Inson proksimal tubulali epiteliya hujayralarida immunoglobulin G ning ifodalanishi

Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG va boshqalar

Abstrakt. Proksimalquvurliepiteliya hujayralari (PTEClar) tug'ma immun xususiyatlarga ega va yallig'lanishga qarshi omillar, kimyokinlar va epiteliya-mezenximal o'tishni (EMT) qo'zg'atuvchi komplement komponentlarini ishlab chiqaradi. Bizning oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, inson mezangial hujayralari va podotsitlar mos ravishda immunoglobulin (Ig) A va IgG ni sintez qilish va ajratishga qodir. Ushbu tadqiqotning maqsadi PTEClarda Igs ifodasini baholash edi. Birinchidan, IgG sitoplazmada, hujayra membranasida va lumenda aniqlangan.PTEClartomonidan normal buyrak korteksidaimmunohistokimyo. Ikkinchidan, Ig geni transkripsiyasi va V (D) J rekombinatsiyasi bitta PTEC-larda ichki PCR va Sanger sekvensiyasi orqali aniqlandi. Uchinchidan, Ig, Igk va Igl o'lmaslashtirilgan PTEC chizig'ida (HK‑2) immuno-bo'yash va g'arbiy blot orqali aniq aniqlandi, unda RP215 (asosan B hujayradan kelib chiqqan IgG bilan bog'laydigan antikor) ishlatilgan. Bundan tashqari, HK‑2 hujayralarida Ig, Igk va Igl gen transkriptlari, Ig o'zgaruvchan hududida konservativ V (D) J rekombinatsiyasi, rekombinatsiyani faollashtiruvchi gen 1/2 va faollashuv natijasida kelib chiqqan sitidin deaminazasi aniqlandi. Ushbu ma'lumotlar PTECs IgGni B hujayralariga o'xshash tarzda ifodalashi mumkinligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, IgG ifodasi TGF-1 tomonidan tartibga solingan va EMTda ishtirok etishi mumkin.

Kalit so‘zlar:proksimalquvurliepitelial hujayralar, bir hujayrali, HK‑2, IgG, epiteliya-mezenximaga o'tish

Cistanche tubulosa buyrak kasalligining oldini oladi, namunani olish uchun shu yerni bosing

Kirish

Proksimalquvurliepiteliya hujayralari (PTEClar) eng ko'p tarqalgan hujayra turidirbuyrakva buyrakni tiklashda va/yoki surunkali buyrak kasalliklarining rivojlanishida muhim rol o'ynaydi. PTEClar bir nechta Toll-o'xshash retseptorlarni (TLR), masalan, TLR 1, 2, 3, 4 va 9 (1,2) va antigen taqdim qiluvchi hujayra funktsiyasi bilan bog'liq molekulalarni, shu jumladan MHCII, CD74, CD80ni ifodalash orqali immunologik funktsiyalarni bajaradi. , va CD86 (3). PTEC ning ushbu tug'ma immun xususiyatlari ularga turli xil stimullarga qarshi immun javob beruvchi sifatida harakat qilish imkonini beradi, natijada interstitsial yallig'lanish va fibrozni qo'zg'atuvchi proinflamatuar sitokinlar, kimyokinlar va komplement komponentlarini o'z ichiga olgan bioaktiv vositachilar ishlab chiqariladi va chiqariladi (4). PTEClar, shuningdek, neonatal Fc retseptorlarini ifodalaydi va immunoglobulin (Ig) G (5) ning o'ziga xos pH ga bog'liqligi va transsitozi qobiliyatini saqlaydi. Biroq, bizning eng yaxshi ma'lumotlarimizga ko'ra, PTEClar Iglarni ifodalaydimi yoki yo'qmi, noma'lum.

Ilgari Iglar faqat etuk B hujayralari va plazma hujayralari tomonidan ishlab chiqariladi va Iglar turli patogenlarni tanib olish va zararsizlantirish uchun antikorlar sifatida ishlaydi, deb taxmin qilingan. Biroq, bu nazariya so'nggi o'n yilliklarda shubha ostiga olindi, chunki Iglar, jumladan IgA, IgG va IgM, inson epitelial saraton hujayralari (6,7) kabi B bo'lmagan hujayralar tomonidan ishlab chiqarilishi va ajralishi mumkinligi haqida ko'payib borayotgan dalillar. oddiy B bo'lmagan hujayralar (8,9), shuningdek immunitetga ega bo'lgan joylarda, masalan, ko'zlar (10), markaziy neyronlar (11,12), yo'ldosh (13), moyak va epididimis (14)

B hujayradan olingan Igs (B-Igs) singari, B-Ig bo'lmaganlar ham Ig genining transkripsiyasi va qayta joylashuvi mahsuloti bo'lib, o'tish joylarida nukleotid qo'shilishi va somatik gipermutatsiyalar bilan klassik V (D)J rekombinatsiya naqshlarini ko'rsatadi (7, 11,14). B-Iglardan farqli o'laroq, B-Ig bo'lmaganlar cheklangan V(D)J rekombinatsiya naqshlarini va kamroq xilma-xillikni ko'rsatadi (7). Funktsional jihatdan, B-Ig bo'lmaganlar nafaqat teri va shilliq qavatlarda tabiiy antikor faolligini ta'minlaydi (8), balki hujayralar proliferatsiyasi va yopishishini rag'batlantiradigan o'sish omillari sifatida ham harakat qilishi mumkin va integrinlar bilan bog'lanib, saratonning boshlanishi va metastazini kuchaytirishi mumkin. 15-17). Masalan, RP215 tomonidan tan olingan saraton IgG integrin 6 4 kompleksi bilan o'zaro ta'sir qilish va FAK va Src yo'llarini faollashtirish orqali o'zining onkogen funktsiyasini bajaradi (15).

