Inson Alpha Defensin 5 Inson buyragi va siydik yo'llaridagi ifodasi
Mar 16, 2022
Batafsil maʼlumot uchun: ali.ma@wecistanche.com
Jon Devid Spenser va boshqalar
Abstrakt
Fon:Siydik chiqarish yo'llarida bepushtlikni saqlaydigan mexanizmlar to'liq tushunilmagan. So'nggi tadqiqotlar siydik yo'llarini infektsiyadan himoya qilishda mikroblarga qarshi peptidlarning (AMP) muhimligini ko'rsatdi. Bu erda biz AMP inson alfa-defensin 5 (HD5) ning inson organizmidagi ifodasi va ahamiyatini tavsiflaymiz.buyrakva normal va infektsiyalangan sub'ektlarda siydik yo'llari.
Metodologiya/Asosiy topilmalar:Insondan ajratilgan RNKdan foydalanishbuyrak, siydik yo'llari va siydik pufagi to'qimalarida biz HD5 genini kodlaydigan DEFA5 siydik yo'llari bo'ylab konstitutsiyaviy ravishda ifodalanganligini ko'rsatish uchun real vaqt rejimida miqdoriy PCR o'tkazdik. Pielonefrit bilan DEFA5 ifodasi sezilarli darajada oshdibuyrak. Immunoblot tahlilidan foydalanib, pielonefrit bilan HD5 ishlab chiqarish ham ortdi. Quviq va siydik yo'llarining uroteliysida lokalizatsiya qilingan HD5 ni immuno-bo'yash. Buyrakda HD5 asosan distal nefron va yig'uvchi tubulalarda ishlab chiqarilgan. Immunoblot va Elishay tahlillari yordamida HD5 infektsiyalanmagan odam siydigi namunalarida muntazam ravishda aniqlanmadi, shu bilan birga siydikda HD5 ishlab chiqarish E.coli siydik yo'llari infektsiyasi bilan ortdi.
Xulosa/ahamiyat:DEFA5 infektsiyalanmagan odamlarda siydik yo'llari bo'ylab ifodalanadi. Xususan, HD5 pastki siydik yo'llarining uroteliysida va siydik yo'llarining yig'uvchi kanallarida ifodalanadi.buyrak. INFEKTSION bilan HD5 ifodasi ortadibuyrak, va siydikda darajalar aniqlanadi. Bizning ma'lumotlarimizga ko'ra, bizning topilmalarimiz inson buyragida HD5 ifodasi va ishlab chiqarish miqdorini aniqlash uchun birinchi bo'lib hisoblanadi. Bundan tashqari, bu infektsiyalangan siydik namunalarida HD5 mavjudligini aniqlaydigan birinchi hisobot. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, HD5 siydik yo'llarining bepushtligini saqlashda muhim rol o'ynashi mumkin.
Kirish
Siydik chiqarish yo'llari, uretral go'shtdan tashqari, fekal flora bilan yaqin bo'lishiga qaramay, odatda sterildir. Siydik chiqarish yo'llarining bepushtligini saqlab turishining aniq mexanizmlari yaxshi tushunilmagan. Siydik chiqarish yo'llarini himoya qilishga hissa qo'shadigan tavsiya etilgan mexanizmlar orasida siydik oqimi, siydik pH va osmolyarligining o'zgarishi, siydik pufagining muntazam bo'shatilishi, uroepiteliyning kimyoviy himoya komponentlari va bakterial stimulyatsiya bilan effektor immun hujayralarining epitelial to'kilishi / oqimi kiradi [1]. Bundan tashqari, yaqinda mikroblarga qarshi peptidlar (AMP) siydik yo'llarining bepushtligini saqlashda muhim rol o'ynashi ko'rsatildi [2]. Deyarli barcha organizmlar tomonidan ishlab chiqariladigan tabiiy antibiotiklar bo'lib xizmat qiluvchi AMPlar tug'ma immunitet tizimining hamma joyda mavjud komponentidir. AMPlar fagotsitar oq hujayralar va epiteliya hujayralari tomonidan ifodalangan katyonik molekulalardir. Odamlarda va boshqa sutemizuvchilarda defensinlar AMPlarning asosiy oilasi hisoblanadi. Defensinlar odatda gramm-musbat va gramm-manfiy bakteriyalar, viruslar, zamburug'lar va protozoyalarga qarshi keng spektrli mikroblarga qarshi faollikka ega [2,3]. Defensinlar dastlab preproproteinlar sifatida sintezlanadi va etuk, biologik faol peptidlarga aylanish uchun qayta ishlanadi [4]. Odamlarda defensinlar disulfid ko'prigiga qarab ikkita oiladan biriga bo'linadi - alfa-defensinlar yoki beta-defensinlar [5].
