GRP78 haddan tashqari ifodalanishi PINK1-IP3R vositachiligidagi neyroprotektiv mitofagiyani ishga tushiradi 2-qism

2.5. Western Blot

Biz kalamushlarni Dolethal (n=4) bilan 7 dpi tezlikda chuqur behushlik qildik, western blot tahlili uchun L4–L5 orqa miya segmentlarini (5- mm uzunlik) olish uchun. Biz namunalarni suyuq azotda muzlatib qo'ydik.

So'nggi yillarda tobora ko'proq tadqiqot natijalari oqsillarni tozalash va xotira o'rtasida yaqin bog'liqlik borligini ko'rsatdi. Proteinlarni blokirovka qilish - bu nevrologiya tadqiqotlarida keng qo'llaniladigan protein ifodasini aniqlashning analitik usuli.

Neyronlar orasidagi aloqa xotirani saqlash bilan chambarchas bog'liq. Protein blokirovkasi neyronlar o'rtasidagi bog'liqlik holatini va sinapsdan oldingi va keyingi oqsillarning ifodasini aniqlashi mumkin, bu esa oqsillarning xotira shakllanishi va saqlashdagi muhim rolini yanada ochib beradi.

Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, presinaptik neyron oqsillarining ifodasi xotirani shakllantirish va saqlash bilan chambarchas bog'liq. Masalan, o'rganish va xotira jarayonida neyronlar presinaptik oqsillarning ifodasini o'zgartiradi va bu o'zgarish yangi xotiralarni shakllantirish va saqlash bilan bog'liq. Bundan tashqari, ba'zi tadqiqotlar, shuningdek, ba'zi oqsillarni ifodalashdagi o'zgarishlar Altsgeymer kasalligi kabi neyrodegenerativ kasalliklar bilan bog'liqligini aniqladi.

Shuning uchun oqsillarni tozalash neyronlarning molekulyar mexanizmini ochib, neyronlar o'rtasidagi bog'liqlik holatini va tegishli oqsillarni ifodalashdagi o'zgarishlarni chuqur tushunish imkonini beradi. Bu xotirani shakllantirish mexanizmini va neyrodegenerativ kasalliklarni o'rganish uchun katta ahamiyatga ega.

Muxtasar qilib aytganda, oqsillarni tozalash va xotira o'rtasidagi munosabatlar neyronlar va xotirani saqlash o'rtasidagi aloqada oqsillarning rolini ko'rsatadi. Bu xotirani shakllantirish mexanizmini va neyrodegenerativ kasalliklarni o'rganish uchun yangi g'oyalar va yo'nalishlarni beradi. Keling, nevrologiya bo'yicha tadqiqotlarni faol ravishda targ'ib qilaylik va salomatlik va uzoq umr ko'rishga hissa qo'shaylik! Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki u antioksidant, yallig'lanishga qarshi va qarishga qarshi ta'sirga ega, bu miyadagi oksidlovchi va yallig'lanish reaktsiyalarini kamaytirishga yordam beradi va shu bilan asab tizimining sog'lig'ini himoya qiladi. tizimi. Bundan tashqari, Cistanche nerv hujayralarining o'sishi va tiklanishiga yordam beradi va shu bilan neyron tarmoqlarning ulanishi va funktsiyasini oshiradi. Ushbu effektlar xotirani, o'rganish qobiliyatini va fikrlash tezligini yaxshilashga yordam beradi, shuningdek, kognitiv disfunktsiya va neyrodegenerativ kasalliklarning paydo bo'lishining oldini oladi.

Miya faoliyatini yaxshilash yo'llarini bilish tugmasini bosing

Namunalar liziz tamponida (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA va proteaz kokteyli (Sigma-Aldrich) va fosfataza ingibitorlari (Rochet, Balandsel), ) muz ustidagi Potter gomogenizatori bilan.

Lizatlarni 800 × g da 20 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilingandan so'ng, biz supernatantni post-yadro fraksiyasi sifatida yig'dik va BCAassay (Pierce Chemical Co.) yordamida oqsillarni miqdorini aniqladik.