Bizning oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, mezangial hujayralar (18) va podotsitlar (19) IgA va IgGni sintez qilishlari va ajratishlari va hujayra o'sishi va hujayra yopishishida ishtirok etishlari mumkin. Ushbu tadqiqot PTEClarda Igs ifoda darajasini baholash va uning epitelial-mezenximal o'tishda (EMT) potentsial rolini o'rganishga qaratilgan.

Cistanche ta'siri: foyda buyrak

Materiallar va uslublar

Hujayra madaniyati va davolash.Abadiylashtirilgan PTEC HK‑2 liniyasi American Type Culture Collectiondan sotib olindi. HK‑2 hujayralari DMEM/F12 da 1{4}}0 U/ml penitsillin, 0,1 mg/ml streptomitsin (barchasi Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) va 10% homila sigir zardobi (FBS; Avstraliyadan kelib chiqqan; Biological Industries USA, Inc.) 37˚C da 95% havo va 5% CO2 bo'lgan atmosferada. Ig ning FBS ga aralashuvini oldini olish uchun hujayra hosilidan 24-48 soat oldin muhit sarumsiz muhit bilan almashtirildi. HK-2 hujayralari turli konsentratsiyalarda (2, 5 va 10 ng/ml) TGF-1 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) bilan ishlov berildi.

Yagona PTEC izolyatsiyasi va cDNK sintezi.Makroskopik normal kortikal to'qimalarning inson buyragi namunasi buyrakning aniq disfunktsiyasisiz buyrak karsinomasi natijasida nefrektomiya qilingan bemordan (erkak, 31 yosh) olingan. Bir hujayrali suspenziya buyrak korteksini 1 mg/ml kollagenaza I (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) bilan 37˚C da 20 daqiqa davomida hazm qilish orqali tayyorlandi. PTEClar fikoeritrin (PE) bilan konjugatsiyalangan anti-CD10 (kat. № 312203) va allofikosyanin (APC) bilan konjugatsiyalangan anti-CD13 (kat. № 301705; ikkalasi ham BioLegend, Inc.) (bioaktiv hujayralar bilan ajratilgan) yordamida saralangan. BD FACSAria II Maxsus buyurtma tizimi) avval tavsiflanganidek (20). Tegishli izotip nazorat qiluvchi antikorlar (kat. № 400111 va 400119; ikkalasi ham BioLegend, Inc.) o'ziga xos bo'lmagan bo'yashni istisno qilish uchun ishlatilgan. Ikki musbat etiketli tirik hujayralar PTEC sifatida ajratilgan. Bitta PTEC kapillyar pipetka yordamida teskari yorug'lik mikroskopi ostida qo'lda tanlab olindi va keyin lizis buferini o'z ichiga olgan 0,2 ml yupqa devorli PCR trubasiga o'tkazildi (21). Yagona PTEC RNK ekstraktsiyasi va cDNK sintezi ilgari tasvirlangan usullarga muvofiq amalga oshirildi (21). Ig geni transkripsiyasi va qayta tashkil etilishini aniqlash uchun jami beshta bitta PTEC ishlatilgan.

PCR kuchaytirilishi.Jami RNK HK‑2 hujayralaridan, periferik qonning mononuklear hujayralaridan [PBMCs, Ficoll (kat. № 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) yordamida 31 yoshli sog‘lom donor ayoldan ajratilgan. ] va buyrak korteksi (bitta PTEC izolyatsiyasida ishlatiladigan bir xil bemordan) TRIzol® reagenti (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) yordamida va RNK kontsentratsiyasi NanoDrop spektrofotometri (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) yordamida baholandi. . Keyinchalik, 2 mkg umumiy RNK RevertAid First Strand cDNK sintezi to'plami (kat. № K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.) yordamida cDNKga teskari transkripsiya qilindi. PCR Ig, Igk, Igl va faollashuv natijasida kelib chiqqan sitidin deaminazaning (AID) doimiy hududlariga qaratilgan primerlar yordamida amalga oshirildi. Ig ning o'zgaruvchan mintaqasini, past zichlikdagi lipoprotein retseptorlari bilan bog'liq protein 2 (LRP2) va rekombinatsiyani faollashtiruvchi gen (RAG) 1 va RAG2ni kuchaytirish uchun ichki PCR amalga oshirildi. PCR mahsulotlari 1,0 foizli agaroz jelida elektroforez orqali ajratildi va GelRed (kat. № 41003; Biotium, Inc.) yordamida vizualizatsiya qilindi. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan AID, RAG1/2 primerlari va Ig, Igk, Igl ning doimiy hududlari Jing va boshqalar (19) tomonidan qo'llaniladigan primerlarga ishora qiladi. Ig o'zgaruvchan hududining primerlari van Dongen va boshqalar (22) tomonidan qo'llaniladigan primerlarga ishora qiladi. PCR uchun ishlatiladigan boshqa primerlar SI jadvalida keltirilgan. Termosiklning shartlari SII-jadvalda keltirilgan.