Siydik chiqarish yo'llarida beta-defensinlar uroepitelyum bo'ylab keng tarqalgan. Qoplagan epiteliya hujayralaribuyrakHenle halqasi, distal tubula va yig'uvchi kanal konstitutsiyaviy ravishda inson beta-defensin 1 (hBD1) ni ifodalaydi. Siydikdagi hBD1 darajasi bosqinchi bakteriyalarni o'ldirish uchun etarli bo'lmasa-da, hBD1 quvurli lümenlerin tez ta'sir qiluvchi antimikrobiyal qoplamasini ta'minlaydi va bakterial uroteliyga biriktirilishini inhibe qilish orqali infektsiyani oldini oladi [6]. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, hBD1 ning redoks holati antimikrobiyal ta'sirga sezilarli darajada ta'sir qiladi, shuning uchun pasaytirilgan peptid disulfid bilan bog'langan oksidlangan shaklga qaraganda ancha kuchliroqdir [7]. Buning uroteliya yuzasida ahamiyati aniqlanmagan. Boshqa bir defensin, inson beta-defensin 2 (hBD2) sog'lom buyrak to'qimalarida konstitutsiyaviy ravishda ifodalanmaydi; ammo, hBD2 ifodasi infektsiya tomonidan qo'zg'atiladi [8].
Beta-defensinlardan farqli o'laroq, epiteliyadan olingan alfa-defensinlarning roli siydik yo'llarida yaxshi tasvirlanmagan. HD5 va HD6 alfa-defensinlarining ifodasi va funktsiyasi asosan ingichka ichakda qayd etilgan, bu erda ular panethcells tomonidan ichak kriptlariga chiqariladi va ichak mikrobiotasi muvozanatiga hissa qo'shadi [9]. HD5, shuningdek, erkak va ayol jinsiy yo'llarida ham lokalizatsiya qilingan, bu dalillar bilan u infektsiyani yo'q qilishda qo'zg'aluvchan va muhim ekanligini ko'rsatadi [10,11,12]. HD5 siydik pufagi rekonstruksiya qilingan va yonbosh kanali siydik yo‘lini yo‘naltirgan bemorlarda aniqlangan, bunda HD5 ishlab chiqarish manbai asosan yonbosh panet hujayralariga hisoblangan [13,14]. HD5 keng tarqalgan uropatogen gramm-musbat bakteriyalar va gramm-manfiy bakteriyalarga qarshi antibakterial faollikka ega [15]. HD5 shuningdek, adenovirus va BK virusi kabi uropatogen viruslarga qarshi mikroblarga qarshi faollikka ega [16,17,18]. Ushbu tadqiqotda biz insonda HD5 ifodasining dastlabki tavsifi va miqdorini taqdim etamizbuyrakva sterillik va infektsiya paytida pastki siydik yo'llarida uning ifodasini yanada aniqlang.
Natijalar
DEFA5 mRNK konstitutsiyaviy ravishda odamning siydik pufagi, siydik yo'llari va buyragida ifodalanadi.
Miqdoriy real vaqtda PCR shuni ko'rsatadiki, barcha tekshirilgan siydik pufagi, siydik yo'llari vabuyrakinfektsiyasiz namunalar konstitutsiyaviy ravishda DEFA5 bilan ifodalangan. DEFA5 ifodasi pastki siydik yo'llarida yuqori siydik yo'llariga qaraganda sezilarli darajada kattaroq edi (p= 0.014). Quviqda (n=4) o'rtacha DEFA5 ifodasi 10 ng RNK uchun 4,656637 transkriptni va siydik yo'llarida (n=4) o'rtacha DEFA5 ifodasi 10 ngRNK uchun 4,1126170 transkriptni tashkil etdi (1A-rasm) . Buyrakda (n=6), o'rtacha DEFA5 ifodasi 10 ng RNK uchun 2,9376274 transkriptni tashkil etdi. DEFA5 ifodasi buyrak korteksida, medullada va tosda alohida tahlil qilindi. DEFA5 ifodasi buyrak mintaqasiga qarab sezilarli darajada farq qilmadi (p= 0.45).
DEFA5 ifodasi va HD5 peptid ifodasi pielonefrit bilan ortadi
Haqiqiy vaqtda PCR tahlili amalga oshirildibilan buyrak to'qimalaripielonefrit infektsiyalanmagan buyrak to'qimalariga nisbatan DEFA5 ifodasining sezilarli o'sishini ko'rsatdi. Piyelonefrit (n= 6) bilan o'rtacha DEFA5 ifodasi 10 ng RNK uchun 7,82961,052 transkriptgacha oshdi (p= 0.019) (2A-rasm).
