Wistar kalamushlarining ichak mikrobiotasi va jigar va buyrak funktsiyasining o'zgarishi bo'yicha og'iz orqali yuboriladigan kaltsiy alginat aerogelini baholash

Aloqa:ali.ma@wecistanche.com

Muhammad AA Al-Najjar va boshqalar

Abstrakt

Ushbu tadqiqot kaltsiy alginat aerojelining potentsial dori tashuvchisi sifatida jigar va jigarga ta'sirini baholaydi.buyrak funktsiyalari, va Wistar kalamushlarining ichak mikrobiotasida. Tadqiqotlar alginat aerojel reaktiv kesish texnikasidan foydalangan holda nanopartikullar shaklida tayyorlangan va ular o'ziga xos sirt maydonlari, tashqi morfologiya va zarrachalar hajmining taqsimlanishi nuqtai nazaridan tavsiflangan. In vivo tadqiqot uchun kaltsiy alginat aerogel og'iz orqali, jigar vabuyrak funktsiyalaribir hafta va to'rt hafta davomida ikkita alohida tadqiqotda sinovdan o'tkazildi. Qisqa muddatli in vivo tadqiqot davomida bakterial DNK ekstraktsiyasi uchun najas namunalari yig'ildi, so'ngra ichak mikrobiotasidagi o'zgarishlarni aniqlash uchun 16S rRNK gen sekvensiyasi tahlillari o'tkazildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, tayyorlangan alginat aerojelning o'rtacha BETga xos sirt maydoni taxminan 540 m2 / g, g'ovak hajmi 7,4 cc/g va gözenek kengligi 30-50 nm. In vivo tadqiqot shuni ko'rsatdiki, o'rganilgan darajalarbuyrakva jigar fermentlari normaning eng yuqori darajasidan oshmadi. Ichak mikrobiotasini o'rganish turli naqshlarni ko'rsatdi; Clostridia va Bacteriodia kabi bakteriyalarning ayrim guruhlari ko'paydiaerojellarrejimi va aerojel to'xtatilgandan keyin o'sishda davom etdi. Erysipelotrichia va Candidatus Sacha kabi boshqa guruhlar esa davomida ko'payganaerojellardavolash va keyin bir oydan keyin yana kamayadi. Bacilli sinfining a'zolari o'ziga xos tendentsiyani ko'rsatdilar, ya'ni 0 davrida eng ko'p tarqalgan guruh (63 foiz) bo'lganidan keyin ularning nisbiy ko'pligi < 5="" foizga="" yetguncha="" keskin="" kamaydi;="" aerogel="" bilan="" davolashni="" to'xtatgandan="" keyin="" ham="" shunday="">

Cistanchetubulosa oldini oladibuyrakkasallik, cistanche yon ta'siri, bosing.

Kirish

AerojellarTerminologiya birinchi marta 1931 yilda Samuel Kistler tomonidan yaratilgan bo'lib, u ularni g'ovak suyuqliklarini gaz bilan almashtirishda o'zlarining g'ovaklari va tarmoq tuzilishini buzilmagan holda saqlaydigan materiallar deb ta'riflagan [1]. Ularning kashfiyotidan 60 yil o'tgach, organikaerojellarKatta ichki yuzasi va ochiq gözenek tuzilishi tufayli biotibbiyot va dori vositalarini etkazib berish uchun taklif qilingan [2]. Ushbu material sinfining ajoyib xususiyatlari nafaqat yuklanish samaradorligini oshirishga, balki yuklangan molekulalarning bio-mavjudligini, barqarorligini va ajralish kinetikasini yaxshilashga imkon beradi.

bo'yicha tadqiqotaerojellarog'iz dori qabul qilish uchun dastlab silika foydalanishga qaratilganaerojellarularning moslashuvchan va taniqli sol-gel kimyosi, shuningdek derivatizatsiya imkoniyatlari tufayli [3]. Shunga qaramay, og'iz orqali yuborish uchun mo'ljallangan farmatsevtik formulalarda silika aerojellaridan foydalanish ularning biologik parchalanishi cheklanganligi sababli hali ham ma'lum tashvish tug'diradi. Shu sababli, biologik mos keluvchi va biologik parchalanadigan aerojel tashuvchisini ishlab chiqish zarurati tug'iladi. Buni tabiiy organik materiallar yoki biologik parchalanadigan polimerlar, masalan, alginat [4] gialuron kislotasi [5], xitozan, tsellyuloza [6] va oqsillar [7] yordamida amalga oshirish mumkin.

