Buyrakni tasvirlash: yorug'likdan o'ta aniq mikroskopgacha
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Mariya Lusiya Anjelotti1,2, Julia Antonelli1,2 Karolina Konte1,2va Paola Romagnani1,2
ANTRACT
Muhim yutuqlarbuyrakfiziologik va patofiziologik mexanizmlar asosan mikroskopiya texnologiyasining rivojlanishiga bog'liq bo'lishi mumkin. Arxitektura haqida biz bilgan ko'p narsabuyrakyorug'lik mikroskopidan foydalangan holda anatomik mikroskopistlarning fundamental tavsiflariga va keyinchalik elektron mikroskop tomonidan taqdim etilgan ultrastruktura tahliliga asoslangan. Bu ikki usul buyrak kasalliklarini birinchi tasniflash tizimlari va ularning doimiy yangilanishi uchun ishlatilgan. Yaqinda bir qator yangi tasvirlash texnikasi vaqt va makonning keyingi o'lchovlarida tahlilni qo'shdi. Konfokal mikroskopiya bizga Z o'qi bo'ylab optik qismlarni ketma-ket ko'rish imkonini berdi va maxsus tahlil dasturiy ta'minotining mavjudligi qalinroq to'qimalar namunalarini uch o'lchovli ko'rsatishni ta'minladi. Multifoton mikroskopiya bizga bir vaqtning o'zida tekshirish imkonini berdibuyrakreal vaqtda funksiya va tuzilish. Floresan-umr bo'yi tasvirlash mikroskopiyasi bizga metabolitlarning fazoviy tarqalishini o'rganishga imkon berdi. Super rezolyutsiyali mikroskop nano-miqyosdagi darajaga qadar sezgirlik va ruxsatni oshirdi. Krio-elektron mikroskop yordamida tadqiqotchilar to'qimalarda atom darajasidagi individual biomolekulalarni ko'rishlari va ularning hujayra osti darajasidagi o'zaro ta'sirini tushunishlari mumkin edi. Nihoyat, matritsa yordamida lazerli desorbsiya/ionlash tasvirlash mass-spektrometriyasi bir vaqtning o'zida yuzlab turli molekulalarni yuqori aniqlikda to'qimalar bo'limlarida o'lchash imkonini berdi. Ushbu sharh mavjud bo'lganlar haqida umumiy ma'lumot beradibuyrakeng so'nggi texnologik yaxshilanishlarning mumkin bo'lgan ta'siriga e'tibor qaratgan holda tasvirlash strategiyalari.
Kalit so‘zlar:immunohistokimyo,buyrakbiopsiya, podotsitlar,proksimaltubula, ildiz hujayralari
Buyrak kasalligi uchun Cistanche herba, namuna olish uchun shu yerni bosing
KIRISH
Thebuyrakuning turli fiziologik funktsiyalarini bajarish uchun ajoyib tizimli murakkablik talab qilinadi. Dastlab, o'rganishbuyrakmakroskopik kuzatishlar bilan cheklangan va ularning buyrak kasalliklari diagnostikasiga qo'shgan hissasi shubhasiz cheklangan edi. Klinik ko'rinishlar tasvirlangan, ammo asosiy patogenetik mexanizmlar noma'lum. Buyrak fiziologiyasi va patofiziologiyasini tushunishdagi yutuqlar asosan mikroskopiya sohasidagi davomiy taraqqiyot bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Urinishlarbuyraktasvirlash ancha oldin boshlangan [1]. 1666 yilda anatomist Malpigi tekshirdibuyrak25-30 quvvatga ega bo'lgan yorug'lik mikroskopidagi to'qimalar va birinchi marta glomerulusni "siydik qondan ajratilgan bez" deb ta'riflagan [2]. Bu hissa 1842 yilgacha ser Uilyam Bowman tomonidan 10 baravar kuchli yorug'lik mikroskopi yordamida nefron tuzilmalari ochilgunga qadar e'tiborga olinmadi. Bowman anatomik jihatdan tubulaning birinchi qismi bilan bog'langan periglomerulyar kapsulani (keyinchalik Bowman kapsulasi deb ataladi) kashf qildi [3]. 1862 yilda Jeykob Henle kortikal tubula va buyrak papillasini bog'laydigan, uning nomini olgan halqaga o'xshash tubula segmentini tasvirlab berdi.
