Homiladorlik davrida kam protein iste'mol qilishning embrion buyrak mikroRNK ifodasiga va erkak homilaning nefron progenitor hujayralariga ta'siri
Mar 08, 2022
Kirish
Oziq moddalarning etishmasligi homila rivojlanishining turli bosqichlarida asosiy yo'llarning signalizatsiya o'zgarishiga olib kelishi mumkin, bu esa balog'at yoshida qaytarib bo'lmaydigan organlar va tizimlarning buzilishiga olib kelishi mumkin [1]. Xomilalik dasturlash organizmning tuzilishi yoki funktsiyasiga uzoq muddatli ta'sir ko'rsatadigan rivojlanish davridagi har qanday haqoratni anglatadi [2]. Homila dasturlashidagi buzilishlar kam vaznga, nefronlarning kamayishiga va yurak-qon tomir va yurak-qon tomir kasalliklari xavfini oshiradi.buyrakkattalardagi buzilishlar [3-6]. Boshqa mualliflar va biz tomonidan olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, tug'ilishning og'irligi past, nefronlar 28 foizga kam,buyraktuzning chiqarilishi, surunkalibuyrak etishmovchiligi, va balog'at yoshidagi standart (NP) protein iste'mol qiladigan avlodlar bilan solishtirganda, homiladorlik davrida past proteinli (LP) iste'mol qilishda arterial gipertenziya [3-7]. Nefrogenez gen ekspresyonini, oqsil sintezini va to'qimalarni qayta qurishni qattiq nazorat qilishni o'z ichiga oladi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, nefron soni siydikchil kurtaklari (UB) va metanefros mezenximasi (MM) progenitor hujayralari o'rtasidagi o'zaro ta'sir bilan belgilanadi [8-10]. MM dan kelgan signallar UB tomonidan qo'zg'atilgan o'sishni va tubula tizimining dallanishini keltirib chiqaradi. O'z navbatida, mezenxima qopqog'ini (CM) tashkil etuvchi MM proliferatsiyasi va differentsiatsiyasi UB uchlari orqali amalga oshiriladi [11].
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK KASALLIKLARINI SOZLADI
Prenatal stressning homila rivojlanishiga uzoq muddatli ta'siriga oid epigenetik o'zgarishlarning roliga jiddiy qiziqish mavjud [12]. MikroRNKlar (miRNKlar) genom bilan kodlangan, uzunligi taxminan 22 nukleotid bo'lgan kichik kodlanmagan RNKlar bo'lib, maqsadli gen ifodasini transkripsiyadan keyingi tartibga solishda muhim rol o'ynaydi [13-16]. miRNKlar mRNK tarjimasini yoki sitoplazmadagi barqarorlikni tartibga solish orqali transkripsiyadan keyingi gen ekspressiyasini boshqaradi [17, 18]. Funktsional tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, miRNKlar rivojlanish jarayonida va hujayra fiziologiyasida muhim biologik jarayonlarda ishtirok etadilar [13, 16]. Ularning ifodalanishidagi o'zgarishlar bir qancha patologiyalarda kuzatilgan [16, 19]. Shunday qilib, miRNKlarning xarakteristikasi genlarning regulyatsiyasi va hujayra proliferatsiyasi, differentsiatsiyasi va apoptozini tushunishga yordam berdi va patofiziologik kasalliklarni, shu jumladanbuyrakbuzilishlar [20-22]. Bu haqda tadqiqotlar shuni ko'rsatdibuyrakontogenez miRNKlar nefron rivojlanishi uchun ajralmas hisoblanadi [23-26]. Bundan tashqari, MM progenitor hujayralarida ba'zi miR NA'larning kam ifodalanishi hujayra proliferatsiyasini kamaytiradi, natijada erta farqlanadi va natijada nefronlar soni kamayadi [27, 28]. Bu hodisa apoptozning kuchayishi va progenitor hujayralardagi yuqori Bim ifodasi bilan tavsiflanadi [27]. Shunday qilib, miRNKlar apoptoz va ushbu metanefrik birlamchi hujayralarning proliferatsiyasi o'rtasidagi muvozanatni modulyatsiya qiladi [29].
Biz noma'lum epigenetik o'zgarishlar va miRNKni ifodalash profili bilan bog'liq deb taxmin qildikbuyrakonaning oqsili cheklangan nasllarda rivojlanish buzilishlari. Shunday qilib, biz miRNK naqshlarini va homilada prognoz qilingan gen ekspressiyasini baholashni maqsad qildikbuyrak17 kunlik homiladorlik davrida (17-DG) protein bilan cheklangan erkak naslning molekulyar yo'llari va buzilishlarini aniqlash uchun.buyrakdavomida hujayra proliferatsiyasi va differentsiatsiyasibuyrakrivojlanish.