Vestern bloting uchun biz har bir hayvondan L4-L5 segmentlarining 30 mkg post-yadro fraksiyalarini 12% SDS-poliakrilamid jellariga yukladik va oqsillarni elektrotroforetik ajratishni amalga oshirdik, so'ngra BioRadcuvette tizimidagi PVDF membranasiga 25 mm ga o'tkazdik. Tris, pH 8,4, 192 mM glisin, 20% (v/v) metanol.

Biz 5% BSA va 0.1% Tween-20 bilan PBS da 1 soat davomida xona haroratida tematik membranalarni blokladik va bir kechada 4 ◦C da asosiy antikor bilan inkubatsiya qildik: sichqonchaga qarshi{6}}aktin ( 1:10000 SigmaAldrich), sichqonchaga qarshi GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), sichqonchaga qarshi CV (1:1000, Invitrogen), quyonga qarshi HSP60 (1:500, Antikorlar-onlayn), sichqonchaga qarshi NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), sichqonchaga qarshi OPA1 (1:1000, BD Biosciences), quyonlarga qarshi parkin (1:500, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya), sichqonchaga qarshi PINK1 (1:500, Abcam), quyonga qarshi NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), quyonga qarshi GRP75 (1:500, Abcam).

Bir necha marta yuvishdan so'ng, membranalar horseradishperoksidaza bilan konjugatsiyalangan tegishli ikkilamchi antikor bilan 2 soat davomida inkubatsiya qilindi (1:5000, Vektor). Membrana 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM p-kumar kislotasi, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) va (8,8 M vodorod peroksid, 1 M Tris-HCl; pH 8,5) va tasvirlar Gen Genom apparati bilan olingan va Gene Snap va Gene Tools (Syngene) dasturlari bilan tahlil qilingan.

2.6. In Vitro modeli

NSC34 hujayralari 1{5}}% homila sigir zardobi (Sigma-Aldrich), 100 birlik/mlpenitsillin va 0,5 X penitsillin/streptomitsin eritmasi bilan toʻldirilgan modifikatsiyalangan oʻrta glyukoza (DMEM, Biochrom, Kembrij, Buyuk Britaniya)da yetishtirildi. (Sigma-Aldrich) va namlangan inkubatorda 37 ◦C haroratda 5% CO2 ostida saqlanadi, asosan yuqorida tavsiflanganidek [26].

Muhitni o'zgartirmasdan 4 kunlik hujayra madaniyatidan so'ng, NSC34 hujayralari uzoq neyritlar mavjudligi bilan tavsiflangan differentsiatsiyalangan fenotipga ega edi. 4-kuni dorilar hujayralarga qo'shildi. Tun (Sigma-Aldrich, Missuri, AQSH) va EFV (Bristol-Myers Squibb, Nyu-York, AQSh) eritmalari 10X konsentratsiyasida tayyorlangan va DMEMda eritilgan.

24 soatdan keyin hujayralarni 4 mg/ml MTT eritmasi bilan 3 soat davomida inkubatsiya qilish orqali hujayra hayotiyligi baholandi. Hosil bo'lgan ko'k formazan kristallari DMSOda eritildi va 570 nm da absorbans mikroplata o'quvchi (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, AQSh) bilan o'lchandi.

2.7. Nukleofektsiya

GFP, GRP78, HAPARK, sichqoncha sh-eGFP, sichqoncha sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) va /yoki sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) sichqonchasi Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Bazel, Shveytsariya) va Nucleofactor V to'plami (Lonza) yordamida ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga amal qilgan holda.

Statik sitometrik tahlil uchun biz hujayralarni 10% kollagen bilan qoplangan {0}}yaxshisiga ekdik. Madaniyatdan so'ng biz hujayralarni 4% PFA bilan mahkamladik, PBS bilan ikki marta yuvdik va PBS 0,3% (v/v) Triton X-100 va homila sigir zardobidan 10% o'z ichiga olgan blokirovka buferini saqladik yoki keyin qo'shdik. 3 kunlik hujayra madaniyatidan so'ng, DMEMda eritilgan dorilar qo'shildi.

