Streptozototsin-nikotinamid qo'zg'atadigan diabetik kalamushlarda Cistanche Tubulosa ekstraktining erkaklar reproduktiv funktsiyasiga ta'siri - Ⅰ

1.Kirish

Qandli diabet (DM) ko'payadigan holatglyukoza darajalariqonda oshqozon osti bezining etarli darajada insulin ishlab chiqarishda samarasizligi yoki tananing uni samarali ishlata olmasligi sababli. JSST ma'lumotlariga ko'ra, qandli diabet bilan kasallanganlar soni 1980 yildagi 108 milliondan 2014 yilda 422 millionga ko'tarildi [1]. To'rtta asosiy toifa mavjud: diabetdan oldingi (qandli diabetdan oldingi bosqich), 1-toifa (oshqozon osti bezi insulin ishlab chiqara olmaydi), 2-toifa (tana insulin ishlatmaydi) va homiladorlik qandli diabet (homiladorlik davrida yuzaga keladi). Oksidlanish stressi reaktiv kislorod turlari (ROS) va antioksidantlar [2] ishlab chiqarish o'rtasidagi nomutanosiblik tufayli yuzaga keladi, natijada diabetik holatga olib keladi. Qandli diabetning asoratlari orasida buyrak etishmovchiligi, asabning shikastlanishi, ko'rlik, insult, yurak xuruji, homila o'limi va bepushtlik mavjud. [1]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, diabetga chalingan erkaklarda sperma yadrolari, deoksiribonuklein kislotasi (DNK) va mitoxondriyalar sezilarli darajada shikastlangan. Spermatozoidlarni tashish jarayonida oksidlovchi stress erkak jinsiy tizimining jarayonini o'zgartiradi [4,5].

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermatogenez jarayoni gipotalamus-gipofiz-gonadal (HPG) o'qi tomonidan boshqariladi. Gipotalamus tomonidan ishlab chiqarilgan gonadotropinni chiqaradigan gormon (GnRH) luteinlashtiruvchi gormon (LH) va follikullarni ogohlantiruvchi gormon (FSH) ishlab chiqarishni rag'batlantiradi. Leydig xujayralari seminifer tubulaga tutashgan vatestosteron ishlab chiqaradiLH nazorati ostida. FSH erkak gormoni o'tishiga yordam beradigan antigen bog'lovchi oqsil (ABP) ishlab chiqarishni qo'zg'atadi. Shunday qilib, bepushtlik va boshqa muammolar asosan HPG o'qida yuzaga keladigan buzilishlar tufayli yuzaga keladi. Eksperimental kalamushlarda streptozotsin-nikotinamid kombinatsiyasini qo'llash diabetni keltirib chiqaradi. Streptozotsin oshqozon osti bezidagi insulin ishlab chiqaruvchi hujayralar uchun zaharli kimyoviy birikma va nikotinamid suvda eriydigan vitamin bo'lib, hujayralarni to'liq shikastlanishdan himoya qiladi [6].

Cistanche tubulosa - cho'l o'simlik turi, shuningdek, "Rou Cong-Rong" [7]. Bu xlorofil boʻlmagan parazit oʻsimlik boʻlib, asosan Calotropis procera daraxtining ildizida oʻsadi va qurgʻoqchil Gansu, Sinxay, Shinjon, Moʻgʻuliston, Eron va Hindistonda keng tarqalgan. Cistanche tubulosaning umumiy nomi "cho'l sümbülü". U Xitoy an'anaviy tibbiyotida keng qabul qilingan va unga "Cho'l jenshen" nomi berilgan. U tibbiy sohada morbid leykoreya, ko'p metrorragiya, surunkali buyrak kasalliklari, ich qotishi, jinsiy quvvatsizlik va bepushtlikni davolash uchun keng qo'llaniladi. Kimyoviy tarkibiy qismlarCistanche tubulosa uchuvchan bo'lmagan feniletanoid glikozidlardan iborat(PHG), iridoidlar, lignanlar, uchuvchi moylar, alditollar, oligosakkaridlar va polisaxaridlar [8]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatadiechinacosidebu o'simlik ROS darajasini tartibga solish orqali shikastlangan fibroblastni himoya qiladi [9]. Ushbu birikma neyroproteksiya va osteoporozning oldini olish bilan bir qatorda antioksidant, vazorelaksatsiya va yallig'lanishga qarshi ta'sirlarni ishlab chiqaradi [10,11].

