Buyrak ishemiyasi/reperfuziya shikastlanishining cho'chqa modelida-3-pentraxin vositachiligida komplement faollashuvi
Mar 21, 2022
Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Chiara Divella va boshqalar
ANTRACT
Pentraxinlar - bu bakterial va virusli infektsiyalar paytida patogenlarning opsonizatsiyasi kabi tug'ma immunitet va yallig'lanishda asosiy rolga ega bo'lgan evolyutsion tarzda saqlanib qolgan naqshni aniqlash molekulalari oilasi. Xususan, uzoq Pentraxin 3 (PTX3) qattiq organ transplantatsiyasi paytida qon tomir va to'qimalarning yallig'lanishining bir necha jihatlarini tartibga solishi ko'rsatilgan.
Bizning tadqiqotimiz PTX3 ning buyrak ishemiyasi / reperfuziya (I / R) shikastlanishining cho'chqa modelida Komplement faollashuvining mumkin bo'lgan modulyatori sifatida rolini o'rganib chiqdi. Biz peritubulyar va glomerulyar kapillyar darajalarda I / R jarohati tufayli erta PTX3 konlarini ko'rsatdik. Konfokal lazerli skanerlash mikroskopi CD31 va endotelial hujayralar bilan birgalikda lokalizatsiya qiluvchi PTX3 konlarini aniqladi. Bundan tashqari, PTX3 infiltratsiya qiluvchi makrofaglar (CD163), dendritik hujayralar (SWC3a) va miyofibroblastlar (FSP1) bilan bog'liq edi. Xususan, biz komplementning klassik (C1q vositachiligida) va lektin (MBL vositachiligida) yo‘llarining PTX vositachiligida sezilarli faollashuvini ko‘rsatdik. Qizig'i shundaki, PTX3 konlari endotelial hujayralardagi Komplement terminal kompleksining (C5b-9) faollashishi bilan birgalikda lokalizatsiya qilingan, bu PTX vositachiligida komplement faollashuvi asosan buyrak tomirlari darajasida sodir bo'lganligini ko'rsatadi. Xulosa qilib aytganda, bu ma'lumotlar PTX3 komplement tomonidan qo'zg'atilgan I / R shikastlanishining oldini olish uchun potentsial terapevtik maqsad bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Quyidagiga yozishmalar:Juzeppe Kastelano
Kalit so‘zlar:ishemiya/reperfuziya shikastlanishi, komplement tizimi, pentraxin 3,buyrak, klassik yo'l
Cistanche tubulosa buyrak kasalligining oldini oladi, namunani olish uchun shu yerni bosing
KIRISH
Ishemiya-reperfuziya (I/R) shikastlanishi o'tkir kasallikning asosiy sababidirbuyrakjarohattransplantatsiyadan keyin va komplement tizimining sezilarli faollashuvi bilan tavsiflanadi [1, 2]. Ushbu stsenariyda endotelial hujayralar (EK) I/R dan keyin noto'g'ri tiklanishda muhim rol o'ynaydi, bu esa endotelialdan mezenximaga o'tish (EndMT) orqali erta fibrozga olib keladi [3]. Reperfuziya bosqichida Komplement immunologik va yallig'lanish jarayonlarini boshqaradi, turli xil immun va yallig'lanish kasalliklariga yordam beradi [2-5]. Tug'ma immunitet tizimining gumoral qo'lining boshqa muhim tarkibiy qismlari qon tomir biologiyasida hal qiluvchi rol o'ynaydigan pentraxinlar bilan ifodalanadi [6].
Pentraxinlar multimerik eruvchan oqsillar oilasi [6] boʻlib, tuzilishiga koʻra qisqa va uzun oilalarga boʻlinadi [7]. Evolyutsion tarzda saqlanib qolgan bu oqsillar o'tkir fazali effektorlar bo'lib, yallig'lanishni boshlash uchun sensorlar bo'lib xizmat qiladi va infektsiya paytida plazmada tez ko'payadi [8]. Uzoq pentraxin 3 (PTX3) tug'ma immunitetni himoya qilishda hal qiluvchi ahamiyatga ega bo'lgan va komplement tizimini faollashtirishi mumkin bo'lgan eruvchan naqshni aniqlash molekulasidir [9-11].
Xususan, PTX3 C1q, MBL, Ficolin -2 bilan bog'lanish orqali klassik va lektin yo'llarining faollashuvini keltirib chiqardi va CFH [10-12] orqali muqobil yo'lga ta'sir ko'rsatishi mumkin.