Ushbu tajribalar uchun biz 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 1 0 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) yoki 10 mkM BAPTA-AM (Sigma) dan foydalandik. -Aldrich). Davolanishdan 5 soat o'tgach, biz hujayralarni immunotsitokimyo uchun 4% PFA bilan aniqladik yoki ularni modifikatsiyalangan RIPA buferida (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1 mM EGTA) gomogenlashtirdik. , 1% NP-40, 0,5% natriy deoksixolat, 0,1% SDS, proteaz va fosfataza kokteyllari) immunobloting uchun. Namunalarni ikki marta PBS bilan yuvish va PBSplus 0,3% (v/v) Triton X-100 va 10% homila sigir zardobini o'z ichiga olgan blokirovka qiluvchi bufer bilan inkubatsiya qilish orqali immunohistokimyo o'tkazildi.

Biz quyidagi asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qildik: quyonga qarshi IP3R (1:200, Abcam), sichqonchaga qarshi HA (1:2000, Abcam), sichqonchaga qarshi GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) va quyonga qarshi HSP60 (1:500, Antikorlar-onlayn). Yuqorida ta'riflanganidek, MTT tomonidan hayotiylikni baholash uchun biz davolanishni 24 soatga qoldirdik.

2.8. Mitoxondriyal superoksid ishlab chiqarishni o'lchash va ∆psM

Hujayralar superoksid tahlili uchun 2,5 mkM MitoSOX yoki davolashning oxirgi 30 daqiqasida Molekulyar problardan va Invitrogendan ∆psM tahlili uchun 2,5 mkMTMRM bilan inkubatsiya qilindi. Floresans IX81 Olympus mikroskopi bilan aniqlandi va statik sitometriya dasturi yordamida miqdori aniqlandi.

2.9. Kislorod iste'molini elektrokimyoviy o'lchash

Hujayralar (HBSSda 1 ml ga 1 × 106) gaz o'tkazmaydigan kamerada 37 ◦C da aralashtirildi. O'lchovlar Clark tipidagi O2 elektrodi bilan (Rank Brothers, Kembrij, Buyuk Britaniya) olingan va Dup.18 ma'lumotlari bilan qayd etilgan. olish qurilmasi (WPI) avtomobil yoki Tun bilan 5-davolagandan keyin darhol.

2.10. Mitoxondrial va sitozolik fraksiyalanish

Hujayralar liziz tamponida (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM saxaroza va proteazlar kokteyli (Sigma-Aldrich) va fosfataza inhibitörleri (Roche)) muz ustida Potter gomogenizatori bilan homogenlashtirildi.

Lizatlarni 2 000 × g 5 daqiqa davomida santrifüjlangandan so'ng, supernatant 12 daqiqa davomida 10,000 × g da santrifüj qilindi. Supernatant eruvchan fraktsiya (S2) deb hisoblangan va sitozolik oqsillar va mikrosomalarni o'z ichiga oladi.

Pelet (P2) o'zgartirilgan RIPA buferida (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 0 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8}) qayta suspenziya qilingan boyitilgan mitoxondriyal fraktsiya edi. }}, 0,5% natriydeoksixolat, 0,1% SDS, proteaza va fosfataza kokteyllari) va oqsil kontsentratsiyasi BCA tahlili bilan aniqlandi. Keyin namunalar western blot uchun qayta ishlandi.

2.11. Transmissiya elektron mikroskopiyasi

Biz orqa miya L{0}}L5 segmentlarini ({2}}mm bo'laklar) 2% (h/v) PFA va 2,5% (h/v) glutaraldegid (EM darajasi) fiksator eritmasiga botirdik. 0.1 M PBS, pH 7,4 va ularni 2 soat davomida tebranuvchi platformaga qo'ying, so'ngra 1% (h/h) PFAda mahkamlang va keyin 1% (g/h) osmiy tetroksid bilan postfikslanadi (TAAB laboratoriyasi). ) 2 soat davomida PBSda 0,08% (w/v) kaliyheksasiyanoferrat (Sigma-Aldrich) o'z ichiga oladi.

Biz deionizatsiyalangan suv va asetonda ketma-ket suvsizlanish bilan to'rtta yuvishni amalga oshirdik. Barcha muolajalar ilgari tasvirlangan [33] 4 ◦C da amalga oshirildi. Biz namunalarni EPON qatroniga joylashtirdik va 60 ◦C da 48 soat davomida polimerlashdik.