Ushbu tadqiqot ta'sirini o'rganishga qaratilganCistanche tubulosa ekstraktistreptozototsin-nikotinamid bilan qo'zg'atilgan diabetik kalamushning reproduktiv disfunktsiyasida ECHni o'z ichiga olgan.

2. Materiallar va usullar

2.1. Materiallar

ECH va CTE Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tayvan) dan sotib olindi. Kengaytirilgan glikatsiyaning yakuniy mahsulotlari (AGEs) Biovision (San-Fransisko, CA, AQSh) dan sotib olingan. LC-540 va TM3 hujayra liniyalari Oziq-ovqat sanoati tadqiqot va rivojlantirish institutidan (Xsinchu, Tayvan) xarid qilingan. Besh haftalik Sprague-Dawley (SD) erkak kalamushlari Milliy laboratoriya hayvonlar markazidan (Taypey, Tayvan) sotib olindi. Feed Lab Diet® PMI Nutrition International, Inc.dan (Taypey, Tayvan) sotib olingan. 2,2-difenil-1-pikrilgidrazil (DPPH) Sigma kompaniyasidan (Sent-Luis, MO, AQSH) olingan. Metanol va 4-(2-gidroksietil)-1-piperazinetansülfonik kislota (HEPES) ham Sigma'dan sotib olingan. Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhiti/F12 va tripsin-EDTA GIBCO (Nyu-York, NY, AQSh) dan olingan. 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolium bromid (MTT), dikloro-dihidro-fluoresein diasetat (DCFH-DA), dimetil sulfoksid (DMSO) va nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma'dan sotib olindi. Glyukoza fermentativ to'plamlari Yaponiyaning Tokio shahridagi Kyokutoseiyaku shahridan olingan. Insulin ELISA to'plamlari Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Shvetsiya) dan sotib olingan. T-PER to'qima oqsili ekstrakti reagenti Thermo Scientific kompaniyasidan (Chikago, IL, AQSh) sotib olindi. Anti-inson/Sichqoncha/Kalamush yadro omili-kappa B NF-kB poliklonal antikorlari Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AQSHdan sotib olingan. Kengaytirilgan glikatsiyaning yakuniy mahsuloti (RAGE) poliklonal antikorlari, inson/sichqon/kalamushga qarshi Starr poliklonal antikorlari va odam/sichqon/kalamushga qarshi sitoxrom P450 17A1 monoklonal antikorlari uchun anti-sichqoncha/rat retseptorlari Gendan sotib olindi. Tex (Irvine, CA, AQSH). Anti-Inson/Sichqoncha/Kalamush CYP11A1 poliklonal antikorlari Cell Signaling Technology (Beverli, PA, AQSh) dan olingan. Easy-Blue reaktivi Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, AQSH) dan sotib olingan. Agaroza va DNK belgisi 100 bp Promega, Corporation (Madison, WI, AQSh) dan olingan. RNeasy Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN, Hilden, Germaniyadan sotib olingan.

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Usullari

2.2.1. In Vitro tahlili

LC{0}} va TM3 hujayra madaniyati: LC{2}} hujayra chiziqlari natriy bikarbonat (1,5 g/L) bilan toʻldirilgan Earlning muvozanatlangan tuz eritmasi (EBSS) muhitida 37 ◦C da yetishtirildi, L-glutamin (2 mM), muhim bo'lmagan aminokislotalar (0,1 mM), natriy piruvat (1,0 mM) va homila sigir zardobi (FBS) (10%) 5% CO2 inkubatori (CO2 inkubatori, Napco 5410, Tayvan). TM3 hujayra liniyasi glyukoza (4,5 g/L), natriy piruvat (0,5 mM), L-glutamin (2,5 mM), natriy bikarbonat (1,2 g/L), {{ bilan to'ldirilgan Dulbekkoning o'zgartirilgan Eagle muhitida (DMEM) yetishtirildi. 28}}(2-gidroksietil)-1-piperazinetansülfonik kislota (HEPES, 15 mM) va homila buzoq zardobi (FCS, 10%) yoki ot zardobi (5%) 37 ◦C da 5% CO2 inkubatori.