Sanger ketma-ketligi va ketma-ketlik ma'lumotlarini tahlil qilish.Yagona PTEC, HK‑2 hujayralari va PBMC lardan olingan Ig o‘zgaruvchan hududining PCR mahsulotlari mos ravishda pGEM‑T Easy Vector System I ga klonlandi (kat. № A1360; Promega korporatsiyasi), u o‘zgartirildi. TOP10 vakolatli hujayralarga (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Qisqacha aytganda, 5 µl ligatsiya mahsuloti 30 µl TOP10 kompetent hujayralarga qo‘shildi, 30 daqiqa davomida muzda inkubatsiya qilindi, 90 sekund davomida 42˚C haroratda qizdirildi va 5 daqiqa davomida muz ustida inkubatsiya qilindi. Keyin 500 µl LB qo‘shildi va bakterial suyuqlikning bir qismini 0,1 mmol/l IPTG va 20 µg/ml X‑Gal bilan qoplangan Petri idishlariga ekishdan oldin 37˚C da 40 daqiqaga qoldirildi. Idishlar bir kechada 37˚C da teskari aylantirildi. Hammasi bo'lib, har bir namuna uchun 5‑16 oq koloniya tasodifiy tanlab olingan va ABI 3730XL genetik analizatori (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) yordamida ketma-ketlashtirilgan. Qayta tartibga solingan V(D)J ketma-ketliklari primerni kesishdan keyin eng yaxshi mos keladigan germline gen segmentlari va o'tish joylarini aniqlash uchun asosiy mahalliy moslashtirish qidiruv vositasidagi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) bilan solishtirildi. .

Western blot tahlili.HK-2 xujayralari muzli suvda 1 daqiqa davomida ultratovushli proteaz inhibitori kokteyli (Applygen Technologies Inc.) o'z ichiga olgan TSD lizis buferida (1 foizli SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM DTT) lizing qilindi ( 5 sek ishlaganda va 15 sek dam olishda; 3 marta) va xona haroratida 30 daqiqa davomida lizislangan. 12,{12}} xg da 10 daqiqa davomida 4˚C da santrifüjlashdan so'ng hujayra lizatining oqsil kontsentratsiyasi BCA to'plami (Applygen Technologies Inc.) yordamida aniqlandi. Keyinchalik, lizatga 5X kamaytiruvchi yuklama buferi qo'shildi, 100˚C da 10 daqiqa qaynatiladi va namunalar darhol western blot tahlili uchun ishlatilgan. Ig uchun ijobiy nazorat sifatida ishlatiladigan sarum xona haroratida 10 daqiqa davomida 2103 xg da santrifüjlash orqali sog'lom donordan (PBMClarda ishlatiladigan donor) ajratildi.

Cistanche ta'siri: foyda buyrak

Western blotting standart protseduralarga muvofiq amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, 3{40}} mkg oqsil 10 foizli jellarda SDS‑PAGE orqali ajratilib, nitroselüloza membranasiga o‘tkazildi. Keyinchalik, membrana xona haroratida 1 soat davomida 5 foizli yog'siz sutda to'sib qo'yildi va bir kechada 4˚C da asosiy antikorlar, jumladan quyonning insonga qarshi Ig (kat. № ab109489; 1:1,{{8}) bilan inkubatsiya qilindi. }), quyon odamga qarshi Ig 4 (kat. № ab109493; 1:1,000), anti-Igk (kat. № ab124727; 1:10,000), anti‑ Igl (kat. № ab124719; 1:20,000), quyon odamga qarshi ‑aktin (kat. № ab8227; 1:2,000) (barchasi Abcamdan) va RP215 monoklonal antikor (mAb) (Pekin universiteti, Pekin, Xitoy, professor Xiaoyan Qiu tomonidan taqdim etilgan; 1:1,000), u B-Ig bo'lmaganda uglevod bilan bog'langan epitopni aniq aniqladi. Keyin membrana echkiga qarshi quyon (kat. № 926-32211) yoki sichqonchaga qarshi (kat. № 926-32210) IgG‑IRDyeTM680CW ikkilamchi antikorlari (ikkalasi ham 1:10) bilan inkubatsiya qilindi,{{37} LI‑COR Biosciences) xona haroratida 1 soat davomida. Signal Odyssey Imaging tizimi va Odyssey V3.0 dasturi (ikkalasi ham LI‑COR Biosciences) yordamida aniqlangan. Yarim miqdorni aniqlash uchun ImageJ dasturi (versiya 1.8.0; Milliy Sog'liqni saqlash institutlari) ishlatilgan.

IgG tozalash va massa spektrometriyasi.HK‑2 xujayralari DMEM/F12 da FBSsiz 48 soat davomida yetishtirilgandan so‘ng, kultura supernatanti 4˚C da 10 daqiqa davomida 2,103 xg da santrifüjdan so‘ng yig‘ildi. Hujayra supernatanti ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq (kat. № 17‑0618‑02; Thermo Fisher Scientific, Inc.) G Sepharose oqsili yordamida yaqinlik xromatografiyasi orqali tozalandi. Eluent buferni (0,1 M Glitsin; pH 2,4) PBS bilan almashtirish uchun ultra-filtrlangan. Tozalangan oqsillar SDS‑PAGE yordamida 10 foizli jellarda ajratildi, western blot usulida aniqlandi va Beijing Protein Innovation Co., Ltd tomonidan amalga oshirilgan massa spektrometriyasi yordamida keyinchalik tahlil qilindi.

