Qusishga qarshi dorilar yordamida buyrak OCT2 va MATE1 sekretsiyasini in vitro inhibe qilish
Mar 18, 2022
Muborak Jorj1, Xia Ven1, Edgar A. Jaimes2, Melanie S. Joy3,4,5,†va Lauren M. Aleksunes
Annotatsiya:Organik kation tashuvchisi 2 (2-oktabr) va ko'p dori va toksin ekstruziya oqsili 1 (MATE1) dorilarning buyrak sekretsiyasiga vositachilik qiladi. Oxirgi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, ko'ngil aynishi va qayt qilishning oldini olish uchun ishlatiladigan 5-HT3 antagonisti bo'lgan ondansetron inhibe qilishi mumkin.2-oktabr- va MATE{1}}vositachiligida transport. Ushbu tadqiqotning maqsadi beshta 5-HT3 antagonisti dori-darmonlarni inhibe qilish qobiliyatini tekshirish edi.2-oktabrva MATE1 tashuvchilar. OCT2/MATE1 zond substratining ASP plus transporti ikkita model yordamida baholandi: (1) HEK293buyrakinsonni haddan tashqari ifodalovchi hujayralar2-oktabryoki MATE1 va (2) MDCK hujayralari inson bilan transfektsiyalangan2-oktabrand MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >dolasetron (IC50: 27,4 mkM). Ondansetron (0.5–20 mkM) ASP ning bazolateraldan apikalga transcellular tashilishini va 64 foizgacha inhibe qildi. Palonosetron, tropisetron va dolasetronning yuqori konsentratsiyasi (10 va 20 mkM) xuddi shunday ASP plus ning hujayralararo tashilishini kamaytirdi. Ikki marta transfektsiyalangan OCT2-MATE1 MDCK hujayralarida 0,5 va 2,5 mkM konsentrasiyalarda ondansetron ASP plus ning hujayra ichidagi sezilarli to‘planishiga sabab bo‘ldi. Birgalikda bu maʼlumotlar shuni koʻrsatadiki, 5-HT3 antagonisti dorilar OCT2 va/yoki MATE1 funksiyasiga xalaqit berib, kationik dorilarning buyrak sekretsiyasini inhibe qilishi mumkin.
Kalit so‘zlar:OCT2; MATE1; katyonik; 5-HT3 antagonisti;buyrak; sekretsiya; transport
Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche tubulosa oldini oladibuyrakkasallik, namunani olish uchun shu yerni bosing
1.Kirish
Buyrak sekretsiyasiga dorilarning naycha epiteliysi bo'ylab muvofiqlashtirilgan qabul qilinishi va chiqishi orqali erishiladi. Organik kationlar bo'lgan dorilar va toksikantlar uchun ularning filtratga transepitelial tashilishi birinchi navbatda bazolateral yuzada organik kation tashuvchi 2 (OCT2) va keyinchalik cho'tka chegarasida ko'p dori va toksin ekstruziyasi 1 (MATE1) orqali amalga oshiriladi. membrana. OCT2/SLC22A1 va MATE1/SLC47A1 genlarini kashf qilishdan oldin, organik kationlarning sekretsiyasini farmakologik jihatdan inhibe qilish mumkinligi yaxshi tushunilgan edi [1]. Turli xil preklinik turlar bo'yicha turli xil eksperimental yondashuvlardan foydalangan holda, organik kationlar faol transport va buyrak sekretsiyasidan o'tishi ko'rsatildi [2-4]. Ushbu dastlabki kuzatuvlardan so'ng, tadqiqot nafaqat organik kation sekretsiyasining molekulyar mexanizmlarini, balki OCT2 va MATE1 ning buzilishidan keyin klinik ahamiyatga ega dori o'zaro ta'sirining potentsialini ham tushunish uchun rivojlangan ([5] da ko'rib chiqilgan).
Serotonin 5-HT3 retseptorlari antagonistlari ko'ngil aynishi va qayt qilishni davolash uchun muhim dori sifatida paydo bo'ldi. Serotonin ingichka ichakning enterokromaffin hujayralari tomonidan chiqariladi. 5-HT3 antagonistlari vagusdan afferent nervlarda ionotrop ligand bilan o'ralgan ion kanalini inhibe qiladi va qusish refleksini oldini oladi [6]. Ondansetron kimyoterapiya sabab bo'lgan ko'ngil aynishi va qayt qilishning oldini olish uchun tasdiqlangan birinchi 5-HT3 antagonisti edi [7,8]. O'sha vaqtdan boshlab ushbu sinfdagi qo'shimcha dorilar (shu jumladan tropisetron, granisetron, dolasetron va palonosetron) ishlab chiqildi [9]. 5-HT3 antagonistlarining asosiy terapevtik koʻrsatkichi kimyoterapiya va radiatsiya taʼsirida boʻlgan qusishni oldini olish boʻlsa-da, ular operatsiyadan keyingi koʻngil aynishi va qusishni davolashda ham tasdiqlangan va ertalabki koʻngil aynish, giperemezis gravidarumni davolashda qoʻllaniladi. , operatsiyadan keyingi deliryum va qichishish [10-14].