ning hujayra hayotiyligini aniqlashEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid (MTT) reaktivi hujayra hayotiyligini tahlil qilish uchun ishlatilgan. Hujayra konsentratsiyasi 96-quduq plastinkasida 2 × 105 hujayra/ml ga o'rnatildi. Keyin 20 mL ECH (2% muhitda suyultirilgan) qo'shildi va 5% CO2 inkubatorida 37 ◦C da 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, 100 mL MTT reaktivi qo'shildi va qorong'i sharoitda 37 ◦C da 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Absorbans 570 nm da o'lchandi (ELISA o'quvchi, Dynatech MR5000, Kloten, Shveytsariya).

Nisbiy hujayra hayotiyligi (%)=[(570 nm da namuna - 570 nm da ablank)]/[(570 da nazorat - 570 da ablank)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) Reduction Assay va 2,{1}}difenil-1-pikrilgidrazil (DPPH) tahlili: Hujayralar soni 1×1{{10}}6 hujayra/ga sozlangan. ml. Keyin, 50 mg/ml ECH, resveratrol (RES) va ilg'or glikatsion yakuniy mahsulotlar (AGEs) (nazorat) qo'shildi va 37 ◦C da 18 soat davomida birgalikda kultivatsiya qilindi. Keyin 0,3 ml NBT eritmasi (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS va 10 ml DMEMda erigan 3% dimetil sulfoksid (DMSO)) qo'shildi va 37 ◦C da 5% CO2 da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Santrifüjdan so'ng (800 × g 3 daqiqa davomida) supernatant olib tashlandi va 200 mL DMSO qo'shildi va ultratovushli osilatorda (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tayvan) 5 daqiqa davomida chayqatildi. Absorbans 630 nm da o'lchandi. DPPH radikal tahlili uchun standart sifatida Trolox (95% spirtda) olingan. Keyin 75 µL 0,5 mM DPPH eritmasi 25 µL namunalar bilan aralashtirildi va xona haroratida qorong‘i joyda 30 daqiqa davomida reaksiyaga kirishishiga ruxsat berildi. Aralash chayqatildi va absorbans 517 nm da o'lchandi.

Reaktiv kislorod turlari (ROS) tarkibini tahlil qilish: Hujayra soni 2% FBS o'z ichiga olgan 12-quduq plastinkasida 2 × 105 hujayra/ml ga o'rnatildi. Keyin plastinkaga 50 µL/ml ECH, RES va AGE qo‘shildi va 37 ◦C da 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. 24 soatdan so'ng, 20,{9}}diklorofloressein-diatsetat (DCFH-DA) qo'shildi va 37 ◦C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Santrifüjdan so'ng (400 × g, 5 min) supernatant olib tashlandi va hujayralar ikki marta fosfat tamponli tuz (PBS) bilan yuvildi. Shundan so'ng, hujayralar 1 ml PBSda to'xtatildi va ROS darajalari oqim sitometri (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, AQSH) yordamida aniqlandi.

