Dizel egzoz ta'siri zebrafish miyasidagi neyrodegeneratsiyaga ta'sir qiluvchi tarmoqlarning ifodasini o'zgartiradi 2-qism

Protein namunasini tayyorlash

Protein namunalarini tayyorlash uchun 8{4}} dan 100 tagacha anesteziya qilingan lichinkalar (5 pdf) boshlari ehtiyotkorlik bilan ajratildi va 15% oldindan sovutilgan TCA/asetondan iborat 0,07% beta-merkaptoetanol (ME) dan iborat lizis buferiga o'tkazishdan oldin PBS bilan yuvildi. )va proteaz inhibitori kokteyli (ishlab chiqaruvchiga kerak) umumiy hajmi 500 ul.

So'nggi yillarda protein namunalarining xotiraga ta'siri katta qiziqish uyg'otdi. Tobora ko'proq odamlar dietaning salomatlik uchun muhimligini, ayniqsa, oqsilning inson organizmidagi muhim rolini tushuna boshladilar.

Proteinlar inson tanasining asosiy qurilish materiallari bo'lib, ular inson tanasida muhim rol o'ynaydi. Shu sababli, oqsil namunalari ko'plab odamlar uchun sog'liq va go'zallikka intilishda muhim kanalga aylandi. Protein namunalari mushaklarni qurish va tanani haykalga solishdan tashqari, inson xotirasini ham yaxshilaydi.

Ba'zi olimlar oqsillar va xotira o'rtasidagi munosabatni o'rganishdi. Ular etarli miqdorda proteinni uzoq muddatli iste'mol qilish jismoniy salomatlikning barcha jihatlari, ayniqsa xotira uchun foydali ekanligini aniqladilar. Ratsiondagi protein iste'moli miya faoliyati va xotiraga muhim ta'sir ko'rsatishi haqida ko'proq dalillar mavjud.

Protein inson miyasidagi neyronlarning muhim tarkibiy qismidir, shuning uchun kunlik protein iste'moli odamlarning xotirasi va fikrlash qobiliyatiga muhim ta'sir ko'rsatadi. Proteinni uzoq muddatli iste'mol qilish nafaqat organizmning protein ehtiyojlarini qondiradi, balki miyaning faol va sog'lom bo'lishiga yordam beradi.

Bundan tashqari, oqsil ham organizmga qon shakar muvozanatini saqlashga va barqaror kayfiyatni saqlashga yordam beradi. Bu xotira va fikrlash qobiliyatlarini saqlash uchun juda muhimdir. Shuning uchun proteinni o'rtacha iste'mol qilish inson tanasining turli kognitiv funktsiyalari va hissiy holatini yaxshilashga yordam beradi.

Umuman olganda, oqsil namunalari va xotira o'rtasida kuchli bog'liqlik mavjud. Proteinni iste'mol qilishni ko'paytirish miya va tanangizni sog'lom saqlashga yordam beradi, fikrlash qobiliyatlari va xotirani yaxshilaydi. Xotirani yaxshilashga muhtoj bo'lgan odamlar uchun tegishli miqdorda protein iste'mol qilish juda zarur. Sog'lom tana va o'tkir fikrni saqlash uchun proteinli ovqatlarni to'g'ri iste'mol qilishimiz va oqilona ovqatlanishga e'tibor berishimiz kerak. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola antioksidant, yallig'lanishga qarshi va qarishga qarshi ta'sirga ega, bu miyadagi oksidlanish va yallig'lanish reaktsiyalarini kamaytirishga yordam beradi va shu bilan miyani himoya qiladi. asab tizimining salomatligi. Bundan tashqari, Cistanche deserticola asab hujayralarining o'sishi va tiklanishiga yordam beradi, shu bilan neyron tarmoqlarning ulanishi va funktsiyasini oshiradi. Ushbu ta'sirlar xotira, o'rganish va fikrlash tezligini yaxshilashga yordam beradi, shuningdek, kognitiv disfunktsiya va neyrodegenerativ kasalliklarning rivojlanishiga to'sqinlik qilishi mumkin.

Xotirani kuchaytirish uchun bilish qo'shimchalarini bosing

Qisqa gomogenizatsiyadan so'ng oqsillar 20 daraja haroratda 12 soat cho'ktirildi, so'ngra 12,{3}} aylanish tezligida 5 minut 4 daraja santrifüj qilindi. Supernatant olib tashlandi va proteinpellet ikki marta sovuq aseton bilan yuvildi (tarkibida 0.07% ME va proteaz inhibitori kokteyllari). Yakuniy protein pelleti 7,0 M karbamid o'z ichiga olgan lizis buferida eritildi, va sonicationon muz bilan 2,0 M tiokarbamid.