5-HT3 antagonistlarining katyonik tabiatini hisobga olgan holda (1-rasm), ular OCT va MATE tashuvchilarning substratlari va ingibitorlari sifatida paydo bo'ldi. In vitro tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ondansetron va tropisetron OCT1 va OCT2 ning substratlari va ingibitorlaridir [15-20]. Bundan tashqari, OCT1/SLC22A1 genida funktsiyani yo'qotadigan variantlari bo'lgan shaxslar tropisetron farmakokinetikasini o'zgartirgan va klinik samaradorlikni yaxshilaganligi ko'rsatilgan [16]. Xuddi shunday, ondansetron MATE tashuvchilarni inhibe qilishi mumkin, bu esa diabetga qarshi dori metforminning buyrakda to'planishiga, shuningdek, saratonga qarshi dori sisplatinning nefrotoksikligini oshiradi [19]. Odamlarda ondansetron metforminning buyrak klirensini kamaytiradi, ehtimol MATE1 oqimini inhibe qiladi [21]. Bu maʼlumotlar birgalikda 5-HT3 antagonistlari OCT2 va MATE1 orqali dorilarning transepitelial sekretsiyasini inhibe qilish potentsialiga ishora qiladi. Shu sababli, biz beshta 5-HT3 antagonistini bir va ikki transfektsiyadan foydalangan holda prob-kationik substratning MATE vositachiligida inson OCT2 va MATE vositachiligida tashishini inhibe qilish qobiliyati uchun muntazam ravishda solishtirishga harakat qildik.buyrakhujayralar. Shunisi e'tiborga loyiqki, hozirgi tadqiqot asosan MATE1ga, ya'ni insondagi MATE2-K protein darajasiga qaratilgan.buyrakkorteks avvalroq massa spektrometriyasi yordamida miqdoriy aniqlashning pastki chegarasidan past ekanligi ko'rsatilgan [22].
2. Natijalar
2.1. OCT2 va MATE1ni haddan tashqari ifodalovchi HEK293 hujayralarida ASP plus ning lyuminestsent substrat sifatida tavsifi
Dastlabki tadqiqotlar ASP plyusning bo'sh vektor (EV), OCT2 yoki MATE1ni haddan tashqari ifodalovchi hujayralarga o'zlashtirilishini tavsifladi (2-rasm). ASP plus vaqtga bog'liq (2A-rasm) va konsentratsiyaga bog'liq (2B-rasm) ikkala OCT2- va MATE1-ekspressiv hujayralarda qabul qilishni va to'yingan kinetikani ko'rsatdi (OCT2: Vmax 8,1 nmol/mg/min) , Km 2,9 uM, R2 0,95; MATE1: Vmax 3,4 nmol/mg/min, Km 8,2 uM, R2 0,96). EV hujayralari ASP plyusning minimal to'planishini ko'rsatdi (Vmax 1,9 nmol/mg/min, Km 37,3 uM, R2 0,92). Ushbu topilmalarga asoslanib, ASP plyus o'zlashtirilishi 1 daqiqadan so'ng (OCT2 va MATE1 transporti uchun chiziqli diapazon) 10 uM konsentratsiyada aniqlandi, bu floresansni aniqlash va 5-HT3 antagonistlarini inhibitorlar sifatida skrining qilish uchun etarli darajada sezgirlikni ta'minladi.
Ushbu shartlar har bir tashuvchi tomonidan faol tashishni aks ettirishini ta'minlash uchun yaxshi tasdiqlangan OCT2 va MATE1 inhibitori simetidinning IC5{{10}} qiymatlari aniqlandi (3-rasm va 1-jadval). Timetidin uchun IC5{14}}, MATE1 ning pastroq konsentratsiyalarda inhibisyonini ko'rsatuvchi nashr ma'lumotlariga muvofiq, OCT{11}}ekspress qiluvchi hujayralarda 24,5 m 4,0 uM ni, MATE ni ifodalovchi hujayralarda1- 0,23 m 0,2 uM ni tashkil etdi. [18,20]. Simetidin ASP va EV hujayralarida o'zlashtirilishiga hech qanday ta'sir ko'rsatmadi.
2.2. HEK293 hujayralarida antiemetik dori vositasida OCT2- va MATE1-vositachilikni inhibe qilish
Besh xil 5-HT3 antagonistlari (ondansetron, palonosetron, granisetron, tropisetron va dolasetron) substrat sifatida ASP plyusdan foydalangan holda HEK293 hujayralarida OCT2 va MATE1 transportini inhibe qilishlari uchun baholandi (3-rasm). OCT2- va MATE{8}}ekspres qiluvchi hujayralarda ASP plyus yutilishining konsentratsiyaga bog'liq kamayishi turli konsentratsiyalar oralig'ida sinovdan o'tkazilgan barcha beshta 5-HT3 antagonistlari ishtirokida kuzatildi. Sinov qilingan kontsentratsiya diapazonlaridan foydalangan holda 5-HT3 antagonistlari tomonidan ASP plyus to‘planishini inhibe qilish uchun IC50 qiymatlari 1-jadvalda ko‘rsatilgan. Granisetrondan tashqari, boshqa 5-HT3 antagonistlari MATE1ni o‘zlariga qaraganda kuchliroq inhibe qilgan. 2-oktabr. Sinov qilingan konsentratsiyalarda OCT2-vositachiligida tashish ~90 foizgacha, MATE1-vositachilik orqali tashish esa ~70 foizgacha inhibe qilindi.
Umuman olganda, ASP plus ning EV hujayralari tomonidan o'zlashtirilishi 5-HT3 antagonistlari tomonidan katta darajada o'zgarmadi. Shu bilan birga, palonosetron va tropisetron EV hujayralarida qo'shimcha ASP plyus o'zlashtirilishini rag'batlantirgani va granisetronning eng yuqori konsentratsiyasi ASP plyus to'planishining kichik pasayishiga olib kelganligi qayd etildi.
2.3. OCT2/MATEda ASP plus ning hujayralararo tashish va hujayra ichidagi toʻplanishining xarakteristikasi1-MDCK hujayralarini ifodalash
OCT2 va MATE1 ning transepitelial sekretsiyadagi qo'shma hissasini o'rganish uchun bazolateral (OCT2) va apikal (MATE1) sirtlari bilan polarizatsiyalangan MDCK hujayralarida keyingi tajribalar o'tkazildi. OCT2 va MATE1 oqsilining ifodasi Western blotting yordamida ikki marta transfektsion MDCK hujayralarida tasdiqlangan (4A-rasm). Kationik prob substratining ASP plus (25 uM) hujayralararo transporti Transwell qo'shimchalari yordamida ushbu hujayralarda sinovdan o'tkazildi. ASP plyusning bazolateraldan apikalga (B-dan-A) o'tishi apikal-bazolateral (A-B) transportiga qaraganda ancha katta (120 daqiqada 28-baravargacha) edi. OCT2/MATE1 er-xotin transfektsion hujayralarda (4B-rasm). ASP plus faol sekretsiyasini qo'llab-quvvatlovchi OCT2/MATE1 hujayralari uchun 120 daqiqada B-dan A/A-dan B gacha oqim nisbati 2,7 ga teng deb taxmin qilingan. Aksincha, nazorat xujayralari OCT2/MATE1 hujayralariga nisbatan har ikki yo'nalishda ham ancha past ASP va transportni namoyish etdi. ASP plus ning B dan A ga tashilishi nazorat hujayralarida 90 (1{40}}katta) va 120 daqiqa (17-katta)da A dan Bgacha bo'lgan transportga nisbatan sezilarli darajada yuqori bo'lgan. ). Barcha keyingi inhibisyon tahlillari B-dan-A yo'nalishida amalga oshirildi.