Yorug'lik mikroskopining kiritilishi tufayli gistomorfologik tasnifibuyrakkasalliklarmumkin bo‘ldi [1]. Kasal buyraklarda nima sodir bo'lishini kuzatish imkoniyati patologik o'zgarishlar o'xshash klinik ko'rinishga ega bo'lgan bemorlarda sezilarli darajada farq qilishini tushunishga imkon berdi. Biroq, buyrak to'qimalaridagi patologik o'zgarishlar bo'yicha birinchi tadqiqotlar otopsiya namunalarida o'tkazildi, bu asosan surunkali kasalliklarning tavsifiga olib keldi. O'limdan keyingi to'qimalardan foydalanish bilan bog'liq bo'lgan buyrak patologiyalarining evolyutsiyasi va avtolitik hodisalarning texnik muammosi haqida ma'lumotlarning etishmasligi inson kasalliklari haqidagi bilimlarni cheklab qo'ydi. 1951 yilda joriy etilganbuyrakbiopsiya nafaqat surunkali, balki o'tkir buyrak kasalliklarini ham bevosita kuzatish va o'rganish imkonini berdi. Shu bilan birga, mikroskopiya asta-sekin o'sib bordi va nano o'lchovgacha bo'lgan sezgirlik va ruxsatni oshirdi. Ushbu sharhda biz eng so'nggi texnik ishlanmalardan kelib chiqadigan imkoniyatlarga e'tibor qaratgan holda mikroskopiya texnologiyasidagi yutuqlar tufayli amalga oshirilgan buyraklarning fundamental kashfiyotlari haqida umumiy ma'lumot beramiz.
Buyrak Immunopatologiyasini Vizualizatsiyalash
Immunobeling va floresan mikroskopiya
Tirik to'qimalarning vakillik fragmentini olish imkoniyati to'qimalarni maksimal darajada saqlashni talab qiladigan yangi paydo bo'lgan usullarni qo'llash imkonini berdi, masalan, immunohistokimyoviy usullar (avval lyuminestsent, keyin fermentativ). Darhaqiqat, 1950 yilda Coons antikorlarni flüoresan izosiyanat, ya'ni immunofloressensiya bilan belgilash usulini ishlab chiqdi, bu ularning to'qimalar antijenleri bilan maxsus reaksiyaga kirishish qobiliyatini yo'q qildi. O'shandan beri immunofluoressensiya muzlatilgan buyrak biopsiya namunalarini baholash uchun diagnostika protsedurasiga kiritilgan. Birinchi marta bu usullar glomerulonefrit bilan og'rigan bemorlarda intrarenal immunoglobulinlar (Igs) va komplement konlarini kuzatish imkonini berdi, bu esa to'qimalarning ma'lum noaniq lezyonlari asosida yotgan turli patofiziologiyalarni, masalan, yarim oy glomerulonefritida [4] kamsitishga yordam berdi. Bundan tashqari, xarakterli bo'yash naqshini va flüoreseinning immunoglobulin G (IgG) dan boshqa antikorlarga ulanishini kuzatish imkoniyati IgA nefropatiyasida immunoglobulin A (IgA) konlarini, shuningdek postinfeksion glomeritlarda komplement konlarini aniqlashga olib keldi. va membranoproliferativ glomerulonefrit [4].
Konfokal mikroskopiya
1980-yillarning oxirida konfokal mikroskopiyaning joriy etilishi bilan floresan mikroskopiya sezilarli darajada texnik takomillashtirildi. Konfokal mikroskopiyaning asosiy elementlari namuna ustida yo'naltirilgan va skanerlangan nuqtali yorug'lik va detektor oldidagi o'zgaruvchan konfokal diafragma (pin teshigi) bo'lib, bu fokus tekisligi atrofidagi (optik qism deb ataladi) faqat ingichka qismdan yorug'lik to'plash imkonini beradi. Konfokal mikroskopiya eksperimental modellarda buyrakni birinchi in vivo tadqiq qilish imkonini berdi va floresan molekulalarning buzilmagan tubulalar orqali o'zlashtirilishi va tashilishini kuzatish imkonini berdi.buyraklarmikropunksiyadan keyin. Bu fiziologik va patologik sharoitlarda quvur funktsiyasini o'rganishga imkon berdi [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, ko'rinadigan yorug'likning diffraktsiya chegarasi, fotooqartirish va fototoksiklik tufayli.
