Kaempferol autofagiyani rag'batlantirish orqali LD-mitoxondriyal zararni engillashtiradi: Parkinson kasalligining oqibatlari 1-qism

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Annotatsiya:Rivojlanayotgan dalillar shuni ko'rsatadiki, kutilmagan lipid tomchilari (LD) cho'kishi va peroksidlanish organellalar stressini tezlashtirishi va neyrodegenerativ kasalliklar (NDD) patogenezida hal qiluvchi rol o'ynashi mumkin. Oldingi tadqiqotimizda biz tabiiy flavonoid kichik molekula bo'lgan kaempferol (Ka) LPS tomonidan qo'zg'atilgan Parkinson kasalligi (PD) bo'lgan sichqonlarga neyroprotektiv ta'sir ko'rsatishini tasdiqladik. Bundan tashqari, oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, autofagiya hujayralardagi LD cho'kmasini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi. Joriy tadqiqotda biz Ka ni MPTP / p-induktsiyali PD sichqonlarida neyronlarning yo'qolishi va xulq-atvor etishmovchiligidan himoyalanganligini ko'rsatdik, bu esa substantia nigra pars compacta (SNpc) da lipid oksidlovchi stressning kamayishi bilan birga keladi. Madaniyatli neyron hujayralarida Ka nisbatan xavfsiz kontsentratsiya oralig'ini namoyish etdi va MPP plus tomonidan qo'zg'atilgan LD to'planishi va hujayra apoptozini sezilarli darajada bostirdi. Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Ka ning himoya ta'siri otofagiyaga, xususan lipofagiyaga bog'liq. Tanqidiy jihatdan Ka lizosomalarda LD degradatsiyasiga vositachilik qilish uchun avtofagiyani qo'llab-quvvatladi, bu esa lipidlarning cho'kishi va peroksidlanishini va natijada mitoxondriyal shikastlanishni engillashtirdi, natijada neyronlarning o'limini kamaytiradi. Bundan tashqari, AAV-shAtg5-vositalangan Atg5 yiqitishi PD sichqonlarida Ka ning lipid oksidlanishiga qarshi neyroprotektiv ta'sirini bekor qildi. Ushbu ish shuni ko'rsatadiki, Ka lipid peroksidatsiyasi vositasida mitoxondriyal shikastlanishni inhibe qilish orqali lipid peroksidatsiyasi vositasida lip-ofagiyani rag'batlantirish orqali PDda dopaminerjik neyron degeneratsiyasini oldini oladi va PD va tegishli NDDlar uchun potentsial yangi terapevtik strategiyani taqdim etadi.

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

1.Kirish

Parkinson kasalligi (PD) keng tarqalgan neyrodegenerativ kasallik (NDD) bo'lib, u patologik jihatdan qora substantia pars compacta (SNpc) da dopaminerjik (DA) neyronlarning progressiv yo'qolishi bilan tavsiflanadi. Ushbu kasallikning aniq etiologiyasi va tabiiy yo'nalishi hali to'liq aniqlanmagan bo'lsa-da,ko'pPD patogenezida tizim darajasidagi jarayonlar va disfunktsiyalar, jumladan, mitoxondriyal funktsiyalar, dopamin gomeostazi, neyroinflamatsiya va autofagiya ishtirok etgan. So'nggi hisobotlar lipid tomchilari (LD) bilan bog'liqligini ko'rsatdilipotoksiklikPD patologiyasida ishtirok etishi mumkin [3,4]. LDlar endoplazmatik retikulum (ER) membranasidan chiqadigan va odatda neytral lipidlarni saqlashning hujayra ichidagi joylari bo'lib xizmat qiladigan yuqori dinamik organellalardir [5]. Yaqinda LDlar yog 'kislotalarini (FA) saqlashga qaraganda ancha kengroq rol o'ynashi va ko'plab kasalliklarda ishtirok etishi ko'rsatildi. Masalan, miyeloid hujayralar, shu jumladan makrofaglar, leykotsitlar va eozinofillar yallig'lanish va stressga javoban LD hosil qiladi va LDlar yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarish va saqlash joylari bo'lib, keyinchalik antigen taqdimoti va patogenlarni tozalashda ishtirok etadi [6]. Muhimi, aterosklerozda LDga boy ko'pikli hujayralar kasallikning barcha bosqichlarida zararli ekanligi isbotlangan [7].