Qon oqimidagi boshqa jigar tomonidan ishlab chiqariladigan pentraxinlardan (ya'ni CRP) farqli o'laroq, PTX3 yallig'lanish joyidagi rezident hujayralar tomonidan, masalan, mononuklear fagotsitlar, dendritik hujayralar, fibroblastlar va parakrin ta'sir ko'rsatadigan EC [9] tomonidan chiqarilishi mumkin. [13]. PTX3 shuningdek, neytrofillarda tayyor shaklda saqlanadi, o'ziga xos granulalarda lokalizatsiya qilinadi va mikrobial qismlarning tan olinishiga javoban chiqariladi [14]. EKda PTX3 ifodasi TNF- va IL-1 tomonidan osonlik bilan induktsiya qilinadi, bu tinch, yallig'lanishga qarshi fenotipdan prokoagulyant va yallig'lanishga qarshi holatga o'tishni ta'minlaydi va shu bilan mikrovaskulyar funktsiyani kuchli tartibga soladi [7, 8] ]. Shuning uchun PTX3 darajalari shunday tasvirlangansurunkalibuyrakkasallik, PTX3 oqsil darajasining oshishi GFRning pasayishi va yurak-qon tomir asoratlari bilan bog'liq bo'lgan, ammo PTX3 ning dastlabki sharoitlarda I / R tomonidan qo'zg'atilgan o'tkir davridagi roli hali ham ma'lum emas.buyrakjarohati [15, 16].
Buyrak yallig'lanish kasalliklarida PTX3 ning roli ikki valentli bo'lib, bir tomondan oqsil boshlang'ich yallig'lanish va shikastlanishga yordam beradigan klassik va lektin yo'llarini faollashtirishi mumkin [10-12]. Boshqa tomondan, PTX3 modulyatsiyalangan komplement faollashuvining N-terminal domeni leykotsitlarning to'planishini susaytirdi va to'qimalarning tiklanishiga yordam beradigan o'tkir buyrak shikastlanishida interstitsial fibrozni inhibe qildi [17-20].
Komplement I/R shikastlanishidan kelib chiqqan o'tkir kasallikning patofiziologiyasida hal qiluvchi rol o'ynaydibuyrakjarohat[21, 22]. Buyrak I / R shikastlanishining cho'chqa modelida biz klassik va lektin yo'llarining ishtiroki bilan EndMT va erta fibrozni qo'zg'atishda Komplement tizimining faollashuvining asosiy rolini ko'rsatdik [23]. Bundan tashqari, biz ushbu komplement yo'llarining rekombinant C1-INH (rhC1INH) tomonidan terapevtik inhibisyoni komplement yotqizishning sezilarli kamayishiga olib kelishini, infiltratsiya qiluvchi yallig'lanish hujayralari va tubulointerstitial shikastlanishning kamayishi bilan birga ekanligini ko'rsatdik [23]. Bu natijalar Delpech PO va boshqalar tomonidan ham tasdiqlangan [24]; C1q, MASP va C4d glomerulyar va quvurli cho'kmalarning sezilarli modulyatsiyasi reperfuziyadan 30 minut o'tgach baholandi, bu C1-INH ning klassik va lektin yo'llariga qarshi turishdagi markaziy rolini ko'rsatadi.
Ushbu tadqiqotda biz PTX3 ning turli xil hujayra manbalarini tavsiflovchi buyrak I / R shikastlanishida erta Komplement faollashuviga vositachilik qilishda PTX3 ning mumkin bo'lgan ishtirokini tekshirdik.
NATIJALAR
PTX3 I/R shikastlanishining cho'chqa modelida endotelial hujayralar va immun infiltratsiya qiluvchi hujayralar tomonidan ifodalanadi.
Birinchidan, biz cho'chqa modelida PTX3 mavjudligini o'rganib chiqdik. Oddiy to'qimalarda juda cheklangan PTX3 konlarini kuzatdik (1A-rasm). I/R shikastlanishi reperfuziyadan 15 minut o‘tgach (1B, 1C-rasm) tubulointerstitial sohada (1E-rasm), peritubulyar kapillyarlarda (1D-rasm; o‘q) va glomerulyar darajalarda (1D-rasm) PTX3 ning diffuz cho‘kishiga sabab bo‘ldi. PTX3 konlari hali ham peritubulyar kapillyarlar darajasida reperfuziyadan 1 soat o'tgach aniqlangan (1G-rasm). Oldingi ishimizda [23] biz I / R shikastlanishining asosiy xususiyatlari quvurli epiteliya hujayralari apoptozi va monositlar, dendritik hujayralar va limfotsitlar kabi infiltratsiya qiluvchi yallig'lanish hujayralarini jalb qilish ekanligini ko'rsatdik. Shunga qaramay, muntazam gistologik baholash (qo'shimcha 1-rasm) bilan biz ko'rsatdikki, 30 daqiqa issiq ishemiya va undan keyin 15 minut davomida reperfuzion sabab bo'lgan erta kanalcha oraliq shikastlanishi, epiteliya epiteliyasiga qaraganda kattaroq kapillyar tiqilishi va fokal sitoplazmatik vakuolatsiyasi bilan tavsiflanadi. holat.
PTX3 konlarining hujayra lokalizatsiyasini yanada tavsiflash va uning yallig'lanish reaktsiyasi va shikastlanishini modulyatsiya qilishdagi potentsial ta'sirini baholash uchun biz er-xotin immuno-bo'yash va konfokal mikroskopiya tahlilini o'tkazdik. PTX3 oqsili ifodasi EK ning ko'p qismida peritubulyar (2A-rasm) va glomerulyar (2B-rasm) kapillyar darajalarda, reperfüzyondan 15 daqiqa o'tgach aniqlandi.