GLOMERULAR FILTRATSIYA TO'SIQINI TUSHUNISH: ELEKTRON MIKROSKOPİYASI
Yorug'lik va lyuminestsent mikroskoplarning aniqlik chegarasini engib o'tishga birinchi urinish 1931 yilda Ernst Ruska va Maks Knoll qo'zg'atuvchi manba sifatida yorug'lik nuri o'rniga tezlashtirilgan elektronlar nuridan foydalanadigan elektron mikroskopni (EM) ixtiro qilganlarida, va yorug'lik mikroskoplariga qaraganda yuqori ajratish kuchiga ega (0,2 nm gacha). Ushbu yangilik uchun 1986 yilda Ernst Ruska fizika bo'yicha Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi. Rezolyutsiyaning kuchayishi tufayli glomerulus shunchaki mexanik filtr emas, balki uchta qatlamdan tashkil topgan o'ta murakkab organ ekanligi ayon bo'ldi: endotelial hujayralar, glomerulyar bazal membrana (GBM) va podotsitlar [9]. Transmissiya EM (TEM) glomerulyar hujayralarni ichkaridan ko'rishga imkon berdi [10] va endotelial hujayralar yupqa fenestrlangan hujayra tanachalariga ega ekanligini, podotsitlarda esa katta hujayra tanachalari borligini va GBMga bog'langan va o'zaro bog'langan asosiy va ikkilamchi "oyoq" jarayonlari mavjudligini aniqladi. chiziqli birikmalar (engil diafragma) (1B-rasm). Bundan tashqari, EM (SEM) ni skanerlash, orqaga tarqalgan elektronlarni ushlash, ularning tashqi yuzasidan glomerulyar hujayralarni ko'rishga imkon berdi [10] va qo'shni podotsitlarning oyoq jarayonlari GBMni bir-biriga bog'lab qo'yganligini aniqladi (1C-rasm). EM nafaqat oddiy glomerulyar ultrastrukturani tushunish uchun, balki tushunish uchun ham kuchli vosita bo'lib qoldi.buyrakfiziologiya va patofiziologiya [11]. Inson namunalarida yoki eksperimental modellarda o'tkazilgan ko'plab tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, turli xil kasalliklar jarayonlari ultrastruktura o'zgarishlarining o'ziga xos naqshlari bilan bog'liq bo'lib, bu rivojlanayotgan tasniflash tizimini yanada yangilashni nazarda tutadi.buyrakkasalliklar. Buyrak ultrastrukturasining yanada murakkabligini tasavvur qilishning texnik qobiliyati nefropatologlarning ixtisoslashuvini tasdiqladi.
Yuqori sezgir detektorga asoslangan yaqinda o'tkazilgan SEM texnikasi diafragmaning eng chuqur qismini o'rganishga imkon berdi va u turli o'lchamdagi teshiklar bilan tavsiflanganligini aniqladi [12]. Sichqonlarda proteinuriyaning boshlanishi katta teshiklar bilan bog'liq bo'lib, diafragma diafragmasining ultrastrukturaviy o'zgarishlari glomerulyar permselektivlikdagi o'zgarishlarga sabab bo'lishi ehtimolini oshirdi [12]. Keyingi texnik taraqqiyot sifatida, blok-yuzli SEM sog'lom sichqonlarda, kasal sichqonlarda va kasal sichqonlarda eng nozik hujayrali jarayonlarning nanostrukturasini kuzatish uchun etarli bo'lgan aniqlik bilan glomerulyar filtratsiya to'sig'ining 2D ko'rinishidan 3D ko'rinishiga o'tishga ruxsat berdi.buyrakrivojlanishi [13, 14].
Nihoyat, EM ning rentgen mikrotahlil tizimiga (rentgen mikroskopiyasi) ulanishi hujayralar yoki hujayralar qismlarini ultrastruktura darajasida elementar tahlil qilish imkonini berdi. X-nurli mikroskopiya namunani qo'zg'atish uchun tor elektron nurli skanerlash TEMdan foydalanadi. Nurdan yuqori energiyali elektronlarning namunalardagi atomlarga ta'siri rentgen nurlari fotonlari shaklida energiya hosil qiladi. Energiya dispersli yarimo'tkazgich detektori bilan to'plangan ushbu rentgen signali namunada mavjud bo'lgan elementlarni aniqlash uchun ishlatiladi, eng yaxshisi 30 nm. Inbuyraksohasida rentgen mikrotahlili Bek va Thurau tomonidan transepitelial tubula ionlarining tashishini [15] va quvurli hujayralardagi hujayra ichidagi element kontsentratsiyasini [16] o'rganish uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan.