Pielon-frit bilan ifodalanishning ushbu o'sishini yanada baholash uchun biz xuddi shu tarzda immunoblot tahlilini o'tkazdik.buyrakHD5 peptid ishlab chiqarishning bir vaqtning o'zida o'sishini baholash uchun real vaqt rejimida PCR tahlili uchun ishlatiladigan to'qimalar (2B-rasm, o'rta panel). Poliklonal HD5 antiserumlardan foydalangan holda immunoblot tahlili pielonefritli buyrak to'qimalarida HD5 peptid ishlab chiqarishning sezilarli darajada oshishini ko'rsatdi (n {{5}). }) yuqtirilmaganlarga nisbatanbuyrakto'qimalar (n=6). Infektsiyalanmaganbuyrakto'qimalarda esa 300625 ng HD5/gram ho'l to'qimalar og'irligi ifodalanganbuyrakpielonefritli to'qimalar 600621 ng HD5/gram ho'l to'qimalarning og'irligi (p,0,0001) ifodalangan. Blotlar yuklash nazorati sifatida xizmat qilish uchun GAPDH bilan qayta tekshirildi (2B-rasm, o'rta panel) va teng protein yuklanishini tasdiqlash uchun kumush bo'yoq ham bajarildi (2B-rasm, yuqori panel).
HD5 peptid insonning butun buyrak va siydik yo'llarida ishlab chiqariladi
Siydik chiqarish yo'llarida HD5 ishlab chiqarishni lokalizatsiya qilish uchun immuno-bo'yoq o'tkazildi. Immunohistokimyo (IHC) HD5 immunoreaktivligi barcha tekshirilgan namunalarning siydik yo'llari va siydik pufagining uroteliysida mavjudligini ko'rsatdi (n=4, 3-rasm). IHC shuningdek, HD5 barcha buyrak korteksi va medulla kanalchalarida ishlab chiqarilganligini ko'rsatdi. namunalar (n= 6, 4-rasm). Immunofluoresans (IF) HD5 ifodasi distal nefron va yig'uvchi kanalchalarda eng yuqori ekanligini ko'rsatdi (5-rasm). Interstitium va glomeruli HD5 immunoreaktivligini ko'rsatmadi. 3, 4 va 5-rasmlarda ko'rsatilgan immuno-bo'yash HD5 propeptidini (Abcam, Kembrij, MA) taniydigan sichqoncha monoklonal anti-HD5 antikori (8C8) yordamida amalga oshirildi. HD5 propeptidini va etuk peptidni (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) taniydigan quyon poliklonal anti-HD5 antikoridan foydalanganda natijalar o'xshash edi - bu HD5 propeptid sifatida saqlanganligini ko'rsatadi.
Pielonefrit bilan HD5 immuno-bo'yash sezilarli darajada oshdi. HD5 immunoreaktivligi proksimal nefron, distal nefron va yig'uvchi kanalchalar bo'ylab ortdi (4-rasm va 5-rasm). Infektsiyalanmagan namunalarda bo'lgani kabi, glomeruli va interstitsial infektsiya bilan HD5 ifodasini ko'rsatmadi. Salbiy nazoratlar HD5 immunoreaktivligini ko'rsatmadi.
Infektsiyalangan odam siydigida HD5 peptidining o'lchanadigan konsentratsiyasi mavjud
Immunoblot tahlili, proHD5 prekursorini aniqlaydigan quyon poliklonal antiserumidan foydalangan holda va keyinchalik qayta ishlangan shakllar uropatogen E.coli bilan kasallangan 15 ta sinovdan o'tgan siydik namunalarining 13 tasida HD5 ning o'lchanadigan darajasini aniqladi (6A va B-rasm). Mavjud bo'lsa, siydik kreatininiga normallashtirilgan HD5 darajalari 299,8–669,7630 ng HD5/mg siydik Cr (110,67 ng/ml–276,67 ng/ml), bu 11,10–27,67 nmol/L ga to'g'ri keladi. Infektsiyalanmagan siydik namunalari (n=15), HD5 (,50 ng) aniqlash chegarasida yoki undan past edi. Xuddi shu siydik namunalarida faqat proHD5 prekursorini aniqlaydigan sichqoncha monoklonal antikoridan (8C8) foydalangan holda ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) sinovdan o'tkazilgan 15 ta infektsiyalangan namunaning 13 tasida proHD5 ning o'lchanadigan darajasini aniqladi. Siydikdagi proHD5 kontsentratsiyasi mavjud bo'lganda 122,78–490,060,03 ng HD5/mg siydik Cr (30,02 ng/ml–200,5 ng/ml) oralig'ida bo'lgan (7-rasm).
Munozara
Ushbu tadqiqotda biz insonda HD5 ning dastlabki tavsifini beramizbuyrak, siydik yo'llari va siydik pufagi. HD5 ichakdagi invaziv infektsiyani oldini oladigan va infektsiya paytida genital tizimda yuqori tartibga solinadigan muhim AMP ekanligi ko'rsatilgan [11,18,19,20,21]. HD5 kabi epiteliyadan olingan AMPlar siydik yo'llarida bepushtlikni saqlashda muhim ekanligi ko'rsatilgan [8,22,23,24]. Ushbu tug'ma shilliq qavat himoyalarining etishmasligi o'tkir va / yoki surunkali infektsiyaga olib kelishi mumkin [25,26].
