Farneziltransferaza inhibitori LNK-754 sichqonlarda aksonal distrofiyani susaytiradi va amiloid patologiyasini kamaytiradi 2-qism

Neyronlarning jonli tasviri

Jonli tasvirlash tajribalari uchun neyronlar yuqoridagi kabi tayyorlangan va 7 kun davomida 35 mm shisha taglik idishlarga (MatTek # P35G-1.5-14C) qo'yilgan. 10nM LNK-754 yoki lonafarnib keyin shartli muhitga qo'shildi, nazorat madaniyatlari DMSO bilan vosita sifatida ishlandi. 48 soatlik davolanishdan so'ng, media neyronlarning ishlov berilmagan parallel plitalaridan shartli muhit bilan almashtirildi. Shartli muhitga 25nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) qo'shildi va neyronlar 30 daqiqa davomida 37 darajada inkubatsiya qilindi.

Neyronlar asab tizimining muhim qismi bo'lib, axborotni qabul qilish, qayta ishlash va uzatish qobiliyatiga ega bo'lib, inson aql-zakovati va xatti-harakatlarining moddiy asosi hisoblanadi. Immunitet inson tanasining kasalliklarga qarshi turishi uchun muhim kafolatdir. U patogenlar va g'ayritabiiy hujayralarni aniqlashi va yo'q qilishi va tananing sog'lig'ini saqlashi mumkin.

Tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, neyronlar va immunitet tizimi o'rtasida kuchli bog'liqlik mavjud. Neyronlar norepinefrin, epinefrin va boshqalar kabi turli xil neyrotransmitterlarni chiqarish orqali immunitet tizimiga ta'sir qilishi mumkin. Bu neyrotransmitterlar immunitet hujayralarining faolligini o'zgartirishi, immunitet hujayralarining ko'payishi va funktsiyasini kuchaytirishi va tananing immunitetini yaxshilashi mumkin. Shu bilan birga, immunitet tizimi turli yo'llar orqali neyronlarning funktsiyasiga ham ta'sir qilishi mumkin. Immunitet hujayralari immun yo'llari orqali neyronlarning o'sishi, rivojlanishi va faoliyatiga ta'sir qiluvchi turli xil sitokinlar va gormonlarni ajratishi mumkin.

Bundan tashqari, psixologik va ijtimoiy omillar immunitet va neyron funktsiyasiga ta'sir qilishi mumkin. Stress, tashvish va depressiya kabi salbiy his-tuyg'ular immunitet tizimiga va neyronlarga salbiy ta'sir ko'rsatishi, tananing immunitetini kamaytirishi mumkin. Ijobiy his-tuyg'ular, ijobiy ijtimoiy munosabatlar va sog'lom turmush tarzi immunitet va neyronlarning sog'lom rivojlanishiga yordam beradi.

Xulosa qilib aytganda, neyronlar va immunitet o'rtasida interfaol va o'zaro qo'llab-quvvatlovchi munosabatlar mavjud. Ruhiy salomatlikni saqlash, hayotga ijobiy munosabatda bo'lish va to'g'ri turmush tarzini qabul qilish tananing immunitetini va neyronlarning sog'lom rivojlanishiga yordam beradi. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak. Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola neyrotransmitterlar muvozanatini ham tartibga solishi mumkin, masalan, atsetilxolin va o'sish omillari darajasini oshirish. Ushbu moddalar xotira va o'rganish uchun juda muhimdir. Bundan tashqari, go'sht qon oqimini yaxshilaydi va kislorod yetkazib berishni rag'batlantiradi, bu esa miyaning etarli miqdorda ozuqa va energiya olishini ta'minlaydi, shu bilan miya hayotiyligi va chidamliligini oshiradi.

Miya faoliyatini yaxshilash yo'llarini bilish tugmasini bosing

Neyronlarning vaqt oralig'ida tasviri Ti2 keng mikroskop yordamida amalga oshirildi. Rasmga tushirish 30 daqiqadan so'ng darhol boshlandi va 30 daqiqadan ko'proq davom etmadi. 1- ekspozitsiyalari har daqiqada olindi va 30 daqiqa ichida har bir idish uchun 20-30 ta alohida maydon suratga olindi. LysoTracker zarralarining masofa va tezlik miqdori va kimograf tahlillari NIS Elements dasturi yordamida amalga oshirildi va quyida batafsil tavsiflangan. Alohida tajribalarda shartli muhitga 1 mkM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) qo'shildi va 60X ob'ektivli Nikon A1 konfokal mikroskop yordamida jonli neyronlarning suratlari 15 daqiqadan ko'p bo'lmagan vaqt davomida olingan. (NA 1.4) va NIS Elements dasturi.