BUYRAK FIZIOLOGIYASINI MULTIFOTONLI MIKROSKOPIYA BILAN VIZALIZALASH
Multifotonli mikroskopiya (MPM) bu borada keyingi taraqqiyotni ta'minladibuyraktadqiqot, ya'ni real vaqt rejimida buyrak funktsiyasi va tuzilishi munosabatlarini bir vaqtning o'zida tekshirish imkoniyati [17]. An'anaviy yorug'lik mikroskoplaridan farqli o'laroq, ikki fotonli qo'zg'alish klassik bir fotonli qo'zg'alishda ftorforni qo'zg'atish uchun zarur bo'lgan qo'zg'alish to'lqin uzunligi ikki baravar katta bo'lgan ikkita fotonning bir vaqtning o'zida yutilishiga bog'liq (1D-rasm). Savdoda mavjud bo'lgan impulsli infraqizil, past energiyali qo'zg'atuvchi lazerlardan foydalanish chuqur to'qimalarga kirib borishini oshirdi va fototoksiklikni minimallashtirdi (1D-rasm). Bu tadqiqotchilarga tirik hayvonlardagi dinamik hujayra jarayonlarini to'g'ridan-to'g'ri tasavvur qilish imkonini berdi, bu xususiyat ilgari hech qanday boshqa texnikada erishilmagan. MPM buyrakning asosiy funktsiyalarini va glomerulyar o'tkazuvchanlik, qon tomirlari qon oqimi, bitta nefronli glomerulyar filtratsiya tezligi va quvurli oqim kabi patologik o'zgarishlarni aniqlashga imkon beradi [17] (1E va F-rasm). Bundan tashqari, MPM shikastlanishga javoban hujayra ichidagi jarayonlarni o'rganishga imkon beradi, shu jumladan hujayra o'limi va to'kilishi, leykotsitlarning siljishi, GBMning ishga tushishi va buzilishi [17]. Keyingi texnik yaxshilanishlar bir necha kundan bir necha haftagacha uzoq vaqt davomida intravital tasvirni olish imkonini berdi [18], bu flüoresan oqsillarni ifodalovchi transgen sichqonlar bilan birgalikda sog'lom va shikastlangan buyraklardagi yagona hujayralar taqdirini to'g'ridan-to'g'ri in vivo kuzatish uchun ishlatilgan [19] va buyrak hujayralari almashinuvi va regeneratsiyasi mexanizmlarini yaxshiroq tushunish.
Jarohatdan keyin quvurli hujayralarning redoks holatini o'rganish uchun nikotinamid adenin dinukleotid gidratining (NADH) tabiiy avtoflüoresansidan foydalangan holda MPM bilan yorliqsiz tasvirlash usullari ham mumkin edi [20]. Bundan tashqari, fibrillyar kollagendan ikkinchi garmonik avlod buyrak fibrozining belgisi bo'lgan kollagen yotqizish miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan [21]. Ikkinchi garmonik avlod - bu chiziqli bo'lmagan optik jarayon bo'lib, unda bir xil to'lqin uzunligiga ega ikkita qo'zg'atuvchi foton biologik to'qimalarda, masalan, kollagen yoki mikronaychalar kabi markazlashtirilgan bo'lmagan tuzilmalar bilan o'zaro ta'sir qiladi va to'lqin uzunligining yarmiga teng bo'lgan yangi foton hosil qiladi.
Intravital mikroskopiyaning yaqinda innovatsiyasi tirik anesteziya qilingan sichqonlarda buyraklarni tasvirlash uchun muvaffaqiyatli ishlatiladigan miniatyuralashtirilgan multifoton endoskopning joriy etilishi edi [22]. Ushbu minimal invaziv MPM to'qimalarni olib tashlamasdan va juda qisqa vaqt ichida real vaqtda in vivo diagnostika uchun yo'l ochishi mumkin.
3D DA BUYRAK: TO‘QINALARNI TOZLASH TEXNIKALARI VA KEYANISH MIKROSKOPIKASI
Texnologik yaxshilanishlarga qaramay, chuqurroq hajmli tasvirlashning asosiy chegaralaridan biri buyrak to'qimalarining shaffofligi bo'lib, bubuyrakoptik jihatdan eng qiyin organlardan biri. Shuning uchun to'qimalarni tozalash usullari katta qiziqish uyg'otdi [23]. Ushbu yondashuvlarning maqsadi shaffof bo'lmagan to'qimalarni shaffofga aylantirish, oqsillarni va oxir-oqibat floresan markerlarni saqlab qolish, qalin to'qimalar bo'laklarini tasvirlashdir. Optik tozalashning zamonaviy mikroskop bilan kombinatsiyasi qalin to'qimalarda yoki hatto buzilmagan buyrakda glomerulyar hajm va sonni aniqlash kabi morfometrik tahlil qilish imkoniyatini beradi [24]. Boshqa ilovalar orasida tubulaning alohida segmentlari [25], ularning funktsiyalari [26] va podotsitlar yo'qolishining miqdorini aniqlash [27] tahlili kiradi.