Bizning real vaqt rejimidagi PCR natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, DEFA5 konstitutsiyaviy ravishda insonda ifodalanadi.buyraklar, siydik yo'llari va siydik pufagi. DEFA5 ifodasi siydik yo'llarining yuqori qismidan pastki siydik yo'llariga o'tadi - siydik oqimining oqimi va mikrobiotaning invaziya nuqtasiga yaqinlashishi bilan. Bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu inson buyragi va siydik pufagida DEFA5 ifodasini aniqlash bo'yicha birinchi tadqiqotdir. Yaqinda Townes va boshqalar oddiy distal ureter DEFA5 ni ifodalashi mumkinligini ko'rsatdi [14]. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, DEFA5 konstitutsiyaviy ravishda distal siydik yo'llari tomonidan ifodalanadi. Siydik chiqarish yo'llarida DEFA5 ifodasi oshqozon-ichak to'qimalariga qaraganda deyarli 100-baravar kam bo'lsa-da, DEFA5 ning bazal uroepitelial ifodasi katelisidin, hBD-1, hBD kabi ilgari tasvirlangan siydik yo'l kuchaytirgichlarining ifodasi bilan solishtirish mumkin. -2 va ribonukleaza 7[6,8,22,24,27].
DEFA5 salomatlik holatida ham, infektsiya/yallig'lanishda ham yuqori darajada namoyon bo'ladigan etuk oshqozon-ichak traktidan farqli o'laroq, bizning real vaqt rejimidagi PCR ma'lumotlarimiz DEFA5 ifodasini ko'rsatadi.buyrakinfektsiya bilan sezilarli darajada yuqori tartibga solinadi [27,28,29]. Ushbu induksiyali ifoda modeli ayol jinsiy tizimidagi DEFA5 ifodasiga o'xshaydi, bu erda DEFA5 ekspressiyasi salpingit bilan kuchayadi [30]. Siydik chiqarish yo'llarida, Taunes va boshqalar siydik yo'llarida siydik yo'lini yo'naltirish bilan og'rigan UTI bilan og'rigan bemorlarda DEFA5 ning siydik yo'llari orqali ko'payishi tendentsiyasini ko'rsatdilar [14]
Bizning immunoblot tahlilimiz HD5 peptid ishlab chiqarish pielonefrit bilan ortib borishini ko'rsatib, real vaqt rejimida PCR ma'lumotlarini to'ldiradi. HD5 ishlab chiqarishning bu induksiyali modeli beta-defensinlar oilasining ba'zi a'zolarida kuzatilganiga o'xshaydi.hBD2 siydik yo'llari infektsiyasi va/yoki surunkali pielonefrit [8,31,32] bilan ishlab chiqarishning induksiyali modelini ko'rsatadi. HD5peptid ishlab chiqarish yuqori ayol jinsiy yo'llarida va yallig'lanish bilan erkaklar siydik yo'lida ortishi ko'rsatilgan [11,30].
Immunitetni bo'yash yordamida biz HD5 siydik yo'llari va siydik pufagining uroteliysida bir xilda ishlab chiqarilishini ko'rsatamiz. UTIlarning aksariyati siydik pufagiga ko'tarilgan najas florasidan kelib chiqqanligi sababli, bu natijalar HD5 ekspressiyasi mikrobial ta'sir ko'proq uchraydigan joylarda mavjudligini ko'rsatadi [33]. Shu sababli, HD5 ko'tarilgan mikrobial infektsiyani oldini olish uchun ideal tarzda joylashtirilgan. Inbuyrak, HD5 asosan distal nefron va yig'uvchi tubulada ishlab chiqariladi. Ushbu topilmalar HD5 optimal mikroblarga qarshi faollikka ega bo'lgan joylarda ishlab chiqarilganligini ko'rsatadi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, defensinlarning antimikrobiyal xususiyatlari tuz konsentratsiyasiga bog'liq - yuqori tuz konsentratsiyasi mikroblarga qarshi faollikni kamaytiradi [23,34,35]. Biz distal nefron va yig'uvchi kanalchalarning past tuz konsentratsiyasi HD5 mikroblarga qarshi faollik uchun qulay muhitni ta'minlaydi deb taxmin qilamiz.
Immunoblot va Elishay tahlillari HD5 ning siydikda past darajada ajralib chiqishini ham ko'rsatadi. proHD5 va to'liq qayta ishlangan HD5 ning hajmi (8,1 kDa va 3,7 kDa) va musbat zaryadini hisobga olsak, ba'zi siydik HD5 peptidlari plazma filtratidan qisman bo'lishi mumkin. Shunga qaramay, HD5 ning plazmada saqlanib qolganligini ko'rsatadigan juda kam dalillar mavjud [27]. Bundan tashqari, siydikda paydo bo'lishi uchun HD5 proksimal tubuladagi samarali peptid so'rilish mexanizmlaridan qochishi kerak [6,36]. Nihoyat, tahlillar o'tkazilishidan oldin ishlatilgan siydik namunalari HD5 ning hujayra manbalarini olib tashlab, santrifüjdan o'tkazildi.