Immunofluoresans.HK‑2 xujayralari xona haroratida 5 daqiqa davomida sovuq suyultirilmagan asetonda mahkamlangan qopqoqli qatlamlarda o'stirildi. Keyinchalik, slaydlar PBSda ikki marta yuvildi va xona haroratida 20 daqiqa davomida 5 foiz FBS/PBS bilan bloklandi, shundan so'ng ular bir kechada 4˚C da asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Antikorlar western blotingda ishlatilganlar bilan bir xil edi: quyon odamga qarshi Ig (1:150), insonga qarshi Igk (1:250), odamga qarshi Igl (1:250) va RP215 mAb (1:200) ); PBS salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. PBS da yuvilgandan so‘ng, slaydlar floressein izotiosiyanat yorlig‘i bilan belgilangan echkiga qarshi quyon (kat. № A11008) yoki echkiga qarshi sichqoncha (kat. № A11001) IgG antikorlari (1:1,{18}}; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) xona haroratida 1 soat davomida. Yadrolar DAPI bilan bo'yalgan. Tasvirlar Leica DFC300 FX floresan mikroskopi (Leica Microsystems GmbH) ostida olingan.

Immunogistokimyoviy bo'yash.Parakanserli buyrak kortekslari buyrak karsinomasi bo'lgan to'rtta erkak bemordan (38-49 yosh) to'plangan. Nefrektomiyadan keyingi normal parakanserli buyrak kortekslari xona haroratida 48 soat davomida 1{5}}% formalin bilan mahkamlangan va keyin kerosinga solingan. Parafin o'rnatilgan inson buyragi namunalari 3 mkm bo'laklarga bo'linib, bir qator darajali etanol kontsentratsiyasi orqali parafinsizlashtirildi va regidratatsiya qilindi. Antigenni olish 0.05 M Tris-EDTA (pH 9.0) bosimli pishirgichda 3 daqiqa qaynatish orqali amalga oshirildi. Keyin bo'limlar endogen peroksidazani yo'q qilish uchun xona haroratida 10 daqiqa davomida 3 foizli H2O2 eritmasi bilan inkubatsiya qilindi va o'ziga xos bo'lmagan moddalarni blokirovka qilish uchun oddiy echki zardobi (kat. № ZLI‑9022, ZSGB-BIO, Xitoy) bilan 30 daqiqa davomida xona haroratida inkubatsiya qilindi. xona haroratida antikorlarni bog'lash joylari. Keyinchalik bilvosita immunohistokimyoviy bo'yash bir kechada 4˚C haroratda birlamchi antikorlar, jumladan RP215 mAb (1:200; 5 mkg/ml), quyonning odamga qarshi Ig (1:2,000), odamga qarshi antikorlar bilan amalga oshirildi. Igk (1:1,000), insonga qarshi Igl (1:1,000) (western blotingda ishlatiladigan antikorlar). Birlamchi antikorlarsiz bo'limlar salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Keyin slaydlar suyultirilmagan horseradish peroksidaza bilan belgilangan ikkilamchi antikorlar (kat. No. PV‑6001 va PV‑6002; ikkala OriGene Technologies, Inc.) bilan xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Bog'langan antikorlar diaminobenzidin yordamida aniqlandi. Nihoyat, slaydlar gematoksilin bilan bo'yalgan. Rasmlar yorug'lik mikroskopi (x200 kattalashtirish) yordamida olingan. Statistik tahlil. Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida taqdim etilgan va Windows uchun SPSS 20.0 (IBM Corp.) yordamida tahlil qilingan. Barcha tajribalar 3 marta takrorlandi. Bir nechta guruhlar o'rtasidagi farqlar bir tomonlama ANOVA va Tukeyning posthoc testi yordamida tahlil qilindi. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche ta'siri: foyda buyrak

Natijalar

Buyrak korteksining buyrak tubulali epiteliya hujayralarida IgG ifodasi.Buyrak hujayrali karsinomasi natijasida nefrektomiya qilingan donorlardan to'plangan normal buyrak kortekslari inson Ig, Igk, Igl va RP215 (asosan antikor) ga qarshi antikorlardan foydalangan holda immunohistokimyo yordamida buyrak tubulali epiteliya hujayralarida IgG ifodasini aniqlash uchun ishlatilgan. B-IgG bo'lmagan bilan bog'lanadi). IgG og'ir va engil zanjirlarining ijobiy bo'yalishi nafaqat PTEClarda, balki sitoplazmada, hujayra membranasida yoki quvurli lümenda distal konvolyutsiyalangan tubula epitelial hujayralarida ham aniqlandi (1-rasm).

Yagona PTEClarda IgG ning transkripsiyasi va V (D) J rekombinatsiyasi. Qoldiq qon, IgG ning buyrak korteksidagi PTEClar tomonidan bog'lanishi va transsitozining aralashuvini oldini olish va PTEClarda IgG ifodasining bevosita dalillarini olish uchun CD10 va CD13 yorlig'i yordamida inson buyragi korteksidan bitta PTEClar saralangan. sitometriya (20). 2A-rasmda ko'rsatilganidek, CD10/CD13 ikki musbat PTEClar namunadagi yashovchan hujayralarning 4,1 foizini tashkil qiladi. Izolyatsiya qilingan PTEClar LRP2 o'ziga xos marker geni yordamida qo'shimcha tasdiqlandi va B-hujayralarining ifloslanishi CD19 tomonidan yo'q qilindi. Ig o'zgaruvchan mintaqasi transkriptlari beshta bitta PTECda ichki o'rnatilgan PCR orqali kuchaytirildi (2B va C-rasm). Sanger ketma-ketligi natijalari shuni ko'rsatdiki, PTECs IgG og'ir zanjirining funktsional va konservativ VDJ rekombinatsiyasini ko'rsatdi (I-jadval), bu IgG ifodasi PTEClarda paydo bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.