Kimyoviy moddalarning ASP plyus oqimini inhibe qilish va OCT2/MATE1 qo'sh transfektsion hujayralarda to'planish qobiliyati belgilangan sinov sharoitida uchta musbat nazorat inhibitori (simetidin 5 va 50 uM, pirimetamin 1 uM va olanzapin 20 uM) yordamida baholandi (4C-rasm). Simetidin OCT2 va MATE1 ning ma'lum inhibitori bo'lib, MATE1 uchun katta kuchga ega (1-jadval) [18]. Pirimetamin o'ziga xos MATE1 inhibitori [23], olanzapin esa OCT2 ni kuchliroq inhibe qilishi aniqlandi (Qo'shimcha rasm S1) [18,20]. Har uch kimyoviy modda ham ASP plyusning hujayralararo oqimini inhibe qilgan (18% simetidin 5 umM, 40% simetidin 50 uM, 36% pirimetamin 1 umM va 28% olanzapin 20 umM 120 daqiqada).
ASP plyus hujayra ichidagi to'planishi ham 120 daqiqada lizatlarda aniqlangan. Simetidin va pirimetamin ASP plyusning hujayra ichidagi to'planishini mos ravishda 1,{2}} va 1,{4}} barobar oshirdi (asosan MATE1 inhibisyonu tufayli), olanzapin esa ASP plyusning hujayra ichidagi to'planishini 51 ga kamaytirdi. foiz (OKT2 inhibisyonu tufayli). Nazorat hujayralarida ASP plyusning B dan A ga o'tkazilishini sezilarli darajada inhibe qilish hech qanday vaqt nuqtalarida kuzatilmadi. Boshqaruv hujayralarida ASP plyusning hujayra ichidagi to'planishida transport vositalarini boshqarish hujayralariga nisbatan sezilarli o'zgarishlar kuzatilmadi, faqat olanzapin 20 uM ishtirokida ASP plyus to'planishining ozgina pasayishi bundan mustasno.
2.4. 5-OCT2/MATEda HT3 antagonistlari tomonidan ASP plus ning hujayralararo tashilishini inhibe qilish1-MDCK hujayralarini ifodalash
Beshta 5-HT3 antagonisti (ondansetron, palonosetron, granisetron, tropisetron va dolasetron) OCT2/MATE1 qoʻsh transfektsion hujayralarda ASP plyusning hujayralararo tashilishi va hujayra ichidagi toʻplanishiga taʼsir qilish qobiliyati uchun baholandi (5 va 6-rasm). Simetidin (50 uM) har bir tajribaga musbat nazorat sifatida Transwellsning parallel to'plamiga kiritilgan. Qizig'i shundaki, barcha besh 5-HT3 antagonistlari ASP plus ning hujayralararo B-dan A-ga o'tishida turli darajadagi inhibisyonni ko'rsatdi (5-rasm). Avtotransport bilan ishlov berilgan hujayralar bilan solishtirganda, ondansetron konsentratsiyaga bog'liq holda ASP plyusning B dan A ga tashilishini inhibe qildi, sinovdan o'tgan eng yuqori konsentratsiyada (20 uM) 120 daqiqada 36 foiz inhibisyon bilan. Palonosetron va tropisetron, shuningdek, ASP plyus sekretsiyasining konsentratsiyaga bog'liq bo'lgan inhibisyonini ko'rsatdi, bu barcha vaqt nuqtalari uchun 10 va 20 uM da sezilarli edi. Palonosetron va tropisetron bilan 20 uM da ASP plyus sekretsiyasini inhibe qilish kuzatildi. Dolasetron 10 va 20 uM da ASP plyus tashishni faqat 120 daqiqada inhibe qildi. Nihoyat, granisetron sinovdan o'tgan har qanday konsentratsiyada ASP plyusning B dan A ga tashilishini o'zgartirmadi. Nazorat xujayralari ASP plus ning HT3 antagonistlarining hech biri bilan B dan A ga tashilishida sezilarli inhibisyonni ko'rsatmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).
2.5. ASP plus OCT2/MATEda hujayra ichidagi toʻplanishi1-Keyingi MDCK hujayralarini ifodalash
5-HT3 antagonistlari bilan davolash
Ondansetronning past konsentratsiyasi (0.5 va 2.5 uM) hujayra ichidagi ASP ning 1.3-katta oshishiga, shuningdek, OCT2/MATE1-ekspressiv hujayralarda toʻplanishiga olib keldi, biroq farq yoʻq edi. yuqori konsentratsiyali (10 va 20 uM) transport vositalariga nisbatan (6-rasm). Shu bilan birga, nazorat hujayralarida ondansetronning yuqori konsentratsiyasida ASP plyus to'planishining pasayishi (40 foiz) kuzatildi. OCT2/MATE1 hujayralarida tropisetron va granisetron eng yuqori konsentratsiyada (20 uM) ASP plyus to'planishini (mos ravishda 1,5 va 1,3-katta) oshirdi. Palonosetron yoki dolasetron bilan ASP plyus to'planishida sezilarli o'zgarishlar kuzatilmadi.