Jigarrang suv o'tlaridan olingan alginat (Alg) chiziqli sopolimer bo'lib, ß-1,4-D-mannuron kislotasi va -L-guluron kislotasi monomerlaridan tashkil topgan bo'lib, ular bir-biri bilan kesishgan gomogen yoki heterojen bloksimon naqshlardir. . Alginatlar oziq-ovqat va farmatsevtika sanoatida qo'llanilgan, chunki u toksik bo'lmagan, arzon, biologik parchalanadigan va biomoslashuvchan [8, 9]. Ca2 plyus, Ba2 plyus yoki Sr2 plyus kabi polivalent kationlar Alg ning ionli o'zaro bog'lanishini keltirib chiqarishi va uni eriydigan shakldan erimaydigan (gel) shaklga aylantirishi mumkin.

Alg oziq-ovqat mahsulotlarida va farmatsevtik qo'shimcha sifatida keng qo'llaniladi, masalan, jelleştiruvchi vosita va planshetlarni parchalovchi [10, 11]. Bundan tashqari, u biomedikal ilovalarda, jumladan, dori vositalarini etkazib berish va to'qimalarni muhandislik qilishda qo'llanilgan [12]. Boshqa oziq-ovqat tolalari singari, Alg va uning oligomer hosilalari insonning endogen fermentlari tomonidan hazm bo'lishiga chidamli. Biroq, u inson ichak mikrobiotasi tomonidan sezilarli darajada hazm bo'lishi mumkin [13]. Uning ahamiyatiga qaramay, Alg degradatsiyasiga sabab bo'lgan ichak mikrobiotasi haqida kam narsa ma'lum.

Evropa oziq-ovqat xavfsizligi boshqarmasi (EFSA) algin kislotasi va uning tuzlari, shuningdek, ularning fermentatsiya mahsulotlari xavfsizligini e'lon qildi. Hayvonlarda algin kislotasi va uning tuzlarining suvli eritmalari va suspenziyalarining so'rilishi va chiqarilishi bo'yicha in vivo sinovlari, qabul qilish paytida qanday shaklda bo'lishidan qat'i nazar, oshqozon-ichak traktida mavjud bo'lgan fermentlar tomonidan so'rilmaydi yoki metabollanadi. Shu bilan birga, ular anaerob ichak mikrobiotasi ta'sirida yo'g'on ichakdan o'tish paytida fermentatsiya natijasida qisman parchalanadi, bu esa EFSA tomonidan oziq-ovqat qo'shimchalari sifatida sinovdan o'tgan yuqori dozalarga bog'liq moslashuvchan jarayon sifatida ko'richak kengayishiga olib keladi [14] . Shunga qaramay, ilgari o'tkazilgan in vivo tadqiqotlarda aerojel ko'rinishidagi kaltsiy alginat (Ca-Alg) ning organizmga ta'siri o'rganilmagan.jigar, buyrak,yoki ichaklardagi bakterial jamoa.

Ichak mikrobiotasi inson ovqat hazm qilish tizimining muhim tarkibiy qismidir, chunki ular qabul qilingan oziq-ovqatning, ayniqsa, inson tanasida zarur fermentlarga ega bo'lmaganlarning parchalanishiga yordam beradi [15, 16]. Ichak mikrobiotasi, shuningdek, patogen mikroorganizmlar bilan oziq moddalar resurslari bo'yicha raqobatlashish yoki ularning o'sishiga to'sqinlik qiladigan kimyoviy moddalar ishlab chiqarish orqali ularning gullashiga to'sqinlik qilishi mumkin. Shu bilan birga, Alg kabi yutilgan hazm bo'ladigan tolalarning parchalanishi asosan yo'g'on ichakdagi fermentlangan bakteriyalar tomonidan sodir bo'lishi ko'rsatilgan [17]. Ushbu jarayonning mahsulotlari qisqa zanjirli yog 'kislotalari (SCFA) bo'lib, ular yo'g'on ichakning yallig'lanishi uchun foydalidir va saratonga qarshi kurashadi. Brownlee va boshqalar. Alg va inson najas mikroflorasining inkubatsiyasi Alg degradatsiyasining aksariyati ichak mikrobiotasining o'zgarishi bilan birga ekanligini ko'rsatdi. Shuningdek, bunday inkubatsiya 24 soatdan keyin SCFA va gaz hosil bo'lishiga olib keladi [17].