Namunalar Leicaultracut UCT mikrotomi bilan yarim yupqa bo'laklarni (1 mkm) olish uchun qayta ishlandi, 1% (w/v) suvli toluidin ko'k eritmasi bilan bo'yaldi va MNs bilan boyitilgan qorin shoxlari joylarini aniqlash uchun yorug'lik mikroskopida tekshirildi.

Ultra yupqa bo'laklar (70 nm) olmosli pichoq bilan kesilgan, qoplangan panjaralarga joylashtirilgan va an'anaviy uranil asetat va Reynolds qo'rg'oshin sitrat eritmalari bilan kontrastlangan.

Nihoyat, biz GatanUltrascan ES1000CCD kamerasi bilan jihozlangan transmissiya elektron mikroskopi (Jeol 1400) yordamida bo'limlarni kuzatdik. Biz har bir shart uchun uchta bo'lakni tanladik, har bir bo'limda uchta MNni tahlil qildik va ImageJ asboblari yordamida yadrolarning umumiy maydonini MNning umumiy maydoni bilan taqqosladik.

2.12. Bioinformatika va statistika

Oddiylik taxminiga javob beradigan ma'lumotlar uchun turli eksperimental guruhlar orasidagi qiymatlarni solishtirish uchun biz dispersiya tahlilidan (ANOVA) foydalandik. Guruhlar o'rtasidagi farqlar bir tomonlama ANOVA, so'ngra Tukeyning post hoc ko'p diapazonli testi yoki Student t-testi yordamida tahlil qilindi. Barcha statistik tahlillar GraphPad Prism5 dasturi yordamida amalga oshirildi (n=3–5; ahamiyatlilik uchun p < 0.05).

3. Natijalar

3.1. Matn

3.1.1. GRP78 haddan tashqari ifodalanishining proteomik tahlili mitoxondriyani asosiy maqsad sifatida aniqladi

GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi orqali neyroproteksiyaga olib keladigan molekulyar mexanizmlarni aniqlash uchun biz ilgari neuroprotec bo'lgan GRP78 (Ad-GRP78) ning haddan tashqari ko'payishi uchun adenoviruslar bilan kasallangan RA bilan shikastlangan hayvonlar o'rtasidagi miqdoriy va sifat jihatidan farqlarni aniqlash uchun qiyosiy yorliqsiz proteomik tahlil o'tkazdik. MNs yoki beta-galaktosidaza (Ad-ß-Gal) nazorati sifatida [20].

Laboratoriyamizda o'tkazilgan oldingi tadqiqotlarga ko'ra, jarohatdan keyingi etti kun (dpi) tahlil uchun tanlangan vaqt nuqtasi edi [20,25]. Distal aksotomiya va siyatik nerv choklari bilan bizning degenerativ RA modelimizdan so'ng regeneratsiya modeli o'rtasidagi oldingi taqqoslashda biz signalizatsiya hodisalari RA dan keyin divergentpro-degenerativ hodisalar paydo bo'lganda 7 dpi gacha o'xshashligini kuzatdik [20,25].

L{3}}L5 omurilik segmentlarining post-yadro fraksiyalarining LC-MS/MS yorliqsiz tahlili 1420 ta oqsilni aniqlashga olib keldi, bunda boshqa misollar va tadqiqotlarda ilgari xabar qilinganidek, har bir proteinda kamida ikkita peptid bor [25] .

Virus bilan kasallanmagan RA bilan shikastlangan hayvonlarga nisbatan Ad-GRP78 yoki Ad-ß-Gal haddan tashqari ekspressiyasi tufayli jami 566 va 732 oqsil yoki peptid sezilarli darajada o'zgargan (p < 0 .05) (S1 va S2-jadvallar).

Biz ikkala roʻyxatni solishtirdik va 220 Ad-GRP78Oʻta ifodasi (S3-jadval) tufayli noyob tarzda oʻzgartirilganligini aniqladik.Izoh, vizualizatsiya va integratsiyalashgan kashfiyot (DAVID) maʼlumotlar bazasidan foydalangan holda ushbu oqsillarning funktsional izohlanishi bizga aniqlash imkonini berdi. ma'lumotlar to'plamidagi eng muhim biologik funktsiyalar (FDR <0,05) [34,35].

GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi mitoxondrial jarayonlar, funktsiyalar va tarkibiy qismlarda ishtirok etadigan oqsillar darajasidagi farqlarga olib keldi (jadval S4A-C, S1A-C-rasm). Ushbu ma'lumotlarning gen ontologiyasi (GO) atamalari va KEGG yo'lini boyitish tahlili Ad-GRP78 bilan kasallangan hayvonlarda mitoxondrial funktsiyalarga ega ko'plab oqsillar, shu jumladan tashqi va ichki mitoxondriyal yuz oqsillari, nafas olish kompleksi oqsillari, va matritsa oqsillari.

Biz proteomik ro'yxatda aniqlangan protein darajasidagi farqlarni tasdiqladik, masalan, yuqori tartibga solingan GRP75 (p < 0.05) va V kompleksining subbirligi (CV ), pastga regulyatsiya qilingan (p=0.03) kutilganidek GRP78 guruhlarida (1A-rasm).

Butun roʻyxat boʻyicha eng koʻp regulyatsiya qilinganlar 2-oksoglutarat/malattashuvchi oqsil OGC (SCL25A11), MT-ND3 (temalat-aspartat uzatishda ishtirok etuvchi va mitoxondriyal matritsadagi NADH hovuzini regeneratsiya qiluvchi oʻsimta bostiruvchi) edi. I funktsiya), I kompleksining NADH dehidrogenaza 3-kichik birligi, gammaaminobutirik kislota aminotransferaza ABAT va III kompleksning ubiquinol-sitoxrom C reduktaza subbirligi. Bundan farqli o'laroq, juda oz miqdordagi oqsillar yuqori tartibga solingan (1B-rasm).

Bir yuqori tartibga solingan oqsil kutilganidek GRP78 edi va boshqa yuqori tartibga solinadigan oqsillar asosan plazma membranasida va ba'zan qo'zg'atuvchi sinapslarda mitoxondriyalarda joylashgan EAAT2 aminokislota tashuvchisi va betamitoxondrining so'nggi uch bosqichini katalizlovchi gidroksiasil-KoA dehidrogenaza HADHA edi. -uzun zanjirli yog 'kislotalarining oksidlanishi.

Biz mitoxondriya yoki mitoxondriya funktsiyasi bilan bog'liq oqsillardagi boshqa oqsillar funktsional mitoxondriya ta'sirini tasdiqlash uchun proteomik ro'yxatdan o'zgartirilganmi yoki yo'qligini tekshirish uchun tahlilni kengaytirdik (1C-rasm).

Biz mitoxondriyal saqlanib qolgan dinamin bilan bog'liq bo'lgan GTPaz optik atrofiyasi 1 (OPA1), termoyadroviy [36], pastga regulyatsiya qilinganligini kuzatdik (p < 0.1); LONP1, noto'g'ri katlanmış polipeptidlarning tanlab degradatsiyasiga sabab bo'lgan ATPga bog'liq proteaz, ko'payish tendentsiyasini ko'rsatdi, ammo ubiquinone NDUFA9, antioksidant reaktsiya elementlarini yoki boshqa dinaminlarni o'z ichiga olgan genlarni tartibga soluvchi NRF2 transkripsiya omili darajasida farqlar kuzatilmadi. Mitofusin 2 (MFN2) kabi infuziya bilan bog'liq GTPaz [36].

Mitoxondriya ichidagi o'zgarishlarning to'liq sarhisobi 1D-rasmdagi sxemada ko'rsatilgan. Mitoxondrial dinamika stressga javob berish uchun muhim, chunki material almashinuvi uchun shikastlangan mitoxondriya birlashtiruvchi va mitoxondriyal bo'linish shikastlangan mitoxondriyalarni va keyingi mitophalarni ajratish imkonini beradi [37].