3. Munozara
OCT2 va MATE1 organik kationlarning buyrak sekretsiyasini muvofiqlashtiruvchi asosiy tashuvchilardir. Ular metformin, sisplatin, lamivudin va entekavirni o'z ichiga olgan bir-biriga o'xshash bir qator substratlarni, shuningdek tanlangan 5-HT3 antagonistlari [15-20,24]. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, 5-HT3 antagonistlari OCT2 va MATE1 orqali tashishni ham inhibe qilishi mumkin. Eng muhimi, ondansetronning MATE1 tomonidan sisplatin va metforminning tashishini kamaytirishi ko'rsatilgan [19]. Joriy tadqiqot ushbu oldingi ishni kengaytirib, beshta 5-HT3 antagonistlarini HEK293 hujayralarida haddan tashqari ifodalanganda va MDCK hujayralarida birgalikda eksprese qilinganda va Transwell qo'shimchalarida o'stirilganda OCT2 va MATE1ni individual ravishda inhibe qilish qobiliyatini solishtirishga qaratilgan. Ondansetron va palonosetron prob-kationik kimyoviy ASP plus ning OCT2 yoki MATE1ni ifodalovchi HEK293 hujayralariga, ayniqsa, 0.1–0.5 uM gacha past konsentratsiyalarda soʻrilishini inhibe qila oldi. . Xuddi shunday, granisetron, tropisetron va dolasetron ham har bir tashuvchini inhibe qila oldi (lekin yuqori konsentratsiyalarda). OCT2/MATE1 er-xotin transfektsion MDCK hujayralaridan foydalanib, ondansetron bazolateraldan apikalgacha ASP plyus sekretsiyasini sinovdan o'tgan barcha kontsentratsiyalarda (0,5-20 uM) inhibe qildi, bu faqat palonosetron, tropisetron va dolasetron uchun yuqori konsentratsiyalarda kuzatildi. Zondli floresan substrat yordamida olingan bu ma'lumotlar OCT2- va MATE1-vositachilik bilan dori vositalarining 5-HT3 antagonistlari bilan o'zaro ta'sirini ko'rsatadi.
OCT2/MATE1 qo'sh transfektsion hujayralarda hosil qilingan ma'lumotlar HEK293 ma'lumotlariga asosan mos keladi, granisetron bundan mustasno. Ondansetron, palonosetron va tropisetron HEK293 hujayralarida kuzatilgan MATE1 inhibisyoni bilan kuzatilgan potentsiallarni aks ettiruvchi ASP plus ning B dan A ga tashilishining konsentratsiyaga bog'liq inhibisyonini ko'rsatdi. Ajablanarlisi shundaki, granisetron OCT2/MATE1 MDCK hujayralarida, hatto OCT2 yoki MATE1 ni ifodalovchi HEK293 hujayralarida kuzatilgan IC50 kontsentratsiyasidan besh baravar yuqori konsentratsiyalarda ham sezilarli inhibisyonni ko'rsatmadi. MDCK hujayralari HEK293 hujayralaridan ko'ra ko'proq mahalliy quvurli hujayralarga o'xshashligi sababli, OCT2 yoki MATE1 yoki potentsial boshqa tashuvchilarning endogen tashuvchi ortologlari ifodasi tufayli granisetronning joylashishi o'zgarishi mumkin. Masalan, MDCK hujayralari itlarning P-glikoprotein tashuvchisini [25] yuqori darajada ifodalaydi, bu esa granisetron oqimiga olib kelishi mumkin. Inson MDR1/ABCB1 tashuvchisidagi bitta nukleotid polimorfizmi qusishni davolashda granisetronning klinik samaradorligini oshirganligi bu taxminni tasdiqlaydi [26]. Ushbu ma'lumotlar granisetronning MATE1 tashuvchisi ta'sirida hujayra ichidagi konsentratsiyasining o'zgarishiga olib keladigan it P-glikoproteini uchun substrat bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
OCT va MATE tashuvchilarning substratlari va ingibitorlari o'rtasida juda ko'p o'xshashlik mavjud bo'lsa-da, farqlar mavjud. Transporterga asoslangan dori vositalarining o'zaro ta'siri ko'pincha OCT2 [27-29] uchun ko'rsatilgandek baholanayotgan jabrlanuvchi substratining identifikatoriga bog'liq bo'lishi mumkin. OCT2 uchun katyonik substratni tanlash inhibisyon darajasi va turiga ham miqdoriy, ham sifat jihatidan ta'sir qiladi [27,28]. Bundan farqli o'laroq, tashilgan substratning ko'rinadigan Michaelis konstantasi va MATE1 ni to'rt xil substratda inhibe qilish uchun IC50 qiymatlari o'xshash edi [30]. Ushbu ma'lumotlar hMATE1 ning tashqi yuzasida substratlar va inhibitorlarning o'zaro ta'siri uchun umumiy bog'lanish joyi mavjudligini ko'rsatadi. Natijada, 5-HT3 antagonist dorilarining OCT2 va MATE1 bilan o'zaro ta'siri, umumiy katyonik tabiatiga qaramay, turli mexanizmlar orqali sodir bo'lishi mumkin. Zond substratidan foydalangan holda joriy tadqiqotni rivojlantirish va simetidin, metformin va sisplatin kabi o'ziga xos dori substratlari bilan o'zaro ta'sirini baholash uchun kelajakdagi tadqiqotlar zarur.
Ko'ngil aynishi va qayt qilishning oldini olish uchun 5-HT3 antagonistlaridan tashqari qo'shimcha dorilar sinflari ham qo'llaniladi. Dastlabki tadqiqotlarda biz boshqa antiemetik dorilarning HEK293 hujayralarida OCT2 va MATE vositachiligida ASP plyus tashilishini inhibe qilish qobiliyatini baholadik. Qizig'i shundaki, olanzapin, proxlorperazin va metoklopramid turli konsentratsiyalarda OCT2 faolligini inhibe qilgan (Qo'shimcha rasm S1). Ushbu dorilarning hech biri 10 uM konsentratsiyasida MATE1 faolligini inhibe qilmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Boshqa qusishga qarshi dorilar, jumladan aprepitant va deksametazon, HEK293 hujayralarini ifodalovchi HEK293 hujayralari2- yoki MATE{10}}da ASP plus qabul qilinishiga ta'sir qilmagan (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Natijada, boshqa qusishga qarshi dorilar (olanzapin, proxlorperazin va metoklopramid) 5-HT3 antagonistlari bilan birgalikda kationlarning buyrak sekretsiyasiga ta'sir qilishi mumkin, ayniqsa ularning OCT2 so'rilishini inhibe qilish qobiliyati.