Materiallar va uslublar

Materiallar

Algin kislotasi natriy tuzi BASF, Germaniya tomonidan yetkazib berildi. Kaltsiy xlorid (CaCl2) Th dan sotib olindi. Geyer GmbH & Co. KG, Germaniya. Karbonat angidrid (tozaligi 99,5 foiz) Praxair (Germaniya), etanol 99,8 foizi Karl Rotdan (Germaniya) olingan. Barcha kimyoviy moddalar qabul qilinganidek ishlatilgan. ALPni o'lchash uchun tijorat diagnostika to'plamlari ishlatilgan va kreatinin to'plamlari Biostsystems SA, Ispaniyadan sotib olingan. MO BIO'S PowerMax SoilDNA izolyatsiyasi to'plami AQShning MO BIO Laboratories kompaniyasidan sotib olingan. Tadqiqot davomida deionlashtirilgan suv ishlatilgan.

Usullari

Aerojel zarralarini tayyorlash.

Aerojel zarralarini tayyorlashda birinchi qadam stok eritmasini tayyorlash edi; Buning uchun natriy alginat kukuni (Alg) distillangan suvga 1% og'irlik / og'irlik konsentratsiyasida qo'shildi va xona haroratida tun davomida magnit aralashtirish ostida saqlangan. Gidrojel zarralarini tayyorlash uchun Preibisch va boshqalar tomonidan tasvirlangan yondashuv. [18] Genia Lab, Braunschweig (Germaniya) dan Jet Cutter Type S yordamida kuzatildi. Jet-kesish jarayonida alginat eritmasi nozuldan (diametri 350 mkm) siqilgan havo (1-3 bar) orqali oqim hosil qilish uchun chiqariladi (massa oqimi 1 g / s). Jet aylanuvchi disk bilan alohida zarrachalar bilan kesilgan (kesish disklarining 100 mkm simli diametri bo'lgan 40 sim, silindr nisbati 5). Diskdan o'tgandan so'ng, polimer eritmasi 5 g / L bo'lgan CaCl2 eritmasi bilan jelleşme vannasiga pastga tushdi. Jel zarralari aglomeratsiyasini oldini olish uchun jelatin vannasining hajmi qayta ishlangan biopolimer eritmasining umumiy hajmidan kamida to'rt baravar ko'p bo'lgan va vannalarning tarkibi magnit bar (60 rpm) bilan aralashtiriladi. Ko'krak va jelatin vannasi orasidagi ajratish masofasi 50-70 sm da saqlanadi. Jel zarralarini to'plagandan so'ng, to'liq gellanishni ta'minlash va aglomeratsiyani oldini olish uchun aralashtirish 60 daqiqa davomida davom ettirildi. Jellangan zarrachalar filtrlash orqali jelleşme vannasidan ajratildi va erituvchi almashinuvi uchun davom etdi.

Yig'ilgan zarrachalarda hal qiluvchi almashinuvi (suvdan etanolga) bosqichma-bosqich amalga oshirildi (30,60, 90, 100 foiz v/v etanol). To'liq almashinuvni ta'minlash uchun oxirgi erituvchini almashtirish bosqichidan keyin namlash suyuqligining zichligi zichlik o'lchagich yordamida o'lchandi (DMA4500, Anton PaarCompany, Avstriya). Keyin zichlik etanol tarkibiga qayta hisoblab chiqildi. Olingan alkogel zarralari oxir-oqibat filtr qog'oziga o'ralgan va o'ta kritik CO2 bilan avtoklavda 50˚C doimiy haroratda va 120 bar bosimda quritilgan. Etanol to'liq ekstraksiya qilinmaguncha (2-4 soat) CO2 ning uzluksiz oqimi (20-80 g / min) o'rnatildi. Keyin avtoklavning sekin bosimini tushirish (1-3 bar / min) amalga oshirildi. Atrof muhit bosimiga erishilgandan so'ng, avtoklav ochildi va kaltsiy alginatining aerojel mikrosferalari (bundan keyin Ca-Alg deb nomlanadi) yig'ildi va quruq sharoitda yaxshi muhrlangan idishlarda saqlangan.