MFN2 va L/S OPA1 shakllari nisbatini tahlil qilish orqali mitoxondriyadagi pastga regulyatsiya qilingan oqsillarning asosiy soni va mitoxondriya sintez faolligida aniq o'zgarishlar kuzatilmaganini hisobga olib (1C-rasm), biz mitofagiya bilan bog'liq markerlarni tekshirdik.

Klassik ravishda mitoxondriyaning avtofagiyaga bog'liq degradatsiyasi depolarizatsiyadan keyin sodir bo'ladi va bu odatda tashqi mitoxondriyal membranada fosfataza va tensinhomolog (PTEN) tomonidan qo'zg'atilgan taxminiy kinaz 1 (PINK1) ning to'liq uzunlikdagi to'planishi natijasida yuzaga keladi.

Keyinchalik, halqa orasidagi E3 ubiquitin-protein ligaza Parkin depolarizatsiyalangan mitoxondriyaning ubikvitatsiyasining mitoxondrial tashqi membrana oqsilini belgilash uchun ishga tushiriladi [38-41]. 2A-rasmning yuqori qismida Parkin darajasida hech qanday o'zgarishlar yo'q, lekin 7 dpi da nazoratga nisbatan ipsilateral L{10}}L5 orqa miya segmentida RA jarohati natijasida hosil bo'lgan to'liq uzunlikdagi PINK1 sezilarli darajada kamaygan. Aksincha, GRP78 ning haddan tashqari ko'payishi Parkinni kamaytirdi, ammo bog'liq bo'lmagan Gal proteinining nazorati bilan solishtirganda RAdan keyin PINK1 darajasini ikki baravar oshirdi (2A-rasm, pastki).

To'liq uzunlikdagi PINK1 ning ko'tarilishi mitofagiya [42] induksiyasi bilan mos keladi va Parkinning qisqarishi qolgan mitoxondriya oqsillari tomonidan kuzatilgan organellalarning demontajining ilg'or holati bilan bog'liq bo'lishi mumkin.

Biz mitoxondriyalar va mikrotubulalar bilan bog'liq bo'lgan oqsillar 1A/1B engil zanjiri 3 (LC3)-musbat punktalarning birgalikda lokalizatsiyasini, asosiy makroautofagiya apparatining asosiy komponenti bo'lgan va mitofagiya jarayoni uchun zarur bo'lgan [43].

Konfokal mikroskopiyadan foydalangan holda, biz anti-COX IV yordamida etiketlangan mitoxondriyalarning birgalikda lokalizatsiyasining sezilarli o'sishini kuzatdik, faqat 7 dpi da GRP78 ni haddan tashqari ko'rsatadigan shikastlangan MNlarda RA dan keyin LC {2}}musbat nuqta bilan (2B-rasm).

Biz avullangan MNlarda mitofagiya mavjudligini faqat GRP78 ni haddan tashqari ifodalashda transmissiya elektron mikroskopidan foydalangan holda namuna tahlili orqali tasdiqladik.

Biz Ad-GRP78 hayvonlarining MN ichida mitokondriya bilan chambarchas bog'langan mitofagosomalarga o'xshash mitofagiyaning o'ziga xos belgisi bo'lgan [37] va bir nechta ERsisternalarni yutgan ko'p vakuolalarni kuzatdik, ammo ularni Ad- -Gal RA-injudada aniqlamadik. kalamush namunalari 5 dpi da (2C-rasm).

Shakl 1. RA-shikastlangan hayvonlarda GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi mitoxondriyal oqsillarni nishonga oladi. (A) GRP78 va L5 orqa miya segmentlarida GRP78, GRP75 va CV oqsil darajasining oʻrtacha katlam oʻzgarishlarini (± SEM) koʻrsatadigan immunoblot va shtrixli grafiklar GRP78 va GRP78 ga nisbatan.