Kalit so‘zlar:buyrak etishmovchiligi; buyrak naychalari; buyrak kasalliklari; buyrak rivojlanishi; buyrak
Material va metodologiya
Hayvonlar va parhezlarTajribalar avvalroq [5, 6] batafsil tavsiflanganidek, CEMIB/UNICAMP tomonidan yetkazib berilgan naslchilikdan kelib chiqqan aka-uka Wistar HanUnib kalamushlarining (250–300 g) yoshiga mos urgʻochi va erkak kalamushlarida oʻtkazildi. , Campinas, SP, Braziliya. Eksperimental jarayon davomida atrof-muhit va uy-joy ularning salomatligi va farovonligini boshqarish uchun qulay shart-sharoitlarni taqdim etdi. Hayvonlar uch haftalik sutdan ajratilgandan so'ng darhol nazorat ostida harorat (25˚C) va yorug'lik sharoitida (07:00–19:00) musluk suvi va standart laboratoriya kemiruvchi chov (Purina Nuvital) bilan bepul foydalanish imkoniyatiga ega bo'ldilar. , Curitiba, PR, Braziliya: Na plyus tarkibi: 135 ± 3 mkEq/g; K plyus tarkibi: 293 ± 5 mkEq/g), nasl berishdan oldin 12 hafta davomida. San-Paulu shtat universiteti (#446-CEUA/UNESP) qoshidagi Hayvonlardan foydalanish boʻyicha institutsional etika qoʻmitasi eksperimental protokolni tasdiqladi va butun tergov davomida Braziliya hayvonlar tajribasi kolleji tomonidan oʻrnatilgan umumiy koʻrsatmalarga amal qilindi. Bu homiladorlikning 1-kuni vaginal smearda spermatozoidlarni ko'rsatadigan kun sifatida belgilandi. So'ngra, damlar butun homiladorlik davrida standart protein tarkibi [NP, n=36] (17 foiz protein) yoki past protein miqdori [LP, n=51 bo'lgan izokalorik kemiruvchilar laboratoriya chowida ad libitum saqlanib qoldi. ] (6 foiz protein). Onaning NP va LP oziq-ovqat iste'moli har kuni aniqlandi (keyinchalik tana vazni uchun normallashtirildi) va to'g'onlarning tana vazni har ikki guruhda har hafta qayd etildi. Homiladorlikning 17 kunida (17-DG) dambalar ketamin (75mg/kg) va ksilazin (10mg/kg) bilan behushlik qilindi va bachadon ochildi. Homilalar olib tashlandi va darhol dekapitatsiya yo'li bilan evtanizatsiya qilindi. Homilalar tortilib, jinsiy aloqa qilish uchun dumi va oyoq-qo'llari yig'ildi. Metanefros Keyingi avlod ketma-ketligi (NGS), RT-qPCR va immunohistokimyo tahlillari uchun to'plangan.
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK EKSIZLIGINI YAXSHILADI
Jinsiy aloqani aniqlashUshbu tadqiqot faqat erkak 17-DG avlodlarida o'tkazildi va jinsi Sry an'anaviy PCR (polimeraza zanjiri reaktsiyasi) ketma-ketlik tahlili bilan aniqlandi. DNK proteinaz K va fenol-xloroform bilan fermentativ lizis yo'li bilan ajratilgan. Reaktsiya uchun Master Mix Colorless-Promega, ishlab chiqaruvchining velosipedda yurish shartlari bilan ishlatilgan. Integrated DNK Technologies (IDT) primerni quyidagi ketma-ketlikda sintez qildi: Oldinga: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Ters: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Umumiy RNK ekstraktsiyasiRNK NP (n=4) va LP (n=4) to'liq dan olinganbuyraklarishlab chiqaruvchi tomonidan ko'rsatilgan ko'rsatmalarga muvofiq Trizol reaktivi (Invitrogen) yordamida. Umumiy RNK miqdori nanoVue spektrofotometri (GE Healthcare, AQSH) yordamida 260 nm yutilish orqali aniqlandi. RNKning yaxlitligi Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Germaniya) [30] yordamida RNK yaxlitlik raqami — RIN > 8 ni olish orqali ta'minlandi.
miRNA-Seq va ma'lumotlarni tahlil qilishSekvensiya MiSeq platformasida (Illumina) amalga oshirildi. Protokol ishlab chiqaruvchining mavjud ko'rsatmalariga amal qildiQisqacha aytganda, ketma-ketlik kutubxona qurilishini o'z ichiga oladi va bu 1ug umumiy RNK ishlatilgan. Ushbu bosqichda adapterlar ulanadi, 3 "va 5". Adapterlar bog'langandan so'ng, cDNK yaratish uchun teskari transkripsiya reaktsiyasi amalga oshirildi. Keyin u standart PCR reaktsiyasi bilan kuchaytirildi, u namunani identifikatsiyalash uchun ketma-ketlik indeksini o'z ichiga olgan primerlardan foydalanadi - bu cDNK kutubxonasi, miRNK izolyatsiyasi uchun agaroz jel elektroforeziga duchor bo'ladi. Miqdori aniqlangandan so'ng kutubxona konsentratsiyasi 10 nM Tris-HCl, pH 8,5 yordamida 2 nM ga normallashtirildi va transkriptomlar ketma-ketligi MiSeq Reagent Kit v2 (50 tsikl) tomonidan amalga oshirildi.
Ma’lumotlar tahlili fan nomzodi Tao Chen bilan hamkorlikda amalga oshirildi. Genetika va molekulyar toksikologiya bo'limidan, Milliy toksikologik tadqiqotlar markazi, Jefferson, AR, AQSh. MiRNKlarning Next Generation Sequencing (NGS) ma'lumotlari FASTA formatida yaratilgan va BaseSpace.com saytiga (Illumina, AQSh) import qilingan. Ma'lumotlar sifati ishlab chiqaruvchi (Illumina) tomonidan ishlab chiqilgan CASAVA dasturiy ta'minotidan foydalangan holda baholandi. Tahlillar BaseSpace miRNA tahlili (Torino universiteti, Kanada) va kalamush genomi uchun Kichik RNK (Illumina, AQSh) tomonidan turli miRNKlarning ketma-ket xaritalashi orqali amalga oshirildi. Differensial ifodalangan miRNK tadqiqoti Ingenuity Pathway Analysis dasturi (Ingenuity, AQSH) yordamida tahlil qilindi.
