In vitroda estrogen retseptorlari yordamchisi sifatida Cistanche Deserticola glikozidlarining estrogenik faolligi

KIRISH

Cistanche deserticola(Xitoy tilida "Rou Cong Rong"), an'anaviy xitoy dorivor o'simliklari birinchi bo'lib qayd etilganShenNongBenCaoJing, ming yillar davomida buyrak yetishmovchiligi, iktidarsizlik, keksalik ich qotishi va qon tanqisligini davolash uchun ishlatilgan.[1] U asosan Gansu va Shinjon kabi shimoli-g'arbiy Xitoyning cho'l hududlarida tarqalgan..[2]Zamonaviy farmakologiya tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, C. deserticola gormonlarni tartibga solish, immunomodulyatsion, antioksidant, neyroprotektiv, yallig'lanishga qarshi vaestrogen faolligi.[3,4] Cistanches glikozidlari(GC) turli biologik ta'sirga ega bo'lgan asosiy faol komponentlardan biri sifatida qaraldi.

Estrogen retseptorlari- (ERs-) va ER fiziologik funktsiyalarni tartibga soluvchi ERning kichik turlaridir.[7] Ushbu oqsillar hujayra yadrosidagi DNK tartibga soluvchi ketma-ketliklarga bog'lanish orqali maqsadli genlarning transkripsiyasini tartibga solishi mumkin edi. Ikkala kichik tip ham yurak-qon tomir va markaziy asab tizimlarida sezilarli darajada namoyon bo'ladi.[8,9] ER asosan sut bezlari, bachadon, tuxumdon, suyak, erkak jinsiy a'zosi va prostata bezlarida mavjud. ER asosan prostata, tuxumdon va siydik pufagida mavjud.[10,11] Bundan tashqari, tuxumdonlarning rivojlanishi va faoliyati hamda yurak-qon tomir tizimini himoya qilish kabi ikkita kichik tip uchun umumiy fiziologik rollar mavjud.[ 12,13] Guruhimizdagi oldingi tadqiqotlar metabolomik tahlil usuli bilan GKlarning estrogenga o'xshash mexanizmini aniqladi.[14] Uzluksiz tadqiqotda biz ER bilan bog'liq bo'lgan MCF-7 hujayra liniyalarida GKlarning estrogenik faolligi mexanizmini tahlil qildik.

TABIIY CISTANCHE TUBULOSA YASASHLASH UCHUNESTROGEN FAOLIYATIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIALLAR VA USULLAR

Asboblar

ECO‑170P‑230 inkubatori New Brunswick Scientific (Xitoy) Co., Ltd.dan, Bio‑Rad 680 mikroplata oʻquvchi va elektroforez apparati Bio‑Rad Laboratories, Inc.dan, CX21 mikroskopi Olympus Co., Ltd.dan, GIS‑2019 gel tasvirlash tizimi Tanon Science and Technology Co., Ltd.dan, tekis pastki plastinka Corning Inc.dan, EPICS‑XL oqim sitometriyasi Beckman‑Coulter Inc.dan va StepOnePlus Real-Time polimeraza zanjiri reaktsiyasi ( PCR) tizimi Thermo Fisher Scientific kompaniyasidan edi.

Kimyoviy moddalar va reagentlar

Laboratoriyamizda GK lar avval xabar qilingan usul [14] boʻyicha tayyorlangan va ultrabinafsha spektrofotometriya yordamida GK larning tozaligi 52% (GK larni aniqlash uchun marker sifatida akteozid ishlatilgan) aniqlangan. Estradiol (E2 ) Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanxay, Xitoy) dan sotib olingan. Homila sigir zardobi (FBS) va RPMI‑1640 Gibco Co., Ltd.dan, 96-quduqli tekis pastki plastinka Corning Inc.dan, dimetil sulfoksid (DMSO) va 3‑[4,5‑dimetil-2‑tiazolil edi. ]‑2,5‑difeniltetrazolium bromid (MTT) Sigma-Aldrich korporatsiyasidan sotib olingan. TRIzol reagenti, teskari transkripsiya (RT) to‘plami va TB Green™ RT-PCR to‘plami TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Xitoydan xarid qilingan. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb va ‑aktin antikorlari Wanlei Biotechnology Co., Ltd.dan sotib olingan. Boshqa barcha umumiy kimyoviy moddalar standart tijorat yetkazib beruvchilardan sotib olingan.

Namuna tayyorlash

Cistanches eritmasidan glikozidlarni tayyorlash

GC ekstrakti DMSOda eritilib, konsentratsiyasi 0,1051 g/ml bo'lgan birlamchi eritma hosil qilindi va 4 daraja haroratda saqlanadi. Fenol qizilsiz RPMI‑1640 ishlatishdan oldin eritmani turli konsentratsiyalarda suyultirish uchun ishlatilgan.

