Echinacoside hujayra proliferatsiyasini rag'batlantiradi va o'sish faktorini- 1 ifodasini yuqori tartibga solish orqali ichak epitelial MODE-K hujayralarida hujayra apoptozini oldini oladi

Aloqa: Audrey Xu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuxay Guo va Kaygan Du

Abstrakt

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) irritabiy ichak sindromi yoki qabziyatni davolash uchun o'simlik tibbiyotida laksatif o'simlik sifatida keng qo'llanilgan vacistanche dan echinacoside(ECH) bu o'simlik tarkibidagi asosiy biologik faol moddalardan biridir. Bizning maqsadimiz ECH ning ichak epiteliya hujayralarining o'sishi va o'limiga ta'sirini o'rganish edi. MODE-K, ichak epitelial hujayra liniyasi, ichakning in vitro modeli sifatida ishlatilgan. Hujayra proliferatsiyasi metil tiazol tetrazolium (MTT) tahlili bilan o'lchandi. Hujayra apoptozi Annexin-V bo'yash bilan aniqlandi. Bu erda biz madaniyatli MODE-K hujayralarida ECH H2O2 yoki yallig'lanishga qarshi sitokinlar aralashmasi ishtirokida hujayra apoptozini kamaytirish orqali hujayra proliferatsiyasini sezilarli darajada rag'batlantirganini va o'sish omilini (TGF) o'zgartirishini ko'rsatdi- 1 ifoda dozaga bog'liq tarzda yuqori tartibga solindi. TGF- 1 ifodasini nokaut qilish ECH ning proliferativ va sitoprotektiv faolligini buzdi, bu esa anti-TGF- 1 antikorlari yordamida TGF- 1 faolligini neytrallash bilan tasdiqlandi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, ECH o'simlik C. deserticola va boshqalarning bioaktiv tarkibiy qismlaridan biri sifatida ichak epiteliya hujayralarining ko'payishini rag'batlantirish va TGF-ni yuqori tartibga solish orqali hujayra o'limini oldini olish orqali shilliq qavat to'qimalarining tiklanishini yaxshilashi mumkin.

Kalit so'zlar: Cistanche deserticola, ichak epiteliysi, hujayra proliferatsiyasi, hujayra apoptozi, transformatsion o'sish omili (TGF)-

Kirish

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) odatda Xitoy o'simlik tibbiyotida Rou Cong Rong nomi bilan tanilgan va u tibbiyotda qo'llanilishi tufayli Xitoyda yangi ekinga aylandi (1). Uning klinik foydasi ko'plab sog'liq muammolarini davolashda qayd etilgan, jumladan surunkali ich qotish (2, 3) va uning foydali ta'siri ichakdagi laksatif faolligi bilan bog'liq; u najasni namlashni kuchaytiradi, bemorlarda ichak harakatini rag'batlantiradi (4, 5), shuningdek, hayvonlar modellarida (6, 7). Bizning yaqinda o'tkazilgan tadqiqot shuni ko'rsatdiki, C. deserticolaning suv ekstrakti og'iz orqali yuborilishi kolorektal saratonga moyil bo'lgan sichqonlarning ichaklarida yallig'lanish giperplaziyasi sonini sezilarli darajada kamaytiradi (8).

Cistanche dan echinacoside (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>Jami PhG ning 50 foizi) C. deserticola (9) dan ajratilgan va C. deserticola o'z ichiga olgan laksatif dori Ronggui Tongbian Capsule (10) sifatini nazorat qilish yoki etishtirilgan C. deserticola ishlab chiqarish sifatini nazorat qilish uchun biomarker sifatida ishlatilgan. (11). ECH ham Parkinson kasalligining hayvon modelida (12, 13) va o'pka shikastlanishi modelida (14) va madaniy feokromotsitoma hujayralarida (PC12) (15, 16) sitoprotektiv ekanligi ko'rsatilgan; va u inson fibroblastik hujayralarining (MRC-5) hujayra bo'linishini kuchaytirishi ko'rsatilgan (17). Ushbu tadqiqotda ichak kasalliklarini davolashda C. deserticola o'z ichiga olgan o'simlik dori vositalarining farmakologik ta'sirini tushunish uchun C. desertikolaning asosiy bioaktiv moddasi sifatida ECH ning hujayra ko'payishi va madaniyatli ichak epitelial hujayralarida omon qolishiga ta'siri o'rganildi. .

Materiallar va uslublar

Hujayra madaniyati

MODE-K - bu C3H/HeJ sichqonlaridan (18) olingan ichak epitelial hujayra chizig'i bo'lib, u doktor Teodor Shtayner (Vankuver qirg'oq sog'lig'i tadqiqot instituti, Vankuver, Kanada) tomonidan taqdim etilgan. MODE-K xujayralari Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM) o'stirildi, havo atmosferasida 5 foiz CO2 ostida 37 darajada 10 foiz homila sigir zardobi (FBS) bilan to'ldiriladi.

cistanche dan echinacoside (ECH) tayyorlash

ECH (cistanche dan echinacoside) tijoriy C. tubulosa ekstraktidan (tarkibida 70 foizdan ortiq yoki unga teng ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Xanchjou, Xitoy) qayta-qayta etanol ekstraksiyasi orqali tozalandi, so'ngra havo- kimyoviy dudbo'ronda quritish. Qolgan modda liyofilizatsiya orqali qo'shimcha quritilgan. Yakuniy mahsulotdagi ECH yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi bilan tasdiqlangan (1-rasm).