Aniqlangan konsentratsiyalarda siydikdagi HD5 uropatojenik mikroorganizmlarga to'g'ridan-to'g'ri antimikrobiyal ta'sir ko'rsatishi dargumon, chunki to'liq qayta ishlangan HD5 gram-manfiy uropatogenik bakteriyalarga nisbatan minimal inhibitiv kontsentratsiyaga (MIC) 6-10 mg / ml ga ega [15]. Shu bilan birga, shilliq qavatning sirt konsentratsiyasi yuqori bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, immunoblot tahlili shuni ko'rsatadiki, HD5 kontsentratsiyasi qonda sezilarli darajada yuqoribuyrak. Ushbu natijalar HD5 siydik yo'llarining shilliq qavatini himoya qilishda ishtirok etishini ko'rsatadi. Shunga o'xshash holat BD1 bilan kuzatiladi, bu erda hBD1 ning siydikdagi kontsentratsiyasi mikroblarga qarshi faollikni ko'rsatish uchun etarli emas, lekin buyrak kanalchalari yaqinida yuqori peptid konsentratsiyasi aniqlanadi [6,31].
Chunki IHC proHD5 HD5 ning asosiy shakli ekanligini ko'rsatadibuyrakva siydikda ham etuk, ham proHD5 aniqlanganligi sababli, biz HD5 birinchi navbatda prekursor molekulasini ajratib olishini va keyin oshqozon-ichak va genitouriya tizimiga o'xshash etuk shakllarni yaratish uchun proteolitik ishlovdan o'tishini taxmin qilamiz [11,30,37]. Ingichka ichakda Paneth xujayralari tripsin ishlab chiqaradi, bu HD5 propeptidini parchalaydi, shuning uchun to'liq qayta ishlangan peptid ichak lümeninde ustunlik qiladi [37]. Erkak siydik yo'lida HD5 uchun asosiy qayta ishlash va faollashtiruvchi fermentlar infektsiya joyiga jalb qilingan neytrofillar tomonidan qo'shilgan neytrofil proteazlardir [11]. INFEKTSION paytida siydik yo'llarida HD5 ni qayta ishlashga epitelial tripsinogen, siydik tripsin va / yoki neytrofil proteazalarning hissasi aniqlanishi kerak. Bundan tashqari, siydik muhitidagi o'zgarishlarning HD5 funktsiyasiga ta'siri (osmolyarlik, pH va katyonik kontsentratsiyalardagi o'zgarishlar) ham aniqlanishi kerak.
Xulosa qilib aytganda, bu siydik yo'llarida HD5 ning ifodalanishi va ishlab chiqarilishini aniqlash va miqdorini aniqlash bo'yicha birinchi tadqiqotdir. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, HD5 epiteliyadan kelib chiqqan AMP bo'lib, inson uroepiteli liumining tug'ma immunitetida muhim rol o'ynashi mumkin, bu invaziv patogenlarning qon aylanish tizimiga o'tishini oldini oladi. HD5 ishlab chiqarishni tartibga soluvchi omillarni aniqlash UTI xavfi bo'lgan bemorlarda va surunkali infektsiyalari bo'lgan bemorlarda UTI patogeneziga yangi tushuncha berishi mumkin.
Usullari
O'qishni tasdiqlash
Ushbu tadqiqotda qatnashgan barcha bemorlardan xabardor qilingan yozma rozilik olindi. 18 yoshdan kichik bo'lgan sub'ektlar uchun ota-ona / vasiyning yozma roziligi olingan. NationwideChildren's Hospital (NCH) Institutional Review Board ushbu tadqiqotni rozilik jarayoni va hujjatlar (IRB07-00383) bilan birga tasdiqladi.
Inson to'qimalari va siydik namunalari
Infektsiyalanmagan distal siydik pufagi va siydik pufagi to'qimalari (n= 4) takroriy infektsiyadan tashqari boshqa sabablarga ko'ra siydik yo'llari reimplantatsiyasidan o'tayotgan bolalardan olingan. Infektsiyalanmaganbuyraknamunalar (n=6) buyrak shishi uchun nefrektomiya qilingan bemorlardan olingan. To'qimalar namunalarida kasallik yoki yallig'lanishning makroskopik belgilari yo'q edi.BuyrakSurunkali pielonefrit bilan og'rigan bemorlarning to'qimalari Kooperativ HumanTissue Network (n=6) tomonidan taqdim etilgan [38]. Ikki mustaqil patolog pielonefritning gistopatologik tashxisini tasdiqladi. To'qimalarning namunalari muzlatilgan yoki neytral formalin bilan biriktirilgan kerosin bilan o'rnatilgan qismlar sifatida saqlanib qolgan. Infektsiyalanmagan buyrak to'qimalarining bo'limlari saqlashdan oldin korteks, medulla yoki buyrak tos suyagiga ajratilgan (n=4).