HK‑2 hujayralarida IgG og'ir va engil zanjir ifodasi. Bitta PTECda IgG oqsili ifodasini aniqlash va western blotting uchun yetarli PTEClarni olish qiyin bo‘lganligi sababli, IgG oqsili ifodasini yanada tasdiqlash uchun o‘lmas PTEClardan tashkil topgan HK‑2 hujayra liniyasi tanlandi. Immunofluoressensiya tahlili sitoplazmada Ig, Igk va Igl ning ijobiy bo'yalganligini va RP215 ning asosan sitoplazma va hujayra membranasida kuchliroq ijobiy bo'yalganligini ko'rsatdi (3A-rasm).

Keyinchalik, HK‑2 hujayralarida IgG og'ir va engil zanjirlarining ifodalanishi kamaytirish sharoitida g'arbiy blot bilan aniqlandi. Madaniyat muhitida FBS aralashuvini bartaraf etish uchun FBS o'z ichiga olgan muhit mos keladigan antikorlar bilan tozalandi va salbiy bo'yaldi. Tijoriy IgG antikori zardobdan olingan IgGni aniqlay oldi, lekin HK-2 hosilasi IgGni aniqlay olmadi. Aksincha, RP215 HK‑2-dan olingan IgGni aniqlay oladi, ammo sarum IgGni aniqlay olmaydi. Tijoriy IgG antikorlari ham, RP215 ham 55 kDa da Ig ni aniqlay oldi. HK‑2 hujayralarida prognoz qilingan molekulyar og‘irlikka mos keladigan Ig 4 (36 kDa) bandi aniqlandi. Bundan tashqari, hujayra lizatlarida Igk (25 kDa) va Igl (50 kDa, dimer) ifodalari kuzatildi (3B-rasm). Keyinchalik, hujayra supernatantidagi IgG oqsil G bilan tozalandi, western blot bilan tasdiqlandi va mass-spektrometriya bilan ketma-ketlashtirildi, bu esa 55-kDa diapazonida Igk zanjiri va Ig og'ir zanjiri o'zgaruvchan mintaqasining qismlari borligini ko'rsatdi, Milliy markaz ma'lumotlariga ko'ra. Biotexnologiya ma'lumotlari (NCBI) ma'lumotlar bazasi (3C‑E-rasm). Ushbu ma'lumotlar HK‑2 hujayralari IgG oqsilini ishlab chiqargan va ajratgan.

HK‑2 hujayralarida IgG og'ir va engil zanjirlarining transkripsiyasi va V(D)J rekombinatsiyasi. Ig genining transkripsiyasi va funktsional V(D)J rekombinatsiyasi Ig ifodasi uchun zaruriy shartdir. HK‑2 hujayralarida IgG ifodasini tasdiqlash uchun Ig, Igk va Igl transkriptlari HK‑2 hujayralarida doimiy va o‘zgaruvchan hududlarni kuchaytirish orqali baholandi (4A va B-rasm). Doimiy PCR mahsulotlarining ketma-ketligi NCBI ma'lumotlar bazasida nashr etilgan ketma-ketlik bilan yuqori homologiyani ko'rsatdi. T-A klonlash va Sanger sekvensiyasi HK‑2 hujayralaridagi Ig ning VH4‑4/D2‑8/JH5 bilan konservativ V(D)J rekombinatsiyasini ko‘rsatishini ko‘rsatdi. Aksincha, PBMClarda V (D) J rekombinatsiyasining xilma-xilligi kuzatildi, bu esa primer tarafkashlikni bartaraf etdi (II-jadval). B hujayralariga o'xshab, HK‑2-dan olingan IgG, V‑D va D‑J birikmalari bilan tipik samarali V(D)J rekombinatsiyasini ko'rsatdi (4C-rasm). Bundan tashqari, HK‑2-dan olingan Ig (diapazon, 6,8‑8,4 foiz)da somatik gipermutatsiyalar 15 ta hotspot motifidan 7 tasi (RGYW/WRCY, W=A/T, R=) bilan aniqlandi. A/G, Y=C/T) mutatsiyalar bilan namoyon boʻladi.

Bundan tashqari, HK‑2 hujayralarida AID transkriptlari (B hujayralarida somatik gipermutatsiya va sinfni almashtirish rekombinatsiyasi uchun muhim element) va RAG1 va RAG2 [V(D)J rekombinatsiyasi uchun zarur] aniqlandi (4B-rasm), bu shuni ko'rsatadiki HK‑2 hujayralarida Ig sintezi mexanizmi B hujayralaridagiga o'xshash bo'lishi mumkin.

TGF-1 HK-2 hujayralarida IgG ifodasini kuchaytiradi. HK-2 hujayralari 48 soat davomida TGF-1 ning turli konsentratsiyasi bilan rag'batlantirildi. Immunofloresan bo'yash sitoplazmatik IgG nazorat guruhi bilan solishtirganda yaxshilangan ijobiy bo'yashni ko'rsatdi (5A-rasm). Western blotting IgG TGF-1 tomonidan sezilarli darajada ko'tarilganligini tasdiqladi (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Cistanche ta'siri: foyda buyrak

Munozara

Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatdiki, PTEClar IgG ni gen transkripsiyasi va funktsional konservativ V (D) J rekombinatsiyasi bilan ifodalaydi, bu B-IgG bo'lmaganga o'xshaydi. HK2 hujayralarida TGF-1 ko'tarilgan IgG ifodasi.

