EDX tahlili uchun buyrak to'qimalarining ingichka bo'laklari uranil asetat bilan bo'yalgan va yuqoridagi kabi ddH2O bilan yuvilgan, so'ngra elektron desikator shkafida quritilgan. Namunalar 120 kV kuchlanishda ishlaydigan yuqori aniqlikdagi JEM 2100 transmissiya elektron mikroskopi (JEOL) ostida kuzatildi. EDX spektrlari INCA Energy EDS tizimi (Oxford Instruments, Abingdon, Buyuk Britaniya) yordamida uch nusxada olingan. HS-NP ning ingichka bo'laklari bo'yashsiz kuzatildi.

Mineral-organik NPlarni tayyorlash.Barcha boshlang'ich eritmalar pH 7,4 ga sozlangan va ishlatishdan oldin 0.2 mkm membranalar orqali filtrlash orqali sterillangan. HS an'anaviy venipunktura usulidan foydalangan holda sog'lom inson ko'ngillilaridan olingan. Ushbu tadqiqotda inson biologik suyuqliklaridan foydalanish Linko Chang Gung memorial kasalxonasining institutsional tekshiruv kengashi tomonidan tasdiqlangan va ko'ngillilardan yozma ravishda xabardor qilingan rozilik olingan. HS-NPlar 3 mM CaCl2 va Na2HPO4 ni har biriga 10% HS ni o'z ichiga olgan DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) qo'shib, hujayra madaniyati sharoitida bir hafta davomida inkubatsiya qilish orqali tayyorlangan (37 daraja, 5 foiz CO2, namlangan havo). Zarrachalar 16,{14}} ×g haroratda 15 daqiqa davomida 4 darajada santrifüjlash orqali granulalarga aylantirildi va xuddi shu santrifüj yordamida HEPES buferi (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) bilan ikki marta yuvildi.

SDS-PAGE va Western blotting.SDS-PAGE va Western blot tahlillari asosan avvalgidek amalga oshirildi15. Qisqacha aytganda, 0.2 ug (5A,D-rasm) yoki 1,2 ug (5B,C-rasm) HS oqsillari, 47 ug (5A,B,D-rasm) yoki 590ug. HS-NP oqsillarining (5C-rasm), 0.1ug HSA (5A-D-rasm) va 0,6ug (5A, C, D-rasm) yoki {{23} },15ug HSF (5B-rasm) 5x "yuklash tamponida" eritildi (0,313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 foiz SDS, 0,05 foiz bromofenol ko'k, 50 foiz glitserin, 12,5 foiz - merkaptoetanol) yakuniy konsentratsiyasini 1x ga qadar 95 daraja qizdirishdan oldin 5 minut va denaturatsiya va qaytaruvchi sharoitlarda 10 foizli SDS-PAGEda mini-jel tizimi yordamida ajratishdan oldin (Xoefer, Holliston, MA). NP nazorati (5A-D-rasmning 1-bo'lagida ishlatilgan) har biri DMEMga (yakuniy hajm 1ml) 3 mM CaCl2 va Na2HPO4 qo'shib tayyorlangan mineral NPlardan iborat bo'lib, hujayra madaniyati sharoitida bir kun davomida inkubatsiya qilinadi; zarralar 16,000 ×g 15 daqiqa davomida santrifüjlash orqali granulalarga aylantirildi, ikki marta HEPES buferi bilan yuvildi va 50ul HEPES buferida qayta suspenziya qilindi. Yuqoridagi kabi SDS-PAGE uchun 20ul qayta suspenziyalangan zarrachalarning alikvoti qayta ishlandi. PVDF membranalari xona haroratida 5 foiz (v/v) yog'sizlangan sutda 1 soat davomida bloklandi. Yuqorida tavsiflanganidek, uyda ishlab chiqarilgan birlamchi antikorlar25 1:1,000 (-apo-A1 va -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) suyultirilganda ishlatilgan. , yoki 1:6,000 ( -HSA). Echkiga qarshi quyon otlari peroksidaza bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikor ishlab chiqaruvchi (Millipore, Billerica, MA) tomonidan taqdim etilgan ko'rsatmalar asosida ishlatilgan. Blotlar yaxshilangan kimilyuminesans (Amersham Biosciences, Amersham, Buyuk Britaniya) va avtoradiografik filmlar yordamida aniqlandi.

Immunogold belgilari.TEM kuzatuvi uchun namunalar tayyorlandi. HS-NP bloklari qalinligi 70 nm dan kam bo'laklarga bo'lingan. To'rlardagi namuna bo'laklari 25 daqiqa davomida 0.1 M HEPES buferida (pH 8,0) 1 foizli baliq jelatini (Sigma) bilan bloklandi. To'rlar quyidagi asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilindi: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Salbiy nazoratda birlamchi antikor yo'q edi (HEPES buferidagi 1 foiz baliq jelatini). Kuluçka qilingan qismlar HEPES buferi bilan 15 daqiqa davomida yuvildi. Yuvilgan qismlar HEPES buferida 1 foizli baliq jelatini bilan 20 daqiqa davomida bloklandi. Namunalarga 1 soat davomida ikkilamchi 5-nm-oltin-konjugatli echki quyonlarga qarshi IgG bilan ishlov berildi. Namunalar HEPES buferi bilan 10 daqiqa davomida yuvilgan, ddH2O bilan 10 daqiqa yuvishdan oldin. TEM kuzatuvlari yuqoridagi kabi amalga oshirildi.