Yuqumli bo'lmagan va infektsiyalangan siydik namunalari NCH tez yordam bo'limiga yoki keyinefrologiya klinikasiga kelgan bolalardan olingan. UTI tashxisi Amerika Pediatriya Akademiyasi ko'rsatmalariga muvofiq siydikning ijobiy madaniyati bilan qo'yilgan [39]. Barcha infektsiyalangan siydik namunalarida .106 CFU/ml E.coli bor edi. Siydik pH qiymati 5,5 dan 8,5 gacha (o'rtacha siydik 6,9) o'zgardi. Siydikning ion tarkibi o'lchanmagan. Siydik cho'kmasini olib tashlash uchun siydik namunalari santrifüj qilindi va proteaz inhibitori kokteyli qo'shildi (Thermo Scientific, Rockford, IL, AQSh).
Ribonuklein kislota izolyatsiyasi va teskari transkripsiya
PromegaTotal RNK izolyatsiya tizimi (Promega, Madison, WI, AQSh) yordamida muzlatilgan to'qimalardan umumiy RNK ajratilgan. ForcDNK sintezi, jami 4-8 mg RNK yetkazib beruvchining protokoliga (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSh) muvofiq oligo-(dT)12-18primer yordamida Superscript III teskari transkriptaza bilan teskari transkripsiya qilindi.
Standart egri chiziqlar uchun genga xos plazmidlarni klonlash
DEFA5 va GAPDH ni kodlovchi cDNK ishlab chiqaruvchi ko‘rsatmalariga muvofiq 4-Topo plazmid vektoriga (Invitrogen) klonlandi. To'g'riligini tasdiqlash uchun plazmidlar ketma-ketlashtirildi
konstruksiyalar olindi. Genga xos plazmidlarning ketma-ket suyultirilishi miqdori aniqlandi (260 da spektrofotometrik absorbans va etidiy bromid bilan bo'yalgan agaroz jel elektroforezi orqali) va har bir reaksiya uchun standart egri chiziqlar hosil qilish uchun real vaqtda PCR da qo'llanildi.
Miqdoriy real vaqtda PCR
Miqdoriy real vaqtda PCR insondan olingan bir zanjirli cDNK yordamida amalga oshirildibuyrak7500 Real-Time PCR tizimi (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, AQSH) yordamida maxsus oligonükleotid primer juftlari bilan siydik pufagi va siydik pufagi to'qimalari. : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 va DEFA5 teskari astar 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
Qisqacha aytganda, 10 ng RNKga mos keladigan cDNK har bir primerdan 2.0 mM va 16 Light-Cycler-Fast Start DNK Master SYBR Green aralashmasidan iborat 25 ml reaksiyada namuna sifatida xizmat qildi. PCR shartlari: 95uC da 10 daqiqa davomida dastlabki denatürasyon, so'ngra har bir tsikl bilan 30 soniya davomida 94uC da denaturatsiya, 64uC da 30 soniya davomida tavlanish va 72uC da 30 soniya davomida uzaytirishdan iborat bo'lgan 40 tsikl. Tsikldan tsiklga floresan emissiyasi 530 nm da kuzatildi va 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems) yordamida tahlil qilindi. Har bir reaksiya to'plamiga genga xos plazmid standartlari kiritilgan. Ijobiy nazorat sifatida, terminal bilanum RNK har bir reaksiyalar to'plamiga kiritilgan va natijalar ilgari chop etilgan standartlar bilan taqqoslangan [27].
Belgilangan mahsulotning PCR kuchaytirilishini tasdiqlash uchun namunaviy namuna 1,5 foizli agaroz jelida elektroforez orqali tahlil qilindi. Mahsulotlar etidiy bromidini bo'yash yo'li bilan tasvirlangan va DNK o'lchami standartlari bilan tasdiqlangan mahsulot hajmiga (ko'rsatilmagan) solishtirilgan. Bundan tashqari, har bir reaksiya oxirida har bir PCR reaktsiyasining erish harorati profilining egri chizig'i aniqlandi.
HD5 antikorlari
HD5 propeptidi (AA20-94) va qisman qayta ishlangan shakllar (AA36-94 va 56-94) sotuvda mavjud bo'lgan sichqonchaning monoklonal (8C8) anti-HD5 antikori (Abcam) yordamida aniqlandi. HD5 propeptid va etuk peptid (AA63-94) ilgari tasvirlangan quyon poliklonal antiserum [13,40] yordamida aniqlangan.
Immunoblot
Bir xil bo'limlarbuyrakreal vaqt rejimida PCR miqdorini tahlil qilish uchun ishlatiladigan namunalar (3-6 mg nam og'irlik) suyuq azotda ohak va pestle yordamida maydalangan va proteaz inhibitörleri bilan RIPA buferida eritilgan. Siydik oqsillari ProteospinTM siydik oqsili konsentratsiyasi mikro to'plami (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada) yordamida siydik namunalaridan olingan. Buyrak va siydikdagi oqsil kontsentratsiyasi o'zgartirilgan Bradford tahlili yordamida aniqlandi va anOD280 nm ko'rsatkichi yordamida tasdiqlandi. Buyrak to'qimalarining yoki siydik oqsilining teng konsentratsiyasi 18 foiz natriy dodesil sulfat gradient jellariga yuklangan va elektroforezga duchor qilingan. Proteinning teng yuklanishini ta'minlash uchun kumush bo'yoq bajarildi.