miRNK ifodasini tekshirishHar bir guruhda miRNK (miR{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{) uchun har bir guruhda turli urug'lardan to'rtta erkak nasl ishlatilgan. 4}}p, -181a-5p, -181c-3p va -199a-5p) ifoda tahlili. Qisqacha aytganda, 450 ng RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq TaqMan1 Micro RNK teskari transkripsiya to'plamidan foydalanib, oldindan kuchaytirilmasdan teskari transkripsiya qilindi. To'ldiruvchi DNK (cDNK) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, StepOnePlusTM Real-Time PCR tizimida (Applied BiosystemsTM) TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) bilan TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, AQSh) yordamida kuchaytirildi. Ma'lumotlar tahlili qiyosiy miqdoriy aniqlash usuli (Pfaffl, 2001) yordamida baholangan nisbiy gen ifodasi yordamida amalga oshirildi. Barqarorlik tahlili asosida U6 snRNK va U87 scaRNK mos yozuvlar gen sifatida ishlatilgan. Barcha nisbiy miqdorlar DataAssist dasturi, v 3.0, DCT usuli yordamida baholandi. miRNK ma'lumotlari MIQE ko'rsatmalariga muvofiq yaratilgan [31].
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK FONKSIYASINI YAXSHILADI
Bashorat qilingan maqsadli genlarning RT-qPCRcDNK sintezi uchun High Capacity cDNA teskari transkripsiya to'plami (Life Technologies, AQSh) ishlatilgan. Bax, Bim, Kaspaza-3, Kollagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c uchun RT-qPCR reaktsiyalari -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 va IGF1 geni SYBR Green Master Mix (Life Technologies, AQSh) tomonidan amalga oshirildi. ) IDT1 Integrated DNK Technologies tomonidan taqdim etilgan (1-jadval). Reaksiyalar 2 mkl cDNK (1:30 nisbatda suyultirilgan), 10 mkL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, AQSh) va har bir maxsus primerdan (5 nM) 4 mkl yordamida 20 mkl umumiy hajmda amalga oshirildi. Amplifikatsiya va aniqlash StepOnePlusTM Real-Time PCR tizimi (Applied BiosystemsTM) yordamida amalga oshirildi. Ct qiymatlari mos yozuvlar gen sifatida GAPDH bilan normallashtirilgan nasl metanefros ma'lumotlari bilan DDCt usuli yordamida nisbiy ifoda qiymatlariga aylantirildi [32].
Immunogistokimyo,Homila (guruhda n {0}}) olib tashlandi va darhol 4 foizli paraformaldegidda (0,1M fosfat, pH 7,4) fiksatsiya qilindi. Materiallar suvsizlangan, diafanizatsiya qilingan va paraplastga kiritilgan va bloklar 5- mkm qalinlikdagi qismlarga bo'lingan. Gistologik bo'limlar deparafinizatsiya qilindi va immunofluoresans va immunoperoksidaza uchun qayta ishlandi. Bo'limlar edi
blokirovka qiluvchi eritma (8 foiz homila sigir zardobi, 2,5 foiz sigir albumini va PBSda 2 foiz yog‘siz sut kukuni) bilan inkubatsiya qilinadi. Keyinchalik, bir kechada muzlatgichda 1 foiz yog'siz sutni o'z ichiga olgan PBSda suyultirilgan asosiy antikor (anti-Six-2) bilan o'rnating. PBS bilan yuvilgandan so'ng, bo'limlar xona haroratida 2 soat davomida 1 foiz sutni o'z ichiga olgan bir xil tamponda suyultirilgan Alexa 488 florofor bilan konjugatsiyalangan o'ziga xos ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. PBS bilan ketma-ket yuvilgandan so'ng, slaydlar Vectashield floresan yig'ish muhiti (Vector Laboratories, Inc. Burlingame) yordamida qoplamalar bilan o'rnatildi. Namunadagi lyuminestsentlik lazer konfokal mikroskopiya yordamida aniqlangan. Tasvirlar Focus Imagecorder Plus tizimi yordamida olingan. c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - katenin, ZEB1, ZEB2, kaspaza 3 ajralgan, siklin A va WT1 oqsillari uchun immunohistokimyo o‘tkazildi. Slaydlar gidratlangan va 5 daqiqa davomida PBS pH 7,2 da yuvilgandan so'ng, antigenni qayta tiklash sitrat buferi pH 6.0 bilan bosimli pishirgichda 25 daqiqa davomida amalga oshirildi. Slaydlar PBS da yuviladi. Keyinchalik, vodorod periks va metanol bilan endogen peroksidaz blokadasi 10 daqiqa davomida qorong'uda amalga oshirildi. Bo'limlar PBS da qayta yuvildi. Keyinchalik o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishning bloklanishi kuzatildi va slaydlar blokirovka qiluvchi eritma (5 foizli yog'siz sut kukuni, PBSda) bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Bo'limlar birlamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi (2-jadval), muzlatgichda tun davomida 1 foiz BSAda suyultirildi. PBS bilan yuvilgandan so'ng, bo'limlar xona haroratida 2 soat davomida o'ziga xos ikkilamchi antikorga ta'sir qildi. Slaydlar PBS bilan yuviladi. Dilimlar DAB (3,3'- diaminobenzidin tetrahidroklorid, Sigma-Aldrich CO1, AQSh) bilan aniqlandi. Oqim suvda ketma-ket yuvilgandan so'ng, slaydlar gematoksilin bilan bo'yalgan, suvsizlangan va Entellan1 yordamida qopqoq bilan o'rnatilgan. Tasvirlar Hujayraga tatbiq etilgan fotonika milliy fan va texnologiya institutining Axio Observer Z.1 mikroskopida (Carl Zeiss AG, Germaniya) fotomikroskopi (Olympus BX51) yoki Zeiss LSM 780-NLO konfokal yordamida olingan. Kampinas davlat universitetida biologiya (INFABIC).