Eriydigan oqsil namunalari erimaydigan zarrachalarni cho'ktirish uchun 15,{1}} rpm 10 daqiqa davomida 4 darajada santrifüj qilindi va yakuniy oqsil namunalarining konsentratsiyasi Bredford usuli yordamida o'lchandi.

TMT asosidagi yuqori o'tkazuvchanlik proteomik tahlili

Tripsin va liz-C proteazlarini ketma-ket qo'shish orqali namunalar qisqartirildi, alkillanadi va hazm qilindi. Keyin peptidlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq 10-plexTMT izobarik teglari yordamida etiketlandi. Belgilangan namunalar aralashtiriladi va keyin yuqori pH teskari fazakromatografiya yordamida mayda qismlarga bo'linadi.

So'ngra individual fraktsiyalar LC-MS/MS orqali onlayn teskari fazaxromatografiya va Thermofsher Fusion Lumos massa spektrometrida tandem massa spektrometriyasi yordamida tahlil qilindi. Ma'lumotlar yuqorida tavsiflanganidek sinxron prekursor tanlashga asoslangan MS3 usuli yordamida olingan (McAlister va boshq. 220). Ma'lumotlar bazasini qidirish va TMT reportyorining ion ma'lumotlarini olish MaxQuant dasturiy platformasi yordamida amalga oshirildi (Cox and Mann 2008).

TMT ma'lumotlarini namunalar bo'ylab taqqoslash MSStats (Choiet boshq. 2014) yordamida amalga oshirildi. Transkriptomik tahlil Taxminan 80-100 bosh anesteziya qilingan embrionlardan ajratildi (120 soat), PBS bilan yuvildi va Trizol (Sigma Aldrich) yordamida umumiy RNK ekstraktsiyasiga duchor qilindi. , AQSh) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq reagent.

RNK sifati va miqdori NanoDrop2000 spektrofotometri (Thermo Scientific, MA) va keyinchalik Agilent 2100 Bioanalyzer tomonidan 50 ng/ul minimal konsentratsiya va RNK yaxlitlik raqami (RIN) 8 ga teng bo'lishini ta'minlash uchun baholandi. So'ngra kutubxona tayyorlash Illuminaac HiSeq0040 yordamida amalga oshirildi. protokoli: "Ribo-Zero Gold bilan TruSeqStranded Total RNK Library Prep ish jarayoni" va namunalar quyidagi shartlarga muvofiq tartiblangan: "Paired End run, R1=75 sikl (antisens strand), Index=8 sikllar, R2=75 sikl (sezgi zanjiri)."

Ma'lumotlarni tahlil qilish

Proteomik va transkriptomik tadqiqotlar uchun ikkala ma'lumotlar to'plami bir vaqtning o'zida Metascape onlayn vositasi yordamida yuklandi va tahlil qilindi, bu turli xil turlar, jumladan Danio rerio (Chjou va boshq. 2019) uchun gen izohlash imkonini beradi. Ingenuity Pathways Analysis (IPA) dasturidan foydalanish orqali tahlil qilingan (Krämer va boshq. 2014).

Ilovaga gen yoki oqsil identifikatorlari va tegishli ifoda qiymatlarini o'z ichiga olgan ma'lumotlar to'plamlari yuklandi. Har bir identifikator Ingenuity bilimlar bazasida mos keladigan ob'ekt bilan taqqoslandi.

Ekspressiyasi differensial tartibga solinadigan molekulalarni aniqlash uchun ifoda oʻzgarishining 1.3-katta chegarasi oʻrnatildi. Funktsional tahlil maʼlumotlar toʻplamida eng muhim boʻlgan biologik funksiyalar va/yoki kasalliklarni aniqladi. Tahlil qilish uchun ma'lumotlar to'plamidan kesilgan va biologik funktsiyalar bilan bog'liq bo'lgan molekulalar ko'rib chiqildi. Right-tailedFisherning aniq testi p-qiymatini hisoblash uchun ishlatilgan, bu ma'lumotlar to'plamiga tayinlangan har bir biologik funktsiya va/yoki kasallikning faqat tasodifga bog'liq bo'lishi ehtimolini aniqlaydi.

Yo'lni tahlil qilish

Proteom ortranskriptom profilidagi o'zgarishlarning muayyan yo'llardagi hissasini baholash uchun ikkala ma'lumotlar to'plami IPA dasturiga yuklandi (Krämer va boshq. 2014). Eng muhim o'zgartirilgan kanonik yo'llar, keyin quyida tavsiflanganidek, PCR va western blotting yordamida baholandi va talqin qilindi.