Transformatsiya qiluvchi o'sish omili (TGF)- 1 ifodasini nokaut qilish

MODE-K hujayralarida TGF- 1 ifodasi TGF- 1 transkriptiga (19) qarshi shRNKning barqaror ifodasi bilan nokaut qilindi. Qisqasi, sichqoncha TGF- 1 mRNK (5′-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3′) va oʻziga xos boʻlmagan boshqaruv (shifrlangan) (5′-AAT CGC) maqsadli shRNK yaratish uchun qisqacha oligonukleotidlar ketma-ketligi. ATA GCG TAT GCC GTT-3') ilgari tasvirlangan (19, 20) va ular Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, AQSH) tomonidan sintez qilingan. Har bir ketma-ketlik pHEX-siRNA vektoriga bog'langan (21). Vektorlar ishlab chiqaruvchining protokoliga binoan Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, AQSH) yordamida MODE-K hujayralariga transfektsiya qilindi. Anti-TGF- 1 shRNK-transfektsiyalangan (MODE-Ktgfb) va shifrlangan shRNK-transfektsiyalangan (MODE-Kscr) hujayralar Zeotsin (500 ug/ml gacha) (Invitrogen-Gibco) ishtirokida o'stirildi va tanlangan. yashil floresan oqsili (GFP) uchun oqim sitometriyasi yordamida hujayralarni saralash orqali. Transfektsion hujayralarning 95 foizdan ortig'i oqim sitometriyasida yoki mikroskopiyada kuchli yashil floresansni ko'rsatdi.

Metiltiazol tetrazolium (MTT) tahlili

MTT tahlili madaniyatlarda hujayra proliferatsiyasi yoki hayotiyligini o'lchash uchun ishlatilgan. Hujayralar 96-quduq mikroplastinkalarida har bir quduqqa 2500 da ekilgan va har bir holat kamida toʻrt nusxada sinovdan oʻtkazilgan. Qisqacha aytganda, 10 mL 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) har bir quduqqa qo'shildi va 37 daraja haroratda 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik yashovchan hujayralardagi formazan kristallari 100 mkL / quduq dimetil sulfoksidda (DMSO, Sigma-Aldrich Kanada) eritildi. Har bir quduqdagi rangning absorbsiyasi ELx808 Ultra Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT, AQSh) yordamida 560 nm to'lqin uzunligida absorbsiya birliklari (AU) sifatida aniqlandi. Dori bilan ishlov berilmagan nazoratga qarshi dori bilan davolash qilingan madaniyatlarda hujayra proliferatsiyasining o'zgarishi ulushi quyidagicha hisoblangan: foiz=(dori bilan davolash - Nazorat) / Nazorat × 100 foiz. O'sish sur'ati quyidagicha hisoblandi: O'sish sur'ati (AU/kun)=(AUend − AUbegin) / vaqt (kun), bunda vaqt tekshiruv davrini, AUend esa imtihon oxiridagi absorbans birliklarini ifodalaydi. , va AU boshlanadi tekshirish boshida absorbans birliklari ifodalanadi.

Apoptozning floresan faollashtirilgan hujayralarni saralash (FACS) tahlili

Hujayra apoptozini aniqlash uchun Annexin-V-fikoeritrin (Annexin-V-PE) va 7-amino-aktinomitsin D (7-AAD) bilan FACS tahlili ishlatilgan (Annexin-V musbat: erta apoptoz). ; 7-AAD: kech apoptoz/nekrotik) ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq (BD Biosciences, San-Xose, CA, AQSh). Shunday qilib, FACS grafigida yashovchan hujayralar pastki chap kvadrantda, yuqori chap kvadrantda kech apoptotik hujayralar (7-faqat AAD musbat), yuqori o'ng kvadrantda apoptotik hujayralar (Ikkala Annexin-V va {{) 10}}AAD musbat) va pastki o'ng kvadrantda erta apoptotik hujayralar (faqat Annexin-V musbat). Qisqacha aytganda, davolanishdan so'ng hujayralar tripsin-EDTA eritmasi (Sigma Aldrich Kanada) bilan qisqa inkubatsiya yo'li bilan ozod qilindi va keyin Annexin-V-PE bilan 1 × bog'lovchi buferda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar 7-AAD bilan bo'yalgan. Apoptotik hujayralar floresansining intensivligi oqim sitometriyasi yordamida o'lchandi va CELLQUEST (BD Biosciences) yoki FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, AQSh) dasturlari yordamida fon nazorati bilan solishtirganda tahlil qilindi.

Yarim kantitativ teskari transkripsiya-polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR)

TGF{0}} mRNK darajalari RT-PCR to'plamlari (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSH) yordamida ichki nazorat sifatida glitseraldegid-3- fosfatdehidrogenaza (GAPDH) bilan solishtirganda yarim miqdoriy jihatdan aniqlandi. ) yuqorida tavsiflanganidek (19). Xuddi shu cDNK preparatidagi TGF- 1 va GAPDH transkriptlari 1 daqiqa davomida 94 daraja, 1 daqiqa va 15 soniya davomida 57 daraja va boshlang'ichdan keyin 1 daqiqa va 30 soniya davomida 72 darajali 35 tsikl bilan PCR orqali kuchaytirildi. 1 daqiqa davomida 94 daraja denaturatsiya bosqichi. 10 daqiqaga 72 darajaga yakuniy uzaytirish bosqichi qo'shildi. TGF- 1 va GAPDH uchun maxsus primer juftliklari oldingi hisobotdan (19) olingan (mTGF- 1: sezgir, 5′-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC va anti-sezuvchi, 5 ′- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: sezgi, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G va anti-sezuvchi, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Olingan PCR mahsuloti (25 mkl) 0,5 ug/ml etidiy bromidni o'z ichiga olgan Tris-asetat-EDTA (TAE) buferida 1 foizli agaroz jelida elektroforezga o'tkazildi va UV nurlari ostida ko'rildi. TGF- 1 ifoda darajalari yarim miqdoriy jihatdan GAPDH bilan solishtirildi.

G'arbiy dog'

TGF- 1 ning hujayra darajasi yuqorida tavsiflanganidek western blot usulida tekshirildi (19). Blotdagi TGF{2}} oqsil tasmasi monoklonal anti-TGF- 1 (A75-3) (BD Biosciences) bilan aniqlangan. Har bir namunadagi yuklangan proteinni tasdiqlash uchun anti-aktin IgG (Sigma-Aldrich Kanada) yordamida xuddi shu dog' qayta tekshirildi.