Proteinning identifikatsiyasi va miqdoriy tahlili: Proteinlar protein ekstraktsiya reagenti (T-PER) yordamida ekstraksiya qilingan. Hujayra zichligi 12-quduq plastinkasida 2 × 105 hujayra/ml va 50 mL/ml ECH, RES va ilg'or glikatsion yakuniy mahsulot (RAGE) antagonisti retseptoriga sozlandi va AGE qo'shildi va inkubatsiya qilindi. 37 ◦C da 5% CO2 inkubatorida 24 soat davomida. Shundan so'ng, 400 mkl T-PER qo'shildi, hujayralarni qirib tashladi va 125,000× g da 20 daqiqa (4 ◦C) davomida santrifüj qilindi. Supernatant yig'ildi va keyingi tahlil qilish uchun -80 ◦C (-80 ◦C muzlatgich, Nuaire, Plymouth, MN, AQSh) da saqlangan. Protein miqdorini aniqlash uchun bicinchoninic kislota (BCA) to'plami ishlatilgan. Keyin, 10 µL standart hujayra eritmasi va 200 µL BCA reaktivi 8-quduq plastinkalariga qo‘shildi va 37 ◦C da 5% CO2 inkubatorida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Absorbans 562 nm da o'lchandi. Protein identifikatsiya tahlili natriy dodesil sulfat (SDS)-poliakrilamid gel (SDS-PAGE) elektroforezi orqali amalga oshirildi. Protein yuklash tamponiga protein lizatini qo'shib namunalar tayyorlandi va maxsus oqsillarni aniqlash uchun western blot tahlili o'tkazildi.

2.2.2. In Vivo tahlili

Hayvon modeli dizayni: Oltmishta {0}} haftalik erkak Sprague-Dawley (SD) kalamushlari Milliy laboratoriya hayvonlar markazidan (Taypey, Tayvan) sotib olingan. Har bir kalamush alohida-alohida 12 soat yorug'lik / 12 soat qorong'i tsikl bilan nazorat qilinadigan harorat (23 ± 1 ◦C) va namlik (40-60%) ostida dezinfektsiyali zanglamaydigan po'latdan yasalgan qafaslarga joylashtirildi. Oziq-ovqat va suv ad libitum bilan ta'minlangan. Har bir kalamush birinchi haftada xonakilashtirildi va asosiy parhez sifatida 5001 laboratoriya kemiruvchi dietasi berildi. Barcha protseduralar Tayvan, Milliy Tayvan Okean Universitetining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi (IACUC tasdiqlash № 101026) standartiga amal qildi. Uyga aylantirilgandan so'ng, kalamushlar ikki guruhga bo'lingan: 5001 laboratoriya dietasi bilan oziqlangan nazorat guruhi (Con) va butun tajriba davomida yuqori yog'li dieta bilan oziqlangan diabetik guruh (HFD, 40%). 4 hafta davomida HFD bilan oziqlanganidan so'ng, diabetik guruh kalamushlari diabetes mellitus (DM) ni qo'zg'atish uchun streptozotosin (65 mg / kg) (STZ) bilan AOK qilindi. STZ yuborilgandan keyin 15 daqiqa ichida nikotinamid (230 mg / kg tana vazni) yuborildi. In'ektsiyadan bir hafta o'tgach, qandli diabetning (DM) muvaffaqiyatli indüksiyasini aniqlash uchun og'iz orqali glyukoza bardoshlik testi (OGTT) o'tkazildi. Shundan so'ng hayvonlar oltita guruhga bo'lingan: nazorat (laboratoriya dietasi 5001 bilan oziqlangan); DM guruhi (DM + 45% HFD); DMR guruhi (DM + rosiglitazon: 0,571 mg/kg BW) + 45% HFD; DME1 guruhi (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; DME2 guruhi (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; va DME4 guruhi (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazon (RSG) ijobiy nazorat sifatida qabul qilindi. Tayvan oziq-ovqat va farmatsevtika idorasining (TFDA) sog'lom oziq-ovqat funktsional baholash ko'rsatmalariga muvofiq CTE ning uchta dozasi (80, 160 va 320 mg / kg) ishlatilgan. Muolajalar tajriba oxirigacha o'tkazildi. Barcha eksperimental kalamushlar 6 haftadan so'ng qurbon qilindi. Sichqonlardan olingan qon 4 ◦C da 15 daqiqa davomida 3000 rpm tezlikda santrifüj qilindi. Supernatant quyidagi tahlil uchun tekshirildi:

Umumiy glyukoza, triglitserid va xolesterinni aniqlash: Glyukozani aniqlash glyukoza fermentativ to'plamlari orqali amalga oshirildi. Keyin reagentlarga 20 mkL qon plazmasi namunalari qo'shildi va 5 daqiqa davomida 37 ◦C da saqlanadi. Umumiy triglitseridlar va umumiy xolesterin kontsentratsiyasi triglitseridlar va xolesterin fermentativ to'plamlari yordamida aniqlandi. Keyin reagentlarga 10 mkl qon plazmasi qo'shildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq tajriba o'tkazildi. Absorbans 510 nm da o'lchandi.