Aerojel zarrachalarining xarakteristikasi

aerojel zarrachalarining o'ziga xos sirt maydonlari past haroratli azot adsorbsiyasi/desorbsiyasi (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Germaniya va Micromeritics TriStar II 3020, Germaniya) orqali o'lchandi. O'lchovlardan oldin namunalar vakuum ostida 20 quritilgan (< 1="" mpa)="" at="">

Tayyorlangan aerojel zarrachalarining tashqi morfologiyasini tekshirish skanerlovchi elektron mikroskop (SEM) tahlili (Zeiss Supra VP55, Jena, Germaniya) orqali 3 kV tezlanish kuchlanishida va 9 ish masofasida amalga oshirildi.0– 9,4 mm. Zaryadlashni minimallashtirish va tasvir kontrastini yaxshilash uchun namunalar tasvirga olishdan oldin oltin bilan sepilgan (qalinligi 10 nm).

Taxminan 10 000 zarrachadan tashkil topgan har bir namuna uchun zarrachalar hajmini taqsimlash o'lchovlari uch marta amalga oshirildi. Dinamik tasvir tahlili X-Jet modulli (Retsch GmbH, Germaniya) aCamsizer XT yordamida 50 kPa bosimli havo bilan amalga oshirildi.

Jigar va buyrak funktsiyasi, ichak mikrobiotasini o'rganish

Davolash moddalarining to'rtta dozasini qamrab olish uchun turli guruhlarga bo'lingan oz sonli hayvonlar ustida uchuvchi tadqiqot o'tkazildi. Buyrak yoki jigar faoliyatiga katta ta'sir ko'rsatmaydigan va kasallanish yoki o'lim belgilarini ko'rsatmaydigan Ca-Alg aerojellarining maksimal dozasini ko'rish uchun qisqa vaqt (1 hafta) davomida o'tkazildi. Dozalar og'iz orqali qabul qilingan alginatning LD50 miqdorini (tana vazniga 5,{4}} mg/kg dan ortiq) hisobga olgan holda o'ylab tanlandi [19]. Ammo hayvonlarning minimal qo'zg'alishi bilan erishilgan maksimal dozasi 2,000mg/kg tana vazniga teng edi.

Tadqiqotning ikkinchi qismida hayvonlar ikki hafta davomida belgilangan doza darajasiga ta'sir qilishdi. Ushbu tadqiqot davomida yosh va vazn o'zgarishi va parvarish sharoitlari bo'yicha Iqtisodiy hamkorlik va taraqqiyot tashkiloti (OECD) ko'rsatmalariga amal qilindi (kod № 206). Barcha eksperimental protokollar Iordaniya Amaliy fanlar xususiy universiteti (ASU) axloqiy qo‘mitasi (IRB, Tasdiqlash raqami: 2019-PHA-12, S1 fayliga biriktirilgan) tomonidan tasdiqlangan. ASU hayvonlar uyidagi barcha xodimlar aralashuv natijasida hayvonda yuz berishi mumkin bo'lgan har qanday o'zgarishlarni kuzatish uchun yaxshi o'qitilgan. Xususan, ular vazn o'zgarishi, g'ayritabiiy xatti-harakatlar, jingalak mo'yna, harakatchanlikning pasayishi, tana holati yoki tana suyuqligining o'ziga xos belgilarini ifodalash kabi parametrlarni kuzatadilar. Hayvonlarning holatida biron bir jiddiy g'ayritabiiy o'zgarishlar bo'lsa, ularga ASU axloqiy qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan insonparvarlik protokolidan foydalanishga ruxsat beriladi. Tajribalar oxirida kalamushlar vena ichiga 20 mg/kg dozada 2,5 foiz tiopental natriy (Abbott Laboratories, North Point, Gonkong) yordamida umumiy behushlik ostida ekssanguinatsiya yo‘li bilan evtanizatsiya qilindi.

Hayvon

Qisqa muddatli va uzoq muddatli in vivo tadqiqotlarda o'rtacha og'irligi 240 ± 37 g bo'lgan o'n haftalik sog'lom Wistar kalamushlari 21-23 ˚C haroratda va 35% -70% namlikda saqlangan. boshqariladigan xonalarda, 12 soat yorug'lik - 12 soat qorong'u davrlarda. Kalamushlar aniqlandi va ularning xatti-harakatlarini buzmasdan kuzatish qulayligi uchun aniq qirrali kataklarga alohida joylashtirildi. Yog'och talaşlari choyshab sifatida ishlatilgan. Kalamushlar sotiladigan parhez bilan oziqlangan (Mahalliy ta'minot, Iordaniya) va chuchuk suv bepul taklif qilingan.