Katta hajmdagi to'qimalarni tasvirlash va shu bilan birga nozik struktura detallarini hal qilish uchun yaqinda yangi texnik yondashuv, ya'ni kengayish mikroskopiyasi (ExM) joriy etildi. Maqsad, umumiy arxitektura va 3D proteom tarkibini saqlab qolgan holda, butun organni 4- jismonan 5-kattalash uchun kengaytirishdir. Namuna ichida to'g'ridan-to'g'ri sintez qilingan kengaytiruvchi polimer yordamida yorug'likning difraksiya chegarasidan yaqinroq bo'lgan molekulalar kosmosda ko'proq masofalarga izotropik ravishda ajratiladi va shuning uchun hatto an'anaviy lyuminestsent mikroskop yordamida ham optik jihatdan hal qilinishi mumkin. Bundan tashqari, ExM kattaroq optik shaffoflikni ta'minlaydi va yorug'lik tarqalishini kamaytiradi, bu esa katta hajmdagi to'qimalarni tasavvur qilish imkonini beradi. Ushbu yondashuvdan foydalanib, diafragma va GBMdagi bir nechta oqsillarning lokalizatsiyasini oddiy konfokal mikroskop bilan ham ajratish mumkin [28]. Masalan, u proteinurik sichqonlarda 2D va 3D ko'rinishda, ilgari hech qachon erishilmagan nanometr aniqlikda oyoq jarayonining o'chirilishini aniqlashi mumkin [29]. Yaqinda ExM gematoksilin va eozin bilan bo'yalgan kerosin bilan o'rnatilgan namunalarni klinik gistopatologik mantiqiy baholash uchun ishlatilgan [30]. Ushbu usul ilgari faqat EM bilan mumkin bo'lgan nano o'lchov darajasida oyoq jarayonini tozalashni ko'rishi mumkin. Hajmli tasvirlash sohasidagi yutuqlar butun organni yuqori aniqlikdagi 3D tahliliga imkon beradi, shuning uchun chuqur tasvirlash uchun asosiy cheklov endi antikorlarning to'qimalarga kirib borish qobiliyati bilan ifodalanadi.
METABOLIK PROFILNI O'RGANISH: Chastota-domenli floresans-hayot bo'yi tasvirlash mikroskopiyasi
Thebuyrakmitoxondriyalarning yuqori miqdori bo'lgan metabolik organdir. NADH va boshqa metabolitlarning qisqartirilgan shakli tabiiy ravishda lyuminestsentdir va bu avtofluoresans redoks holatining indeksi sifatida ishlatilishi mumkin [20]. Biroq, bu endogen floroforlarning emissiya spektrlari bir-biriga mos keladi va ularni alohida aniqlash mumkin emas edi. Ammo flüoresansning ishlash muddati (ya'ni, flüoresansning vaqti-vaqti bilan parchalanishi) sezilarli darajada farq qilishi aniqlandi. Shunday qilib, floresan umrbod ko'rish mikroskopiyasi (FLIM) metabolik profillarni o'rganish imkonini beradi [31]. Yaqinda MPM va FLIM kombinatsiyasidan foydalanib, hujayraga xos metabolik belgilarni tavsiflash va metabolik o'zgarishlarni in vivo jonli kuzatish mumkin bo'ldi.buyrakkasallik [32]. FLIM qo'shimcha ma'lumotlarni taqdim etishi kutilmoqdabuyraksog'liq va kasalliklarda in vivo metabolizm.
HAQIDA CHEKORLARDAN ORQALIK TASHRISH: BUYRAQNI SUPER-ROLyutsiyali tasvirlash
Standart yorug'lik mikroskopi 200 nm dan ortiq optik ruxsat chegarasiga duch keladi. Yuqori aniqlikdagi tasvirlash deb ataladigan yangi texnologiyalar endi flüoresan mikroskopiyani nanoskopiya davrining boshlang'ich nuqtasi sifatida diffraktsiya chegarasidan tashqarida tasvirlashga imkon beradi [33]. Ushbu yondashuvlar nanoskopik piksellar sonini ko'p rangli floresan yorliqlashning afzalliklari bilan birlashtiradi. Ushbu innovatsiyalarning potentsial ta'sirini e'tirof etgan holda, 2014 yilgi kimyo bo'yicha Nobel mukofoti Erik Betsig, Stefan Hell va Uilyam Moernerga "o'ta aniqlangan floresan mikroskopiyani ishlab chiqish uchun" berildi. Turli xil biologik savollarni hal qilish uchun yuqori aniqlikdagi tasvirlashning turli strategiyalari qo'llanilishi mumkin. Ushbu yondashuvlarni ikkita asosiy toifaga bo'lish mumkin, ular o'ta aniqlik yagona molekulalar darajasida yoki ansambllarda ishlatilishiga bog'liq [33].
Ansamblga asoslangan texnikalar
Ansamblga asoslangan usullar qo'zg'atuvchi yorug'lik nurini vaqtinchalik va fazoviy modulyatsiya qilish orqali diffraktsiya chegarasini buzadi. Ular orasida o'ta aniqlikdagi stimulyatsiyalangan emissiyani yo'qotish (STED) tasviri ikkita lazerdan, qo'zg'atuvchi lazerdan va bir-biriga o'rnatilgan, qizil rangga siljishli, pastadirli lazerdan (STED lazer) foydalanadi, ular tashqarida joylashgan floroforlardan flüoresans emissiyasini bostirish uchun. qo'zg'alish markazi. Ushbu bostirish stimulyatsiya qilingan emissiya orqali amalga oshiriladi va faqat o'lchami diffraktsiya chegarasidan past bo'lgan fokusli nuqtadan kelib chiqadigan signalni yig'ishga imkon beradi (2A-rasm). Yoriq diafragmani optik tozalangan holda tasvirlash uchun STED tasviri ishlatilganbuyrakto'qimalarda (2B-c'-rasm) va podotsin va nefrinning fazoviy taqsimotini nanometr shkalasida kamida 30 lm chuqurlikda lokalizatsiya qilishga imkon berdi [34]. Bundan tashqari, eksperimental modelda oyoq jarayonining o'chirilishini kuzatish va miqdorini aniqlash imkoniyati STED tasvirini glomerulyar filtratsiya to'sig'ini o'rganish uchun foydali qilishi mumkin [34].