Ma'lumki, I/R shikastlanishi tug'ma va adaptiv immun javoblarning faollashuvining kuchayishi, jumladan, yallig'lanish hujayralarining kasal organga o'tishi bilan tavsiflanadi, bu immunitet hujayralari va Komplement tizimi orqali shikastlanishni yanada kuchaytiradi [25]. Bizning cho'chqa modelimizda, shuningdek, reperfuziyadan 15 minut o'tgach, tubula-interstitsial sohada asosan makrofaglar va dendritik hujayralardan tashkil topgan zich yallig'lanish infiltratini kuzatdik. Biz bu ikkala antigen taqdim qiluvchi hujayralar T0 bilan solishtirganda PTX3 ifodasining kuchayishi bilan tavsiflanganligini aniqladik, chunki biz CD163 plyus /PTX3 plus (2E, 2F, 2K-rasm) va SWC3a plyus /PTX3 plus sonining ko'payishini kuzatdik. (2G, 2H, 2L-rasm) T15 da tubula interstitsial darajasidagi hujayralar.
PTX3 ifodasi I/R shikastlanishida EndMT ga hissa qo'shishi mumkin
Oldingi kuzatishlarda biz I/R shikastlanishi EndMT [26, 27] uchun mas'ul ekanligini ko'rsatdik, bu EK tomonidan o'ziga xos endotelial belgilarning yo'qolishi va fibroblastga xos bo'lgan mezenximal belgilarning ortishi bilan mezenximal fenotipni olish bilan tavsiflanadi. protein 1 (FSP-1), neyronal kaderin (N-kaderin) va alfa-silliq mushak aktini (alfa-SMA). Shunday qilib, biz EC tomonidan PTX3 ifodasi bu jarayonga ta'sir qilishi mumkinligini tekshirdik. Kutilganidek, faollashtirilgan miofibroblastning markerlari sifatida alfa-SMA ifodasini o'rganganimizda, alfa-SMA va PTX3 o'rtasida hech qanday birgalikda lokalizatsiya topilmadi (2C, 2D-rasm). Aksincha, biz kuzatish davrida tubulointerstitial FSP1 plyus / PTX3 plyus miyofibroblastlarning ko'payishini kuzatdik (2K-2M-rasm).
PTX3 konlari komplement tizimining faollashuvi bilan bog'liq
Nihoyat, biz PTX3 konlari Komplementni faollashtirish bilan bog'liqligini tekshirdik. Darhaqiqat, pentraxin oilasining boshqa komponentlarida bo'lgani kabi, PTX3 klassik komplement yo'lining faollashuvini tartibga solishi mumkin [7]. PTX3 va Komplement faollashuvi o'rtasidagi munosabatni aniqlash uchun biz PTX3 va terminalning ifodasini baholash uchun ikki yorliqli immunofluoresansni o'tkazdik. Komplement kompleksi, C5b-9, C9-neoepitopga qarshi qaratilgan antikor yordamida. Biz PTX3 va C5b-9 depozitlarining sezilarli birgalikda lokalizatsiyasini kuzatdik (3A, 3B-rasm). Komplement terminal kompleksi biz ilgari ko'rsatganimizdek, peritubulyar darajada, shuningdek peritubulyar kapillyarlarda va endotelial hujayra qatlamida lokalizatsiya qilingan. PTX3 komplement tizimini klassik va lektin yo'llari orqali faollashtirishi mumkinligi sababli, biz buyrak parenximasida C1q va MBL cho'kmasini baholadik. Qizig'i shundaki, C1q (3E, 3F-rasm) va MBL (3C, 3D-rasm) konlari, avvalroq [23] ta'riflanganidek, asosan interstitsial va kapillyar darajada (3C-3F-rasm) topilgan va PTX3 konlari bilan birgalikda joylashgan.
C1-ingibitor endotelial hujayralardagi PTX3 bog‘lanishiga xalaqit beradi
Oldingi ishimizda [23] biz C{1}}ingibitorini qo‘llash komplement cho‘kishining sezilarli kamayishiga, infiltratsiya qiluvchi yallig‘lanish hujayralari va tubulointerstitial shikastlanishning kamayishiga olib kelganligini ko‘rsatdik. Shuning uchun biz rhC1-INH bilan davolash qilingan hayvonlarda PTX3 ifodasi darajasini tekshirdik. Biz C{4}}ingibitorining infuzioni reperfuziyadan keyingi 15 daqiqadan so‘ng peritubulyar kapillyarlar va interstitsial darajadagi PTX3 konlarini kamaytirganini aniqladik (4A-rasm).
Bundan tashqari, rhC1-INH bilan davolash qilingan hayvonlarda PTX3 konlarining kamayishi endotelial shikastlanishni inhibe qilish bilan bog'liq degan gipotezani qo'llab-quvvatlash uchun biz in vitro tajribalar o'tkazdik va rhC1-INH va PTX3 ning bog'lanishini baholadik. normal sharoitda yoki hujayra stressi mavjudligida ekilgan EK (4B-rasm). FACS tahlili shuni ko'rsatdiki, normal sharoitda EC rhC1-INH va PTX3 ni ham bog'lamadi. Oldingi tadqiqotimizga ko'ra [26], biz bazal sharoitlarga nisbatan H2O2-stimulyatsiya qilingan ECda rhC1-INH ning hujayralar bilan bog'lanishi kuchayganini kuzatdik. Bundan tashqari, rhC1-INH bo'lmasa, PTX3 faollashtirilgan EKni bog'lashi mumkin. Qizig'i shundaki, H2O{14}}faollashtirilgan EK PTX3 va rhC1-INH bilan inkubatsiya qilinganida, biz C1INH PTX3 ulanishini blokirovka qilish orqali EKni himoya qila olganini kuzatdik.