Plazmadagi umumiy glyukoza/triglitserid/xolesterin (mg/dL)=(namuna - ABlank)/(Astandart - ABlank) × 200.

Misol: Qon namunalarini singdirish, ABlank: Namunasiz to'plamlarning yutilish qiymati, Astandart: Standart reaktivning yutilish qiymati, 200: 200 mg/dL konsentratsiyadagi standart reagentlar.

Insulin, leptin va gomeostatik modelni baholash - insulin qarshiligini (HOMA-IR) aniqlash:Insulin darajasi insulin Elishay to'plamlari yordamida aniqlanadi. Mana, 25µL qon plazmasi qo'shildireagentlar va absorbans 450 nm da o'lchandi. Umumiy leptin miqdori a yordamida aniqlandileptin fermenti immunometrik tahlil to'plami.Keyin, 100µL plazmasi va absorbansi tahlil qilindiElishay o'quvchi yordamida 450 nm da o'lchandi. Barcha eksperiment shunga muvofiq o'tkazildiishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari. HOMA-IR qiymati gomeostaz modelidan aniqlandibaholash tenglamasi=ochlikdagi plazma insulin kontsentratsiyasi (mg/ml)× ochlik plazmasidagi glyukozakonsentratsiyalar (mmol/L)/22,5.

Plazma lipidlarining peroksidlanishi: Bu yerda {0}}.5 ml qon plazmasi 1 ml reagent (15%, trikloroatsetik kislota 0, 25 n xlorid kislotada (HCl)) aralashtiriladi. ) va 0,375%, 0,25 N HCl dagi tiobarbiturik kislota w/v) va suv hammomiga (Water Bath, BUCHI 461, Tsyurix, Shveytsariya) 100 ◦C da 15 daqiqaga joylashtiriladi. Sovutgandan so'ng, 1 ml n-butanol qo'shildi, kuchli chayqatildi va 1500 × g da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Supernatant yig'ildi va absorbans 532 nm [12] da o'lchandi.

Malondialdegid (MDA) kontsentratsiyasi (nM/ml)=[(532 nm da namuna - 532 nm da ablank)/ (532 nm da standart - 532 nm da ablank)] × 5.

standart 532 nm - Ablank da 532 nm)] × 5. Plazma testosteron va luteinlashtiruvchi gormon (LH) darajasini aniqlash: testosteron Elishay to'plami qon plazmasidagi testosteron darajasini o'lchash uchun ishlatilgan. LH kontsentratsiyasini aniqlash uchun RIA to'plami ishlatilgan. Keyin 50 µL plazma qo‘shildi va hisob-kitoblar LH-RP-3 (standart) gormoni kontsentratsiyasiga asoslandi. Keyingi qadamlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.

O'simta nekroz omili (TNF)- va interleykin-6 (IL-6) kontsentratsiyasini aniqlash: Olingan antikor qoplama buferida 250 marta suyultirilib, 96- ga qo'shildi. quduq plastinkasiga (100 µL/quduqqa) soling va 4 ◦C da bir kechada saqlang. Supernatant aspiratsiya qilindi va besh marta yuvish buferi bilan yuvildi (1 marta PBS, 0,05% Tween 20). 200 mkg tahlil suyultiruvchisi bilan inkubatsiyadan so'ng (1 soat), hujayralar yuvish buferi bilan 5 marta yuvildi va har bir quduqqa 100 mkL TNF-standart eritmasi yoki sinov namunalari qo'shildi va 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Yuvishdan keyin 100 µL aniqlangan IL{18}}antikorlar qo‘shildi va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Supernatant aspiratsiya qilindi va 5 marta yuvildi. Keyin 480 mkL avidin-horseradish peroksidaza fermenti (HRP) qo'shildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Supernatant aspiratsiya qilindi va yuvish tamponi bilan besh marta yuvildi. Keyin 100 mL substrat eritmasi qo'shildi va xona haroratida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, har bir quduqqa 50 mkl to'xtash eritmasi (1M fosfor kislotasi) qo'shildi va absorbans 450 nm da o'lchandi.