Fermentga bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) Madaniyat supernatantlarida ajraladigan TGF- 1 darajalari Elishay tomonidan aniqlangan. MODE-K hujayralari (0,5 ml DMEM muhitida 1,8 × 105 hujayra/quduq) 24-uch nusxadagi quduq plitalari bir kechada o'stirildi, so'ngra ECH yo'qligi yoki mavjudligida inkubatsiya qilindi.(cistanche dan echinacoside). Madaniyat supernatantlari 24 soatlik davolashdan so'ng yig'ildi va TGF- 1 chiqarilishi miqdori ishlab chiqaruvchining protokoliga (Promega, Madison, WI, AQSh) rioya qilgan holda TGF 1 Emax® ImmunoAssay tizimi yordamida aniqlandi.

Statistik tahlillar

Guruhlar orasidagi taqqoslash uchun mos ravishda bir tomonlama yoki ikki tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) ishlatilgan. Statistik tahlil uchun har bir tadqiqotda 3 dan 4 tagacha individual tajribalar to'plangan. 0.05 dan kichik yoki unga teng boʻlgan P-qiymati muhim deb topildi.

Natijalar

MODE-K hujayra madaniyatida hujayra proliferatsiyasini rag'batlantirish

Hujayra proliferatsiyasi to'qimalarni tiklash uchun zarurdir. ECH ta'siri(cistanche dan echinacoside)hujayra proliferatsiyasi bo'yicha madaniyatli MODE-K hujayralarida tekshirildi. 2A-rasmda ko'rsatilganidek, ECH qo'shilishi hujayra proliferatsiyasini rag'batlantirdi, MTT tahlili yordamida hujayra hayotiyligini oshirish bilan o'lchanadi, dozaga bog'liq. Giyohvand moddalar bilan ishlov berilmagan kulturalardagi hujayralar soni bilan solishtirganda, ECH bilan ishlov berilgan kulturalardagi hujayralar soni 6,26 ug/ml ECH bo'lgan kulturalarda 25,6 foizga ± 14,82 foizga, 25 foizga 33,6 foiz ± 14,6 foizga oshdi. ug/ml ECH, 5{27}} ug/ml ECH bilan 64,4 foiz ± 9.0 foiz va 100 ug/ bilan 99,4 foiz ± 11,7 foiz mL ECH 48-soatlik inkubatsiyadan keyin (P < 0.0{{50}}01).="" ushbu="" kuzatishni="" yanada="" tasdiqlash="" uchun="" ech="" ning="" {{30}}="" kunlik="" vaqt="" oralig'ida="" mode-k="" hujayra="" o'sish="" egri="" chizig'iga="" ta'siri="" tekshirildi.="" 2b-rasmda="" ko'rsatilganidek,="" optimallashtirilgan="" 1{64}}="" ug/ml="" ech="" qo'shilishi="" inkubatsiya="" vaqtidan="" keyin="" yashovchan="" hujayralar="" sonini="" dori="" bilan="" ishlov="" berilmagan="" kulturalarga="" (bazal="" nazorat)="" nisbatan="" sezilarli="" darajada="" oshirdi.="" ech="" bilan="" davolashning="" boshida="" (0-vaqt="" nuqtasi)="" 0.3{{7{0}}="" ±="" 0.02="" dan="" ech="" bo'lgan="" madaniyatlar="" uchun="" au="" ning="" oshishi="" 2="" kunlik="" inkubatsiyadan="" keyin="" 1,49="" ±="" 0,08="" va="" 4="" kunlik="" inkubatsiyadan="" keyin="" 2,20="" ±="" 0,11,="" dori="" bilan="" davolanmagan="" kulturalar="" uchun="" (faqat="" o'rta)="" o'sish="" boshida="" 0,24="" ±="" 0,01="" dan="" 1,22="" ±="" 0,12="" gacha="" va="" 21="" kundan="" keyin="" 1,22="" ±="" 0,12="" ga="" va="" 21="" kundan="" keyin="" ±="" 1,012="" gacha="" bo'lgan.="" 4="" kundan="" keyin="" (o'rta="" va="" ech,="" p=""><0,0001). o'sish="" egri="" chizig'i="" (2b-rasm)="" asosida="" hisoblangan="" ushbu="" ikki="" madaniyatdagi="" o'sish="" sur'atlari="" shuni="" ko'rsatdiki,="" ech="" har="" ikkala="" kunda="" ham="" kulturalardagi="" o'sish="" sur'atlarini="" sezilarli="" darajada="" oshirgan="" (ech="" bilan="" davolash="" qilingan="" madaniyatlarda="" 0,56="" va="" dori="" bilan="" davolash="" qilinmagan="" nazoratlarda="" 0,35)="" va="" 3-kun="" (ech="" bilan="" davolash="" qilingan="" madaniyatlarda="" 0,43="" va="" dori="" bilan="" davolanmagan="" nazoratlarda="" 0,22)="" (2c-rasm).="" birgalikda="" olingan="" bu="" ma'lumotlar="" ech="" ekilgan="" ichak="" epiteliya="" hujayralarida="" hujayra="" proliferatsiyasini="" rag'batlantirishini="">