Morfologik miqdorni aniqlashParafin 5 mkmbuyrakbo'limlar fotomikroskopdan (Olympus BX51) CellSens Dimension dasturi yordamida tahlil qilindi. ThebuyrakNefrogen maydonni, CM va UB oqsilini va hujayralar sonini, 17-DG LP homilasida (n=5) bo'yalgan gematoksilin-eozinni yoshga mos keladigan NP avlodlari (n {{4) bilan solishtirganda aniqlash uchun bo'laklarga kirildi. }}) turli onalardan. Biz tahlil qilingan har bir metanefrozning barcha CM va UB miqdorini aniqladik (turli onalardan 4NP va 4LP) va statistik tahlil t-testi bilan o'tkazildi va qiymatlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalandi. p�0.05 muhim deb topildi. GraphPad Prism v01 Software, Inc., AQSH, statistik tahlil va raqamlarni qurish uchun ishlatilgan.
Statistik tahlilT-test ishlatilgan va qiymatlar o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida ifodalangan. P�0.05 muhim deb topildi. GraphPad Prisma v. 01 dasturi (GraphPad Software, Inc., AQSH) statistik tahlil va raqamlarni qurish uchun ishlatilgan.
Natijalar
miRNKning miRNK-seq tomonidan ifodalanishiOnaning past protein bilan bog'liq mikroRNK o'zgarishlarini tushunishbuyrakdasturlash, biz global miRNK profilini tahlil qilish ifodasini amalga oshirdik. 44 ta tartibga solinmagan miRNKlar aniqlangan (p � 0.05), ulardan 19 va 25 miRNKlar mos ravishda yuqoriga yoki pastga tartibga solingan (3-jadval). Yuqori ifodalangan miRNKlar va ularning funktsiyalari, yo'llari va tarmoqlari Ingenuity Software yordamida aniqlangan (4-jadval).
miRNK ifodasini tekshirishLP guruhidagi hayvonlarda Let{0}}a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p yuqori tartibga solindi, miR-127-3p, miR-144-3p va miR-199a-5p esa NP hayvonlariga nisbatan past tartibga solingan. Natijalar ikkala guruhni solishtirganda miR{10}} ifodasida hech qanday farqni ko'rsatmaydi (1-rasm). 5-jadvalda RT-qPCR tekshirish ma'lumotlari bilan miRNKlar ketma-ketligi natijasida olingan qiymatlar aniqlangan. LP da NP avlodiga nisbatan sezilarli miRNK ifodasi farqi kuzatilgan bo'lsa-da, tasdiqlangan miRNKlarning katlam o'zgarishi (FC) ikkala texnikaga o'xshash edi.
miRNK-gen maqsadlari
LPda Six-2, Bcl-2, PRDM1, siklin A, PCNA, GDNF, Kollagen 1, Kaspaza 3 va Bim kabi turli xil miRNKlarning bashorat qilingan maqsadlarini ifodalash genlari NP dan sezilarli darajada farq qilmadi. homila. Biroq, Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -katenin, ZEB1, ZEB2 va IGF1 gen ifodasi {{15}da yuqori tartibga solingan. }}DG LP guruhi yoshga moslashtirilgan nazorat bilan solishtirganda. Aksincha, c-Myc va NOTHC1 ona oqsili cheklangan nasllarda pastga tushirilgan (2-rasm).
Xomilaning tana massasi va metanefroz morfometriyasi17-DG LP tana massasi yoshga mos keladigan NP avlodidan farq qilmadi. Shu bilan birga, LP metanefros mezenximasi NP guruhiga qaraganda 7,6 foizga qisqargan maydonni va korteks qalinligining 29 foizga qisqarishini ko'rsatdi (3-rasm).ImmunogistokimyoUshbu tadqiqotda LP homilasi NP avlodiga qaraganda oltita qopqoq floresansining sezilarli darajada kamayganini (taxminan 69 foizga) ko'rsatdi (4-rasm).