Cistanche immunitetni yaxshilashi mumkin

Biroq, LDs markaziy asab tizimida (CNS) keng o'rganilmagan, bir nechta maqolalarda inson miya to'qimalarida LDlarning gistologik mavjudligi haqida xabar berilgan [8,9]. Shunga qaramay, LDlar miyada muhim funktsiyalarga ega bo'lishi mumkin, chunki yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar gliadagi yig'ilgan LDlar Drosophila modelida neyrodegeneratsiyani tezlashtirishini tasdiqladi [10]. Yaqinda sichqonlarda neyronlar, glial fibrillar kislotali oqsil (GFAP) va astrositlar va ionlangan kaltsiyni bog'lovchi adapter molekulasi-1 (IBA{{7}) kabi yog'li qizil rangli O-musbat lipidli hujayralar mavjudligi xabar qilingan. }) plyus mikrogliya miyaning ko'plab mintaqalarida mavjud bo'lib, yoshga bog'liq jarayonlarda ishtirok etishi ko'rsatilgan [1]. Bizning oldingi ishimiz, shuningdek, PD sichqonchasi modelida miyada LD to'planishining ko'payishini ko'rsatdi [12]. Birgalikda olib borilgan ushbu tadqiqotlar LDlarning boshqa NDDlar kabi PD patogenezida ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi.

Odatda, hujayra ichidagi LDlar parchalanadilizosomalarva ozuqa moddalarining kamayishi davrida muqobil energiya manbai sifatida iste'mol qilish uchun mitoxondriyalarga FA etkazib beradi [13]. Biroq, neyronlar energiya ishlab chiqarish uchun mitoxondrial FA iste'mol qilish uchun past imkoniyatlarga ega [14]. Bu xususiyat neyronlarni LD to'planishi va peroksidlanishga ayniqsa sezgir qiladi. Bundan tashqari, LDlarning to'planishi FA oksidlanish tezligini oshiradi va mitoxondriyal elektron tashish zanjiriga doimiy bosim o'tkazadi, bu oksidlovchi stressni kuchaytirish uchun elektron transport zanjiri komplekslari I va II [15] tomonidan reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarishni oshiradi. Lipidlarning ortiqcha yuklanishi, shuningdek, nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidazlar va boshqa oksidlovchi moddalar kabi ekstramitoxondrial manbalar tomonidan ROS ishlab chiqarishga olib keladi.fermentlar. Antioksidant fermentlarning kamayishi va neyronlarda FA iste'mol qilish qobiliyatining pastligi bilan birgalikda, LD to'planishi oksidlovchi stressga vositachilik qiladi va keyinchalik mitoxondriyal shikastlanishga olib kelishi mumkin,lizosomal disfunktsiya, nuqsonli otofagiya va yallig'lanish reaktsiyalarining faollashuvi [6,17]. Agar to'plangan LDlarni inhibe qilish yoki olib tashlash mumkin bo'lmasa, yuqori faol neyronlar neyrodejeneratsiyani keltirib chiqaradigan patofiziologiyaga uchraydi [17]. Dalillar shuni ko'rsatadiki, autofagiya deb ataladigan lizosoma vositachiligidagi katabolik jarayon bir nechta to'qimalarda hujayrali LD gomeostazini saqlashda hal qiluvchi rol o'ynaydi [17,18]. Batafsil ma'lumki, LDlar avtofagosomalarda tanlab sekvestrlanishi va lizosomal kislota lipazalari tomonidan parchalanish uchun lizosomalarga etkazilishi mumkin, bu jarayon maxsus lipofagiya deb nomlanadi [19]. Shu sababli, LDlarni va ularning otofagik olib tashlash yo'lini nishonga olish neyrodejeneratsiyani boshqarish uchun yangi yondashuv bo'lishi mumkin.