2-rasm. Kulturalangan ichak epiteliy hujayralarida hujayra o'sishini ECH tomonidan rag'batlantirish. MODE-K xujayralari (2,500 hujayralar/quduq) bir kechada 96-quduq plastinkalariga ekilgan, so‘ngra ECH bor yoki yo‘qligida inkubatsiya qilingan. Madaniyatlardagi tirik hujayralar soni MTT tahlili bilan o'lchandi. A) Madaniyatlarga 48 soat davomida ECH ning turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. ECH bilan davolash qilingan madaniyatlarda hujayralar sonining ko'payishi (foiz) bazal mos yozuvlar sifatida dori bilan ishlov berilmagan madaniyatlar asosida hisoblab chiqilgan. P <0,0001 (bir="" tomonlama="" anova).="" b)="" madaniyatlarga="" 4="" kun="" davomida="" 10="" ug/ml="" ech="" bilan="" ishlov="" berildi.="" ech="" bilan="" davolash="" qilingan="" va="" dori="" bilan="" ishlov="" berilmagan="" madaniyatlar="" (faqat="" o'rta)="" o'sish="" egri="" mtt="" tahlilida="" 560="" nm="" da="" absorbans="" birliklari="" (au)="" tomonidan="" aniqlandi.="" p=""><0,0001 (o'rta="" va="" ech,="" ikki="" tomonlama="" anova).="" ma'lumotlar="" mustaqil="" tajribalarning="" o'rtacha="" ±="" standart="" hosilasi="" (sd)="" sifatida="" taqdim="" etiladi.="" c)="" o'sish="" sur'ati="" (au="" o'zgarishi/kun)="" o'sish="" kub="" asosida="" hisoblab="">e, har bir kunning o'rtacha soni.

MODE-K hujayralarini apoptozdan himoya qilish

Hujayralarni apoptozdan himoya qilish to'qimalarning keyingi shikastlanishining oldini olish mexanizmidir. ECH ning sitoprotektiv faolligi(cistanche dan echinacoside)vodorod peroksid (H2O2) yoki yallig'lanishga qarshi sitokin aralashmasi (TNF- va IFN-) bilan stimulyatsiya qilingan madaniyatli MODE-K hujayralarida tekshirildi. H2O2 oksidlanish metabolizmi natijasida hosil bo'lgan reaktiv kislorod turi bo'lib, oksidlovchi stress stsenariysini ifodalaydi, TNF- va IFN- faollashtirilgan immun hujayralari tomonidan ishlab chiqarilgan taniqli sitokinlar bo'lib, immun vositachiligidagi yallig'lanish holatini aks ettiradi. 3-rasmda ko'rsatilganidek, ECH (50 ug/ml) qo'shilishi apoptozni, shu jumladan H2O2 bilan ishlov berilgan madaniyatlarda uning bazal darajasini sezilarli darajada kamaytirdi, bu apoptozning bazal darajasidan 5,3{{47 pasayishi bilan tasdiqlanadi. Dori bilan ishlov berilmagan kulturalarda }} foiz ± 1,24 foizgacha 3,76 foiz ± 1.0ECH bilan ishlov berilgan kulturalarda 1 foiz, dori bilan ishlov berilmagan kulturalarda 26,93 foiz ± 1,{27}} foizdan 14,08 foizgacha ± 0,3 mkM H2O2 mavjud bo'lganda ECH bilan ishlov berilgan kulturalarda 1,30 foiz va dori bilan ishlov berilmagan kulturalarda 38,90 foiz ± 1,76 foizdan 0,6 mkM < h20200p="" mavjud="" bo'lganda="" ech="" bilan="" ishlov="" berilgan="" kulturalarda="" 19,88="" foiz="" ±="" 1,02="" foizgacha.="" ,="" o'rta/dori="" bo'lmagan="" davolash="" va="" ech="" bilan="" davolash).="" ech="" ning="" xuddi="" shunday="" sitoprotektiv="" ta'siri="" sitokin="" aralashmasi="" bilan="" rag'batlantirilgan="" madaniyatlarda="" ko'rindi="" (4-rasm);="" ech="" qo'shilmagan="" madaniyatlarda="" apoptoz="" (51,5="" foiz="" ±="" 6,30="" foiz)="" (o'rta/dori="" bilan="" ishlov="" berilmagan="" nazorat)="" ech="" bilan="" davolash="" qilingan="" madaniyatlarga="" qaraganda="" (38,50="" foiz="" ±="" 5,60="" foiz)="" sezilarli="" darajada="" yuqori="" edi="" (p="0.0204," o'rta/dorisiz="" davolash="" qilingan="" va="" ech="" bilan="" davolash="" qilingan),="" bu="" echning="" mode-k="" hujayralarini="" yallig'lanishga="" qarshi="" sitokinlar="" keltirib="" chiqaradigan="" apoptozdan="" himoya="" qilishini="" ko'rsatadi.="" birgalikda="" ech="" h2o2="" oksidlanishi="" natijasida="" kelib="" chiqqan="" hujayra="" apoptoziga="" qarshi="" sitoprotektiv="" faollikka="" ega,="" shuningdek="" yallig'lanishga="" qarshi="" sitokinlarning="" sitotoksikligiga="">

Madaniy MODE-K hujayralarida TGF-ekspressiyasini yuqori tartibga solish

Adabiyotdagi dalillar shuni ko'rsatadiki, TGF{0}} to'qimalarning shikastlanishi va tiklanishida (22, 23) va oshqozon-ichak traktining kolit yoki yallig'lanishli ichak kasalliklaridan (24) tiklanishida muhim rol o'ynaydi. TGF{4}} yuqorida ko'rsatilgandek, ECH bilan bog'liq hujayralar ko'payishi va sitoproteksiyada rol o'ynashini tekshirish uchun, yuqorida ko'rsatilgandek, ECH ta'siri.(cistanche dan echinacoside)madaniyatli MODE-K hujayralarida TGF{0}} ifodasi tekshirildi. TGF- 1 transkript darajalari yarim kantitativ RT-PCR bilan tekshirildi, uning oqsil darajasi esa western blot (umumiy hujayra darajasi) yoki Elishay (sekretlangan oqsil darajalari) bilan aniqlandi. 5A-rasmda ko'rsatilganidek, TGF - 1 mRNK darajasining dozaga bog'liq yuqori regulyatsiyasi ECH qo'shilgandan keyin 24 va 48 soat ichida ECH bilan davolash qilingan madaniyatlarda ko'rindi. Hujayralar ichidagi TGF{{10}} oqsil darajasining o'sish tendentsiyasi western blot tahlilida ko'rsatilgan (5B-rasm). Har xil konsentratsiyali ECHni o'z ichiga olgan 0,5 ml madaniy muhitda 24-soat inkubatsiyadan so'ng, ajratilgan TGF- 1 darajalari ham dozadan mustaqil ravishda oshirildi; 186,4 ± 18,39 pg/ml dan dori bilan davolanmagan kulturalarda (bazal darajalar) 25 ug/ml ECH bo'lgan kulturalarda 186,4 ± 18,39 pg/ml gacha, 263,4 ± 14,14 pg/ml dan 50 ug/6 ECH, va 2 CH/mL bilan. 100 ug/ml ECH bilan 15,56 pg/ml (P <0,0001). bu="" ma'lumotlarning="" barchasi="" ech="" kulturalarda="" ichak="" epiteliya="" hujayralarida="" tgf{39}}="" ishlab="" chiqarishni="" ko'paytirishini="" aniq="">

TGF{0}} ekspressiyasini genetik nokaut qilish natijasida o'sish stimulyatsiyasi va echinakozidning sitoproteksiyasi yo'qolishi.