STED mikroskopiyasi namunani tayyorlash, maxsus floroforlar va texnik tayyorgarlik uchun maxsus protokollarni talab qiladi. Shu sababli, so'nggi bir necha yil ichida diffraktsiya chegarasini lateral va eksenel ravishda ikki barobarga oshirishi mumkin bo'lgan boshqa o'ta aniqlik texnikasiga, tizimli yoritish mikroskopiga (SIM) ko'proq e'tibor berildi. SIM yuqori chastotali ma'lumotlarni (namunadagi nozik tafsilotlarga mos keladigan) pastroq fazoviy chastotalarda olish imkonini beruvchi nozik chiziqli yoritish naqshiga ega keng maydonli mikroskopdan foydalanadi. Turli fazalar va yo'nalishlarning yorug'lik naqshlari bilan bir nechta tasvirlarni olish orqali yuqori aniqlikdagi tasvirni qayta tiklash mumkin (3A-rasm). SIM standart floroforlar bilan mos keladi, maxsus namuna tayyorlashni talab qilmaydi va 3D vizualizatsiyaga ruxsat beradi. Ushbu barcha afzalliklarni hisobga olgan holda, SIM-dan tezkor diagnostika vositasi sifatida foydalanish imkoniyatini baholash uchun turli xil tadqiqotlar o'tkazildi [35], masalan, EMga qaraganda qisqaroq ishlash muddati bilan. Yaqinda 3D SIM va avtomatlashtirilgan tasvirni qayta ishlash minimal o'zgarish kasalligi bo'lgan bemorlarning biopsiyalaridan muntazam kerosin bo'laklari yordamida oyoq jarayonini tozalashning tezkor diagnostika vositasi sifatida ishlatilgan [36] (3B va C-rasm). Nano o'lchamdagi patologiyani ko'rsatadigan kasalliklardagi o'zgarishlarni muvaffaqiyatli aniqlash qobiliyati SIM-ni muntazam diagnostika uchun istiqbolli vosita sifatida tasdiqladi.
Yagona molekulali lokalizatsiyaga asoslangan tasvirlash usullari
Ushbu usullar hal qilish uchun juda yaqin bo'lgan individual floresan molekulalarni tsiklik ravishda yoqish va o'chirish imkoniyatiga tayanadi. Ushbu yondashuvlarda diffraktsiya bilan cheklangan hududdagi molekulalar turli vaqt nuqtalarida faollashtirilishi mumkin, shunda ular alohida-alohida tasvirga olinishi va keyinchalik markazlarini hisoblash yo'li bilan topib, nanometr aniqligi bilan lokalizatsiya qilinishi mumkin (3D-rasm). Ushbu yondashuvlar orasida birinchi bo'lib stoxastik optik rekonstruksiya mikroskopiyasi (STORM) kiritilganbuyrak2013 yilda GBM ning nanometr aniqligidagi murakkab molekulyar tashkilotini, jumladan molekulalarning yo'nalishini ochib bergan tadqiqot bilan [37]. Noyob konjenital nefrotik sindromning sichqoncha modelida STORM vena ichiga yuborishdan keyin laminin 521 ning GBM ichidagi integratsiyasi va to'g'ri yo'nalishini aniqladi, bu bemorlar uchun ilg'or terapevtik variantlarga yo'l ochdi [38]. Boshqa bir tadqiqot molekulyar miqyosdagi rezolyutsiyada podotsitlarda aktin sitoskeletonining tashkil etilishini tasvirlab berdi [39] (3E-I-rasm). Yangi topilma sifatida podotsitlarda oyoq jarayonlarida kontraktil bo'lmagan aktin to'plamlari bilan bog'langan kontraktil aktin to'plamlari mavjud. Podositlarning shikastlanish modellarida oyoqdagi aktin strukturasi demontaj qilinadi, bu esa asosiy tanadagi kontraktil strukturaning qulashiga olib keladi [39].