Western bloting

Jami 25 mkg oqsil 12% NuPAGE (Novex, CA) ga yuklangan va tavsiflanganidek PVDFmembranlarga (Novex, CA) oʻtkazilgan (MahmoudianSani va boshq. 2017; Rafee va boshq. 2019). Membranalar Tris-buferli tuzli 5% yog'siz sut va 30 minat xona harorati uchun 0,01% tween 20 (TBST buferi) bilan bloklandi va keyin quyon poliklonal anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) yoki sichqonchani anti-APG monoklon bilan 4 daraja tunda inkubatsiya qilindi. Abcam, CA), 1% yog'siz sutni o'z ichiga olgan TBST buferida suyultiriladi.

TBST da yuvilgandan so'ng, dog'lar 2 soat davomida quyonga qarshi HRP (Abcam, CA) yoki echki sichqonchaga qarshi HRP (Santa Kruz, CA) antikorlari bilan inkubatsiya qilindi, so'ngra Pierce™ ECL Plus western blotting substrati bilan ishlab chiqildi( Thermo Fisher Scientific, AQSh). Bantlar LI-COR skaneri yordamida tasvirlash yoʻli bilan tasvirlangan va densitometriya (LI_COR Biosciences, NE) orqali tahlil qilingan.

Haqiqiy vaqtda PCR

Jami RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan TRIzol reagenti (Sigma Aldrich, Sent-Luis, AQSh) yordamida kallaklardan ajratildi va keyin NanoDrop 2000 spektrofotometri (Thermo Scientific, MA) yordamida o'lchandi. Har bir RNK namunasining 1 ug miqdori iScript™ teskari transkripsiya supermixi (Bio-Rad, CA) yordamida teskari transkripsiya qilingan, real vaqtda PCR SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA) yordamida amalga oshirilgan va primerlar ro‘yxatga olingan. Qo'shimcha 1-jadvalda. Nisbiy ifoda darajalari 2−DCT usuli yordamida hisoblab chiqilgan va muhim farqlarni baholash uchun statistik T-testidan foydalanilgan.

Natijalar va muhokama

Proteomik va transkriptomik tahlillar kasallik jarayonlarining molekulyar mexanizmlarini va atrof-muhit stimullariga javobni tushunish uchun ikkita asosiy vositadir (Duan va boshq. 2017; García-Estrada va boshq. 2013; Jami va boshq. 2014a, b, 2015; Kosalkova va boshq.2012) . Bu erda biz DEPe ta'siriga uchragan zebrafish embrionlarining boshlarida transkriptomik va proteomik darajalarda chuqur ifoda tahlillarini o'tkazdik.

Ko'pincha miya to'qimalaridan tashkil topgan boshlar boshqa to'qimalarning ifoda profillarini yo'q qilish uchun ajratilgan, chunki biz markaziy asab tizimining ichki patologik yo'llarini aniqlashdan manfaatdormiz.

Zebrafishembrion boshlarining ifoda profili

Profil tahlili 26000 dan ortiq kodlovchi gendan 11172 ta aniqlangan oqsil va 14748 mRNK nishonini berdi (Howe va boshq. 2013). TMT bilan belgilangan namunalardan aniqlangan 11 172 oqsil orasida (2-jadval) 141 ta oqsil sezilarli darajada yuqori tartibga solingan va 607 tasi pastga tushirilgan (3-jadval va 1a-rasm). Xuddi shunday, RNK-seq tahlilida aniqlangan 14748 transkript (4-jadval) orasida 367 ta transkript yuqori tartibga solingan va 149 tasi pastga tushirilgan (1b-rasm va 5-jadval).
Aksariyat hollarda yuqori tartibga solinadigan proteomik va transkriptomik tahlillarning natijalari mos edi. Masalan, yuqori darajada yuqori tartibga solinadigan oqsillar qatoriga sitoxrom P450 Cyp1a, Cyp1c1, guanininukleotidni bog‘lovchi oqsil subbirligi gamma, Annexin, Pleksin B2b qisqa izoformi, dehidrogenaza/reduktaza (SDR oilasi) a'zosi 13-1 kabi, S-landinal, gretinagen kiradi. (arrestin) b va Sulfotransferaza6B1.

Xuddi shunday, eng yuqori transkriptomikupregulyatsiyaga ega bo'lgan genlar orasida sitoxrom P450 (Cyp1a), kimokin (C-C motivi) ligand 27a, aril-uglevodorod retseptorlari repressor A, sitoxrom P450 (Cyp1b) va Rh oilasi C glikoproteinlari va trakriptoproteinlar, qo'l oqsillari kiradi. har doim ham yuqori darajada bog'liq emas edi.