Olti-2 immunoperoksidaza tahlili NP avlodiga nisbatan qopqoq maydoniga nisbatan 28 foizga qisqargan Olti{3}} ortiqcha hujayralar bilan bog'liq bo'lgan LP CMda hujayralar sonining (14 foiz) kamayganini ko'rsatdi (4-rasm). Ushbu tadqiqot, shuningdek, NP avlodiga nisbatan LPda c-Myc CM va UB immuno-bo'yalgan hujayralar (kamroq 14 foiz) sezilarli foizga kamayganligini ko'rsatdi (4-rasm). Bundan tashqari, CMdagi Ki{8}} yorliqli maydon ulushi NP homila bilan solishtirganda LPda 48 foizga kam edi, Bcl-2 va yorilib ketgan kaspaza{11}} immunoreaktivligi ikkala guruhdan farq qilmadi (2-rasm). 5 va 6). Ushbu tadqiqot, shuningdek, NP avlodiga nisbatan LPda c-Myc CM va UB immuno-bo'yalgan hujayralar (kamroq 14 foiz) sezilarli foizga kamayganligini ko'rsatdi (4-rasm). Bundan tashqari, CMdagi Ki{17}} yorliqli maydon ulushi NP homila bilan solishtirganda LPda 48 foizga kam edi, Bcl-2 va yirtilgan kaspaza{20}} immunoreaktivligi ikkala guruhdan farq qilmadi (2-rasm). 5 va 6). Boshqa tomondan, LPda CM va UB-katenin bilan belgilangan hududlar NP avlodlarida mavjud bo'lganlarga nisbatan mos ravishda 154 va 85 foizga ko'tarildi (7-rasm). Shu bilan birga, mTOR immunoreaktivligini taqsimlash NP homiladagiga qaraganda LP CM (139 foiz) va UB (104 foiz) da sezilarli darajada kengroq maydonni egallagan (7-rasm). LP avlodlarida UBS hujayralarida bo'yalgan TGF -1 ko'paygan (taxminan 30 foiz), CMda esa immuno-bo'yalgan hujayralar NP guruhidan farq qilmadi (8-rasm). CM yadro hujayralarida joylashgan ZEB1 metanefros bilan bo'yalgan, NP homila bilan solishtirganda LPda 30 foizga yaxshilangan (8-rasm). Bir vaqtning o'zida ZEB2 immunofloressensi, garchi butun metanefros tuzilmalarida mavjud bo'lsa ham, har ikkala eksperimental guruhda ham o'xshash edi (8-rasm). Joriy tadqiqot, miRNK va mRNK ifodasi va oqsillarni hisobga olgan holda
Munozara
Nefrogenezning hujayra va molekulyar mexanizmlari haqidagi bilimlar ortdi [33-37]. Biroq, ko'plab tartibga soluvchi omillar va signalizatsiya yo'llari ishtirok etadibuyrakontogenez noaniq bo'lib qolmoqda [38]. miRNKlar davomida gen ifodasini tartibga solishda hal qiluvchi rol o'ynaydibuyrakrivojlanishi [25, 39-41]. Bizning ma'lumotlarimizga ko'ra, onaning LP iste'moli 17-DG erkak mezenxima hujayralarida miRNK va mRNK ifodasi tahlillari o'tkazilmagan. Biz erta nefrogenezni inhibe qilishda ishtirok etadigan yangi molekulyar mexanizmni taklif qilamiz, natijada nefronlar soni kamayadi. Biz miRNK ifodasini baholash uchun NGS dan foydalandik va NP metanefrosga nisbatan 17-DG LP da 19 miRNK yuqoriga va 25 ta pastga regulyatsiya qilinganligini aniqladik. Eng yaxshi 10 ta tartibga solinmagan miRNKlar orasida biz proliferatsiya, differentsiatsiya va hujayra apoptozi bilan bog'liq biologik maqsadlarga ega 7 ta miRNKni tanladik. MiRNA-Seq va TaqMan ma'lumotlarini tahlil qilish NP yoshiga mos keladigan hayvonlarga nisbatan LP hayvonlarida miRNK ifodasida izchil va o'ziga xos o'zgarishlarni aniqladi.
miR-181 oilasi to'rtta yuqori darajada saqlanib qolgan a'zolardan iborat, ya'ni miR-181a, miR-181b, miR-181c va miR-181d [ 42]. Neoplastik hujayralarda miR{6}}a o'simta bostiruvchi vazifasini bajaradi, hujayra proliferatsiyasi va migratsiyasini inhibe qiladi va hujayra apoptozini qo'zg'atadi [43]. Ushbu tadqiqot yoshga mos keladigan NP avlodiga nisbatan 17-DG LP da miR-181a-5p ifodasining ortishi aniqlandi. Kaspaza mRNK ifodasi o'zgarmagan bo'lsa-da, NP avlodiga nisbatan LPda Bax/Bcl-2 mRNK nisbatining ikki baravar oshishi CMda apoptozning kuchayganligini ko'rsatadi, bu apoptozning transkripsiyadan keyingi tartibga solinishini ko'rsatadi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, BCL oilasi mitoxondriyadan sitoxrom chiqarilishiga yordam beradi va keyin Casp3 faollashishini inhibe qiladi va shu bilan hujayra apoptozini inhibe qiladi [44]. Li va boshqalar. o'pkaning o'tkir shikastlanishi modelidan foydalangan holda, miR-181a haddan tashqari ifodalanganligi Bcl-2 protein darajasining pasayishi bilan bog'liqligini aniqlash uchun; aksincha, miR-181inhibisyonu Bcl-2 darajasini oshirdi [45]. Ushbu tadqiqot Lv va boshqalarning natijalarini tasdiqladi, ular miR-181c 6-2 ifoda ifodasini va hujayra proliferatsiyasini salbiy, mezenximal hujayralar fenotipini yo'qotish bilan parallel ravishda tartibga solishini ko'rsatdi.buyrakLP 17-DG avlodlarida rivojlanish [25].