PTEC'larning IgGni ifodalaganligini tekshirish uchun IgG birinchi bo'lib sitoplazmada, hujayra membranasida va normal inson buyrak korteksidagi PTEClarning lümeninde immunohistokimyo orqali aniqlangan; Natijalar PTEClar IgG ishlab chiqarishini va ajratishini ko'rsatdi. Bu bizning muntazam patologik tekshiruvimizdan farqli o'laroq, PTEClarda aniq IgG aniqlanmagan. Bu juda zaif PTEC bo'yalishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu juda past bo'lgan, ayniqsa immun bilan bog'liq bo'lgan glomerulyar kasalliklarda Igs glomerulyada kuchli ijobiy bo'ladi va PTEC bo'yalishi beixtiyor, lekin sun'iy ravishda yo'qolishi mumkin. Fc retseptorlari orqali PTEClar tomonidan qon aylanishidan IgG transsitozi qisman istisno qilindi, chunki hujayra membranasi va sitoplazmasida IgG ning RP215 tomonidan aniq bo'yalishi kuzatildi. Ushbu topilmalar PTECdan olingan IgG boshqa B-IgG bo'lmaganlarga o'xshashligini va tijorat anti-IgG antikori o'rniga RP215 tomonidan maxsus tan olinishi mumkin bo'lgan noyob glikozillangan epitoplarga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi (15). Naychali epiteliya hujayralarining faqat bir qismi IgG ni ifodalashi haqidagi topilma turli hujayra sikllarida dinamik ekspressiya bilan izohlanishi mumkin, bu mezangial hujayradan olingan IgA (18) ekspressiyasiga o'xshash edi. IgG ni quvurli belgilar bilan (masalan, aquaporin 1 va aquaporin 3) birgalikda bo'yash ushbu tadqiqot natijalarini yaxshilash uchun keyingi tadqiqotlar uchun foydali bo'ladi.

Bir hujayrali RNK ketma-ketligi ma'lum bir hujayradagi ma'lum bir genning transkripsiyasini aniq ko'rsatishi mumkin. Ig zanjiri va V (D) J rekombinatsiyasining transkriptlari bitta PTEClarda aniqlandi. Faqat beshta bitta PTEC ishlatilgan bo'lsa-da, jarayon qattiq edi, chunki buyrak korteksi o'simtadan uzoqda yig'ilgan va har bir hujayra oqim sitometriyasi orqali ikkita PTECga xos marker genlari bilan saralangan va uchinchi o'ziga xos marker gen (LRP2) yordamida qayta tasdiqlangan. va B-hujayralarining ifloslanishi bartaraf etildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, PTEClar nafaqat IgG gen transkriptlari bilan, balki V-D va D-J bilan samarali V(D)J rekombinatsiyasi kabi o'zgaruvchan mintaqada klassik V (D) J rekombinatsiyasini B hujayralari sifatida ham taqdim etadi. ulanishlar (4-rasm), bu PTEClarning IgG ishlab chiqarish potentsialiga ega ekanligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, konservativ V(D)J rekombinatsiyasi PTEClar IgG gen transkriptlari va boshqa B bo'lmagan hujayralarga o'xshash V(D)J rekombinatsiyasi bilan namoyon bo'lishini ko'rsatdi.

HK‑2, abadiylashtirilgan PTEC liniyasi, ko'p miqdorda etishtirish oson. Ushbu tadqiqot madaniyatli HK‑2 hujayralarida IgG oqsili ifodasini tasdiqladi; IgG HK‑2 hujayralarida ham immunofluoresans, ham western blotting yordamida aniqlandi. Ig ning kichik klassi bo'lgan Ig 4 ham bashorat qilingan molekulyar og'irlik bilan mos keladigan tarmoqli o'lchamida aniqlandi. Mass-spektrometriya shuni ko'rsatdiki, G proteini yordamida hujayra supernatantidan tozalangan oqsil Ig og'ir zanjirining o'zgaruvchan mintaqasi va Igk zanjirining bo'laklarini o'z ichiga oladi, bu PTEClar tomonidan IgG sekretsiyasini tasdiqlaydi. HK‑2 hujayralarida IgG transkripsiyasi PTEClarda IgG ifodasini qo‘llab-quvvatladi va HK‑2 hujayralarida IGHV4‑4/IGHD2‑8/IGHJ5 bilan konservativ V(D)J rekombinatsiyasi ham shunga o‘xshash HK‑2 hujayralarida IgG mavjudligini qo‘llab-quvvatladi. boshqa B bo'lmagan hujayralarga.

Ushbu tadqiqot, shuningdek, HK-2 hujayralarida RAG1, RAG2 va AID transkripsiyasini o'rganish orqali PTEClarda IgG ishlab chiqarishning asosiy mexanizmini o'rganib chiqdi. RAG1, RAG2 va AID HK‑2 hujayralarida transkripsiya qilinganligi aniqlandi. Bundan tashqari, RAG1, RAG2 yoki AID transkriptlari avvalroq podotsitlar (19) va bir nechta saraton hujayralari qatorlari (23) kabi boshqa ko'plab no-B hujayralarida aniqlangan. Ushbu natijalar, B bo'lmagan hujayralar, shu jumladan PTEClar, B hujayralariga Ig sintezining o'xshash mexanizmlariga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi. Biroq, AID va/yoki RAG1/2 PTEC dan olingan IgG uchun zarur genlarmi yoki yo'qmi, qo'shimcha tekshirishni talab qiladi. Bundan tashqari, follikulyar yordamchi CD4 T hujayralari germinal markazning B-hujayralarining plazma hujayralariga differentsiatsiyasini tartibga solish va Igs ishlab chiqarishni qo'llab-quvvatlash uchun muhimdir (24). Bizning e'lon qilinmagan ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, B-Ig bo'lmaganlar hali ham T va B hujayralari etishmovchiligi bo'lgan NOD-SCID sichqonlarida aniqlangan, bu B-Ig bo'lmaganlar T yordamchi hujayralariga to'liq bog'liq emasligini ko'rsatadi. IgGni ifodalash uchun PTEClar uchun T yordamchi hujayralar kerakmi yoki yo'qmi, keyingi tadqiqotlarni talab qiladi.