TGF- 1 o'sishni rag'batlantirish va ECHda apoptozni kamaytirishga hissa qo'shganmi yoki yo'qligini aniqlash uchun(cistanche dan echinacoside)-muomala qilingan hujayralar, MODE-K hujayralarida TGF{1}} ifodasi anti-TGF- 1 shRNKni barqaror ifodalash orqali nokaut qilindi, bu orqali yangi hujayra liniyasi MODE-Ktgfb hosil bo'ldi. TGF- 1 oqsili ifodasi MODE-Ktgfb hujayralarida shifrlangan shRNKni barqaror ifodalovchi MODE-Kscr hujayralaridagiga nisbatan sezilarli darajada kamaydi (6A-rasm). 6B-rasmda ko'rsatilganidek, MODE-Ktgfb hujayralarida ECHning proliferativ stimulyatsiyasi sezilarli darajada buzilgan; ota-ona MODE-K hujayralarida ECHga proliferativ javobga o'xshash (2-rasm), ECH stimulyatsiyasidan keyin MODE-Kscr hujayralarida yashovchan hujayralar soni ko'paydi, 25 ug / ml ECH bo'lgan madaniyatlarda 28,3 foiz ± 12,4 foizga o'sdi, 5{30}} ug/ml ECH bilan 54,2 foiz ± 6,8 foizga, 100 ug/ml ECH bo‘lgan kulturalarda 122,7 foiz ± 20,8 foizga o‘sdi. Aksincha, hujayralar soni MODE Ktgfb hujayra madaniyatlarida ECH borligida kamaydi, 25 ug/ml ECH bo'lgan madaniyatlarda 12,0 foiz ± 5,0 foizga, 50 ug/ml ECH bilan 18,3 foiz ± 4,1 foizga kamaydi va 100 ug / ml ECH bilan 30,4 foiz ± 3,3 foizga kamaydi. Ikki tomonlama ANOVA bilan statistik tahlil bu ikki guruh o'rtasida ECHga proliferativ javobning sezilarli farqini ko'rsatdi (P <0.0001). ushbu="" ma'lumotlar="" shuni="" ko'rsatadiki,="" ichak="" epiteliya="" hujayralarida="" tgf{47}}="" ifodasining="" yo'qolishi="" ech="" o'sish="" stimulyatsiyasini="">

ECHda yuqori tartibga solingan TGF- 1 ifodasi bor yoki yo'qligini qo'shimcha tekshirish uchun(cistanche dan echinacoside)-davolangan hujayralar apoptozning pasayishiga olib keldi, ECH ning anti-apoptotik faolligi MODE-Kscr hujayralariga nisbatan MODE-Ktgfb hujayralarida tekshirildi. 6C-rasmda ko'rsatilganidek, MODE-Kscr hujayra madaniyati bilan solishtirganda, apoptoz darajasi MODE-Ktgfb hujayra madaniyatida sitokinlar yo'qligida yuqori bo'lgan (11,2% ± 0.42% MODE-Ktgfb va boshqalar). MODE-Kscr da 9,6 foiz ± 0,99 foiz) va sitokinlar borligida (2{19}},95 foiz ± 0.0 MODE-da 7 foiz. Ktgfb ga nisbatan MODE-Kscr da 15,4 foiz ± 1,56 foiz) (P=0.0{{60}}13), bu TGF- 1 ning antikor ekanligini ko‘rsatadi. -MODE K hujayralarida apoptotik omil. MODE-Kscr hujayra madaniyatiga ECH (5{72}} ug/ml) qo‘shilishi apoptozning bazal darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (dorisiz davolanganlarda 9,6 foiz ± 0, 99 foizga nisbatan 8,3 foiz ± 0,43 foizga). ECH bilan davolash qilingan) va apoptozning 30,2 foizini sitokinlar bilan stimulyatsiya qilingan madaniyatlarda aniqlangan (15,4 foiz ± 1,56 foiz dori-darmonlar bilan davolash qilingan va ECH bilan davolanganlarda 10,75 foiz ± 1,05 foiz). Biroq, MODE-Ktgfb hujayra madaniyatlarida ECH apoptozning bazal darajasini kamaytirmadi (dorisiz davolanganlarda 11,2 foiz ± 0,42 foizga, ECH bilan davolanganlarda esa 12,0 foiz ± 0,43 foizga) va apoptozning atigi 16,71 foizini kamaytirdi. MODE-Kscr hujayra madaniyatida 30,2 foiz, sitokinlar bilan stimulyatsiya qilingan kulturalarda kuzatilgan (dorisiz davolashda 20,95 foiz ± 0,07 foiz, ECH bilan davolashda esa 17,45 foiz ± 0,35 foiz). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, ichak epiteliya hujayralarida TGF{79}} ifodasining buzilishi apoptozni yomonlashtiradi va ECHning sitoprotektiv faolligini pasaytiradi.