-Gal 7 dpi ga RA-shikastlangan kalamushlarni haddan tashqari ifodalash. Darajalar aktin qiymatlariga normallashtirildi (n=4; * p < 0.05 vs.Ad- -Gal, Student t-testi). (B) GRP78 ni Ad- -Gal guruhiga nisbatan 7 dpi ga haddan tashqari oshirib yuboradigan RA bilan shikastlangan hayvonlarning L{8}}L5-orqa miya segmentlarining proteomik tahlili natijasida olingan mitoxondriyal oqsil burmalari oʻzgarishlari gistogrammasi. (C) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 ning aktinga normallashtirilgan oʻrtacha burma oʻzgarishlarini (± SEM) koʻrsatadigan immunoblot va shtrixli grafiklar. (Guruhlar o'rtasida sezilarli farq yo'q. Talabaning t-testi). (D) RA bilan shikastlangan hayvonlarning L{21}}L5 orqa miya segmentlarida GRP78 ning haddan tashqari ekspressiyasi tufayli oqsillari oʻzgargan sxematik mitoxondriyalar 7 dpi da sariq (kamaygan) yoki koʻk rangda (koʻtarilgan) ajratilgan.

Shakl 2. Mitofagiya GRP78 ni haddan tashqari oshirib yuboradigan kalamushlarda RAdan keyin in vivo modulyatsiya qilinadi. (A) RA-shikastlanganlarning L{3}}L5 orqa miya segmentlarida aktin darajasiga normallashtirilgan oqsil darajasining (oʻrtacha ± SEM) PINK1 va PARK qatlamlarining oʻzgarishi tahlili uchun immunoblotlar va tegishli shtrixli grafiklar.

boshqaruv (yuqorida) yoki Ad{0}}Gal va Ad-GRP78 guruhlaridan (pastda) 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, Talabaning t-testi). (B) Chapda, 7 dpi tezlikda AAVrh10-GFP yoki AAVrh10-GRP78 guruhlari intratekal in'ektsiyasini olgan RAjaralangan hayvonlarning ipsilateral joyidagi vakili MNlarning mikrofotosuratlari. Namunalar COX IV (qizil) va LC3 (yashil) uchun bo'yalgan va floresan Nissl (ko'k) bilan bo'yalgan.

Masshtab satri=10 mkm va raqamli kattalashtirish 10X.

Birgalikda lokalizatsiya faqat AAVrh10-GRP78 guruhida kuzatiladi. O'ngda COX IV va LC3 ning birgalikda lokalizatsiya nuqtalarining % tahlilini ko'rsatadigan chiziqli grafik. COX IV va LC3 birgalikda lokalizatsiyasining o'rtacha ± SEM (n=4; ** p < 0.01, Talabaning t-testi). (C) Orqa miya MNlarida mitoxondriyalar ajralib turadigan transmissiya elektron mikroskopining reprezentativ tasvirlari: a, mitoxondriya nazoratsiz hayvonni ko'rsatuvchi MN sitoplazmasi tasviri; b, Ad- -gal guruhidagi RA bilan shikastlangan kalamushdan olingan MN sitoplazmasi tasviri; c, Ad-GRP78 guruhidagi RA-shikastlangan kalamushdan olingan MN sitoplazmasining tasviri, qizil yulduzcha bilan ko'rsatilgan ba'zi yutilgan mitoxondriyalar; d, yuqoriroq kattalashtirish tasviri (C) katta mitoxondriya va ER kontaktiga ishora qilib ko'rsatilgan. O'lchov chiziqlari raqamlarda ko'rsatilgan.

Umuman olganda, bu natijalar GRP78 haddan tashqari ekspressiyasi RAdan keyin mitofaginin uzilgan MNsni keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatdi va bu neyroproteksiyani rag'batlantirishi mumkin.

3.1.2. GRP78 haddan tashqari ifodasi shikastlangan mitoxondrial funktsiyani tiklaydi

Keyinchalik biz GRP78 haddan tashqari ifodalanishining ER stressining in vitro modelining mitoxondriyaga ta'sirini batafsil o'rganib chiqdik, chunki bu haqorat ilgari xabar qilingan RA jarohatidan keyin erta paydo bo'ladi [20,26] va bu yangi neyroprotektiv vositalarni tekshirishning ishonchli usulidir [2,44] ].

Ushbu modelda tunikamitsin (Tun) qo'llaniladi, bu ER-stress induktori bo'lib, N-atsetilglyukozamin-lipid oraliq mahsulotlarning hosil bo'lishiga olib keladi va shu bilan yangi sintezlangan oqsillarning glikozillanishini oldini oladi va oqsillarning noto'g'ri qatlamlanishiga olib keladi. Biz buni qo'lladik, chunki to'xtatilgan sekretsiya yo'li ham RA dan keyin neyrodegenerativ jarayonda asosiy rol o'ynaydi [26].