TGF-1 Ig ishlab chiqarishda asosiy immunomodulyatsion rolga ega. Masalan, TGF-1 sichqonchaning taloqidagi (25) va insonning bodomsimon B hujayralarida (26) stimulyatsiya qilingan B hujayralarida IgA sinfining o'zgarishi va sekretsiyasini keltirib chiqardi. McIntyre va boshqalar (27) TGF-1 lipopolisakkarid bilan faollashtirilgan B hujayralari tomonidan IgG2b sekretsiyasini, ehtimol, IgM ni IgG2b sinfiga almashtirish orqali selektiv ravishda rag'batlantirishini ko'rsatdi. Duan va boshqalar (28) TGF-1 epitelial saraton hujayralarida Ets-1 transkripsiya faktorini tartibga solish orqali IgA ifodasini oshirganligini ko'rsatdi. Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatdiki, TGF-1 HK-2 hujayralarida IgG ifodasini kuchaytirdi. HK‑2 hujayralarida faqat IgG aniqlanganligini hisobga olib, TGF‑1 Ig sinfini almashtirishdan mustaqil ravishda IgG ifodasini keltirib chiqargan deb faraz qilindi. TGF-1 tomonidan IgG ishlab chiqarishni tartibga solish mexanizmi qo'shimcha tekshirishni talab qiladi.

PTEClar EMT orqali quvurli interstitsial fibrozda muhim rol o'ynaydi va TGF-1 asosiy profibrotik vositachi sifatida ishlaydi. Ushbu tadqiqotda, madaniyatli HK-2 hujayralariga TGF-1 qo'shilishi IgG ifodasini oshirdi, bu HK-2-dan olingan IgG EMT bilan ijobiy bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, saraton-IgG metastaz bilan bog'liq va tuprik adenoid mukovistsidozida (29) va o'pka saratonida (30) E-kaderinni kamaytirish orqali EMTni kuchaytirgan. PTEC dan olingan IgG ishemiya/reperfuziya shikastlanishi kabi kasallik sharoitida buyrak tubulyar EMT va interstitsial fibrozda rol o'ynashi mumkinmi yoki yo'qligini tekshirishga arziydi.surunkali buyrak kasalligi.

Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, bizning ma'lumotlarimiz bo'yicha, ushbu tadqiqot birinchi bo'lib PTEClar IgGni ifodalashi va ajratishi mumkinligini va TGF-1 HK-2 hujayralarida IgG ifodasini kuchaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. Biroq, tubulointerstitial fibrozda PTEC dan olingan IgG ning potentsial roli qo'shimcha tekshirishni talab qiladi.

Cistanche ta'siri: foyda buyrak

Moliyalashtirish

Ushbu tadqiqot Xitoy milliy tabiiy fanlar fondi (grant № 82070736, 91642109 va 81870488), Xaynan tabiiy fanlar fondi (grant № 819QN355), Xaynan tibbiyot universiteti ilmiy tadqiqot etishtirish fondi (grant №. HYPY201926) va Milliy Tabiatshunoslik Jamg'armasining asosiy tadqiqot dasturining asosiy qo'llab-quvvatlash loyihalari (grant № 91642206).

Ma'lumotlar va materiallarning mavjudligi

Joriy tadqiqot davomida foydalanilgan va/yoki tahlil qilingan maʼlumotlar toʻplami tegishli muallifdan asosli soʻrov boʻyicha mavjud.

Mualliflarning hissalari

Tegishli mualliflar sifatida YW va XQ tadqiqotni o'ylab topdilar va loyihalashtirdilar. ZD tadqiqot loyihasida ishtirok etdi, gistologik va bir hujayrali tajribalarni o'tkazdi, mass-spektrometriya uchun namunalar tayyorladi, ma'lumotlarni tahlil qildi va qo'lyozmani yozdi. ZJ tadqiqot loyihasida, HK‑2 hujayralarida IgG ifodasi bo'yicha ko'plab tajribalarda va tegishli ma'lumotlarni tahlil qilishda ishtirok etdi. YG, JM, HD va YL qisman hujayra liniyasi tajribalarini o'tkazdilar. ZC va YP klinik xususiyatlarga ko'ra bitta hujayrali tajribalar uchun mos holatlarni tanladilar. HY va ZS bir hujayrali tajribalarda qatnashdilar. SW immunohistokimyoviy bo'yashda ishtirok etdi, to'qimalarni bo'yash ma'lumotlarini tahlil qildi va qo'lyozmani tuzdi va qayta ko'rib chiqdi. YW, ZD va ZJ barcha xom ma'lumotlarning haqiqiyligini tasdiqladi. Barcha mualliflar qo'lyozmani ko'rib chiqdilar va ma'lumotlarni qayta ko'rib chiqdilar. Barcha mualliflar yakuniy qo'lyozmani o'qib chiqdilar va tasdiqladilar.