ECHning o'sish stimulyatsiyasi va sitoproteksiyasining yo'qolishi(cistanche dan echinacoside)antikor yordamida TGF- 1 faolligini neytrallash orqali

TGF- 1 ECHning o'sishini rag'batlantirish va sitoproteksiyasi uchun zarur bo'lishi mumkinligini tasdiqlash uchun(cistanche dan echinacoside)ichak epitelial hujayralarida yuqorida ta'riflanganidek (6-rasm), neytrallashtiruvchi anti-TGF- 1 antikorining (Clone 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, AQSH) ECH vositachiligiga ta'siri. MODE-K hujayra madaniyatlarida hujayra ko'payishi va omon qolishi tekshirildi. 7A-rasmda ko'rsatilganidek, ECH (25 ug/ml) qo'shilishi antikorlar bilan ishlov berilmagan nazorat guruhlarida hujayralar sonining 44,3% ± 8,2% ga o'sishini rag'batlantirdi, ammo anti-TGF- 1 antikor mavjud bo'lganda. , Hujayra sonining 11,3% ± 9,1{39}} foizga yo'qolishi bir xil ECH bilan davolash qilingan kulturalarda kuzatilgan, bu TGF- 1 faolligini neytrallash ichak epitelial hujayralarida ECH o'sish stimulyatsiyasini kamaytirganini ko'rsatadi. Keyingi tajribalar shuni ko'rsatdiki, anti-TGF- 1 antikor MODE-K hujayra madaniyatida ECH ning sitoprotektiv faolligini ham neytrallashtirgan; ECH qo'shilishi apoptozni dori bilan ishlov berilmagan madaniyatlarda 4,37 foizdan ± 1,19 foizdan 24 soatlik inkubatsiyadan keyin ECH bilan ishlov berilgan kulturalarda 1,72 foizga ± {{5 0}}, 01 foizga va 11,13 foizdan ± 11,13 foizga kamaytirdi. 48 soatlik inkubatsiyadan so'ng dori-darmon bilan ishlov berilmagan madaniyatlarda 1,12 foizdan 9,13 foiz ± 0,02 foizgacha (dori bo'lmagan/o'rta va ECH, ikki tomonlama ANOVA, P=0.0001). Biroq, anti-TGF- 1 antikorlari mavjud bo'lganda, ECH bilan davolash qilingan madaniyatlarda apoptoz (24-soat inkubatsiyadan keyin 2,88 foiz ± 0,01 foiz; 48- soat inkubatsiyadan keyin 12,58 foiz ± 0,02 foiz). ) nazorat madaniyatidagilardan (dori bilan davolanmagan) (ikki tomonlama ANOVA, P=0.9427) sezilarli darajada farq qilmadi, bu esa anti-TGF- 1 antikor ichakda ECH vositachiligida omon qolishga xalaqit berishini anglatadi. epiteliya hujayralari.

Munozara

ECH(cistanche dan echinacoside)faqat o'simlik Cistanche spp ekstraktida asosiy PhG emas. Bundan tashqari, ko'plab boshqa dorivor o'simliklarda, masalan, Echinacea spp. (25, 26). Ushbu tabiiy birikma in vitro va in vivo antioksidant faollikka ega ekanligi xabar qilingan (13, 27, 28). Biroq, uning ta'sir qilish mexanizmi (mexanizmlari) noma'lumligicha qolmoqda. Ushbu tadqiqot natijalarimiz birinchi marta in vitro modelida ECH TGF- 1 ga bog'liq bo'lgan ichak epitelial hujayralarining ko'payishi va omon qolishini rag'batlantirishini ko'rsatdi.

ECH qo'shilishi(cistanche dan echinacoside)H2O2- yoki yallig'lanishga qarshi sitokin aralashmasi (TNF- va IFN-) bilan davolash qilingan MODE-K hujayralarida (3 va 4-rasm) va boshqa hujayra turlarida (16, 29) hujayra apoptozini kamaytiradi va TGF- 1 ifodasini nokaut qilish yoki uning faolligini blokirovka qilish uning antiapoptotik faolligini bekor qilishga olib keladi (6 va 7-rasmlar), bu ECHning sitoproteksiyasi TGF- 1 ishlab chiqarilishiga bog'liqligini ko'rsatadi (5-rasm). Bizning oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, TGF- 1 anti-apoptotik Bcl-2 ifodasini induktsiya qiladi va buyrak tubulali epiteliya hujayralarida TNF vositachiligida apoptozning oldini oladi (19). Xuddi shunday topilmalar boshqa hujayra turlarida ham qayd etilgan; madaniyatli o'pka arteriyasi endotelial hujayralariga TGF- 1 qo'shilishi Bcl-2 ning boshlang'ich darajasini ko'taradi va qon zardobida yetishmovchilik va qon tomir endotelial o'sish omili (VEGF) retseptorlari blokadasi natijasida kelib chiqadigan apoptozning oldini oladi (30); va madaniyatli neyron progenitor hujayralarida (NPC) H2O2 bilan davolashga qarshi hujayraning omon qolishini (taxminan 76 foizga) oshiradi, bu Bcl{31}} ifodasining yuqori regulyatsiyasi bilan bog'liq (31). Ushbu tadqiqotda ECH ning MODE-K hujayralarida Bcl{33}} ifodasiga ta'siri tekshirilmagan bo'lsa-da, TNFda Bcl-2 yuqori regulyatsiyasining ECHning antiapoptotik faolligi bilan bog'liqligi haqida xabar berilgan. - – davolash qilingan SHSY5Y neyron hujayralari (29) yoki H2O2-davolangan PC12 hujayralari (15). Birgalikda bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, ECH ning antiapoptotik faolligi Bcl-2 yo'li orqali TGF- 1 tomonidan vositachilik qilishi mumkin.