Biz birinchi navbatda NSC34motoneyronga o'xshash hujayralarning tegishli vektor bilan nukleofektsiyasi GRP78 ishlab chiqarishga olib kelganligini tasdiqladik (3A-rasm). Ushbu hujayralarda GRP78 ifodasi Tunni o'z ichiga olgan omon qolish vositasini sezilarli darajada oshirdi (3B-rasm).

Tun bilan davolash odatda GRP78 ning o'zini-o'zi qo'zg'atsa ham, bu endogen haddan tashqari ekspressiya juda kech (24 soatgacha) (S2-rasm). Bundan tashqari, biz GRP78 haddan tashqari ekspressiyasining boshqa in vitro modelida neyroprotektiv ta'sirga ega yoki yo'qligini aniqlashimiz mumkinmi, deb hayron bo'ldik, biz ilgari RA jarohatidan so'ng MN o'limining bir nechta xususiyatlarini takrorlashi haqida xabar bergan edik [26].

Ushbu model mikrotubulalar polimerizatsiyasiga xalaqit beradigan nokodazol tomonidan qo'zg'atilgan sitoskeletal shikastlanishga asoslangan. GRP78 ifodasi nokodazol ishtirokida ham yetishtirilgan hujayralarning hayotiyligini oshirdi (3B-rasm).

Keyin, biz NSC34 stress hujayralarida MitoSOX yordamida mitoxondriyadagi reaktiv kislorod turlarini (ROS) hosil bo'lishini, tetrametilrodamin metil ester (TMRM) yordamida mitoxondriyal membrana potentsialini (∆psm) va O2 iste'molini o'lchash orqali mitoxondrial funktsiyani baholadik. GRP78 haddan tashqari ifodasi bilan yoki bo'lmasdan.

Ijobiy nazorat sifatida biz uchta parametrni o'zgartiruvchi mitotoksik agent bo'lgan efavirenz (EFV) dan foydalandik [45]. Tun qo'shilgandan so'ng MitoSOX darajasi asta-sekin o'sib borayotganini, 24 soatga statistik ahamiyatga ega bo'lganini va avtomobil bilan ishlov berilgan nazorat vositalariga nisbatan davolashdan keyingi birinchi soatdan boshlab EFV bilan ishlov berilgan hujayralarda ROS hosil bo'lishi sezilarli darajada oshganini kuzatdik (S3A-rasm).

GRP78 ning haddan tashqari ko'payishi Tun yoki EFV bilan davolashdan keyin 24 soat o'tgach, GFPni ifodalovchi hujayralarga nisbatan ROSin mitoxondriyalarining sezilarli darajada pasayishiga olib keldi (3C-rasm). ∆psm 5 va 24 soatlik Tun bilan davolashdan keyin va 24 soatlik EFVtreatmentdan keyin qulab tushdi (S3B-rasm). Ushbu parametrning tiklanishiga Tun yoki EFV bilan ishlov berilgan hujayralardagi GRP78 haddan tashqari ekspressioni erishildi (3D-rasm).

GFP (qiyalik −0.063,R2=0.98) ifodalovchi hujayralardagi Tun qoʻshilgandan soʻng tahlil qilishning 80 daqiqasi davomida O2 isteʼmoli tezligi kamaydi, lekin O2 isteʼmoli Tun mavjudligiga qaramay, GRP{7}}ortiqcha ifodalanadigan hujayralarda barqaror (qiyalik −0,221, R2=0,99) (3E-rasm, chap).

5 soatdan so'ng, nafas olish GRP{1}}ortiqcha ifodalanadigan hujayralarda normal bo'lib, GFPni ifodalovchi hujayralarda jiddiy buzilgan (3E-rasm, o'ngda). Umuman olganda, bu natijalar GRP78 ER stressi yoki mitotoksisite tufayli kelib chiqadigan mitoxondriya disfunktsiyasini susaytiradi.

For more information:1950477648nn@gmail.com