Elektroforetik ajratishdan so'ng oqsillar nitroselüloz membranasiga o'tkazildi. TBSda 0.05% glutaraldegid bilan fiksatsiya qilingandan so'ng, membranalar 5% yog'siz sutda 30-60 daqiqa davomida bloklanadi va quyon poliklonal HD5 antiserumining 1:1000 suyultirilishida tun davomida inkubatsiya qilinadi. . Yuvib bo'lgandan so'ng, ikkilamchi antikor, 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, AQSH) nisbatida suyultirilgan quyonlarga qarshi turp peroksidazasi bilan konjugatsiyalangan quyonlarga qarshi IgG xona haroratida 1 soat davomida qo'llanildi. dan immunoblotlarbuyrakto'qimalar, shuningdek, anti-GAPDH antikori (Sigma Aldrich) bilan xona haroratida ikki soat davomida tekshirildi va keyin yuqorida tavsiflangan ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. Proteinlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq (BioExpress, Kaysville, UT, AQSh) ECL aniqlash tizimi va kimilyuminesans plyonkasi yordamida vizualizatsiya qilindi.
HD5 miqdori, hosil bo'lgan tarmoqli intensivligini rekombinant standart proHD5 oqsilining ketma-ket suyultirilishi bilan solishtirish orqali aniqlandi (Peptides International, Louisville, KY, AQSh).BuyrakHD5 kontsentratsiyasi ho'l to'qimalarning og'irligiga standartlashtirilgan. UrinaryHD 5 kontsentratsiyasi siydik suyultirilishini hisobga olish uchun standartlashtirilgan siydik HD{2}}kreatinin nisbatini (mg/mg) aniqlash uchun siydik kreatininiga bo'lingan. Siydikdagi kreatinin kontsentratsiyasi Oksford Biotibbiyot tadqiqotining kreatinin mikroplatasi tahlili (Rochester Hills, Michigan, AQSh) yordamida aniqlangan.
Immunogistokimyo
Deparafinizatsiya, regidratsiya va antigen olishdan so'ng biotin bloki va sarumsiz protein bloki amalga oshirildi (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, AQSh). Slaydlar monoklonal sichqoncha HD5(8C8) antikori (1:2{{10}}0; Abcam) yoki quyon poliklonal antiserum (1:500) bilan 4uC da tun davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra soxtalashtirilgan anti-polivalent biotinillangan antikor qo'shildi. Streptavidin/HRP (ScyTek Laboratories). Bo'limlar 0,02% vodorod periks bilan 0,1% diaminobenzidin tetraklorid yordamida ishlab chiqilgan va gematoksilin bilan bo'yalgan. Salbiy nazorat bo'limlari HD5 antikori o'rniga immun bo'lmagan sarum bilan inkubatsiya qilindi.
Immunofluoresans
HD5 ifodasini mahalliylashtirishga yordam berish uchun ikki yorliqli immunofloressensiya amalga oshirildibuyrak. Yig'ish kanali echki poliklonal anti-inson aquaporin-2 antikori bo'lgan asosiy hujayralar uchun ikki marta etiketlangan (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AQSH) [41]. Henle halqasi sichqonchaning poliklonal insonga qarshi uromodulin antikori (Sigma-Aldrich) va proksimal kanalchaga echki poliklonalatihuman aquaporin-1 (Santa Kruz) bilan ikki marta etiketlangan [41,42]. Rodaminli eshak poliklonal echkiga qarshi (Jekson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, AQSh), rodamin echkisiga qarshi sichqoncha (JacksonImmunoResearch Laboratories) va FITC eshak poliklonal anti-quyon (Santa Kruz) ikkilamchi antikorlar bo'lib xizmat qildi.
Barcha bo'limlar yuqorida aytib o'tilganidek tayyorlangan. Ular HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) ga qarshi sichqoncha antiserumlari aralashmasi bilan inkubatsiya qilindi. harorat 90 daqiqa. Ikkilamchi antikor xona haroratida 90 daqiqa davomida qo'llanildi va bo'limlar DAPI bilan o'rnatish vositasi yordamida o'rnatildi. Salbiy nazorat sifatida immun bo'lmagan sarum ishlatilgan. Slaydlar aLeica DM4000B mikroskopida tekshirildi va Spot RT kamerasi/dasturiy ta'minoti (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, AQSh) yordamida raqamli suratga olindi.