ECHning sitoproteksiyasi bo'lishi mumkin(cistanche dan echinacoside)inkubatsiya oxirida o'z-o'zidan hujayra o'limini kamaytirish orqali hayotiy hujayralar sonining biroz oshishiga hissa qo'shishi mumkin, ammo ECH (100 ug/ml) qo'shilishi 48-soatlik davolashdan so'ng yashovchan hujayralarni deyarli ikki baravar oshiradi (2A-rasm). , ECH haqiqatan ham hujayra proliferatsiyasini rag'batlantiradi, deb taklif qiladi, bu 2-rasm, B va C dagi ma'lumotlar bilan tasdiqlanadi. ECHning shunga o'xshash ta'siri inson fibroblastik hujayralarida, MRC-5 (17): MRCda{ {6}} hujayra madaniyati, ECH hujayra siklini G1 fazasidan S fazasi va G2 fazasigacha induktsiya qilish orqali hujayra qarishini kechiktirishi mumkin. ECH ning antiapoptotik faolligi singari, ECH ning proliferativ faolligi ko'p funktsiyali sitokin ekanligi yaxshi hujjatlashtirilgan TGF- 1 (6 va 7-rasm) ga bog'liq (32, 33). TGF- hujayra turiga yoki hujayradan tashqari mikro muhitga qarab hujayra proliferatsiyasini rag'batlantirishi yoki o'sishni to'xtatishga olib kelishi mumkin; u Smadlar va Smad bo'lmaganlar (masalan, mitogen bilan faollashtirilgan protein kinazlar) kabi bir nechta signal yo'llarini faollashtiradi (34, 35), ammo MODE-K hujayralarida ECH / TGF- stimulyatsiya qilingan hujayra proliferatsiyasiga vositachilik qiladigan yo'l qo'shimcha tekshirishni talab qiladi.

Bugungi kunga qadar ECH ning maqsadli oqsillari (proteinlari) haqida kam narsa ma'lum(cistanche dan echinacoside)yoki u tartibga soluvchi signal yo'li(lar). Bir tadqiqot shuni ko'rsatadiki, ECH bilan davolash endotelial hujayralardagi siklik guanozin monofosfat (cGMP) ning hujayra darajasini oshiradi (36) va 8-Bromo-cGMP qo'shilishi yurak fibroblastlarida TGF- 1 ifodasini kamtarona oshiradi (37). ). Biroq, ECH bilan davolash cGMP darajasini oshiradimi va ECH ekilgan ichak epitelial hujayralarida TGF- 1 ifodasini rag'batlantiradimi, qo'shimcha tekshirish kerak.

Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, ECH(cistanche dan echinacoside)kulturali ichak epiteliy hujayralarida hujayra proliferatsiyasi va hujayraning omon qolishiga vositachilik qiluvchi TGF- 1 ishlab chiqarishni induktsiya qiladi. Dekstran sulfat natriy qo'zg'atadigan kolit (38) bo'lgan sichqonlarda shilliq qavatning shikastlanishini tiklash yoki davolash uchun ichak epiteliyasida TGF signali talab qilinadi, bu ECH, ehtimol, ECH o'z ichiga olgan o'simlik C. deserticola yoki boshqalar shilliq qavat shikastlanishini rag'batlantirish uchun terapevtik salohiyatga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. bemorlarda tuzatish.

Tasdiqlash

YJ Xitoyning Xitoy stipendiya kengashining magistratura talabasi stipendiyasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi.

Ma'lumotnomalar

1 Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Zhu WC, Xu J. Cistanche deserticola Ma Xitoyda yangi ekin sifatida etishtiriladi. Genet Resurs Crop Evol. 2009;56:137–142.

2 Jiang Y, Tu PF. Cistanche turlarida kimyoviy tarkibiy qismlarni tahlil qilish. J Chromatogr A. 2009;1216:1970–1979.

3 Tu PF, Vang B, Deyama T, Chjan ZG, Lou ZC. [RP-HPLC tomonidan Herba Cistanchis feniletanoid glikozidlarini tahlil qilish]. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997;32:294–300. (Xitoy tilidagi matn inglizcha konspekt bilan)

4 Huang X, Li Z. [qon tomiridan keyin ich qotishni davolashda Cistanche o'z ichiga olgan eritmaning klinik samaradorligi]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integrated Trad West Med). 2002;22:622–623. (xitoy tilida)

5 Chjan B, Lu X, Chjan R, Li L, Li C. [Cistanche desertikolaning laksatif ta'sirini o'rganish]. Zhong Yao Cai (J Chin Med Mater). 1992;15:33–35. (xitoy tilida)

6 Tu P, Li S, Li Z, Vang C, Lou Z. [Ichaklarni namlash va o't o'simliklarining laksatsiyasini taqqoslash]. Nat Prod Res Dev. 1997;11:48–51. (Xitoy tilidagi matn inglizcha konspekt bilan)

7 Chjan B, Zhao X, Chen S, Liu L, Cheng H. [Herba Cistanche dan ajratilgan qismlarning laksatif ta'siri]. Zhongguo Zhongyiyao Xinxi Zazhi (Chin J Inform Trad Chin Med). 2003;10:31–32. (Xitoy tilidagi matn inglizcha konspekt bilan)

8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. Cistanche deserticola suv ekstrakti bilan yo'g'on ichak saratoniga moyil sichqonlarda ichakdagi yallig'lanish giperplaziyasini kamaytirish. Phytother Res. Matbuotda.

9 Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. Cistanche deserticola dan feniletanoidga boy ekstraktining charchoqqa qarshi faolligi. Phytother Res. 2010;24:313–315.

10 Jing M, Song S, Li J. [Ronggui Tongbian kapsulasini olish va tozalash jarayonini o'rganish]. Zamonaviy Chin Med. 2009;11: 18–20. (Xitoy tilidagi matn inglizcha konspekt bilan)

11 Vu Y, Shi HM, Bao Z, Vang MY, Tu PF, Li XB. O'stiriladigan Cistanche deserticola ishlab chiqarish sifatini bashorat qilishda molekulyar markerlarni qo'llash. Biol Pharm Bull. 2010;33:334–339.

12 Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Parkinson kasalligining sichqoncha MPTP modelida echinacoside ning neyroprotektiv ta'siri. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13 Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Parkinson kasalligining subakut MPTP sichqoncha modelida Echinacoside ning neyrotrofik va neyrorescue ta'siri. Miya Res. 2010;1346:224–236.