MUHOKAZA
Ushbu tadqiqotda biz buyrak I / R shikastlanishining dastlabki bosqichida PTX3 cho'kmasini va uning EndMT rivojlanishiga qo'shadigan hissasini ko'rsatdik. Qizig'i shundaki, biz PTX vositachiligidagi Komplement faollashuvi asosan qon tomirlar darajasida sodir bo'lishini aniqladik, ular Komplement kaskadining klassik va lektin yo'llarini tanib olish molekulalari C1q va MBL bilan birgalikda lokalizatsiya qilinadi.
I/R shikastlanishi komplement faollashuvi, kislorodsiz radikallar va yallig'lanishga qarshi sitokin ishlab chiqarish bilan tavsiflangan sezilarli yallig'lanish reaktsiyasini keltirib chiqaradi, natijada tomir endoteliyasi va periferik leykotsitlar faollashadi [29, 30]. I/R shikastlanishi paytida komplementning faollashishi komplement komponentlarini shikastlangan va disfunktsiyali EK sirt membranasida cho'kishiga olib keladi, bir vaqtning o'zida anafilatoksinlar hosil bo'ladi va yallig'lanish jarayoni kuchayadi [31]. Yallig'lanish paytida PTX3 tez o'sib boradi va endotelial javobni modulyatsiya qilishda markaziy rol o'ynashi mumkin. Darhaqiqat, PTX3 bir qator kasalliklarda, shu jumladan surunkali qon tomir endotelial disfunktsiyasining potentsial biomarkeri sifatida ko'rsatilgan.buyrakkasallik, preeklampsi va bir qancha qon tomir kasalliklari [7, 16, 17, 32]. Shuningdek, biz PTX3 gemodializ bilan og'rigan bemorlarda arteriovenoz oqma etishmovchiligi kabi boshqa qon tomir asoratlarida ishtirok etishini ko'rsatdik [33]. Ushbu kuzatishlar PTX3 yallig'lanish reaktsiyasi va endotelial disfunktsiya o'rtasida ko'prik bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi [34]. Ushbu tadqiqotlarga muvofiq, biz reperfuziyadan keyin 15 daqiqadan so'ng endotelial darajadagi PTX3 konlarini kuzatdik (2A, 2B-rasm). Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, I/R shikastlanishining dastlabki bosqichida PTX3 miofibroblast markeri FSP-1 (2I, 2J-rasm) bilan birlashadi, lekin faollashtirilgan miofibroblast tomonidan ifodalangan alfa-SMA belgisi bilan emas (2C-rasm, 2D). Birgalikda bu ma'lumotlar I/R hayvonlarida [26] kuzatilgan endotelial disfunktsiya va EndMT jarayoni [35] birinchi navbatda PTX3 ni ifodalovchi EKda sodir bo'lganligini ko'rsatishi mumkin.
PTX3 va yallig'lanish hujayralari o'rtasidagi bog'liqlik keng tarqalgan. Ushbu maqolada biz PTX3 ning asosiy manbai bo'lgan leykotsitlarning interstitsial infiltratsiyasida PTX3 ning o'ziga xos ta'siriga alohida e'tibor qaratdik [36]. Xususan, biz makrofaglar va dendritik hujayralarni reperfüzyondan keyin 15 daqiqadan so'ng topdik, PTX3 ning yuqori darajasini ifodalaydi (2E-2H-rasm). Ushbu ma'lumotlar ortib borayotgan dalillar to'plamiga mos keladi, bu I/R shikastlanishida erta zararni bartaraf etishda tug'ma immunitetning tegishli rolini ko'rsatadi [23]. I/R shikastlanishidan so'ng buyrak to'qimalarida komplementning erta faollashishi immun hujayralarini jalb qilishni kuchaytiradigan bir nechta yallig'lanish vositachilarining paydo bo'lishiga olib keladi [21, 23, 37, 38]. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar PTX3 ni I/R shikastlanishi natijasida kelib chiqqan yallig'lanish reaktsiyasini tartibga soluvchi tarmoqning asosiy komponentlaridan biri sifatida aniqladi [39]. I/R shikastlanishining turli eksperimental modellarida PTX3 ma'lum to'qimalarda ikki tomonlama qarama-qarshi rollarni bajarishi mumkin [40, 41]. PTX3 ning erta ishlab chiqarilishi buyrakning shikastlanishi bilan bog'liq, chunki u mahalliy noto'g'ri yallig'lanish reaktsiyasini tezlashtiradigan endotelial adezyon molekulalari va kimyokinlarning erta ifodalanishini keltirib chiqaradi.
Aksincha, uzoq muddatli mahalliy PTX3 ishlab chiqarilishi organlarning haddan tashqari yallig'lanishi va disfunktsiyasini oldini oladi [41].