JINSIY FUNKSIYATNI TASARLASH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sperma va moyak parametrlarini tahlil qilish

Sperma namunalarini yig'ish: Sperma namunalarini yig'ish avval [13] da xabar qilingan usulga muvofiq amalga oshirildi. Spermatozoidlar supernatantdan to'plangan va keyingi tahlil uchun ishlatilgan.

Sperma soni, sperma harakatchanligi va anormal sperma: sperma soni gemositometr va tripan ko'k eritmasi yordamida hisoblangan. Keyin 100 µL sperma suyuqligi tripan ko‘k eritmasi bilan aralashtirildi va gemositometr va mikroskop yordamida sperma, harakatchanlik va anormal sperma soni hisoblandi [14].

Nitro ko'k Tetrazolium NBT qisqarishi va sperma va moyakning lipid peroksidlanishi: Lipid peroksidatsiyasi va NBT qisqarishi plazma tahlilining bir xil tartibiga muvofiq tahlil qilindi.

Superoksid dismutaza (SOD) va katalaza faolligini aniqlash: Superoksid dismutaza (SOD) faolligi RANSEL to'plami yordamida tahlil qilindi. Bu yerda, {0}}.01,7 ml reaksiya eritmasiga (0,05 mM ksantin, 0,025 mM 2-({) 5 ml moyak gomogenatlari qo‘shildi. {9}}yodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolium xlorid (INT)). Aralashtirgandan so'ng, 0,25 ml ksantin oksidaza (80 U / L) qo'shildi va xona haroratida 30 soniya davomida reaksiyaga kirishdi. Absorbans 505 nm da o'lchandi. Moyak gomogenatining oqsil kontsentratsiyasi Bio-Rad DC protein tahlili to'plami bilan aniqlandi va uning o'ziga xos faolligi (U / mg protein) hisoblab chiqildi. Katalaza (CAT) faolligi avval xabar qilingan usul bo'yicha aniqlandi [15].

H&E (gematoksilin va eozin) bo'yash

Moyak 24 soat davomida 10% formalinda namlangan va 4 ° C da saqlanadi. To'qimalar mikro o'lchamda va slaydga biriktirilgan. Fikslashdan so'ng (95% metanol + 5% sirka kislotasi) slaydlar 3 daqiqa davomida gematoksilinga botiriladi, 5 daqiqa davomida oqadigan suv bilan yuviladi va keyin ularni 50%, 70% va 90% spirt bilan namlanadi. bir daqiqa. Shundan so'ng, slaydlar 10 s davomida eozin bilan bo'yalgan va 100% spirtda xira bo'lguncha bir daqiqa davomida namlangan. Nihoyat, slayd bir daqiqa davomida ksilenda namlangan. Keyinchalik, slayd havoda quritilgan va muhrlangan. Bo'yalgan naycha morfologiyani kuzatish uchun teskari fazali kontrastli mikroskopga (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Yaponiya) joylashtirildi.

Gipotalamusni tahlil qilish

Sichqoncha KISS1, G-protein bilan bog'langan retseptorlari (GPR) 54, sitokin signalizatsiyasini bostiruvchi 3 (SOCS-3) va sirtuin 1(SIRT1) gen ketma-ketliklari NCBI (Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi) genlar bazasidan aniqlandi. va maxsus primer Primer 5 yordamida ishlab chiqilgan.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, AQSH.). Tajribada ishlatiladigan primerlar 1-jadvalda keltirilgan.