In vitro modellari insonda endogen tashish xususiyatlarini qanchalik yaxshi takrorlashini hisobga olish muhimdirbuyraklar. Odamning OCT2 va MATE1 oqsillari darajalari avval LC-MS/MS tomonidan ikki marta transfektsion MDCK hujayralarida aniqlangan (hOCT2 va hMATE1 mos ravishda 28,6 va 6,9 fmol/ug membrana oqsili edi) [31]. Taqqoslash uchun, inson buyragi korteksi va inson buyragi membranalarida oqsil ekspressiyasini aniqlash bo'yicha tadqiqotlar ikki tashuvchi o'rtasidagi ifodada oddiyroq farqni yoki undan ham kattaroq MATE1 ifodasini (OKT2 7,4 pmol/mg, MATE{14) aniqlaydi. }},1 pmol/mg) [22] va (OKT2 5 fmol/ug, MATE1 10 fmol/ug) [32]. In vitro modellar va OCT2 va MATE1 ning insonning endogen ifodasi o'rtasidagi bu farqlarni hisobga olish va buyraklardagi potentsial katyonik dorilar o'zaro ta'siri uchun fiziologik asoslangan farmakokinetik modellarni ishlab chiqishda hisobga olish kerak.
Hozirgi tadqiqot asosan katyonik dorilarning buyrak sekretsiyasiga qaratilgan. Shu bilan birga, jigar ham OCT1 va MATE1 ni ifodalashini tan olish kerak, bu esa katyonik kimyoviy moddalarning safro yo'li bilan tozalanishini ta'minlaydi. Bu juda muhim, chunki 5-HT3 antagonistlari tuzilishi, metabolizmi, oqsil bilan bog‘lanishi va klirens yo‘llari bilan farqlanadi. Strukturaviy jihatdan, 5-HT3 retseptorlari antagonistlari tarkibida asosiy amin, aromatik yoki geteroaromatik halqa tizimi va aromatik hududga oʻxshash karbonil (yoki shunga oʻxshash tuzilma) mavjud (1-rasm) [33]. Ta'kidlash joizki, amin qismining tuzilishi ondansetron uchun farq qiladi va imidazolni o'z ichiga oladi, holbuki 6-a'zo halqalar boshqa 5-HT3 antagonistlariga kiritilgan. Ushbu tuzilmaviy farqlarning OCT2 va/yoki MATE1 bilan o‘zaro ta’siriga bog‘liqligi qo‘shimcha tekshirishni talab qiladi, ammo undansetronning past konsentrasiyalarda sezilarli ta’sirini tushuntirishi mumkin. Bundan tashqari, ba'zi 5-HT3 antagonistlari keng qamrovli ravishda tozalanadibuyraklarota-onalar yoki metabolitlar (masalan, palonosetron va tropisetron) sifatida. Ko'pgina 5-HT3 antagonistlari (jumladan, ondansetron, tropisetron, palonosetron va granisetron) jigarda sitoxrom P450 fermentlari tomonidan yuqori darajada metabollanadi (48-95 foiz). So'nggi paytlarda o'tkazilgan tadqiqotlar metabolitlarning dori-darmon o'zaro ta'sirida ilgari o'ylanganidan ko'ra ko'proq rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatdi [34]. OCT2 va MATE1 tashilishining asosiy metabolitlari 5-HT3 antagonistlarining asosiy tizimli ta'sirining 25 foizidan oshib ketishi bilan keyingi sinovdan o'tish kafolatlanadi. Xuddi shunday, kimyoviy sinfda qisqa muddatli yarimparchalanish davriga ega dorilar mavjud (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
In vitro metabolizm va tashuvchi vositali dori-darmon vositalarining o‘zaro ta‘sirini o‘rganish bo‘yicha 2020 FDA yo‘riqnomasiga [35] asoslanib, dori quyidagi hollarda in vivo tashuvchini inhibe qilish potentsialiga ega: Cmax (bog‘lanmagan)/IC50 qiymati 0,1 dan katta yoki teng. Ushbu ko'rsatmalarga asoslanib, ondansetron uchun MATE1 Cmax/IC50 qiymatlari prob substrati sifatida ASP plus dan foydalangan holda potentsial in vivo dori o'zaro ta'sirini ko'rsatadi. Boshqa 5-HT3 antagonistlari uchun IC50 qiymatlarini ularning Cmax qiymatlari bilan solishtirish (yuqori nanomolyardan past mikromolyargacha) hech bo‘lmaganda qurbon substrati sifatida ASP plus bilan dorilarning o‘zaro ta‘siri xavfini ko‘rsatmaydi. Xuddi shunday, biz 5-HT3 antagonistlarining buyrak ichidagi kontsentratsiyasini hozircha bilmaymiz, bu MATE1 dori vositalarining potentsial o‘zaro ta‘sirini baholash uchun muhim bo‘ladi. Ondansetron bilan bog'liq dori vositalarining OCT/MATE substratlari bilan o'zaro ta'sirini baholovchi cheklangan klinik ma'lumotlar mavjud. Masalan, sog'lom odamlarda kreatinin va metformin darajalari buyrak tashuvchisi inhibisyonu tufayli ondansetron tomonidan oshiriladi [21,36]. Qizig'i shundaki, ondansetron nafaqat metforminning buyrak klirensini kamaytirdi, balki glyukoza bardoshlik ko'rsatkichlarini ham yaxshiladi [21]. Boshqa klinik tadkikotlarda ondansetron substrat preparatining nefrotoksikligini oshirishi ma'lum bo'lishicha, tashuvchi vositachi sekretsiyani potentsial o'zgartirishi mumkin.buyrak[37–39]. Ushbu ma'lumotlar birgalikda OCT va MATE tashuvchilarni inhibe qilish orqali ondansetronning dori o'zaro ta'sirini qo'shimcha tekshirishni kafolatlaydi.