PTX3 - komplement kaskad modulyatori [9, 42]; Bu PTX3 ning pleiotropik xususiyatlariga mos keladi, bu PTX3 ning tug'ma immunitet reaktsiyasining modulyatori yoki kuchaytiruvchisi sifatida ikki tomonlama rolini ko'rsatadi [39]. Dastlab, PTX3 C1q va MBLni bog'lash orqali Komplementni faollashtiradi [43]; ammo, erta kuchaygan yallig'lanishni maqsadli hudud bilan cheklash kerak. Shuning uchun, PTX3, H omilini jalb qilish yoki angiogenezni inhibe qilish orqali, shuningdek, yallig'lanish reaktsiyasini kamaytirishi va buyrak parenximasini yallig'lanish shikastlanishidan saqlab qoladigan faollashuvni to'ldirishi mumkin [43]. Kemiruvchilarda I/R da komplement faollashuvi asosan tubulyar darajada lokalizatsiya qilingan bo‘lsa-da [44], reperfuziya bosqichida endoteliy turli yallig‘lanishga qarshi vositalar, shu jumladan Komplement mediatorlarining asosiy maqsadi hisoblanadi [2]. Biz ilgari I / R shikastlanishining cho'chqa modelida, shuningdek, DGF bemorlarida Komplement tizimining faollashishi erta bosqichda, peritubulyar kapillyarlarda, interstitsial ichida va glomerulyar endoteliyda sodir bo'lishini ko'rsatdik [23]. Bizning ma'lumotlarimiz reperfuziyadan keyin 15 daqiqadan so'ng PTX3 plus ECda C5b-9 konlarining aniq birgalikda lokalizatsiyasini ko'rsatdi (3A, 3B-rasm). Shuning uchun buyrak endoteliyasi klinik va klinik sharoitda I/R shikastlanishining dastlabki bosqichida PTX vositachiligida komplement faollashuvining keng tarqalgan joyi bo'lib tuyuladi.
Pentraxinlarning C1q bilan o'zaro ta'siri va uning klassik Komplement yo'lini faollashtirishdagi roli yaxshi tasvirlangan [45-47]. Tug'ma immun javoblar kontekstida PTX3 turli Komplement komponentlarini bog'lashi va Komplementning faollashuvini modulyatsiya qilishi mumkin [43, 48]. PTX3 komplementni C1q ulanishi orqali faollashtiradi [49]. Hayvonlar modelidagi natijalarimiz PTX3 ning C1q bilan o'zaro ta'sir qilish orqali klassik yo'l faollashuviga vositachilik qilishi mumkinligini aniq ko'rsatdi (3E, 3F-rasm). Bundan tashqari, PTX3, shuningdek, 3C, 3D-rasmda ko'rsatilganidek, Komplementning lektin yo'lini modulyatsiya qiladi. MBL PTX3 ni kollagenga o'xshash domen orqali bog'laydi [45] va MBL/PTX3 komplekslari C1q ni jalb qiladi va maqsadli hujayra yuzalarida C3 va C4 cho'kmasini keltirib chiqaradi.
Umuman olganda, bu natijalar vositachilikda PTX3 ning markaziy rolini ko'rsatadibuyrakI/R shikastlanishidagi shikastlanish, bu buyrak I/R shikastlanishida Komplementga yo'naltirilgan terapiya uchun muhim oqibatlarga olib kelishi mumkin.
Oldingi tadqiqotimizda [26], biz klassik va lektin komplement yo'llari proteazlarining kuchli inhibitori bo'lgan C1-INH ning rekombinant shaklini qo'llash orqali EK faollashuviga vositachilik qilishda komplement ishtirokini tekshirdik (C1r, C1s, va MASP2). Xuddi shu hayvon modelida biz (4A-rasm) ikkala yo'lning rhC1INH tomonidan terapevtik inhibisyonu reperfuziyadan keyin 15 daqiqadan so'ng peritubulyar kapillyarlar va interstitsial darajadagi PTX3 konlarini kamaytirganini ko'rsatdik. ECda in vitro natijalari bilan tasdiqlangan ushbu ma'lumotlar (4B-rasm) bizni rhC1INH PTX3 ulanishini blokirovka qilganda shikastlangan EKni himoya qilishi mumkin degan farazga olib keldi. Adabiyotda C1-INH ning faollashgan endoteliyda ifodalangan selektinlar, xususan P va E-selektinlar deb ataladigan endotelial adezyon molekulalari bilan bog'lanishi haqida dalillar mavjud [50, 51]. EK ga bu bog'lanish yallig'lanish paytida endotelial-leykotsitlar o'zaro ta'siriga xalaqit berishi mumkin va u yana bir muhim yallig'lanishga qarshi mexanizmdir [50, 51]. Shuning uchun biz rh-C1INH faollashtirilgan EKni bog'lashi va komplement faollashuvi va yallig'lanish jarayonining mahalliy regulyatsiyasiga vositachilik qilishi mumkinligini taxmin qildik. Oldingi tadqiqotlarimizda biz komplementning I / R shikastlanishi va boshqa immun vositali buyrak kasalliklarida ishtirok etishini ko'rsatdik [38, 52-54]. Hayvonlarning ushbu modelida komplementni faollashtirish mexanizmlari inson sharoitida kutilgan ma'lumotlarni talqin qilish uchun muhim ahamiyatga ega bo'lishi mumkin. Komplementni faollashtirishga qaratilgan terapevtik aralashuvlarni muvaffaqiyatli ishlab chiqish uchun [36, 54], klinik sharoitda sodir bo'ladigan narsalarga nisbatan cho'chqa ma'lumotlarining haqiqiyligini aniqlash kerak. Ushbu tadqiqot faqat kuzatuv tadqiqotlari bilan cheklanganligi sababli, yangi terapevtik strategiyalarni ta'kidlashi mumkin bo'lgan PTX3 va Komplement o'rtasidagi o'zaro bog'liq mexanizmlarni aniqlash uchun qo'shimcha tajribalar talab qilinadi. Yuqoridagi natijalarga ko'ra, bizning ma'lumotlarimiz PTX3 komplement vositachiligidagi I / R shikastlanishining ko'p jihatlarini tartibga solishi va bu potentsial terapevtik maqsadni ifodalashi mumkin bo'lgan gipotezani qo'llab-quvvatlaydi.