Xiang va boshqalar. ortib borayotgan miR-144 ifodani bostirishini ko'rsatdibuyrakkarsinoma proliferatsiyasi, natijada G2/M fazasi qisqaradi. Bundan tashqari, Xiang va boshqalar. miR-144 ning haddan tashqari ifodalanishi mTOR geni va oqsil ifodasini inhibe qilishini aniqladi [46]. Nijland va boshqalar. mTOR signalizatsiyasining ko'payishi onalari ozuqaviy cheklovlarga duchor bo'lgan embrionlarda nefronlar sonini aniqlash uchun juda muhim ekanligini ko'rsatdi [47]. Rapamitsin kompleksi 1 (mTORC1) ning sutemizuvchilar maqsadi embrion rivojlanishi uchun juda muhimdir; ammo, bu kompleks fiziologik sharoitda va atrof-muhit stressida o'sish va autofagiya o'rtasidagi muvozanatni qanday tartibga solishi noma'lumligicha qolmoqda [48]. Shuning uchun, mTOR signalizatsiyasi homiladorlik davrida LP iste'moliga duchor bo'lgan hayvonlarning uyali javoblarida ishtirok etishi mumkin; autofagiyani idrok etish, induksiya qilish va tugatishda; va hujayra ichidagi ozuqa moddalarining mavjudligiga javoban [46]. Proteinning qattiq cheklanishi paytida miR{8}}p ning kamayishi mTOR ekspressiyasining oshishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu taxminan CM hujayralari va UBda mos ravishda 139 va 104 foizga ko'tarilib, {{ nefronlarning yo'qolishini qoplash uchun. 11}}DG LP avlodlari Chen va boshqalar. miR-127 ni Bcl-6 [49] orqali hujayra qarishining yangi regulyatori sifatida aniqladi. Pan va boshqalar. miR-127 kam ifodalanishi jigar hujayralarida hujayra proliferatsiyasining kuchayishi bilan bog'liqligini xabar qildi [50]. Ushbu tadqiqot hujayra proliferatsiyasining kamayganini va oqsil cheklangan hayvonlarning CMida Ki-67 uchun musbat etiketlangan hujayralar sonining sezilarli darajada kamayganini ko‘rsatdi. Bundan tashqari, nefrogen maydonning qisqarishi va LP naslining ko'payishi kuzatildi, bu Menendez-Kastro va boshqalarning natijalariga mos keldi. 8,4 foiz protein cheklangan nasllarda [51, 52]. Shunday qilib, Ki-67 va Bcl-6 mRNK ifodasining ortishi va 17-DG LP qopqog'idagi miR-127-3p ifodasining kamayishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. tarqalishi.
Sun va boshqalar. miR-199a-5p ning haddan tashqari ifodalanishi hujayra siklini nazorat qilishdan tashqari, kist hujayralari proliferatsiyasini kamaytiradi va apoptozni keltirib chiqarishini ko'rsatdi [53]. Ushbu tadqiqotda miR-199a-5p ifodasi 17-DG LPda kamayadi, hujayra koʻpayish belgisi boʻlgan Ki-67 va Map2k2 transkripsiyasi kuchayishi bilan birga keladi. LP 17-DG metanefrosida Ki-67 reaktivligining pasayishi bilan bogʻliq. Shunday qilib, homiladorlikning kam ovqatlanishi post-transkripsiya mexanizmi orqali differentsiatsiyaga yordam beradi. Ta'kidlash joizki, bizning natijalarimiz embrion ildiz hujayralarining differentsiatsiyasi paytida ildiz hujayralari pluripotentligini saqlaydigan EMT induktori bo'lgan sink-barmoq E qutisini bog'laydigan homeobox 1 (ZEB1) ning repressiv rolini ochib beradi. -katenin yadroviy ZEB1 transkripsiyasini faollashtirishi ma'lum, natijada ZEB1 ifodasi [34]. TGF signalizatsiya yo'li, eng yaxshi o'rganilgan yo'llardan biri, embrion rivojlanish davrida EMT ni keltirib chiqarishi mumkin. Embrion rivojlanishi uchun bir nechta TGF kabi ligandlar talab qilinadi. Biroq, EMT ga TGF vositachiligidagi barcha ta'sirlar ZEB1/2 ga bog'liq emas, nokaut hujayralari fibronektin va N-kaderin mezenximal genlarning ekspressiyasini keltirib chiqarishi mumkin. Biroq, E-kaderin endi pastga tartibga solinmaydi va aktin tolalari ham hosil bo'ladi [54]. Karner va boshqalar. davomida xabar berdibuyrakishlab chiqish, Wnt9b/ -katenin
UB va CMda ifodalangan signalizatsiya yo'li ham embriogenez jarayonida nefronlarning shakllanishi uchun zarur bo'lgan nefron progenitor hujayra yangilanishi va differentsiatsiyasi uchun zarurdir [55]. Evolyutsion tarzda saqlanib qolgan Wnt9b/ -katenin yo'li ko'p hujayrali organizmlarda organlar, to'qimalar va shikastlanishlarni tiklashda muhim rol o'ynaydi. Tadqiqot shuni ko'rsatdiki, c-Myc -kateninning ko'payishi va farqlanishini tartibga soluvchi transkripsiyaviy maqsaddir.buyrakquvurli epiteliya [56]. ning o'rganilgan davrlarida gen va oqsil darajasida -kateninning ifodasi ortdibuyrak17-DG LP homila rivojlanishi. Pan va boshqalar. Myc nefron progenitor hujayralarining yangilanishini rag'batlantirish uchun -katenin bilan hamkorlik qiladi [10]. Bu erda yoshga mos keladigan NP avlodlari bilan solishtirganda, LP pastroq c-Myc ifodasini ko'rsatdi. Shu sababli, bu hayvonlar ko'payish va omon qolish uchun zarur bo'lgan yangilanadigan hujayralarning kamroq zaxirasiga ega bo'lishi mumkin va LP modelida nefronlarning kamroq sonini aks ettirishi mumkin. Bundan tashqari,