Xulosa qilib aytganda, bu in vitro maʼlumotlari shuni koʻrsatadiki, koʻpgina 5-HT3 antagonistlari MATE1 inhibisyoniga nisbatan koʻproq potentsialga ega boʻlib, kationik dorilarning quvurli konsentratsiyasini oshirish potentsialini oshiradi. Bundan tashqari, ondansetron klinik ahamiyatga ega Cmax ga yaqin konsentratsiyalarda prob substratining hujayra ichidagi kontsentratsiyasini, ASP plyusni oshirish uchun etarlicha kuchli edi. Bu ma'lumotlar sichqonlarda o'tkazilgan in vivo tadqiqotlarga mos keladi, bunda ondansetronni bir vaqtda qo'llash bilan sisplatin vositasida nefrotoksiklikning kuchayishi kuzatilgan [19]. Klinik dori-darmonlar bilan o'zaro ta'sir qilish potentsialini baholashning joriy mezonlariga asoslanib, boshqa 5-HT3 antagonistlari, shuningdek, bizning tadqiqotimizda sinovdan o'tgan qusishga qarshi dorilar, terapevtik ta'siri ancha past bo'lganligi sababli, klinik jihatdan ahamiyatli dori-darmonlar bilan o'zaro ta'sir qilish xavfi kamroq bo'lishi mumkin. plazma kontsentratsiyasi va yuqori inhibisyon konstantalari.
4. Materiallar va usullar
4.1. Kimyoviy moddalar
4-(4-(Dimetilamino)stiril)-N-metil piridiniy yodid (ASP plus) Life Technologies (Grand Island, NY, AQSH) kompaniyasidan sotib olindi. Tropisetron Abcamdan (Kembrij, MA, AQSh) sotib olingan. Boshqa barcha kimyoviy moddalar Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh).
4.2. Hujayra chiziqlari va hujayra madaniyati
Bo'sh vektor (EV) nazorati (pcDNK5-transfektsion) va Flp-In inson embrion buyragi (HEK) 293 ta hujayra qatorlari inson MATE1 va OCT2 tashuvchilarini barqaror ifodalaydi, Kaliforniya universitetida doktor Keti Giakomini tomonidan saxovatli tarzda taqdim etilgan. Fransisko. HEK293 xujayralari Dulbecco's Modifed Eagle's muhitida (DMEM) o'stirildi, unga 10% homila sigir zardobi, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penitsillin, 100 ug/ml streptomitsin va 200 ug/ml streptomitsin va 200 ug/mL-Vektortsinsi (B.D.3.g.m.) qo'shildi. 1 plus va pcDNA3.1/Hygro( plus )) va inson OCT2/MATE1 ikki tomonlama transfektsion Madin-Darby it buyragi (MDCK) hujayra liniyalari Vashington, Sietl, VA universitetida doktor Joan Vang tomonidan saxiylik bilan taqdim etilgan. MDCK hujayralari 10 foiz homila sigir zardobi, 500 ug/ml G418 va 200 ug/ml gigromitsin B bilan toʻldirilgan minimal muhim muhitda (MEM) saqlangan. Barcha hujayralar 5 foiz CO2 bilan 37oC namlangan inkubatorda yetishtirildi.
4.3. HEK293 hujayralarida qabul qilish va oqimning inhibisyon tahlillari
OCT2- va MATE1-ortiqcha ifodalangan HEK293 xujayralari shaffof poli-D-lizin bilan qoplangan 24-quduq plitalariga (Fisher Scientific, Hanover Park, IL, AQSH) ekilgan va 24 soat davomida yetishtirilgan. taxminan 90 foizga to'g'ri kelguncha. Oldindan isitiladigan Hankning tamponlangan tuzli eritmasi (HBSS) bilan bir marta yuvilgandan so'ng, hujayralar OCT2 hujayralari uchun turli 5-HT3 antagonistlari bilan yoki hujayra ichidagi MATE1 hujayralari uchun pH 6,5 da HBSS ichidagi 30 mM NH4Cl eritmasida 37oC da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. kislotalanish. OCT2 hujayralariga qabul qilish inkubatsiya muhitida to'g'ridan-to'g'ri 10 mM floresan substrat ASP plyus ta'sirida boshlangan. MATE1 hujayralariga qabul qilish, tarkibida 5-HT3 antagonistlari va 10 uM floresan substrat ASP plus ni o'z ichiga olgan pH 7,4 da HBSS qo'llanilishi bilan boshlandi. Shakerda 37oC da 1 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, 500 uM simetidinni o'z ichiga olgan muzdek sovuq HBSS qo'shilishi bilan substratni qabul qilish to'xtatildi. Media olib tashlandi va muzdek sovuq HBSS bilan to'rt marta yuvildi. Hujayralar 1 foiz Triton X-100 bilan lizing qilindi. Floresansiya Spectramax Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, AQSH) yordamida quyidagi to‘lqin uzunliklarida (qo‘zg‘alish 485 nm/Emissiya 495 nm) aniqlandi. Hujayra ichidagi floresans bicinxonin kislotasi (BCA) tahlili (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, AQSh) yordamida har bir quduqdagi hujayra lizatlarining umumiy oqsil kontsentratsiyasiga normallashtirildi. Tajribalar uch marta, har bir tajribada uch-to'rt marta takrorlandi.