Turli xil tajribalarda guruh boshiga kalamushlar soni avval chop etilgan ishlarga (misollar; [20-22]) va milliy va xalqaro miqyosda "hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish" bo'yicha qat'iy qoidalarga qarab tanlab olindi. tadqiqot ishlarida foydalaniladigan hayvonlar soni. Bular, lekin ular bilan cheklanmagan holda, Kaliforniya universiteti, Berkli (https://acuc.berkeley.edu/about.html) va hayvonlardan foydalanish bo'yicha Norvegiya yo'riqnomasi (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-hayvanlar-in-research/).

Pilot in vivo tadqiqoti (7 kunlik takroriy dozalar)

Wistar kalamushlarida xavfsizlikni ko'rsatadigan aerojellarning maksimal mumkin bo'lgan dozasini aniqlash uchun bir hafta davomida takroriy og'iz dozasi o'tkazildi. Ca-Alg aerogel og'iz orqali 50, 100, 250 va 500 mg to'rtta dozada, mos ravishda 200, 400,1000 va 2000 mg / kg (tana vazni) o'rtacha dozasiga mos ravishda yuborildi. Natijalar 50 va 500 mg natriy alginat (Na-Alg) berilgan ikkita ijobiy nazorat guruhi bilan taqqoslandi, mos ravishda 200 va 2000 mg / kg tana vazniga mos keladi. Oxir-oqibat, Ca-Alg aerojel va Na-Alg davolashning barcha oldingi guruhlari nazorat guruhiga (platsebo) havola qilindi. Oxirgi guruh fosfat tamponini sinov moddalari uchun transport vositasi sifatida kiritilganda maksimal dozaga ekvivalent dozada oldi. Uchuvchi tadqiqot uchun nazorat va davolash guruhlari 4 ta kalamush/guruhdan (ikkita ayol va ikkita erkak/guruh) iborat edi. Ca-Alg aerojel va Na-Alg ning qattiq kukunlari mos ravishda fosfat tamponida (pH 7,4) to'xtatildi va to'g'ridan-to'g'ri og'iz orqali yuborishdan oldin yaxshilab aralashtirildi, chunki kalamushlar ularni quruq holatda iste'mol qilishdan bosh tortdilar. Barcha guruhlar uchun kalamushlarga yuborish har kuni bir vaqtning o'zida og'iz orqali gavaj yordamida boshlangan.

Uzoq muddatli in vivo ta'sirni o'rganish (15 kunlik takroriy dozani o'rganish)

Oldingi bo'lim natijalariga ko'ra, 250 mg Ca-Alg aerojel dozasi uzoq muddatli (15 kun) ta'sirini o'rganish uchun qo'shimcha baholash uchun tanlandi. Ca-Alg aerojel yoki mos ravishda Na-Alg ta'sirida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan ta'sirlar. ning. Har bir sinovdan o'tgan modda uchun nazorat, davolash va sun'iy yo'ldosh guruhini o'z ichiga olgan uchta hayvon guruhi ishlatilgan. Nazorat guruhi 6 ta Wistar kalamush/guruhidan (3 erkak va 3 urg'ochi), davolash va sun'iy yo'ldosh guruhlari esa 10 ta Wistar kalamush/guruhidan (5 erkak va 5 urg'ochi) iborat edi. Davolash guruhlaridagi Wistar kalamushlari 15 kun davomida 250 mg sinov moddalarining sutkalik dozasini (Ca-Alg aerojel yoki Na-Alg) olgan va ular 16-kuni qurbon qilingan. Sun'iy yo'ldosh guruhlari bir xil muddatda davolangan. davolash guruhlari uchun xuddi shunday, ammo davolanishdan keyin qo'shimcha 15 kun davomida kuzatuv ostida bo'lishdi va ular 30-kuni qurbon qilindi.

Shuni ta'kidlash kerakki, Ca-Alg aerojel va Na-Alg bo'yicha ikkita tadqiqotni parallel ravishda o'tkazish mumkin emas edi. Shu sababli, ikkalasi uchun bitta nazorat guruhidan foydalanish qulay emas edi. Ushbu nazorat guruhlari faqat 15 kun davomida og'iz orqali fosfat tamponini oldi va keyinchalik 14 kun davomida kuzatildi. Qisqa muddatli tajriba sifatida Ca-Alg aerojel va Na-Alg ning qattiq kukunlari ham fosfat tamponida (pH 7,4) to'xtatildi va to'g'ridan-to'g'ri og'iz orqali yuborishdan oldin yaxshilab aralashtirildi. Barcha guruhlar uchun kalamushlarga yuborish har kuni bir vaqtning o'zida og'iz gavajidan foydalangan holda boshlangan.