MATERIALLAR VA USLUBLAR
Buyrak I/R jarohati cho'chqa modeli
Buyrak I/R shikastlanishining hayvonlar modeli ilgari tasvirlanganidek ishlab chiqilgan [23]. Sog'liqni saqlash vazirligining axloqiy qo'mitasi tomonidan ma'qullangandan so'ng, 4-oylik urg'ochi yirik oq cho'chqalar (n=8, guruh uchun n=4, 20 kg) tekshiruvdan o'tkazildi. umumiy behushlik ostida eksperimental ochiq jarrohlik amaliyoti. Hayvonlar behushlik kiritilishidan oldin 24 soat davomida ro'za tutdilar. Elektrokardiogramma, yurak urish tezligi, kislorodning gemoglobin bilan to'yinganligi, nafas olish gazlari tarkibi, nafas olish tezligi, nafas olish hajmi, havo yo'llari bosimi, sistolik arterial qon bosimi va markaziy venoz bosim doimiy ravishda kuzatilib, avtomatik ravishda qayd etilgan (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Xelsinki, Finlyandiya) . Chap buyrak arteriyasi va venasi ajratilgan va buyrak arteriyasi atrofida to'g'ri burchakli qisqich bilan tomir halqasi joylashtirilgan. Ishemiyadan oldin buyrak biopsiyasi o'tkazildi (T0). Keyin, tomir halqasini tortib, ishemik faza (30 minut) qo'zg'atildi. Keyin reperfüzyondan keyin 15, 30 va 60 daqiqada bir nechta biopsiya o'tkazildi; hayvonlar jarrohlik amaliyotidan 24 soat o'tgach qurbon qilingan. Har bir biopsiya namunasining bir qismi darhol optimal kesish harorati (Tissuetek, Pitsburg, PA) muhitida muzlatilgan va suyuq azotda saqlanadi. Yana bir qismi tamponlangan formalinda (4 foiz) 12 soat davomida mahkamlangan va standart protseduralar yordamida kerosinga solingan.
Mikroskopiyani o'rganish
Buyrak biopsiyalaridan kerosin o'rnatilgan buyrak namunalari an'anaviy gistologik bo'yash uchun ishlatilgan (H&E, davriy kislota-Schiff). Tasvirlar Aperio ScanScope CS2 qurilmasi (Aperio Technologies, Vista, CA, AQSh) tomonidan olingan. Tubule-interstitsial va glomerulyar lezyonlar kelib chiqishini bilmagan ikkita kuzatuvchi (CD, MR) tomonidan sifatli tahlil yordamida baholandi.
Antikorlar
Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan asosiy antikorlar quyidagi antijenlarni tan oldi: PTX3 (MNB4: PTX3 N-terminal domeniga qarshi to'g'ridan-to'g'ri, Exira Life Sciences In., Larsen, Shveytsariya); CD163 (monotsitlar/makrofaglar, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritik hujayralar, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblastga xos protein 1, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya); alfa-silliq mushak aktini (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, AQSH); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Buyuk Britaniya); MBL (3E7: to'g'ridan-to'g'ri MBL karbongidratni tanib olish domeniga qarshi, Hycult biotechnology, Uden, Niderlandiya) va C9 neoantigen (aE11, Hycult biotechnology). O'zaro reaktivlik aniq antikorlarni ishlatishdan oldin ularni ko'paytirish uchun ishlatiladigan inson peptidlari bilan oldindan inkubatsiya qilish orqali tasdiqlangan. Oldindan inkubatsiya cho'chqa to'qimalarida o'ziga xos bo'yashni bekor qildi.