Estradiol zaxira eritmasini tayyorlash

E2 ekstrakti DMSOda eritilib, konsentratsiyasi 0,27 mg/ml bo'lgan eritma hosil qildi va 4 daraja haroratda saqlanadi. Fenol qizilsiz RPMI‑1640 ishlatishdan oldin eritmani turli konsentratsiyalarda suyultirish uchun ishlatilgan.

Ko'mir dekstrani bilan ishlov berilgan homila sigir zardobini tayyorlash

Yuz mililitr FBS 250 mg faollashtirilgan ko'mir kukuni va 25 mg dekstran bilan aralashtiriladi. 55 gradusda 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, aralash 15 daqiqa davomida 4 daraja, 1000 rpm da santrifüj qilindi. Supernatant ko'mir dekstrani bilan ishlov berilgan (CDT) - FBS ni olish uchun Millipore Express PES membranasi yordamida filtrlandi va -20 darajada saqlanadi.

Hujayra madaniyati

Odamning ko'krak bezi saratoni MCF-7 hujayra liniyalari Amerika tipidagi madaniyat kollektsiyasidan (ATCC) olingan. Bundan tashqari, hujayralar 10% FBS va 1% penitsillin-streptomitsinni o'z ichiga olgan RPMI‑1640 muhiti bilan 37 daraja namlangan 5% CO2 atmosferasida ekilgan. Hujayralar hujayralardagi estrogen tozalanishi uchun MTT tahlilidan 4 kun oldin 5% CDT-FBS o'z ichiga olgan fenol qizilsiz RPMI-1640 muhitida ekilgan.

MCF-7 hujayra liniyalarida estradiolning hujayra proliferatsiyasi tahlili

Hujayra proliferatsiyasi MCF‑7 hujayralari uchun MTT tahlili yordamida o'lchandi.[15,16] E2 RPMI‑1640 kultura muhitida 0.1% DMSO ni o'z ichiga olgan yakuniy konsentratsiyalarda {{27} eritildi. }}.1, 1, 10, 100 va 1000 nM. MCF-7 hujayra chiziqlari 4 kun davomida fenol qizilsiz RPMI-1640 muhitida o'stirildi. Fosfat tamponlangan sho'r suv (PBS) bilan uch marta yuvilgandan so'ng, 100 mL FBSsiz RPMI-1640 muhiti har bir quduq uchun 1,5 × 104 da 96 quduqli plitalarga qo'shildi va 37 daraja haroratda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, hujayralar 72 soat davomida E2 eritmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Keyin har bir quduqqa 100 µL MTT eritmasi (0,5 mg/ml) qo‘shildi. Hujayralar 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, formazan kristallarini eritish uchun 150 mkl DMSO qo'shildi. Absorbans 570 nm da mikroplata o'quvchi tomonidan o'lchandi va tarqalish tezligi (PR) hisoblab chiqildi.

JINSIY FUNKSIYANI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MCF-7 hujayra liniyalarida Cistanches glikozidlarining hujayra proliferatsiyasi tahlili

Hujayra proliferatsiyasi MCF-7 hujayralari uchun MTT tahlili yordamida o'lchandi. GKlar 0.0 175, 0,175, 1,75, 17,5 va 175 mkg yakuniy konsentratsiyalarda 0,1% DMSO ni o'z ichiga olgan RPMI‑1640 kultura muhitida eritildi. /ml. MCF-7 hujayra chiziqlari 4 kun davomida 5% CDT-FBS o'z ichiga olgan fenol-qizilsiz RPMI-1640 muhitida yetishtirildi. PBS bilan uch marta yuvilgandan so'ng, 100 mL FBSsiz RPMI-1640 muhiti har bir quduq uchun 1,5 × 104 da 96 quduqli plitalarga qo'shildi va 37 daraja haroratda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, hujayralar mos ravishda 24, 48 va 72 soat davomida GCs eritmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Keyin har bir quduqqa 100 µL MTT eritmasi (0,5 mg/ml) qo‘shildi. Hujayralar 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, formazan kristallarini eritish uchun 150 mkl DMSO qo'shildi. Absorbans 570 nm da mikroplata o'quvchi tomonidan o'lchandi va PR hisoblab chiqildi. Fenol qizilsiz RPMI‑1640 va E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) o‘z ichiga olgan muhit mos ravishda salbiy va ijobiy guruhlar edi.