Miya to'qimalarining jonli tasviri

{{0}}oylik 5XFAD sichqonlari 3 hafta davomida har kuni in'ektsiya qilingan va davolanish tugagandan so'ng, sichqonlar behushlik qilingan va 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kinurenat o'z ichiga olgan eritma bilan perfuziya qilingan. , 0,01 mM DL-2-Amin-5-fosfonopentanoik kislota, 5mM glutation, 25mM glyukoza, 125mM NaCl, 1,4mM NaH2PO4 va 25mM NaHCO3.

Keyin miyalar 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, {{10}}, 5mM CaCl2, 4mM2, 4 Mg5Mg5ms, 5 mM CaCl ni o'z ichiga olgan muzdek sovuq kislorodli ACSFda tezda parchalandi. 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kinurenat, 0.01mM DL-2-amino-5-fosfonopentanoik kislota va 5mM glutation. 300 mkm koronal bo'laklar Compresstome VF{30}} tebranish mikrotomi (Precision Instruments) yordamida olindi va quyidagi 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, NaCl, NaCl, NaCl, NaCl ni o'z ichiga olgan kislorodli ACSF eritmasida 32 daraja haroratda tiklash uchun 30 daqiqa dam olishga ruxsat berildi. 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM saxaroza, 25 mM glyukoza, 50 mM C6H7NaO6, 0,1 mM kinurenat, 0,01 mM DL2-Amino{58}}Amino{58}}Amino{58}9} aminokislota{5 m hon.

Keyin bo'laklar 25nM LysoTracker-Green va 1:10,{8}} 1 mg/g suyultirilgan kislorodli ACSF ni o'z ichiga olgan 35 mm chuqurlikdagi shisha idishlarga (MatTek # P35G-1.5-14C) o'tkazildi. mL Tiazin Red (#S570435, Sigma Aldrich), bu tiklanish davrida ishlatilgan ACSF bilan bir xil edi. Tilimning hayotiyligi to'qimalarni vaqt oralig'ida tasvirlash yordamida tasdiqlandi. Dilimlar LysoTracker-Green va Tiazine Red bilan 15 daqiqa davomida xona haroratida inkubatsiya qilindi, so'ngra miyaning kortikal hududlari darhol bir xil eritmada 32 daraja Nikon A1 konfokal mikroskopida 60X ob'ektiv (NA 1.4) va NIS Elements dasturi bilan tasvirlandi. 30 daqiqadan oshmasligi kerak.

Miya ekstraktsiyasi va immunoblotting

Sichqonlar ksilazin (15 mg/kg) va ketamin (100mg/kg), fenilmetilsulfonil ftorid (20ug/ml) bilan fosfat-buferli fiziologik eritma (1XPBS) bilan perfuziyalangan qorin bo'shlig'iga in'ektsiya yo'li bilan anesteziya qilindi. leupeptin (0,5ug/ml), natriy ortovanadat (20mkM) va ditiotreitol (0,1mM), so'ngra miyani olib tashlash. Protein ekstraktsiyasi uchun ishlatiladigan barcha tamponlarda proteaz inhibitori kokteyli III (#535140, Millipore) va Halt fosfataza inhibitori (#78420, Thermo Fisher Scientific) mavjud. Gemibrain to'qimalari tortildi va 1XPBS da 1:10 (w/v) nisbatda homogenizator yordamida qo'lda gomogenlashtirildi.

Gomogenizatsiyadan so'ng, lizatlar 20,8{{10}}0g haroratda 30 daqiqa davomida 4 daraja santrifüj qilindi. Eriydigan fraksiya (supernatant) olib tashlandi va pellet radioimmunopresipitatsiya tahlili (RIPA) buferida pipetlash orqali qayta suspenziya qilindi [50mM Tris, 0,15M NaCl, 1% oktilfenoksipolietoksietanol (IGEPAL), 1mM EDTA, %10,0,0,0. 30 daqiqa davomida muz ustida inkubatsiya qilish uchun pH8 da % natriy deoksixolat.

Namunalar muzda 20 soniya davomida (Misonix XL{0}}) sonikatsiya qilindi va keyin 20,800 g da 30 daqiqa davomida 4 daraja santrifüj qilindi. RIPAda eriydigan fraktsiya (supernatant) olib tashlandi va pellet erimaydigan oqsillarni tahlil qilish uchun 5M guanidinda (pH 8.0) qayta suspenziya qilindi. Har bir namuna muz ustida 20 soniya davomida sonikatsiya qilindi, xona haroratida 1 soat davomida aylantirildi va keyin 20,800 g da 30 daqiqa davomida 4 daraja santrifüj qilindi. Te bicinchoninic acid (BCA) assay (#23225, Thermo Fisher Scientific) har bir namunadagi oqsil kontsentratsiyasini o'lchash uchun ishlatilgan.