Gipotalamusdan ribonuklein kislotasini (RNK) ajratib olish. Miyaning gipotalamusidan RNKni olish RNeasy Lipid Tissue Mini Kit yordamida amalga oshirildi. Olingan mRNKlar teskari transkripsiya (RT) va polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) bilan miqdoriy jihatdan o'lchandi. RT tahlilidan olingan iltifot DNKsi keyinchalik foydalanish uchun -20 ◦C da saqlangan. Chiqarilgan DNK Taq polimeraza yordamida polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) tahliliga o'tkazildi. Keyin, 5 ~ 10 mL PCR mahsuloti olindi va 1,5% agar kolloidda elektroforez bilan tahlil qilindi. Rasm UVP BioDoc-It tasvirlash tizimida olingan. Teskari transkripsiyalangan komplementar deoksiribonuklein kislotasi (cDNK) olindi va IQ SYBR Green Supermix Kit yordamida PCR o'tkazildi. Keyinchalik, u iQTM 5 optik tizim dasturiy ta'minoti bilan tahlil qilindi. Proteinlar protein ekstraktsiya reagenti (T-PER) yordamida ekstraksiya qilindi. Keyin 400 µL T-PER ga 20 mg moyak gomogenati qo‘shildi va 4 ◦C (125,000× g) da santrifüj qilindi (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germaniya). ) 20 daqiqa. Quyidagi usul in vitro tahlilida "oqsilning identifikatsiyasi va miqdoriy tahlili" ga o'xshash edi.

2.3. Statistik tahlil

Tajriba natijalari o'rtacha ± standart og'ish (O'rtacha ± SD) sifatida ifodalangan va ma'lumotlar Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 dasturiy ta'minoti, IBM, Armonk, Nyu-York, NY, AQSh yordamida tahlil qilingan. Guruhlar orasidagi farqlar bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) bilan tahlil qilindi. Turli guruhlarning bir nechta taqqoslashlari Duncan testi orqali muhim daraja sifatida p < 0.05 qiymatida tahlil qilindi.

3. Natijalar

3.1. In Vitro tahlili

3.1.1. ECH, CTE va RES ning antioksidant faolligini taqqoslash

Uzoq muddatli hyuqori oksidlovchi stress va surunkali yallig'lanish diabetning asosiy sabablari hisoblanadiasoratlar [16]. CTE turli xil narsalarni o'z ichiga oladiechinacoside kabi feniletanoid glikozidlar(ECH) va akteozid, antioksidant faollik potentsiali bilan [17]. DPPH radikallarini tozalashECH ning antioksidant faolligini baholash uchun tahlil o'tkazildi. Troloks va resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilben, RES) mos ravishda standart va ijobiy nazorat sifatida qabul qilindi. Ko'rsatilganidekrasmda1, ECH yaxshi radikal tozalash faolligini ko'rsatdi va faollik sezilarli darajada yuqori edimusbat nazoratga (RES) qaraganda.

3.1.2. LC-540 va TM3 Leydig hujayralarida ECH ning hujayra hayotiyligi

MTT tahlili ECH ning turli kontsentratsiyasining hujayra hayotiyligini baholash uchun o'tkazildi. LC-540 Leydig hujayralari va TM3 Leydig hujayralari ECH bilan davolashdan keyin 80% dan ko'proq hayotiylikni ko'rsatdi (2-rasm). Boshqa kontsentratsiyalar bilan solishtirganda, ECH ning 100-µM konsentratsiyasi (2% FBS da 100 mkM suyultirish) TM3 Leydig hujayralarida yaxshi hujayra hayotiyligini ko‘rsatdi. Natija shuni ko'rsatdiki, ECH ning ortib borayotgan konsentratsiyasi hujayralarga sezilarli toksik ta'sir ko'rsatmaydi.

3.1.3. LC-540 va TM3 Leydig hujayralarida NBT tahlili orqali ECHning yoshga bog'liq bo'lgan superoksid ishlab chiqarishga ta'siri

AGE glyukozaning oksidlanishi va O2-, gidroksil radikallari va karbonil guruhlari kabi erkin radikallarning shakllanishi tufayli organizmda oksidlovchi shikastlanishga olib keladi [18]. 50 ug/ml AGE bilan stimulyatsiya qilingandan so'ng, LC -540 (3a-rasm) va TM3 (3b-rasm) hujayralari ECH va RES (har biri 5 mkM va 10 mkM) bilan ishlov berildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, nazorat guruhida (stimulyatsiya qilingan AGE) superoksid anionining ishlab chiqarilishi ko'paygan, ammo nazorat guruhidan keyin superoksid anionining ishlab chiqarilishi kamaygan (stimulyatsiya qilingan AGE), ammo superoksid anionining ishlab chiqarilishi superoksid ishlab chiqarilgandan keyin kamaydi va himoyalangan. hujayralarni oksidlovchi shikastlanishdan. LC{9}} hujayralarida 10 µM ECH normal guruh bilan deyarli o‘xshash faollikni ko‘rsatdi. Ikkala hujayradagi superoksid ishlab chiqarish ham ECH va RES konsentratsiyasining oshishi bilan kamaydi.