MCF-7 hujayra liniyalarida fulvestrant bilan Cistanches glikozidlarining hujayra proliferatsiyasi tahlili

Hujayra proliferatsiyasi MCF-7 hujayralari uchun MTT tahlili yordamida o'lchandi. GKlar 1,75, 17,5 va 175 mkg/ml yakuniy konsentratsiyalarda 0,1% DMSO ni o'z ichiga olgan RPMI‑1640 kultura muhitida eritildi. MCF-7 hujayra chiziqlari 4 kun davomida 5% CDT-FBS o'z ichiga olgan fenol-qizilsiz RPMI-1640 muhitida yetishtirildi. PBS bilan uch marta yuvilgandan so'ng, 100 mL FBSsiz RPMI-1640 muhiti har bir quduq uchun 1,5 × 104 da 96 quduqli plitalarga qo'shildi va 37 daraja haroratda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, hujayralar GCs eritmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi va fulvestrant (6,06 × 10-5 mkg / ml) bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin har bir quduqqa 100 µL MTT eritmasi (0,5 mg/ml) qo‘shildi. Hujayralar 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, formazan kristallarini eritish uchun 150 mkl DMSO qo'shildi. Absorbans 570 nm da mikroplata o'quvchi tomonidan o'lchandi va PR hisoblab chiqildi. Fenol qizilsiz RPMI‑1640 va E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) o‘z ichiga olgan muhit mos ravishda salbiy va ijobiy guruhlar edi.

Hujayra siklini tahlil qilish

GKlar 1,75, 17,5 va 175 mkg/ml yakuniy konsentratsiyalarda 0,1% DMSO ni o'z ichiga olgan RPMI‑1640 kultura muhitida eritildi. MCF-7-hujayra liniyalari 4 kun davomida 5% CDT-FBS o'z ichiga olgan fenol qizilsiz RPMI-1640 muhitida o'stirildi. PBS bilan uch marta yuvilgandan so'ng, har bir quduq uchun 2,5 × 105 da 6 quduqli plitalarga 1 ml FBSsiz RPMI-1640 muhiti qo'shildi va 37 daraja haroratda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, hujayralar GCs eritmasining turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi va fulvestrant (6,06 × 10-5 mkg / ml) bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, hujayralar yig'ildi va PBS bilan uch marta yuvildi, 4 daraja, 1000 rpm 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi va bir kechada -20 daraja 70% etanol bilan mahkamlandi. PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, hujayralar 30 daqiqa davomida 4 daraja qorong'ida 1 mg / ml RNase A va 0,1% Triton X-100 o'z ichiga olgan PI eritmasi (50 mg / ml) bilan bo'yalgan. Hujayra sikli oqim sitometriyasi yordamida aniqlandi va proliferatsiya indeksi (PI) quyidagicha hisoblandi. Fenol qizilsiz RPMI‑1640 va E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) o‘z ichiga olgan muhit mos ravishda salbiy va ijobiy guruhlar edi.

PI {0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100%

RNK izolyatsiyasi va real vaqtda miqdoriy polimeraza zanjiri reaktsiyasini tahlil qilish

mRNK darajasini o'lchash uchun RT-kantitativ PCR (qPCR) tahlili ishlatilgan. Umumiy hujayrali RNK TRIzol reaktivi bilan ekstraksiya qilindi. qPCR uchun RNK RT to'plami yordamida 4 mkg umumiy RNKdan cDNKga teskari transkripsiya qilindi. RT‑PCR tahlillari TB Green™ RT‑PCR to‘plami yordamida o‘tkazildi. Barcha protokollar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. ERni kuchaytirish uchun ishlatiladigan primer jufti 5'‑GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG‑3' (oldinga) va 5'‑TGGCTGGACACATATAGTCGTT‑3' (teskari); ERni kuchaytirish uchun ishlatiladigan primer jufti 5'‑AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG‑3' (oldinga) va 5'‑CCTGGGTCGCTGTGACCAGA‑3' (teskari) edi. ER va ER uchun PCR shartlari 3 daqiqa davomida 94 daraja, keyin 37 va 40 tsikllar, mos ravishda 30 soniya uchun 94 daraja, 2 daqiqa uchun 58 daraja va 2 daqiqa uchun 72 daraja. GAPDH ni kuchaytirish uchun ishlatiladigan primer jufti 5'‑GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT‑3' (oldinga) va 5'‑GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG‑3' (teskari) edi. GAPDH uchun PCR shartlari 3 daqiqa davomida 94 daraja, keyin 30 soniya davomida 94 daraja 30 tsikl, 2 daqiqa uchun 58 daraja va 2 daqiqa davomida 72 daraja edi. Har safar RT‑qPCR tajribasi ikki martadan ortiq takrorlangan. Buning uchun GAPDH ichki nazorat sifatida ishlatilgan. Nazorat hujayralariga nisbatan transfektantlarning ER / ER ning nisbiy gen ifodasi hisoblab chiqilgan: 2−(∆∆Ct).