Wnt/ -katenin va Notch signallari yo'llari olti-2 ifodaning tartibga solinishini muvofiqlashtirishi mumkin va nefron progenitori hujayralarida olti-2 ifodaning pastga regulyatsiyasida ishtirok etadi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, oltita-2 ifoda va CM progenitor hujayralarni ajratilmagan holatda ushlab turish uchun past darajadagi -katenin talab qilinishi mumkin; Bundan tashqari, - kateninning yuqori darajalari nefron progenitor hujayra taqdirini belgilaydi [57, 58]. Shunday qilib, biz faraz qilamizki, cMyc va Notch signallarining kamayishi, -katenin ifodasining ortishi bilan birga, 17-DG LP avlodlarida Six-2 ifodasini 28 foizga kamaytirdi va CM hujayralarining erta farqlanishi va ildiz hujayralarining kamayishi bilan bog'liq. kattalardagi nefron soni. Bundan tashqari, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, LP avlodining MM hujayralarida Let{12}}a-5p va -katenin ifodasining ortishi va kamaytirilgan Notch signali c-Myc, Six-2, va Ki-67 ifodasi, bu esa progenitor hujayralarning o'z-o'zini yangilanishining kamayishiga olib keladi. Qolgan CM progenitor hujayralarining kamayishi nefron sonining kamayishiga va arterial gipertenziya rivojlanishiga olib keladi vabuyrakkattalardagi buzilishlar (10-rasm). Boivin va boshqalarning natijalariga muvofiq, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, CM-kateninning ortishi UB o'sishi va nefrogenezni buzadi [59]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, UB o'sishining muhim regulyatori bo'lgan o'sish omili glialdan kelib chiqqan neyrotrofik omil (GDNF) c-Ret tirozin kinaz retseptorlari va Gfra1 ko-retseptorlari orqali signal beradi [60, 61]. 17-DG LP avlodlarida sezilarli
c-Ret retseptorlarini kodlovchi mRNKning ortishi nazariy jihatdan UB o'sishining oshishiga olib keladi. Biroq, ushbu tadqiqotda GDNF ifodasi o'zgarmadi, bu cRet mRNKning ko'payishiga qaramay, UB shoxlanishi kamaydi. Ilgari biz 14,5 kunlik homiladorlik protein cheklanishidan so'ng ureter kurtaklari shoxlari 28,3 foizga qisqarganini kuzatdik [4], bu GDNFda hech qanday o'zgarish bo'lmaganiga qaramay, MM hujayralarining Olti{7}} belgilarining 28 foizga qisqarishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. transkripsiya. -katenin, ehtimol, c-ret retseptorlari bilan o'zaro ta'sir qiladi va UB hujayra yadrosiga ko'chiriladi, epiteliya hujayralarida TGF -1 ifodasini rag'batlantiradi, UB shoxlanishini inhibe qiladi va CM progenitor hujayraning erta farqlanishiga olib keladi, {{11} }DG LP avlodlari [62-64]. Shuning uchun, GDNF mezenximal signallarni ureter kurtaklariga vositachilik qilishda muhim bo'lmasligi mumkin; biroq, mexanizmni hali ham tushuntirish kerak. Haqiqatan ham, biz 17-DG LP avlodidan olingan MM Let-7 miRNK ifodasining o'ziga xos o'sishini ko'rsatib, buning natijasida sezilarli darajada buzilganligini ko'rsatdik.buyrakrivojlanish, shu bilan nefrogenezning rivojlanish vaqtini belgilashda ushbu genlarning modulyator rolini tasdiqlaydi [65].
Dastlabki insulinga o'xshash o'sish omili (IGF) tadqiqotlarida IGF-1 va -2 ning homila o'sishidagi asosiy roli ko'p, lekin asosan bilvosita dalillar bilan aniqlangan. IGFlar yetishtirilgan xomilalik hujayralar va preimplantatsiya embrionlarida proliferatsiya va differentsiatsiya omillari sifatida harakat qilishlari aniqlandi. Bundan tashqari, IGFlar in vitro madaniyatli xomilalik hujayralar va eksplantlar tomonidan ajralishi aniqlandi [66]. O'sish omillari, shu jumladan IGF, qisman yoki to'liq epiteliya-mezenximal o'tishga olib kelishi mumkin. IGF yo'llarining faollashishi ZEB1 ifodasini qo'zg'atish orqali EMT ning yuqori regulyatsiyasiga olib keladi [67]. Bir nechta nomzod o'sish omillari ishtirok etsa hambuyrakrivojlanishi, ularning nefrogenezda ishtirok etishi noma'lum. Turli vaqtlarda turli xil o'sish omillari kerak bo'lishi mumkin. Ba'zi o'sish omillari bu kontekstda ortiqcha bo'lishi mumkin. Embrion rivojlanish jarayonida ixtisoslashgan hujayra turlarini farqlash va uch o'lchovli tuzilmani yaratish uchun EMT va METning ketma-ket turlari kerak. Ushbu tadqiqotda mezenximal-epitelial o'zaro konvertatsiya hujayra plastisiyasini saqlab turishi aniqlandi, bu embrion uchun LP sharoitida yuqori induktsiyali tizim mavjudligini ko'rsatadi. Let-7 miRNK oilasining ifodasi turli homila to'qimalarida keng o'rganilgan. Let{3}} miRNK ifodasining ortishi proliferatsiyaning kamayishi va