G'arbiy dog'lar uchun har bir namunaning 20 ug proteini 4-12% NuPAGE (Invitrogen) jellariga yuklangan va MOPS buferi yordamida qisqartirilgan va denatüratsiya qilingan sharoitlarda ajratilgan. Proteinlar poliviniliden diflorid membranasiga o'tkazildi va Pirs ECL (kengaytirilgan xemiluminesans; Thermo Fisher Scientific) yordamida ishlab chiqilgan. Ishlab chiqilgan signallar ProteinSimple FCR (FluorChem R) yordamida tasvirlangan va keyingi kimyoluminesans signallari AlphaView dasturi (ProteinSimple) yordamida miqdori aniqlangan. Ko‘p mintaqaviy fonni to‘g‘rilash (AlphaView dasturi) bilan birgalikda Fon havolasi vositasi yordamida tahlil qilingan HDJ-2 blokidan tashqari barcha blotlar Mahalliy fonni tuzatish vositasi yordamida tahlil qilindi.

42 ELISA

5XFAD sichqonlarining hemibrain homogenatlarida A 42 ni o'lchash uchun ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan hemibrain va PBSda eruvchan A 42 ni tahlil qilish uchun ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan sotiladigan Enzyme- LinkedImmunosorbent-Assay (ELISA) (ELISA) ishlatilgan. HAPP/PS1 sichqonlarining miyasida A 42 ni o'lchash uchun sotiladigan ELISA dan foydalanilgan (h amiloid 42 ELISA yuqori sezgir, Te Genetics Company, Tsyurix, Shveytsariya). Elishay ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq amalga oshirildi.

Sichqoncha miya to'qimalarining immunofluoresansi

Perfuziyadan so'ng miyalar ekstraksiya qilindi va hemibbrinlar 10% formalinda fiksatsiya qilindi, so'ngra 1XPBS da 30% saxaroza eritmasida kriyokonservatsiya qilindi. 30-mkm koronal yoki sagittal boʻlaklarni yigʻish uchun muzlatuvchi suriluvchi mikrotom ishlatilgan. Bo'limlar ketma-ket ravishda kriyoprotektiv eritmada (1xPBS, 30% saxaroza va 30% etilen glikol) 12-quduq plastinkasiga joylashtirildi va ishlatilgunga qadar -20 darajada saqlanadi. Immunofluoressensiya bilan bo'yash avval qismlarni 1XTBSda uch marta yuvish, so'ngra xona haroratida 1 soat davomida 1XTBSda 16 mM glisinda inkubatsiya qilish orqali amalga oshirildi. 1XTBS da 3 ta qoʻshimcha yuvishdan soʻng, boʻlaklar xona haroratida 2 soat davomida 1XTBS da 0,25% Triton X-100 tarkibidagi 5% echki sarumida bloklandi.

Keyin bo'limlar bir kechada birlamchi antikorlarda 0.25% Triton X-100, 1% sigir zardobi albumini va 1XTBS eritmasida 4 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Keyin ikkilamchi immuno-bo'yash eshak AlexaFluor bilan belgilangan ikkilamchi antikorlar bilan 1:1000 konsentratsiyasida amalga oshirildi (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) olish uchun Nikon NIS Elements dasturidan foydalangan holda tasvir miqdorini aniqlash uchun Ti2 keng maydonli mikroskop yoki Nikon A1 lazerli skanerlash konfokal mikroskopida tasvirga olishdan oldin qismlarni o'rnatish uchun ishlatilgan.

Barcha olish sozlamalari genotiplar orasida bir xil bo'lib qoldi va barcha tasvirlar individual tajribalar uchun bir xil tasvirlash davrida olingan (Shimoliy-g'arbiy universitet ilg'or mikroskopiya markazi va Nikon tasvirlash markazi).

Rasm miqdorini aniqlash

Sichqoncha miyalari

Sichqoncha miya to'qimasini immuno-bo'yashning immunofluoresans miqdori har bir hayvon uchun 3-5 bo'limda, taxminan -0,94 dan -2,55 mm gacha bo'lgan Bregma koordinatalarida amalga oshirildi, ular Ti2 keng maydon mikroskopida 10X ob'ektiv yordamida tasvirlangan. Nikon NIS-Elements Software (Shimoliy-g'arbiy universitet Nikon Imaging markazi) yordamida o'lcham va intensivlik chegaralarini o'z ichiga olgan miqdor tahlillari amalga oshirildi.

Signalga qarab, ob'ektning o'lchami, shakli va kontrasti asosida Umumiy tahlil vositasi yordamida chegaralar o'rnatildi, so'ngra har bir kanal va qiziqish zonasi uchun ikkilik niqoblar yaratildi. Signal-shovqin nisbatini optimallashtirish va o'ziga xos bo'lmagan fon signallarini yo'q qilish orqali qiziqish signallarini ajratish uchun har bir kanalda chegaralash alohida amalga oshirildi. LAMP1, BACE1 yoki LysoTracker-Green bilan qoplangan maydonni, shuningdek, birlamchi neyronlarda LAMP1 va Lysosensor floresans intensivligini o'lchash uchun NIS-Elementlar yordamida qiziqish hududlari qo'lda kuzatildi va har bir qiziqish mintaqasi uchun ikkilik qatlam yaratildi.