To'qimalarning immunofluoresansi va konfokal lazerli skanerlash mikroskopiyasi
PTX3 signalining xarakteristikasi va lokalizatsiyasi OCT muhitiga (Tissue-Tek) kiritilgan muzlatilgan to'qimalarda tekshirildi. Slaydlar 5 foizli quyon zardobi bilan 1 soat davomida 37 daraja C da inkubatsiya qilindi. Keyin slaydlar maxsus antikorlar bilan xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. PBSda uchta yuvishdan so'ng slaydlar tegishli ikkilamchi antikorlar (Alexa Flour 488 va 555, Molecular Probes, Eugene, OR) bilan inkubatsiya qilindi. Barcha bo'limlar TO-PRO-3 (molekulyar problar) bilan bo'yalgan. Salbiy nazoratlar ahamiyatsiz antikorlar bilan tayyorlangan. Bo'limlar Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Germaniya) konfokal lazerli skanerlash mikroskopi yordamida tahlil qilindi. Infiltratsiya qiluvchi hujayralar soni kamida 10 ta yuqori quvvatli (x630) maydon/bo'limda slaydlarning kelib chiqishini ko'rmagan ikkita mustaqil kuzatuvchi tomonidan o'lchandi. Yakuniy hisoblar ikkita o'lchovning o'rtacha qiymati edi. Hech qanday holatda kuzatuvchilar o'rtasidagi o'zgaruvchanlik 20 foizdan yuqori emas edi.
Hujayra madaniyati va oqim sitometriyasini tahlil qilish
Inson kindik venasi endotelial hujayralari (HUVEC, EC) American Type Culture Collection (ATCC-LGC standartlari, Sesto San Giovanni, Italiya) dan sotib olingan. EC tavsiya etilgan ommaviy axborot vositalarida, EndoGroda (Merck Millipore, Darmshtadt, Germaniya) yetishtirildi. EK 1{{10}},000hujayra/sm2 zichlikda qoplangan va H2O2 bilan ishlov berish bilan stimulyatsiya qilingan (3 foiz, 1 soat). Keyin bazal va stimulyatsiya qilingan EK ikki marta PBS bilan yuvildi va PBS-EDTA 2mM va tripsin 0.001 × bilan olib tashlandi. Keyin hujayralar PBSda qayta suspenziya qilindi va mos ravishda PTX3 (rekombinant inson PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Germaniya) (1ug/ml) yoki/va rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5ug) bilan inkubatsiya qilindi. /ml) 60 daqiqa davomida. PBS 1X bilan uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar oqim sitometriyasida (FACS) buferda (fosfat-buferli sho'r suv, pH 7,2, 0,2 foiz sigir zardobi albumini va 0,02 foiz natriy azid) qayta suspenziya qilindi va FCR blokirovka qiluvchi reagent (Miltenyi Biotec) bilan inkubatsiya qilindi. Xona haroratida 10 daqiqa. Bloklangandan so'ng, EClar quyonlarga qarshi insonga qarshi C1-INH (Leyden universiteti professori M.Daha tomonidan taqdim etilgan, 1/100 suyultirish) yoki/va kalamushlarga qarshi PTX3 (MNB4, Exira Life) bilan inkubatsiya qilindi. Sciences In., 1/20 suyultirish) xona haroratida 30 daqiqa davomida va FACS buferi bilan yuviladi. Keyin hujayralar echkiga qarshi quyon IgG PE (Molekulyar problar, 1/100 suyultirish) yoki/kalamushga qarshi IgG FITC (Molekulyar problar, 1/100 suyultirish) bilan xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va uch marta yuvildi. Hujayralar FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, AQSH) va Kaluza dasturi bilan tahlil qilindi. Ijobiylik maydoni izotipga mos keladigan mAb yordamida aniqlandi va har bir namuna uchun jami 104 ta hodisa olindi. Uchta mustaqil tajriba o'tkazildi.
Statistik tahlil
Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida taqdim etiladi va kerak bo'lganda dispersiya tahlili yoki juftlashtirilgan Student t-testi yordamida taqqoslanadi. Agar p qiymatlari 0 dan kichik bo'lsa, farqlar statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblanadi.05. Ma'lumotlar Statview dasturiy paketi (5.0 versiyasi) (SAS Inc. Co., Cary, NC, AQSh) yordamida tahlil qilindi. Grafiklar GraphPad Prism Software 5 yordamida namoyish etildi.
Qisqartmalar
I/R: ishemiya/reperfuziya; EK: endotelial hujayralar; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: fibroblastga xos oqsil 1; N-kaderin: neyronal kaderin; alfa-SMA: alfa-silliq mushak aktini.
MUALFOLAR HISSALARI
CD tadqiqotni muvofiqlashtirdi, buyrak bo'limlarining immunobeling va konfokal mikroskopiyasida ishtirok etdi va qo'lyozmani tuzdi. AS va RF tadqiqotni loyihalashda ishtirok etdi, ma'lumotlarni tahlil qilishga hissa qo'shdi, in vitro tajribalarini o'tkazdi va qo'lyozmani tanqidiy qayta ko'rib chiqdi. MR va GSN histopatologik tasvir tahlilini o'tkazdi. LL, FS, AMC ishemiya-reperfuziya shikastlanishining hayvon modelini amalga oshirdi va qo'lyozmani qayta ko'rib chiqishga yordam berdi. GL, PD va MB barcha jarrohlik muolajalarini cho'chqa modelida amalga oshirdi va qo'lyozmani qayta ko'rib chiqishga yordam berdi. MRD, P.vdP., C.vK. va FS qo'lyozmani qayta ko'rib chiqdilar.