Etikani tasdiqlash va ishtirok etishga rozilik

Ushbu tadqiqot Xelsinki deklaratsiyasining tamoyillariga mos keldi va Pekin universiteti uchinchi kasalxonasining Tibbiy etika qo'mitasi tomonidan ma'qullandi (tasdiqlash raqami S2020121) va protokolga muvofiq o'tkazildi. Barcha donorlar ixtiyoriy ravishda buyrak kortekslarini hadya qildilar va buyrak korteksini tadqiqotga topshirishdan oldin yozma ravishda xabardor qilingan rozilikni berishdi. Barcha usullar tegishli ko'rsatmalar va qoidalarga muvofiq amalga oshirildi. Ushbu namunalar qat'iy anonimlashtirildi. Ushbu tadqiqotda western blotting yoki teskari transkripsiya-PCRda ijobiy nazorat sifatida ishlatiladigan inson zardobi va PBMC'lar namuna olish uchun yozma ravishda xabardor qilingan rozilik bergan sog'lom ko'ngillining qonidan olingan.

Cistanche ta'siri: foyda buyrak

Ma'lumotnomalar

1. Schlondorff DO: progressiv buyrak kasalligining patofiziologiyasiga yordam beruvchi omillarga umumiy nuqtai. Buyrak Int 74: 860‑866, 2008 yil.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Kamilla R, Chili F, Vergano L, Boido A, Korrieri M, Bianciotto M,va boshqalar al: Henoch-Schonlein purpura va birlamchi IgA nefropatiyasi bo'lgan bolalarda to'lovga o'xshash retseptorlar, immunoproteazoma va tartibga soluvchi T hujayralari. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014 yil.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G va Neumann K: Buyrak proksimal tubular epitelial hujayralari yallig'lanish CD4 va T hujayralari javoblarini qo'zg'atib, immunomodulator funktsiyani bajaradi. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77‑F89, 2019 yil.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL va Lan HY: Buyrak tubulasining shikastlanishi: Surunkali buyrak kasalligiga olib keladigan harakatlantiruvchi kuch. Buyrak Int 93: 568‑579, 2018 yil.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C va Tomino Y: inson buyrak proksimal tubular epitelial hujayralarida immunoglobulin G ning FcRn vositachiligidagi transsitozi. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358‑F365, 2002 yil.

6. Qiu X, Chju X, Chjan L, Mao Y, Chjan J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,va boshqalar al: Inson epitelial saratoni o'simta hujayralarining o'sishi va omon qolishiga yordam berish uchun noma'lum o'ziga xoslik bilan immunoglobulin g chiqaradi. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003 yil.

7. Chjen J, Xuan J, Mao Y, Liu S, Sun X, Chju X, Ma T, Chjan L, Ji J, Chjan Y,va boshqalar al: Immunoglobulin gen transkriptlari inson epitelial saraton hujayralarida aniq VHDJH rekombinatsiya xususiyatlariga ega. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009 yil.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Vang C, Xu V, Zheng J, Shao V,va boshqalar al: IgG va IgA potentsial mikrobial bog'lanish faolligi normal inson teri epidermis hujayralari tomonidan ifodalanadi. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015 yil.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao V, Vang P, Gong X, Ma J, Qiu X va Vang B: Immunoglobulin M, sichqonlarning miokard hujayralarining yangi molekulasi. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017 yil.

10. Niu N, Chjan J, Sun Y, Vang S, Sun Y, Korteweg C, Gao V va Gu J: immunoglobulin G va uning retseptorlarini immunitetga ega bo'lgan joyda ifodalash va taqsimlash: Ko'z. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011 yil.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Chjan P, Chjan L, Du J va Qiu XY: Sichqoncha miya neyronlarida klassik V‑(D)‑J qayta tashkil etilishi bilan immunoglobulin genining ifodasi. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008 yil.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C va Gu J: immunoglobulin G va uning retseptorlarini inson asab tizimida ifodalash va taqsimlash. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011 yil.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li V va Gu J: Inson yo'ldoshida immunoglobulin G ning ikkita ultrastruktura taqsimoti va funktsional ta'siri. Biol Reprod 91: 128, 2014 yil.

14. Huang J, Chjan L, Ma T, Chjan P va Qiu X: Sichqoncha moyak va epididimida klassik V‑(D)‑J qayta tuzilishi bilan immunoglobulin genining ifodasi. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009 yil.

15. Tang J, Chjan J, Liu Y, Liao Q, Xuang J, Geng Z, Xu V, Sheng Z, Li G, Chjan Y,va boshqalar al: O'pka skuamoz hujayrali karsinoma hujayralari integrin-FAK signalini faollashtiradigan kanonik bo'lmagan glikosillangan IgG ni ifodalaydi. Saraton Lett 430: 148-159, 2018 yil.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q va Zhao Y: Saratondan olingan glikosillangan immunoglobulin G ning yuqori ifodasi oshqozon osti bezi kanali adenokarsinomasida yomon prognozni bashorat qiladi. J Saraton 11: 2213-2221, 2020 yil

17. Cui M, Xu Y, Zheng B, Chjan S, Chjan X, Vang M, Qiu XY, Liao Q va Chjao YP: Saratondan olingan immunoglobulin G: paratiroid karsinomasida differentsial tashxis va relapsni bashorat qilish uchun yangi marker. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020 yil.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X va Vang Y: inson mezangial hujayralarida immunoglobulin A ning ifodalanishi va uning hujayra apoptozi va adezyoniga ta'siri. Mol Med Rep 17: 5272‑5282, 2018 yil.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Vu R, AL, Geng Z, Qiu X va Vang Y: inson podotsitlarida immunoglobulin G ning ifodalanishi va uning hujayra hayotiyligi va yopishqoqligidagi roli. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018 yil.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glovakki F, Pottier N, Builez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Kauffiez C,va boshqalar al: CD10/CD13 qo'sh yorlig'i bilan inson buyragidan birlamchi proksimal quvurli epitelial hujayra modelini ajratib olish va tavsiflash. PLoS One 8: e66750, 2013 yil.