Klinik va xulq-atvorni kuzatish

OECD 407 ko'rsatmalariga muvofiq, hayvonlar har kuni har qanday g'ayritabiiy klinik belgilar yoki xatti-harakatlardagi o'zgarishlar uchun har kuni kuzatilgan, bunda sinov moddasi kiritilgandan keyingi dastlabki to'rt soatga alohida e'tibor qaratildi. Sun'iy yo'ldosh va nazorat guruhlaridagi hayvonlar qo'shimcha 15 kun davomida davolanishsiz kuzatildi. Sun'iy yo'ldosh guruhi ishqoriy fosfataza (ALP) va kreatinin darajasini o'lchash orqali jigar va / yoki buyrak ta'sirini ko'rsatadigan kech paydo bo'lgan har qanday klinik belgilarni aniqlash imkonini beradi.

Sarum biokimyosi va najas tahlillari

Ispaniya. Qon namunalari Wistar kalamushlarining orbital sinus venalaridan olingan, keyinchalik ular sarumni ajratish uchun ishlatilgan. Namunalardan olingan bu to'plangan sarum keyin steril Eppendorf naychalariga o'tkazildi va biokimyoviy parametrlarni keyingi tekshirish uchun chuqur muzlatish kamerasida saqlangan. Najas namunalari, shuningdek, har ikkinchi kunda mikroblar hamjamiyati tarkibidagi o'zgarishlarni o'rganish uchun to'plangan. Najas toza steril 15 ml vintli qopqoqli naychalarga yig'ildi va barcha namunalar olinmaguncha bevosita -20˚C haroratda saqlangan. 15-kunlik takroriy dozani oʻrganish uchun har hafta ishqoriy fosfataza (ALP) va kreatinin darajasini oʻlchash uchun faqat qon namunalari olindi, yaʼni 0 kuni, 7-kun, 14-kun. 21-kun va 30-kun (21-kun va 30-kun faqat nazorat va sun'iy yo'ldosh guruhlari uchun qo'llaniladi).

Ichak mikrobial jamiyatini tahlil qilish

Yig'ilgan najas namunalaridan DNK ekstraktsiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda MO BIO'S PowerMaxSoil DNK izolyatsiyasi to'plami (MO BIO Laboratories, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Keyinchalik janob DNK laboratoriyasi (Molecular Research LP, AQSH) yordamida genomik DNKni (gDNK) polimeraza zanjiri reaktsiyasini (PCR) tozalash va sekvensiyalash amalga oshirildi. 16S rRNK genining PCR amplifikatsiyasi va uning keyingi ketma-ketligi Illumina yordamida amalga oshirildi. 16SrRNA geni V4 o'zgaruvchan mintaqa PCR primerlari ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R va oldingi primerda shtrixli mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen) yordamida 30 tsiklda ishlatilgan. Amplifikatsiyadan so'ng, PCR mahsulotlari kuchaytirishning muvaffaqiyati va bantlarning nisbiy intensivligini aniqlash uchun 2 foizli agaroz jelida tekshirildi.

Keyin birlashtirilgan va tozalangan PCR mahsuloti Illumina DNK kutubxonasini tayyorlash uchun ishlatilgan. Sekvensiya ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda mikrobioma sekvensiyasida (MiSeq) MR DNK bilan amalga oshirildi. Ketma-ket ma'lumotlar MR DNK tahlil quvuri yordamida qayta ishlandi. Qisqacha aytganda, ketma-ketliklar birlashtirildi, keyin shtrix-kodlar tugatildi, shundan so'ng < 150="" bpas="" ketma-ketliklar,="" shuningdek,="" noaniq="" asosiy="" qo'ng'iroqlar="" bilan="" ketma-ketliklar="" olib="" tashlandi.="" ketma-ketliklar="" yo'q="" qilindi="" va="" operatsion="" taksonomik="" birliklar="" (out)="" yaratildi="" va="" ximeralar="" olib="" tashlandi.="" otular="" 3="" foiz="" divergensiyada="" (97="" foiz="" o'xshashlik)="" klasterlash="" orqali="" aniqlangan.="" yakuniy="" otular="" rdp-ii="" va="" ncbi="" dan="" olingan="" ma'lumotlar="" bazasiga="" qarshi="" blastn="" yordamida="" taksonomik="" jihatdan="" tasniflangan.="" ierarxik="" klasterlash="" uchun="" "r"="" dasturiga="" kiritilgan="" turli="" statistik="" tahlillar="" to'plami="" ishlatilgan="" (versiya="" 3.5.1,="" vegan="">