PP, ER, GG, GS va LG qo'lyozmani tanqidiy qayta ko'rib chiqdilar. GC yangi tahliliy vositalarni taqdim etdi, tadqiqotni ishlab chiqdi va nazorat qildi. CD, AS va RF ushbu tadqiqotga teng darajada hissa qo'shdi. Barcha mualliflar maqolaga o'z hissalarini qo'shdilar va taqdim etilgan versiyani tasdiqladilar.
MAQDAT
Favqulodda vaziyatlar va organlarni transplantatsiya qilish bo'limining buyrak, dializ va transplantatsiya bo'limidan Klaudiya Kurciga minnatdorchilik bildiramiz.
Bari universiteti mukammal texnik yordam uchun.
MANFATLAR to'qnashuvi
Mualliflar manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qiladilar.
MOLIYALASH
Ushbu tadqiqot Bari "Aldo Moro" universiteti, Italiya Sog'liqni saqlash vazirligi tomonidan qo'llab-quvvatlandi (GR 2016- 02362239 "Transkriptomikaga asoslangan yondashuv, transplantatsiyaning kechikishi uchun prognoz qiluvchi omillar va terapevtik maqsadlarni aniqlash uchun.buyraktransplantatsiya oluvchilar", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD ushbu loyiha bo'yicha stipendiya oldi) va Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-faoliyati 2 ASga berildi
ADABIYOTLAR
1. Bonventre QK, Yang L. Ishemik o'tkir hujayrali patofiziologiyabuyrakjarohat. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.
2. Jang HR, Rabb H. Ishemik o'tkir davrda tug'ma immun javobbuyrakjarohat. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.
3. Riklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Komplement: immunitetni nazorat qilish va gomeostaz uchun asosiy tizim. Nat immunol. 2010; 11:785–97.
4. Turman JM, Holers VM. Inson kasalliklarida muqobil komplement yo'lining markaziy roli. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID: 16424154
5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Kantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Yallig'lanish va to'ldiruvchi tizim: o'tkir o'rtasidagi bog'liqlikBuyrakShikastlanish va surunkali transplantatsiya shikastlanishi. Old immunol.
2020; 11:734.PMID: 32457738
6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Tug'ma immunitetda pentraxinlar: PTX3 dan darslar. Hujayra to'qimalarining Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616
7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) uning tuzilishi, ta'sir mexanizmi va klinik ta'siri nuqtai nazaridan. Otoimmunitet. 2012; 45:119–28.PMID: 21988562
8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3 (PTX 3): yallig'lanish reaktsiyasining endogen modulyatori. Yallig'lanish vositachilari. 2012; 2012:920517.PMID:22577258
9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxinlar tug'ma immunitet, yallig'lanish, matritsaning cho'kishi va ayolning tug'ilishi o'rtasidagi chorrahada. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574
10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Uzoq pentraxin PTX3 humoral naqshni aniqlashning prototip retseptorlari sifatida: hujayrali tug'ma immunitet bilan o'zaro ta'sir. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471
11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Fikolin-2 va pentraxin 3 o'rtasidagi sinergiya tug'ma immunitetni tanib olish va to'ldiruvchi birikmani kuchaytiradi. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990
12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 o'simtadagi immunoflogozni modulyatsiya qiladi. mikro muhit va aniq hujayrali buyrak hujayrali karsinomasi bo'lgan bemorlar uchun prognostik omil hisoblanadi. Qarish (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771
13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Uzoq pentraxin PTX3 so'ng to'qimalarning yallig'lanishi uchun juda muhimdir
sichqonlarda ichak ishemiyasi va reperfuziya. Men J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566
14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Kassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Humoral naqshni aniqlash retseptorlari PTX3 neytrofil granulalarida saqlanadi va hujayradan tashqari tuzoqlarda lokalizatsiya qilinadi. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID: 17389238
15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Surunkali bemorlarda plazma pentraxin 3buyrakkasallik: buyrak funktsiyasi, oqsil-energiya, yo'qotish, yurak-qon tomir kasalliklari va o'lim bilan bog'liqlik. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732
16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Uremiyada pentraxin 3 ning aylanma darajalarining ko'tarilishi va to'qimalar ifodasi: endotelial disfunktsiyaning aksi. PLoS One. 2013 yil; 8: e63493.PMID: 23658833
17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Qon tomir biologiyasida eruvchan naqshni aniqlash retseptorlari PTX3 ning roli. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID: 17760835
18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. PTX3 va SAP pentraxinlari tug'ma immunitet, yallig'lanishni tartibga solish va to'qimalarni qayta qurish. J Gepatol. 2016; 64:1416–27.
19. Xiao Y, Yang N, Chjan Q, Vang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 IL -6/Stat3 yo'lini bostirish orqali o'tkir buyrak shikastlanishidan kelib chiqqan interstitsial fibrozni inhibe qiladi. Yallig'lanish. 2014; 37: 1895–901.PMID: 24854162
20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. Uzoq pentraxinning "shirin" tomoni: glikozillanish tug'ma immunitet va yallig'lanishda PTX3 funktsiyalariga qanday ta'sir qiladi. Old immunol. 2013 yil; 3:407. PMID: 23316195