Floresan mikroskopiyasi.Yuqoridagi kabi tayyorlangan buyrak to'qimalarining gistologik slaydlari xona haroratida 1 soat davomida 1 foiz sigir zardobi albumini bilan bloklandi. Slaydlar birlamchi poliklonal antikorlar bilan 1:4,000 suyultirilgan holda inkubatsiya qilindi. Yuvish bosqichlaridan so'ng, namunalar ikkilamchi antikorlar echki-quyon-FITC (492/520nm) va echki-quyonga-TRITC (550/570nm) (Jekson Immuno Research, West Grove, PA) bilan 1:100 da inkubatsiya qilindi. 1 soat. Komplekslar 15 daqiqa davomida PBST bilan yuviladi. 4′,{18}}diamidino-2-fenilindol (DAPI) floresan bo‘yog‘i 10 ug/ml da 15 daqiqa davomida ishlatilgan. DAPI bilan bo'yalgan namunalar har biri 10 daqiqa davomida 95 va 100 foizli etanol bilan suvsizlandi, so'ngra yana 10 daqiqa davomida ksilenda suvsizlandi. Suvsizlangan buyrak namunalari Vectashield floresan H-1000 oʻrnatish muhiti (Vector Laboratories, Burlingame, CA) bilan oʻrnatildi va Spot Flex kamerasi bilan jihozlangan konfokal mikroskop (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Germaniya) ostida kuzatildi.

Cistanche tubulosa buyrak kasalligining oldini oladi, namunani olish uchun shu yerni bosing

Ma'lumotnomalar

1. Giachelli, CM Ektopik kalsifikatsiya: yumshoq to'qimalarning minerallashuvi haqida qattiq faktlarni to'plash. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Qon tomirlarining kalsifikatsiyasi: mexanizmlar va klinik oqibatlar. Arterioskler Thromb Vasc Biol 24, 1161-1170 (2004).

3. Aleksopulos, N. & Raggi, P. Aterosklerozda kalsifikatsiya. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Tizimli kalsifikatsiyalangan ateroskleroz uchun naqshlar va xavf omillari. Arterioskler Thromb Vasc Biol 24, 331-336 (2004).

5. Ketteler, M. va boshqalar. Dializ bilan og'rigan bemorlarda kaltsiyni tartibga soluvchi oqsillarning etishmasligi: uremiyada yurak-qon tomir kalsifikatsiyasining yangi kontseptsiyasi. Buyrak Int Suppl 84, S84-87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Qon tomirlarining kalsifikatsiyasini maqsad qilib olish: qattiq nishonni yumshatish. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM. Tomirlarning silliq mushak hujayralaridan olingan matritsa pufakchalarini kaltsiy bilan tartibga solish. Trends Cardiovasc Med 22, 133-137 (2012).

8. Doherty, TM va boshqalar. Aterosklerozda kalsifikatsiya: suyak biologiyasi va arterial chorrahada surunkali yallig'lanish. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Xan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Randallning kollagen tolalari va membrana pufakchalari bilan plitalari assotsiatsiyasi. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Narx, PA, Nguyen, TM & Uilyamson, MK. Sarum homila-mineral kompleksining biokimyoviy tavsifi. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Narx, PA, Uilyamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Homila-mineral kompleksining sarum darajalari kalamushdagi arteriya kalsifikatsiyasi bilan bog'liq. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. va boshqalar. Kaltsiy fosfat zarralarini shakllantirish va barqarorlashtirishda fetuin-A va kislotali sarum oqsillarining ierarxik roli. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. va boshqalar. Nano-analitik elektron mikroskopiya insonning yurak-qon tomir to'qimalarining kalsifikatsiyasi haqida asosiy tushunchalarni ochib beradi. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD. Inson qonidagi nanobakteriyalar kaltsiy karbonat nanozarrachalari sifatida ko'rsatilgan. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD va boshqalar. Taxminiy nanobakteriyalar normal kaltsiy gomeostazining fiziologik qoldiqlari va madaniy qo'shimcha mahsulotlarini ifodalaydi. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD va boshqalar. Pleomorf mineral-oqsil komplekslari va taxminiy nanobakteriyalarning prekursorlari sifatida zardobdagi kaltsiy va apatit granulyatsiyasining xarakteristikasi. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineral komplekslari qon zardobidagi kaltsiy granulalari va taxminiy nanobakteriyalarga o'xshash: er-xotin inhibisyonni ekish kontseptsiyasining namoyishi. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Nanobakteriyalarning ko'tarilishi va tushishi. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD. Madaniyatda oziqlantiruvchi sifatida foydalaniladigan gamma-nurlangan sarumni tanqidiy baholash va taxminiy nanobakteriyalar va kalsifikatsiya qiluvchi nanozarrachalarni namoyish qilish. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. va boshqalar. Inson tanasi suyuqliklaridan olingan va suyuq xromatografiya-tandem massa spektrometriyasi orqali tahlil qilingan mineral nanopartikullarning keng qamrovli proteomik tahlili. Anal Biochem 418, 111-125 (2011).