MM hujayra differentsiatsiyasining erta ko'payishi va natijada nefron sonining kamayishi bilan bog'liq [27, 15, 68-71]. Oliy Let{8}} ifodasi yuqori organizmlarda kemiruvchilarda miya embriogenezining oxirgi bosqichida namoyon boʻlgan [72, 73]. Nagalakshmi va boshqalar. Let{11}} miRNK ifodasi UB epitelial hujayra taqdirini prekursordan differentsial holatga o'zgartirganini aniqladi [71]. Aksincha, Yermalovich va boshqalar. RNK-bog'lovchi oqsil bo'lgan Lin28b ning haddan tashqari ko'payishi Let{15}} supressiv miRNKlar bilan bog'liqligini ko'rsatdi. Lin28 va Let-7 umurtqasiz hayvonlarda ontogen vaqtni aniqlashning ma'lum regulyatorlari bo'lsa-da, ularning sutemizuvchilar organlari rivojlanishidagi roli tushunilmagan [65]. Ushbu tadqiqotda LP homiladagi Let{19}}a-5p miRNK ifodasining oshishi NP guruhiga nisbatan nefrogenezni buzuvchi CM hujayralari proliferatsiyasining kamayishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Shunday qilib, biz faraz qilamizki, Let{21}} miRNKning ko'payishi natijasida kelib chiqqan CM hujayralari proliferatsiyasining bostirilishi va nefrogenezning erta to'xtashi 17-DG LP da Lin28b ning vaqtinchalik qisqargan ifodasi orqali bevosita yoki bilvosita sodir bo'lishi mumkin. Bu ta'sir sezilarli darajada yomonlashishi mumkinbuyrak17-DG LP da rivojlanishi, bu gen nefrogenez davrida rivojlanish vaqtini tartibga solishini tasdiqlaydi. Ushbu tadqiqotda Let{1}}a-5p miRNK ifodasining ortishi c-Myc ifodasining pasayishi bilan mos keladi. Myc proliferatsiyada, o'sishda, apoptozda va hujayralar differentsiatsiyasida ishtirok etadibuyrakorganogenez [74-76]. LP 17-DG avlodida MM c-Myc genining ekspressiyasi kamaydi va CM c-Myc immunoreaktivligi maydoni NP naslidagiga nisbatan 14 foizga kichikroq edi. Bir vaqtning o'zida CM hujayralari sonining 14 foizga kamayishi NP avlodiga nisbatan LPda Ki{8}} immunoreaktivligini 48 foizga kamaytirishi kuzatildi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, c-Myc UB shoxlanishining yakuniy bosqichida va CM progenitor hujayra proliferatsiyasini rag'batlantirishda muhim rol o'ynaydi [74].
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK INFEKTSIONINI YAXSHILADI
ildiz hujayralarida darajasini pasaytiradi, ularni ajratilmagan holatda saqlaydi. Biroq, ushbu tadqiqotda Let{0}}a-5p miRNKning CMdagi kuchli ifodasi c-Myc ifodasini pasaytirdi va shu bilan LP 17-DGda progenittor hujayralar proliferatsiyasini va erta hujayra differentsiatsiyasini kamaytiradi. nasl (10-rasm). bo'yicha tadqiqotlarbuyraklarc-Myc transgen sichqonlari bir vaqtning o'zida ildiz hujayralari proliferatsiyasining kamayishi bilan bog'liq c-Myc va S-ix{3}} immunopozitiv CM hujayralarining pasayishini aniqladi [74]. Ushbu tadqiqot oltita musbat hujayraning sezilarli (28 foiz) kamayganini ko'rsatadi, ya'ni o'ziga xosbuyrakNP naslidagiga nisbatan 17-DG LP naslining CMida nefron sonining kamayishi kabi ildiz hujayra belgisi. 2009 yilda Fogelgren va boshqalar. Nefron sonining kamayishi, gipertenziya va surunkali kasalliklar bilan bog'liq bo'lsa, homila ontogenezi davomida olti-2 gen ekspressiyasi pasayganligini ko'rsatdi.buyrak etishmovchiligi[77]. Shunday qilib, CM progenitor hujayralarida olti-2 gen ekspressiyasining kamayishi, bu jarayon davomida signal ta'sirida farqlanishning bostirilishini ko'rsatadi.buyrak17-DG LP avlodida rivojlanish. Shunga qaramay, ortiqcha ehtiyotkorlik bilan foydalanish kerak - nefrogenezdagi nozik nuqsonlar batafsilroq tahlil qilish yoki turli sharoitlarda aniq bo'lishi mumkin. IGF1 mRNK darajalari metanefrik rivojlanishning dastlabki davrida eng yuqori bo'lgan, transkriptlar butun MM davomida aniqlangan, holbuki ularning darajalari keyingi rivojlanish jarayonida pasaygan. Biroq, davomidabuyrakembriogenez, nefronni osonlashtiruvchi o'sish omillari (IGF1) va inhibitiv o'sish omillari (TGF -1) o'rtasidagi nozik muvozanat UB shoxlanishini tartibga soladi.
Xulosa
Garchi bir qancha mualliflar nefrogenezni [34, 37, 78] o'rgangan bo'lsalar ham, nefron sonini aniqlaydigan mexanizmlar haqida juda kam narsa ma'lum. Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, ko'plab MM progenitor hujayra miRNKlari, mRNKlari va oqsillari 17-DG LP naslida o'zgargan, bu esa proliferatsiyaning kamayishiga va hujayralarning erta farqlanishiga olib keladi (11-rasm). Nefron progenitori yangilanishi va differentsiatsiyasi o'rtasidagi bu nozik muvozanat juda muhimdirbuyrakRivojlanish, chunki nefronlarning etarli soniga erisha olmaslik surunkali rivojlanish uchun xavf omilidirbuyraktartibsizlik.