ELISA
Link Biotin Antikor Labeling Kit, Novus Biologicals) xona haroratida 2 soat davomida sichqoncha monoklonal antikor, streptavidin-ot turp peroksidaz (Biolegend, San-Diego CA, AQSh) 30 daqiqa davomida qo'shildi. TMB substrat eritmasi bilan 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng (Kem-En-Tec Diagnostics) reaktsiya STOP eritmasi (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, AQSh) bilan tugatildi va 450 nm to'lqin uzunligida o'qildi. Elishay tahlilidan olingan HD5 kontsentratsiyasi siydik kreatininga bo'linib, yuqorida tavsiflanganidek siydik suyultirilishini hisobga olish uchun standartlashtirilgan siydik HD{8}}kreatinin nisbatlarini (mg/mg) o'rnatdi.
Ma'lumotnomalar
1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Siydik chiqarish yo'llari infektsiyasi paytida ishlaydigan molekulyar himoya mexanizmlarining joriy tushunchalari. Evropa klinik tadqiqot jurnali 38 Suppl 2: 29-38.
2. Zasloff M (2007) Antimikrobiyal peptidlar, tug'ma immunitet va odatda steril siydik yo'llari. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.
3. Lehrer RI, Lixtenshteyn AK, Ganz T (1993) Defensinlar: sutemizuvchilar hujayralarining mikroblarga qarshi va sitotoksik peptidlari. Annu Rev Immunol 11: 105–128.
4. Valore EV, Ganz T (1992) etuk bo'lmagan inson miyeloid hujayralarida defensinlarni posttranslatsiyaviy qayta ishlash. Qon 79: 1538–1544.
5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Insonning beta-defensin-1 va alfa-defensinlari qo'shni genlar tomonidan kodlangan: turli xil disulfid topologiyasiga ega bo'lgan ikkita peptid oilasi umumiy nasl-nasabga ega. Genomika 43: 316–320.
6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., va boshqalar. (1998) Inson beta-defensin -1: urogenital to'qimalarning mikroblarga qarshi peptidi. J Clin Invest 101: 1633–1642.
7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M va boshqalar. (2011) Disulfid bog'lanishlarining qisqarishi inson beta-defensinning kuchli mikroblarga qarshi faolligini ochib beradi 1. Tabiat 469: 419–423.
8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U va boshqalar. (2002) Surunkali bakterial infektsiyali buyraklardagi inson beta-defensinlarining 1 va 2 ifodasi. BMC Infect Dis 2: 20.
9. Bevins CL (2006) Paneth hujayra defensinlari: tug'ma immunitetning asosiy effektor molekulalari. Biokimyoviy jamiyat tranzaksiyalari 34: 263–266.
10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Vang YM, Brabec C va boshqalar. (1998) Inson ayol jinsiy tizimida gen ifodasi, immunolokalizatsiya va inson defensin sekretsiyasi-5. Am J Pathol 152: 1247–1258.
11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O va boshqalar. (2005) Neisseria gonorrhoeae va Chlamydia trachomatis uretritidagi aniq defensin profillari yangi epitelial hujayra-neytrofil o'zaro ta'sirini ochib beradi. Immun 73 ni yuqtiring: 4823–4833.
12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D va boshqalar. (2003) Sichqonlar, sichqonlar va odamlarning erkak jinsiy tizimida antimikrobiyal defensinlarning ifodasi. Ko'payish biologiyasi 68: 95-104.
13. Porter EM, Poles MA, Li JS, Naitoh J, Bevins CL va boshqalar. (1998) Odam ichak defensinlarini yonbosh pufagi siydigidan ajratish. FEBS maktublari 434: 272–276.
14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Siydik chiqarishdan keyin bakteriuriyaga chidamlilik antimikrobiyal peptid faolligi bilan bog'liq. Urologiya 77: 509 e501-508.
15. Vang AP, Su YP, Vang S (2010) Klinik antibiotiklarga chidamli shtammlarga qarshi rekombinant inson alfa defensin 5 ning antobakterial faolligi va mexanizmi. Afr J Microbiol Res 4: 626-633.
16. Gropp R, Frye M, Vagner TO, Bargon J (1999) Epitelial defensinlar adenovirus infektsiyasini buzadi: adenovirus vositachiligidagi gen terapiyasi uchun ta'sir. Inson gen terapiyasi 10: 957-964.
17. Smit JG, Nemerow GR (2008) Inson alfa-defensinlari tomonidan adenovirusni zararsizlantirish mexanizmi. Hujayra xosti va mikrob 3: 11–19.
18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K va boshqalar. (2008) Inson alfa-defensinlari virionlarni to'plash va xost hujayralari bilan bog'lanishni blokirovka qilish orqali BK virusi infektsiyasini inhibe qiladi. Biologik kimyo jurnali 283: 31125–31132.
19. Chjan D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF va boshqalar. (2009) Pastki genital trakt infektsiyalarining mahalliy immunitetini o'rganish. Chjunxua fu chan ke za zhi 44: 13–15.
20. Quayle AJ (2002) Ayol jinsiy tizimidagi patogenlarga qarshi tug'ma va erta immunitet va epiteliya hujayralarining asosiy roli. Reproduktiv immunologiya jurnali 57: 61–79.