Masalan, Kompleksin 2, Spektrin alfa, Kardiyak miyozin engil zanjiri-1, SEC23 oʻzaro taʼsir qiluvchi oqsil, ATPsintaza membranasining subbirligi EA, Sitokrom b va NADga bogʻliq protein deasetilaz yuqori darajada pastga tartibga solinadigan oqsillar qatoriga kiradi, retinal tashqi segment membranasi oqsili 1. , eruvchan tashuvchisi oilasi 5 (yod tashuvchisi), FBJ murin osteosarkomasi virusli onkogen homolog B, kompleksin 4c, FOSga o'xshash antigen 1a, opsin 1 va v-fos transkripsiyaning eng yuqori pastga regulyatsiyasini ko'rsatadi (1 va 2-jadvallar).

Zebrafish oqsillarini taniydigan antikorlar cheklangan, ammo biz western blot tahlili yordamida bu o‘zgarishlar namunasini tasdiqladik. Cyp1A oqsilining yuqori regulyatsiyasi va Kompleksin 2 (CPLX2) ning pastga regulyatsiyasi yuklanish nazorati sifatida GAPDH yordamida tasdiqlangan (2a-rasm). TAT va UGT1B1 transkripsiyasining yuqori darajalari va CHNRB va TH2 ning past darajalari ham ichki nazorat sifatida Elf-alfa yordamida qPCR tomonidan tasdiqlangan (2b-rasm).

Gen izohi

Foydali ma'lumotni ongen annotatsiyasi bilan ta'minlaydigan bir nechta onlayn bioinformatika vositalari va dasturiy ta'minot mavjud. Ular orasida Danio rerio uchun gen izohlash qobiliyatiga ega Metascape (Zhouet al. 2019) ushbu ishda ishlatilgan.

Proteomik va transkriptomik tadqiqotlar uchun ikkala ma'lumotlar to'plami bir vaqtning o'zida ushbu onlayn vosita yordamida yuklandi va tahlil qilindi. Dasturda ikkala proteomik va transkriptomik o'zgarishlarning natijasini birlashtirgandan so'ng, ksenobiotik stimulga javob, ksenobiotiklarning metabolizmi, P450 sitoxrom rcadiane regulyatsiyasi va regulyatsiyasi kabi bir nechta jarayonlar. DEPE bilan davolash natijasida aniqlangan (3a-rasm).

Ushbu tahlil shuningdek, "Vizual idrok etish", "Fototransdüksiya" va "G oqsili bilan bog'langan retseptorlarni ichkilashtirish" kabi biologik jarayonlarning bostirilgan darajalarini taklif qildi. Ko'rish bilan bog'liq ifoda profilidagi o'zgarishlar kutilmagan emas edi, chunki erta rivojlanish davrida DEPe davolashda ko'zlar kichikroq bo'lgan (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Ksenobiotik metabolizm signalizatsiyasi

Chet el tabiiy yoki sintetik kimyoviy birikmalar bo'lgan ksenobiotiklar hujayrali stress reaktsiyasini qo'zg'atishi mumkin, bu differentsiatsiya, proliferatsiya, apoptoz yoki nekrozga olib keladi. Darhaqiqat, organizm o'zini ksenobiotiklardan, shuningdek, zaharli endogen birikmalar va ularning metabolitlaridan, ularni yo'q qilish va detoksifikatsiya qilishda ishtirok etadigan fermentlar va tashuvchilarni ifodalash orqali faol himoyalanishi kerak.

Bu fermentlar uch guruhga bo'linadi: ksenobiotiklarga qutblilikni kirituvchi faza I fermentlari (CYP, ALDH, FMO); II faza fermentlari (UGT, GST, SULT) sulfat, glyukuron kislotasi va glutation kabi gidrofil molekulalarni ksenobiotiklarga konjugatsiya qilish orqali gidrofillikni ta'minlaydi; va II fazali fermentlarni (MDR1, OATP2, MRP) II hosil bo'lgan ksenobiotiklarni yoki konjugazalarni tashuvchi fermentlar. hujayradan tashqari hududga.

Ushbu fermentlar o'ziga xos retseptorlarni (CAR, PXR, AHR) va MAPK vositachiligida transkripsiya omillarini faollashtirishni (NRF2, MAF) o'z ichiga olgan signal kaskadlari orqali induktsiya qilinadi (Omiecinski va boshq. 2011).