14 Chjan Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L, Zhao J. Kalamushlarda oleyk kislotasi sabab bo'lgan o'tkir o'pka shikastlanishidan echinacoside himoyasi. Erkin Radic Res. 2007;41:798–805.

15 Kuang R, Sun Y, Yuan V, Lei L, Zheng X. Feniletanoid glikozidlardan biri bo'lgan echinacoside ning PC12 hujayralarida H2O 2- keltirib chiqaradigan sitotoksiklikka himoya ta'siri. Planta Med. 2009;75: 1499–1504.

16 Kuang R, Sun Y, Zheng X. Ekinakozidning H2O2-induktsiyalangan PC12 hujayra shikastlanishiga himoya ta'sirida ishtirok etgan azot oksidining bostirilishi. Nat Prod Commun. 2010;5:571–574.

17 Xie H, Zhu H, Cheng C, Liang Y, Wang Z. Echinacoside inson fibroblastik hujayralarining hujayra qarishini sekinlashtiradi MRC-5. Dorixona. 2009;64:752–754.

18 Vidal K, Grosjean I, Evillard JP, Gespach C, Kaiserlian D. Sichqoncha ichak epitelial hujayralarini SV40- katta T geni bilan abadiylashtirish. MODE-K hujayra liniyasining fenotipik va immun xarakteristikasi. J Immunol usullari. 1993;166:63–73.

19 Guan Q, Nguan CY, Du C. Transformatsiya qiluvchi o'sish omili-beta1 ifodasi buyrak ishemiyasi-reperfuziya shikastlanishini cheklaydi. Transplantatsiya. 2010;89:1320–1327.

20 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH va boshqalar. TGF-beta1 siRNK siydik yo'llarining obstruktsiyasi buyrakdagi tubulointerstitial fibrozni bostiradi. Exp Mol Pathol. 2006;81: 48–54.

21 Du C, Vang S, Diao H, Guan Q, Zhong R, Jevnikar AM. ShRNK terapiyasi orqali quvurli epiteliya hujayralarining apoptozga chidamliligini oshirish buyrak ishemiyasi-reperfuzion shikastlanishini yaxshilaydi. Men J Transplantatsiya qilaman. 2006;6:2256–2267.

22 Duglas HE. Yarani davolashda TGF-ss: ko'rib chiqish. J Yarani parvarish qilish. 2010;19:403–406.

23 Grande JP. To'qimalarning shikastlanishi va tiklanishida o'sish omili-beta-ning o'rni. Proc Soc Exp Biol Med. 1997;214:27–40.

24 Monteleone G, Boirivant M, Pallone F, MacDonald TT. IBD ni tartibga solishda TGF beta1 va Smad7. Shilliq qavat immunol. 2008;1 Suppl 1:S50–S53.

25 Bauer R, Foster S. Echinacea simulyatsiyasidan va E. paradoxa ildizidan alkamidlar va kofe kislotasi hosilalarini tahlil qilish. Planta Med. 1991;57:447–449.

26 Perry NB, Burgess EJ, Glennie VL. Echinacea standartlashtirish: fenolik birikmalar va dorivor turlardagi tipik darajalar uchun analitik usullar. J Agric Food Chem. 2001;53:849–857.

27 Pellati F, Benvenuti S, Magro L, Melegari M, Soragni F. Echinacea spp ning fenolik birikmalar va radikal tozalash faolligini tahlil qilish. J Pharm Biomed Anal. 2004;35:289–301.

28 Vu Y, Li L, Ven T, Li YQ. Ekinakozidning kalamushlarda uglerod tetraklorid bilan bog'liq bo'lgan gepatotoksisitega himoya ta'siri. Toksikologiya. 2007;232:50–56.

29 Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB, Vang YH. Echinacoside SHSY5Y neyron hujayralarini TNFalpha tomonidan qo'zg'atilgan apoptozdan qutqaradi. Eur J Pharmacol. 2004;505:11–18.

30 Lu Q. Transformatsiya qiluvchi o'sish omili-beta1 ALK5 orqali o'pka arteriyasi endotelial hujayra apoptozisidan himoya qiladi. Am J Physiol O'pka Hujayrasi Mol Physiol. 2008;295:L123–L133.

31 Park SM, Jung JS, Jang MS, Kang KS, Kang SK. O'sish omili-beta1 ni o'zgartiruvchi o'murtqa shnordan olingan neyron progenitor hujayralar taqdirini tartibga soladi. Hujayra prolifi. 2008;41:248–264.

32 Massaj J. Hujayralar TGF-beta signallarini qanday o'qiydi. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1:169–178.

33 Rahimi RA, Leof EB. TGF-beta signalizatsiyasi: ikkita javob haqidagi ertak. J hujayra biokimyosi. 2007;102:593–608.

34 Mustakas A, Xeldin CH. Smad bo'lmagan TGF-beta signallari. J Cell Sci. 2005;118:3573–3584.

35 Shmierer B, Hill CS. TGF beta-SMAD signalini uzatish: molekulyar o'ziga xoslik va funktsional moslashuvchanlik. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8:970–982.

36 U WJ, Fang TH, Ma X, Chjan K, Ma ZZ, Tu PF. Echinacoside NO-cGMP yo'li orqali kalamush aorta halqalarida endoteliyga bog'liq bo'shashishni keltirib chiqaradi. Planta Med. 2009;75:1400–1404.

37 Abdelaziz N, Colombo F, Mercier I, Calderone A. Azot oksidi beqarorlik orqali kalamush yurak fibroblastlarida o'sish omili-beta3 mRNKning o'zgarishini susaytiradi. Gipertenziya. 2001;38:261–266.

38 Bek PL, Rosenberg IM, Xavier RJ, Koh T, Vong JF, Podolskiy DK. Transformatsiya o'sish omili-beta epiteliya hujayralari orqali in vitro va in vivo ichakning shifo va shikastlanishga sezuvchanligiga vositachilik qiladi. Men J Pathol. 2003;162:597–608.