Western bloting

ER va ER oqsillarining ifodasi kichik o'zgarishlar bilan hisobot usuli sifatida western blot tahlili bilan aniqlandi. Qisqacha aytganda, MCF-7 xujayralari har bir quduqda 2,5 × 105 hujayrada 6 quduqli plastinkalarda o'stirildi va 48 soat davomida mos ravishda 1,75, 17,5 va 175 mkg/ml yakuniy konsentratsiyada GC bilan ishlov berildi. Inkubatsiyadan so'ng, butun hujayra ekstraktlari 1 mM PMSF o'z ichiga olgan RIPA buferi yordamida tayyorlandi. Butun hujayra ekstraktidagi oqsillar 12% natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi bilan ajratilgan va keyin poliviniliden diftorid membranalariga o'tkazilgan. Membrana TBST buferida eritilgan 5% (w/v) yog'siz sut bilan bloklandi va navbat bilan birlamchi va ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Bog'langan antikorlar kuzatildi.

TABIIY CISTANCHE TUBULOSA YASASHLASH UCHUNESTROGEN FAOLIYATIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Statistik tahlil

Natijalar o'rtacha va standart og'ishlar sifatida ifodalangan va statistik ahamiyatlilik SPSS 21.0 dasturiy ta'minoti (IBM Co., Ltd. Amerika) bilan Student's t‑testidan foydalangan holda bajarilgan. P<0.05 was considered statistically significant. 

NATIJALAR

24 soatlik E2 davolashdan so'ng, MCF-7 hujayralarining ko'payishi yaxshilandi [1a-rasm]. 10nM E2 eritmasi hujayralar o'sishini rag'batlantirishi mumkin (123,89%). Biroq, E2 kontsentratsiyasining oshishi bilan hujayraning ko'payish qobiliyati zaiflashdi. Demak, 10nM bu tajribada E2 ning optimal konsentratsiyasi edi. 1,75, 17,5 va 175 mkg/mg konsentratsiyadagi GK guruhi vaqt va dozaga bog'liq holda MCF-7 hujayra liniyalarining proliferatsiyasini kuchaytirishi mumkin va salbiy guruh bilan sezilarli farqni ko'rsatdi [1b-rasm]. Salbiy guruh bilan taqqoslaganda, E2 guruhi aniq proliferatsiyani ko'rsatdi (120,06%). CDT-FBS muhitidagi kombinatsiyalangan dori guruhi (CMG) (E2 yoki GC bilan fulvestrant) MCF-4 hujayralari bilan inkubatsiya qilindi. 72 soatdan keyin

inkubatsiya, CMG individual dori guruhi (IMG) bilan solishtirganda PR moyilligiga olib kelishi mumkin (P).< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

XULOSA

Ushbu tadqiqotda GC ning MCF-7 ning proliferatsiyasi va hujayra aylanishiga ta'siri mos ravishda MTT va oqim sitometriyasi usuli bilan tekshirildi.GC lar MCF-7 hujayralarining ko'payishini oshirishi mumkin72 soat davomida inkubatsiyadan keyin 1,75, 17,5 va 175 mkg/ml konsentratsiyada. Biroq, CC va fulvestrant birgalikda ishlatilganda o'sish sekinlashadi. GClar MCF‑7 hujayralarining PI qiymatini oshirishi, G1 fazasining hujayrasini kamaytirishi va S va G2 fazalarining hujayralarini oshirishi mumkin.

Fulvestrant ERga xos antagonist bo'lib, retseptorlarning dimerizatsiyasini va energiyaga bog'liq yadro transportini buzish orqali ERning yadro lokalizatsiyasini bloklaydi.[17] Ushbu tadqiqotda fulvestrant MCF-7 hujayralarida GC ko'payishini susaytirishi va hujayra siklining o'zgarishiga ta'sir qilishi mumkinligini tasdiqladi. Shunday qilib, ushbu tadqiqot GC ning estrogenik faolligini ko'rsatdi, shuningdek, ER

GC maqsadi. RT‑PCR va western blot tajribasida MCF‑7 hujayralarida ER va ERning mRNK va oqsil ifodalari GC kontsentratsiyasining oshishi bilan oshdi. Demak,GKlar estrogenik faollikda rol o'ynashi mumkinyuqori tartibga solingan mRNK va ER va ER oqsillariga ko'ra.

TABIIY CISTANCHE TUBULOSA YASASHLASH UCHUNESTROGEN FAOLIYATIPHGS75% ECH 30% ACT 12%