Aktivatorlar bo'lmasa, konstitutsiyaviy faol retseptor (CAR) CCRP va HSP90 bilan kompleks sifatida sitoplazmada joylashgan. Ammo aktivator mavjud bo'lganda, CAR yadroga o'tadi va geterodimer hosil qilish uchun RXR bilan bog'lanadi va DR3, DR4, ER6 va ER8 kabi takroriy motivning bir nechta variantlari bilan bog'lanadi va gen ekspressiyasini tartibga solishga hissa qo'shadi (2-jadval).

Bizning proteomik tahlilimiz ksenobiotik metabolizmning faollashuvini aniqladi. Haqiqatan ham, CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (gem oksigenaza 1), CAT (katalaza) va CES1 (karboksilesteraza 1) ning aniq ko'tarilishi I faza metabolizmining indüksiyasini ko'rsatadi, shu bilan birga UGT1A1 (UDP glyukuronosiltransferaza a'zosi (GP1ST1 va GP1)) ning ko'payishini ko'rsatadi. glutationS-transferaza pi 1) faza II metabolizmining faollashuvini ko'rsatadi.

Qizig'i shundaki, SULT1A1 (sulfotransferaza oilasi 1A a'zosi 1), SULT1C2 (sulfotransferaza oilasi 1C a'zosi 2) va SULT2B1 (sulfotransferaza oilasi 2B a'zosi 1) kabi sulfat transferazalarining pastga regulyatsiyasi konsentratsiyali metabolizm va tendentsiyalarning ikkinchi bosqichida gidrofilizmning ortishi bilan bog'liqligini ko'rsatadi. , lekin sulfat konjugasiyasi emas (4-rasm).

Transkriptomik tadqiqot natijalari juda mos keladi, chunki CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 va UGT1A1 RNK darajasida yuqori tartibga solinadi. Biroq, SULT2B1 RNK darajasida yuqori regulyatsiyani ko'rsatadi (protein darajasida kam ifodalangan holda).

Bu DEPe bilan sulfat transferaza fermenti supon bilan davolashning degradatsiyasini yoki inaktivatsiyasini keltirib chiqaradigan boshqa mexanizmlarning ishtiroki bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Ajablanarlisi shundaki, ksenobiotik metabolizmidagi bu o'zgarishlar baliqning boshlarida (ehtimol miyasida) sodir bo'lgan. Ksenobiotik genlarning ekspressiyasi sutemizuvchilarning asab tizimida tasvirlangan, ammo bu ularning zebrafish miyalarida birinchi hisoboti (McMillan and Tyndale 2018).

Ushbu topilmalar Shankar va uning hamkasblari tomonidan o'tkazilgan shunga o'xshash tadqiqotga mos keladi, ular turli xil ekologik polisiklik aromatik uglevodorodlar (PAH) guruhlarining embrionlarning rivojlanishiga ta'sirini sinab ko'rdilar va har bir davolash rejimining transkriptom profiliga ta'sirini yanada baholadilar.

48 ot urug'lantirilgan (hpf) embrionlarning butun tanasida ular Cyp1a ning transkripsiya va oqsil darajasida yuqori regulyatsiyasini ksenobiotik AHR faollashuvi va quyi oqimdagi transkriptomik o'zgarishlarning erta ishonchli biomarkeri bo'lishini ko'rsatdi (Shankar va boshq. 2019).

NRF{0}}vositachi oksidlovchi stress javobi

Oksidativ stress apoptoz va nekrozni qo'zg'atishi mumkin va neyrodegeneratsiyada ishtirok etishi mumkin (Ahmadinejad va boshq. 2017; Jami va boshq. 2014b, 2015). Oksidlanish stressiga asosiy hujayra himoya javobi antioksidant va detoksifikatsiya qiluvchi fermentlarning induktsiyasidir.

Yadro omili-eritroid 2-bog'liq 2 (Nrf2) omil antioksidant javob beruvchi promotorlar (ARE) bilan bog'lanadi va ularning transkripsiyasini faollashtiradi. Faol bo'lmagan Nrf2 aktinni bog'laydigan proteinKeap1 bilan bog'langan va sitoplazmada saqlanadi.

Oksidlanish stressi bilan qo'zg'atilgan Nrf2 protein kinaz C, fosfatidilinositol 3-kinaz va MAP kinaz yo'llariga javoban fosforlanadi. Fosforlangan Nrf2 keyinchalik yadroga o'tishi va AREs bilan bog'lanishi va detoksifikatsiya qiluvchi va antioksidant fermentlarni faollashtirishi mumkin (3-qo'shimcha jadval) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com