LAMP1 ning A 42 ga nisbatini hisoblash uchun distrofik neyritlardagi LAMP1 maydoni individual blyashka asosida A 42 maydoniga normallashtirildi va davolash guruhlari orasidagi sichqonchaning o'rtacha nisbati miqdoriy belgilandi. BACE1 va LAMP1 uchun Pearson korrelyatsiya koeffitsienti tahlili 1 mkm qadam o'lchamli Nikon A1 lazerli skanerlash konfokal mikroskopidan foydalangan holda olingan 30 mkm Z-stekli tasvirlarning maksimal intensivlik proyeksiyalarida har bir plakka asosida NIS-Elementlar yordamida amalga oshirildi.

LysoTrackerGreenning Tiazin qizilga nisbatini hisoblash uchun distrofik neyritlardagi LysoTracker-Green maydoni individual blyashka asosida Tiazin Red maydoniga normallashtirildi va davolash guruhlari o'rtasida sichqonchaning o'rtacha nisbati miqdori aniqlandi. Taxminan −1,70 dan −2,55 mm gacha bo'lgan Bregma koordinatalaridan to'rtta koronal bo'lim har bir sichqoncha uchun har bir tegishli miya mintaqasidagi har bir signalning maydoni yoki intensivligini hisoblash uchun ishlatilgan. Blyashka bilan qoplangan maydon va blyashka hajmini tahlil qilish taxminan -0,94 dan -2,55 mm gacha bo'lgan Bregma koordinatalaridan sichqoncha uchun o'rtacha besh qismdan foydalangan holda amalga oshirildi. Bo'limni tanlash, tasvirni olish, tasvirni kuzatish va miqdorni aniqlash davolash guruhlari va genotiplari ko'r bo'lgan odam tomonidan amalga oshirildi.

Birlamchi neyronlar

Ruxsat etilgan sichqonchaning birlamchi neyronlarida LAMP1 immuno-bo'yashining miqdorini aniqlash uchun NIS-Elementlar yordamida morfologiya asosida soma qo'lda kuzatildi va har bir qiziqish mintaqasi va kanal uchun ikkilik niqob yaratildi. Tubulin piksellari uchun LAMP1 musbat piksellarini izolyatsiya qilish orqali LAMP1 signallarini optimallashtirish va LAMP1ni neyritlarda, shu jumladan dendritlar va aksonlarda farqlash uchun chegara qo'llash ishlatilgan.

Neyritlardagi LAMP1 pufakchalarini tahlil qilish uchun hujayra soma LAMP1 signallari umumiy LAMP1 maydonidan chiqarib tashlandi. Neyronlardagi LysoTracker-Green harakatchanligini tahlil qilish uchun tasvirlar NISElements yordamida aniqlandi. Har bir kadrdagi jami LysoTrackerGreen zarrachalarining tezligi va masofasi NIS-Elements-dagi avtomatlashtirilgan harakatni kuzatish funksiyasi yordamida kuzatildi. Fon shovqinini bartaraf qilish uchun LysoTracker-Green zarralarining o'lchami va floresans intensivligi asosida barcha filmlarga chegara qo'yildi va qo'llaniladi.

Kimograf yaratish uchun 60X konfokal mikroskopda bitta neyronlarning vaqt oralig'ida tasviri o'tkazildi va aksonlar morfologik jihatdan aniqlandi. Har bir guruh uchun zarrachalar sonini zarrachalarning umumiy soniga bo'lish yo'li bilan anterograd yoki retrograd yo'nalishda yoki statsionarda harakatlanadigan zarrachalarning chastotasi foizi aniqlandi. Kimograf tahlillari uchun harakatlanuvchi zarrachalar tezligi 0,1 mkM/sek dan yuqori ekanligi aniqlandi.

Statistik tahlil

GraphPad Prism v8 dasturi statistik tahlillarni, shu jumladan ikkitadan ortiq namunalarni solishtirganda posthoc testlar bilan dispersiyani (ANOVA) tahlilini va faqat ikkita namunani solishtirganda juftlashtirilmagan t-testlarini o'tkazish uchun ishlatilgan. Muayyan test tafsilotlari, shu jumladan takrorlashlar soni, posthoc testlar turi va P qiymatlari rasm afsonalarida keltirilgan. Barcha miqdorlar o'rtacha ± SEMda chizilgan. Muhimlik P qiymati 0.05 dan kam bo'lganda, *P bilan ko'rsatilganda xulosa qilingan.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com