4.4. MDCK-OCT2/MATE1 hujayralarida Transwell tadqiqotlari
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL) epitelial voltli ohmmetr yordamida 150 o*sm2. Qattiq birikmalarning to'g'ri shakllanishi, shuningdek, bazolateral-apikal (B-A) yo'nalishi bo'yicha lusifer sariqning passiv o'tkazuvchanligini o'lchash orqali ham tasdiqlangan. Lucifer sariq (20 uM) 1 soat davomida bazolateral kameraga qo'llanildi va apikal kameradan ommaviy axborot vositalari yig'ildi. Lucifer sariq floresansi 430 nm qo'zg'alish to'lqin uzunligida va 538 nm emissiya to'lqin uzunligida o'qildi. O'rtacha passiv o'tkazuvchanlik (Papp) qiymatlari 7 × 10-7 sm/s ni tashkil etdi, bu adabiyot qiymatlariga mos keladi [40].
Hujayralarni bir marta Hankning tamponlangan tuzli eritmasi (HBSS) pH 7.4 bilan yuvgandan so'ng, yuvish buferini apikal va bazal kameralardan aspiratsiyadan so'ng transport tadqiqotlari boshlandi. Hujayralar 5-HT3 antagonistlari HBSS pH 6 da apikal kamerada.0 va 5-HT3 antagonistlari bilan HBSS pH 7,4 da bazolateral kamerada ASP plus (25 uM) bilan inkubatsiya qilindi va inkubatsiya qilindi. 37 oC da 120 minut. Vaqtga bog'liq bo'lgan hujayralararo tashishni o'lchash uchun apikal kameradan (qabul qiluvchi kamera) inkubatsiya muhitining bir qismi (100 uL) 40, 60, 90 va 120 daqiqada to'plangan va teng hajmdagi yangi tampon bilan almashtirilgan {{ 19}}HT3 antagonisti yoki musbat nazorat qiluvchi kimyoviy asl konsentratsiyada. 120 daqiqadan so'ng, davolash muhiti olib tashlandi va Transwells uch marta muzli sovuq HBSS bilan yuvildi. Hujayralar 1 foiz Triton X-100 bilan lizing qilindi. Floresansiya Spectramax Microplate Reader yordamida quyidagi to‘lqin uzunliklarida aniqlandi (qo‘zg‘alish 485 nm/Emissiya 495 nm). Hujayra ichidagi floresans BCA tahlili yordamida har bir transwelldan hujayra lizatlarining umumiy oqsil kontsentratsiyasiga normallashtirildi. Tajribalar uchta alohida Transwell qo'shimchalarida o'tkazildi.
4.5. Statistik tahlil
Statistik tahlil uchun GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, AQSH) dasturidan foydalanilgan. Km va Vmax nochiziqli regressiya yordamida hisoblangan (Michaelis-Menten fermenti kinetik tenglamasi, (Y=Vmax × X/(Km plus X), eng kichik kvadratlarga mos). ANOVA usuli, keyin bir tomonlama ANOVA va/yoki Dunnettning bir nechta taqqoslash uchun posthoc testi. IC5{6}} qiymatlari chiziqli bo'lmagan regressiya orqali eng kichik kvadratlarga mos ravishda hisoblangan. Farqlar p <0,05 da="" statistik="" ahamiyatga="" ega="" deb="">
Qo'shimcha materiallar:Quyidagilar https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22126439/s1 saytida mavjud.
Muallif hissalari:Konseptualizatsiya, BG, MSJ, LMA; metodologiya, BG, XW; rasmiy tahlil, BG, LMA; resurslar, LMA; yozish - asl qoralama tayyorlash, BG, LMA; yozish— ko‘rib chiqish va tahrirlash, MSJ, LMA; loyiha boshqaruvi, LMA; moliyalashtirish sotib olish, MSJ, EAJ, LMA Barcha mualliflar qo'lyozmaning nashr etilgan versiyasini o'qib chiqdilar va rozi bo'ldilar.
Moliyalashtirish:Ushbu tadqiqot Milliy umumiy tibbiyot fanlari instituti (GM123330 granti) va Milliy Atrof-muhit salomatligi fanlari instituti (Grantlar ES005022, ES007148), Milliy saraton instituti (Grantlar CA072720, CA046934, CA008748 va Milliy diabet instituti) tomonidan moliyalashtirildi. Ovqat hazm qilish va buyrak kasalliklari (Grant DK093903), Milliy sog'liqni saqlash institutlarining tarkibiy qismlari.
Institutsional Taftish kengashi bayonoti: Qo'llash mumkin emas.
Axborotlangan rozilik bayonoti:Qo'llanilmaydigan, qo'llab bo'lmaydigan.
Ma'lumotlar mavjudligi to'g'risidagi bayonot:Qo'llanilmaydigan, qo'llab bo'lmaydigan.
Minnatdorchilik:Biz Keti Giacomini tomonidan yaratilgan HEK293 tashuvchi hujayra liniyalarini va Joan Vangning transfektsion MDCK hujayra liniyalarini juda qadrlaymiz.
Manfaatlar to'qnashuvi:Mualliflar manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qilmaydi.
Ma'lumotnomalar
1. Acara, M.; Rennik, B. Organik kationlarning boshqa organik kationlarning chiqarilishiga ikki fazali ta'siri. J. Farmakol. Exp. U erda. 1976, 199, 32–40. [PubMed]
2. Xoloxan, PD; Ross, CR Buyrak plazma membranasi pufakchalarida organik kationlarni tashish mexanizmlari: 1. Kontratransport tadqiqotlari. J. Farmakol. Exp. U erda. 1980, 215, 191–197.
3. Kinsella, JL; Xoloxan, PD; Pessa, NI; Ross, CR Buyrak kortikal luminal va antiluminal membrana pufakchalarida organik ionlarni tashish. J. Farmakol. Exp. U erda. 1979, 209, 443–450.