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. ECH ning H2O2 ning yoshga qarab stimulyatsiya qilingan LC{6}} Leydig hujayralarida ishlab chiqarilishiga ta'siri

Oksidlovchi turlarning mavjudligini aniqlash uchun DCFH-DA tahlili o'tkazildi. Hujayralarga kirgandan so'ng, lyuminestsent bo'yoq DCFH-DA hujayra ichidagi H2O2 bilan oksidlanadi va diklorofloressein (DCF) hosil qiladi. 4-rasmda ko'rsatilganidek, AGE bilan stimulyatsiya qilingan guruhda (nazorat) hujayra ichidagi H2O2 ishlab chiqarishda sezilarli o'sish kuzatildi, 10 mkM ECH va RES qo'shilishi hujayralardagi H2O2 ishlab chiqarishni sezilarli darajada kamaytirdi. 10 mkM ECH ma'muriyati H2O2 ishlab chiqarishning atigi 47,1% ga olib keldi, bu nazorat guruhidagiga qaraganda ancha past.

3.1.5. ECH ning RAGE va NF-kB protein ifoda darajalariga AGE-stimulyatsiya qilingan LC-540 Leydig hujayralarida ta'siri

LC-540 Leydig hujayralarida RAGE mavjudligini tasdiqlash uchun Western blot tahlili o'tkazildi. ECH ning AGEs bilan stimulyatsiya qilingan Leydig hujayralarida RAGE (5a-rasm) va NF-kB (5b) protein ifoda darajalariga ta'siri 5-rasmda ko'rsatilgan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, AGEsning 50 mkg/ml konsentratsiyasi yuqori RAGE va NF-ni qo'zg'atdi. LC-540 Leydig hujayralarida KB ifodasi va ECH va RESning 10 mkM konsentratsiyasi RAGE va NF-kB ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi. NF-kB ifodasi RES va ECHda RAGE antagonistlariga qaraganda ancha past edi. Shunday qilib, natijalar ECH RAGE va NF-kB darajasini pasaytirish orqali yallig'lanish darajasini pasaytirganligini tasdiqladi.

3.1.6. ECH ning AGE-stimulyatsiyalangan LC -540 Leydig hujayralarida testosteron sintezi yo'liga ta'siri.

Spermatogenez jarayoni va erkaklarning bepushtligi testosteron mavjudligiga bog'liq. 6-rasmda ko'rsatilganidek, AGE tomonidan qo'zg'atilgan LCda StAR (6a-rasm), CYP11A1 (6b-rasm), CYP17A1 (6c-rasm) va HSD17 3 (6d-rasm) oqsillari ifodalari sezilarli darajada kamaydi. }} Leydig hujayralari (nazorat guruhi). RAGE antagonisti, RES va ECH qo'shilganda Star, CYP11A1, CYP17A1 va HSD{16}} oqsillarining ifodasi sezilarli darajada oshdi. StAR va CYP11A1 oqsillarining ko'payishi ECH va RES bilan davolash qilingan guruhlarda kuzatilgan. CYP17A1 ning ifoda darajasi RES va ECH guruhlarida deyarli o'xshash edi. ECH bilan ishlangan Leydig hujayralarida HSD{23}} oqsilining ifodasi RES va RAGE antagonistlari bilan davolash qilingan hujayralardagiga qaraganda ancha yuqori edi. Star, CYP11A1, CYP17A1 va HSD{30}} oqsillarining ko'payishi testosteronning normal ishlab chiqarilishini ko'rsatdi.