ATOM DARAJASIDAGI FUNDAMENTAL BIOMOLEKULALARNING 3D TUZILMALARINI VISUALIZALASH: CRIO-ELEKTRON MIKROSKOPİYASI
Yaqin vaqtgacha fundamental biomolekulalarning tuzilishini oʻrganish imkoniyati bir necha nanometrli elektron mikroskopiya bilan chegaralangan edi. Kuchli elektron nurlari bilan namunaning shikastlanishi, past tasvir kontrasti va elektronlar bilan o'zaro ta'sirdan keyin molekula harakati yoki EM kamerasi ichida qo'llaniladigan vakuumda biologik namunalardagi suvni saqlashdagi qiyinchiliklar kabi texnik to'siqlar, bu o'lchamdan past bo'lgan molekulalarni hal qilishni imkonsiz qiladi. . Namunani sovutish suvning bug'lanishini va elektrondan kelib chiqadigan zararni kamaytirishi mumkin [40]. Ushbu g'oyadan kelib chiqqan holda, kriyo-EM 1950-yillarda joriy etilgan. Bir necha yil oldin, yangi bitta elektronli hisoblash detektorining joriy etilishi nihoyat piksellar sonini oldingi chegaralardan tashqariga chiqardi. 2017 yilda kimyo bo'yicha Nobel mukofoti Jak Duboche, Yoaxim Frank va Richard Xendersonga "eritmadagi biomolekulalarning yuqori aniqlikdagi tuzilishini aniqlash uchun krioelektron mikroskopiyani ishlab chiqish" uchun berildi. Endi bu yutuqlar eritmadagi biomolekulalarni strukturaviy aniqlash imkonini beradi [41].
Inbuyraktadqiqotlar natijasida fundamental oqsillarning tuzilishi atom darajasida aniqlangan [42, 43]. Ular orasida mutatsiyalari avtosomal dominant polikistik uchun javobgar bo'lgan odam polikistini-2 tuzilishi.buyrakkasallik [44] va mutatsiyalar odamlarda FSGS sabab [43] vaqtinchalik retseptorlari salohiyati kanonik 6 ion kanallari tuzilishi, bir necha angstrom [44] qarori bilan aniqlangan.
BUYRAK KASALLIKLARINING MOLEKULAR ASOSLARINI TUSHUNISH: INTEGRATIV BUYRAK MIKROSKOPISI.
So'nggi bir necha yil ichida to'qimalardagi molekulalarning umumiy spektrini aniq va bir vaqtning o'zida xaritalash imkonini beradigan yorliqsiz yondashuvlarga qiziqish ortdi [45]. Ular orasida matritsali lazerli desorbsiya/ionlashtiruvchi tasvirli mass-spektrometriya (MALDI-IMS) bir vaqtning o'zida yuzlab turli molekulalarni to'g'ridan-to'g'ri to'qimalar bo'limlarida yuqori aniqlikda o'lchash imkonini beradi. MALDI-IMS tajribasida muzlatilgan yoki kerosin bilan o'rnatilgan yupqa to'qima bo'lagi lazer energiyasini o'zlashtiradigan va to'qimalarni tahlil qiluvchi moddalarning ionlanishiga yordam beradigan matritsa bilan qoplangan. Mass-spektrometrdagi tahlil har bir x/y koordinatasi uchun spektr hosil qiladi. MALDI o'lchovidan so'ng, molekulyar naqshni gistologik tafsilotlar bilan birlashtirish uchun an'anaviy gistokimyoviy va immunohistokimyoviy protseduralar bilan bir xil to'qimalar bo'limi bo'yalgan bo'lishi mumkin. Buyrak tadqiqotlarida MALDI-IMS normal va kasal to'qimalarda dorilar, metabolitlar, lipidlar, peptidlar va oqsillarni o'rganish uchun ishlatiladi [45].
MALDI-IMSning eng keng tarqalgan qo'llanilishidan biri bu buyrak hujayrali karsinomani tasniflash uchun molekulyar markerlarni aniqlash [46] va molekulyar va gistologik darajada saraton va normal to'qimalar o'rtasidagi haqiqiy chegarani aniqlashdir [47]. MALDI-IMS shuningdek, toksik moddalarni erta aniqlashni ta'minlash uchun buyraklar uchun dori toksikligini o'rganish uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan.buyrakfarmatsevtika nomzodlari vositachiligidagi zarar mexanizmlari [48]. Bundan tashqari, MALDI-IMS lipidlarni va ularning diabetik nefropatiya [49], o'tkir buyrak shikastlanishi [50] va polikistik kabi buyrak patologiyalaridagi rolini o'rganish uchun ishlatiladi.buyrakkasallik [51], shuningdek, kasallik bilan bog'liq mexanizmlarni chuqurroq tushunish uchun endogen metabolik profillarni ochib beradi [52]. Yangi potentsial diagnostik va prognostik biomarkerlar bo'lishi mumkin bo'lgan mumkin bo'lgan biomarkerlar uchun molekulyar profillarni aniqlash yakunlandi [53, 54].