4. Wold, JS; Miller, BL Buyrak kortikal bo'laklaridan organik ionlarning chiqishini inhibe qilish. Experientia 1978, 34, 630–631. [CrossRef] [PubMed]
5. Gessner, A.; König, J.; Fromm, MF tashuvchi vositachi dori-darmon o'zaro ta'sirining klinik jihatlari. Klin. Farmakol. U erda. 2019, 105, 1386–1394. [CrossRef]
6. Smit, HS; Koks, LR; Smit, EJ 5- ko'ngil aynishi/qusishni davolash uchun HT3 retseptorlari antagonistlari. Ann. Palliat. Med. 2012, 1, 115–120. [CrossRef] [PubMed]
7. Kostall, B.; Gunning, SJ; Neylor, RJ; Tyers, MB Gvineya cho'chqasida GR38032F, yangi 5-HT3- retseptorlari antagonistining oshqozon bo'shatilishiga ta'siri. Br. J. Farmakol. 1987, 91, 263–264. [CrossRef]
8. Kris, MG; Gralla, RJ; Klark, RA; Tayson, LB. Saratonga qarshi kimyoterapiya olgan bemorlarda qusishga qarshi vosita sifatida foydalanilganda serotonin antagonisti GR-C507/75 (GR38032F) dozasini baholash. J. Klin. Onkol. 1988, 6, 659–662. [CrossRef]
9. Tricco, AC; Blondal, E.; Veronika, AA; Soobiya, C.; Vafai, A.; Fil suyagi, J.; Strifller, L.; Kardoso, R.; Reynen, E.; Nincic, V.; va boshqalar. Kimyoterapiya o'tayotgan bemorlarda serotonin retseptorlari antagonistlarining qiyosiy xavfsizligi va samaradorligi: tizimli ko'rib chiqish va tarmoq meta-tahlili. BMC Med. 2016, 14, 216. [CrossRef]
10. Boelig, RC; Barton, SJ; Sakkon, G.; Kelli, AJ; Edvards, SJ; Berghella, V. Giperemezis gravidarumni davolash uchun aralashuvlar: Cochrane tizimli tahlili va meta-tahlili. J. Matern. Xomilalik neonatal med. 2018, 31, 2492–2505. [CrossRef]
11. Xaque, N.; Naqvi, RM; Dasgupta, M. Ondansetronning operatsiyadan keyingi deliryumning oldini olish yoki davolashda samaradorligi - tizimli tahlil. mumkin. Geriatr. J. 2019, 22, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
12. MakParlin, C.; O'Donnell, A.; Robson, SC; Beyer, F.; Moloney, E.; Bryant, A.; Bredli, J.; Muirhead, CR; Nelson-Pirsi, C.; Nyuberi-Birch, D.; va boshqalar. Homiladorlikda giperemezis Gravidarum va ko'ngil aynishi va qayt qilish uchun davolash usullari: tizimli ko'rib chiqish. JAMA 2016, 316, 1392–1401. [CrossRef] [PubMed]
13. Vang, V.; Chjou, L.; Sun, L. Ondansetron nevraksiyal morfin bilan qo'zg'atilgan qichishish uchun: randomize nazorat ostida bo'lgan sinovlarning meta-tahlili. J. Klin. Farm. U erda. 2017, 42, 383–393. [CrossRef]
14. Yokoi, A.; Mihara, T.; Ka, K.; Goto, T. Operatsiyadan keyingi ko'ngil aynishi va qayt qilishning oldini olishda ramosetron va ondansetronning qiyosiy samaradorligi: sinov ketma-ket tahlili bilan yangilangan tizimli tahlil va meta-tahlil. PLoS ONE 2017, 12, e0186006. [CrossRef]
15. Morse, BL; Kolur, A.; Hudson, LR; Hogan, AT; Chen, LH; Brakman, RM; Sawada, GA; Fallon, JK; Smit, kompyuter; Hillgren, KM. Organik kation tashuvchisi 1 (OCT1) ning farmakokinetikasi 1/2 oktyabrdagi nokaut sichqonlari va turlarning jigardan OKT1-vositachilik bilan qabul qilinishidagi farqi. Dori Metab. Dispos. 2020, 48, 93–105. [CrossRef] [PubMed]
16. Tzvetkov, MV; Saadatmand, AR; Bokelmann, K.; Meyneke, I.; Kayzer, R.; Brokmoller, J. OCT1 polimorfizmlarining hujayralarni qabul qilishga ta'siri, plazma kontsentratsiyasi va 5-HT (3) antagonistlari tropisetron va ondansetronning samaradorligi. Farmakogenomika. J. 2012, 12, 22–29. [CrossRef] [PubMed]
17. Chju, P.; Ye, Z.; Guo, D.; Xiong, Z.; Huang, S.; Guo, J.; Chjan V.; Polli, JE; Chjou, X.; Li, Q.; va boshqalar. Irinotekan 1 (OCT1) va 2 (OCT2) organik kation tashuvchining inhibisyoni orqali morfinning joylashishini o'zgartiradi. Farm. Res. 2018, 35, 243. [CrossRef]
18. Kido, Y.; Matsson, P.; Giacomini, KM. Organik kation tashuvchi vositachilik qilgan buyraklardagi dori-darmonlarning potentsial o'zaro ta'siri uchun retsept bo'yicha dori-darmonlar kutubxonasini yaratish 2. J. Med. Kimyo. 2011, 54, 4548–4558. [CrossRef] [PubMed]
19. Li, Q.; Guo, D.; Dong, Z.; Chjan V.; Chjan, L.; Huang, SM; Polli, JE; Shu, Y. Ondansetron ko'plab toksinlar va ekstruziya oqsillarini (MATE) inhibe qilish orqali sisplatin bilan bog'liq nefrotoksiklikni kuchaytirishi mumkin. Toksikol. Ilova. Farmakol. 2013, 273, 100–109. [CrossRef]
20. Wittwer, MB; Zur, AA; Xuri, N.; Kido, Y.; Kosaka, A.; Chjan, X.; Morrissi, KM; Sali, A.; Huang, Y.; Giacomini, KM. Retsept bo'yicha dori-darmonlarni profillash va hisoblash modellashtirish orqali kuchli, tanlab olingan ko'p dori va toksin ekstruziyasi tashuvchisi 1 (MATE1, SLC47A1) ingibitorlarini kashf qilish. J. Med. Kimyo. 2013, 56, 781–795. [CrossRef] [PubMed]