XULOSALAR VA KELAJAK PERSPEKTİVALARI
Tasvirlash texnikasining doimiy takomillashtirilishi ko'plab muhim texnik to'siqlarni bosqichma-bosqich hal qildibuyraktadqiqot va normal va kasal buyraklar tuzilishi va funktsiyasini dinamik tasvirlash imkonini berdi. Haqiqatan ham, yangi mikroskopiya texnologiyalarining paydo bo'lishi fundamental ilmiy kashfiyotlar qilish imkonini berdi va keyinchalik buyrak fiziologiyasi va patofiziologiyasiga bo'lgan nuqtai nazarimizni o'zgartirdi, ularni endi 3D formatida ko'rish va hatto videolarda suratga olish mumkin, bu erda vaqt to'rtinchi o'lchovni ifodalaydi. Yaqinda o'ta aniqlikdagi mikroskopiyaning texnologik innovatsiyasi va molekulyar tasvirlash texnikasining rivojlanishi bilan tadqiqotchilar endi to'qimalarda individual bio-molekulalarni ko'rishlari va ularning hujayra va hujayra darajasida qanday o'zaro ta'sirini aniqlashlari mumkin.
Ushbu vositalarni patologik qo'llash imkoniyatibuyrakKlinik biopsiyalarda molekulyar va hujayra osti tafsilotlariga e'tibor qaratadigan namunalar kasallikning qayta tasniflanishiga yordam berishi kerak. Agar va qachon bu buyrak kasalligi tashxisiga yoki hatto bemorni boshqarishga ta'sir qiladi, hozircha noaniq.
MOLIYALASH
Moliyalashtirish Yevropa Ittifoqining “Horizon 2020” tadqiqot va innovatsiyalar dasturi (648274-sonli grant shartnomasi) doirasida Yevropa tadqiqot kengashi tomonidan taqdim etildi.
ADABIYOTLAR
1. Weening JJ, Jennette JC. Buyrak patologiyasining tarixiy bosqichlari. Virchows arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Boloniya 1666
3. Bowman V. Malpigiy jismlarining tuzilishi va ishlatilishi haqidabuyrak, bu bez orqali qon aylanishi bo'yicha kuzatuvlar bilan. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. Nefrologiyada buyrak patologiyasining ko'tarilishi: struktura funktsiyani yoritadi. Men JBuyrak2013 yil; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Kristensen EI. In vivo konfokal lazerli skanerlash mikroskopi va buzilmagan kalamushlarda mikropunktura. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25
6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 blokadasi ichki podotsit-progenitor qayta aloqa mexanizmiga yo'naltirilgan holda kortikal nefronlarda yo'qolgan podotsitlarni afzal ko'radi.BuyrakInt 2018; 94:1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A va boshqalar. Endotsikl bilan bog'liq quvurli hujayralar gipertrofiyasi va progenitor proliferatsiyasi o'tkir buyrak funktsiyasidan keyin tiklanadi.buyrakjarohat. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Glomerulosklerozda uchraydigan strukturaviy naqshlarga oid yangi tushunchalar. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funktsional anatomiyabuyrak. Hosp Pract 1978; 13
10. Liapis H. Elektron mikroskopiyabuyraktadqiqot: ko'rish - bu ishonish. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. Strong ML, Evers P. Buyrak tashxisidagi uchinchi o'lchov. Oddiy va anormal buyraklarning skanerlash elektron mikroskopiyasi. S Afr Med J 1979; 55:174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A va boshqalar. Glomerulyar epiteliya filtratsiyasining g'ovakli ultrastrukturasini tasvirlash. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K va boshqalar. Vinkulin glomerulyar to'siqning yaxlitligini saqlash uchun talab qilinadi.BuyrakInt 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y va boshqalar. Podositlar rivojlanishining morfologik jarayoni blok-yuzli elektron mikroskop yordamida aniqlangan. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rik R, Dorge A, Bek FX va boshqalar. Transepitelial ion tashishning elektron-zondli rentgen nurlari mikrotahlili. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J va boshqalar. Buyrak naycha hujayralarida hujayra ichidagi elementar kontsentratsiyalar. Elektron mikroprob tahlili. Klin Vochenschr 1979;57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Vizualizatsiya qilish uchun in vivo romanbuyrakanatomiya va funktsiya. Buyrak Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E va boshqalar. Uzoq to'lqinli multifoton qo'zg'alish intravital uchun foydalidirbuyraktasvirlash.BuyrakInt 2016; 89: 712–719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K va boshqalar. Floresan nasl teglari bo'lgan sichqonchaning yangi modellarida ketma-ket multifotonli tasvirlash yordamida glomerulyar epiteliya hujayralarining taqdirini in vivo jonli kuzatish. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N va boshqalar. Multifotonli tasvirlar nefron segmentlari orasidagi mitoxondrial funktsiyadagi farqlarni ochib beradi. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302