So'nggi yillarda NDDni potentsial davolash va strategiyalar uchun manba sifatida tabiiy mahsulotlar va parhez agentlarini o'rganish katta qiziqish uyg'otdi [20]. Kaempferol (Ka) tabiiy polifenolli kichik molekula bo'lib, uni Xitoyning bir qator dorivor o'tlarida va parhez manbalarida topish mumkin [21]. Ka antibakterial, qarishga qarshi va immunomodulyator ta'sir ko'rsatishi, shuningdek, antioksidant va neyroprotektiv ta'sir ko'rsatishi haqida xabar berilgan [20,22,23]. Ilgari, Ka BV2 mikroglial hujayralardagi yallig'lanishni in vitro [24] inhibe qilishi va DA neyronlarining in vivo neyroinflamatsiyaga chidamliligini oshirishi haqida xabar berilgan edi [25]. Biroq, Kaon LDlarning PDga ta'siri hali tekshirilmagan.

LD ning ahamiyatini va PDda ishtirok etadigan LD, mitoxondriya va avtofagiya [16] o'rtasidagi yaqin aloqani hisobga olgan holda, biz Ka LD peroksidatsiyasini inhibe qiladi va PDda DA neyrodejeneratsiyasini oldini oladi, deb taxmin qilamiz. Ushbu tadqiqotda biz Ka ning LD to'planishini inhibe qilish orqali sichqon PD modelida neyrodegeneratsiyadan sezilarli darajada himoyalanganligini ko'rsatdik. Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Ka autofagiyani qo'zg'atdi va mitoxondriyal disfunktsiyani va mitoxondriyal ROS (mtROS) ishlab chiqarishni yumshatish uchun oksidlangan LDlarning to'planishini kamaytirdi va shu bilan neyronlarning apoptotik o'limini oldini oldi. Ushbu tadqiqotda olingan natijalar PD kabi NDDlarda Ka tabiiy molekulasidan foydalanish bo'yicha to'g'ridan-to'g'ri klinik qarorlarni qabul qilishga yordam beradi.

2. Materiallar va usullar

2.1. Eksperimental hayvonlar

C57BL/6J sichqonlari (erkak, 4-oylik) Nankin tibbiyot universiteti hayvon yadrosidan (Nankin) olingan. Sichqonlar Nankin Tibbiyot Universitetining Tibbiyot fakultetining Hayvonlar Resurs Markazida va Nankin Drum Tower kasalxonasidagi hayvonlar bo'limida parvarish qilingan va o'stirilgan, sichqonlar atrof-muhit harorati 22 ° C bo'lgan xonada oziq-ovqat va suvdan erkin foydalanishlari mumkin. 2 daraja C va yorug'lik/qorong'u tsikli 12:12 soat Hayvonlarga oid barcha protseduralar Milliy sog'liqni saqlash institutlari laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha qo'llanmaning ko'rsatmalariga qat'iy muvofiq amalga oshirildi.

2.2. Reaktivlar

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>In vitro tajribalari uchun 99.0 foiz ,96,353) Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh) olingan. BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) Thermo Fisher Scientific'dan xarid qilingan. Hayvonlar tajribasi uchun Ka steril fiziologik eritmada 16% SBE{15}}CDda 10% DMSO eritmasida eritildi. Hujayra tajribalari uchun Ka DMSO (Sigma-Aldrich) va PBS (yakuniy DMSO kontsentratsiyasi 0,01 foiz), pH 7,4 da tayyorlangan.

2.3. Metil{2}}fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP)-induktsiyali PD sichqoncha modelini induksiyalash va davolash

MPTP/p-toksikligining PD modelidagi Ka ning ta'sirini baholash uchun sichqonlar (erkak, 4-5 oylik) sho'r suv bilan davolash qilingan guruhga, MPTP bilan davolash qilingan guruhga, MPTP va Ka bilan ishlov berilgan guruhga tasodifiy bo'lingan. guruh, va Ka yolg'iz davolash guruhi. MPTP bilan davolash qilingan guruhda sichqonlar ilgari tasvirlanganga o'xshash protokol bilan surunkali MPTP administratsiyasini oldilar [26]: MPTP fiziologik eritmada eritildi va teri ostiga 25 mg / kg dozada yuborildi, so'ngra 250 mg / kg probenetsid (dimetil sulfoksidda eriydi) intraperitoneal (ip) in'ektsiya 5 hafta davomida har 3,5 kunda 1 soatlik interval bilan. Nazorat qiluvchi sichqonlar sho'r suv va probenetsid in'ektsiyasini oldi. MPTP plyus Ka bilan davolash qilingan guruhda sichqonlar MPTP bilan davolashdan 3 kun oldin va 5 MPTP dan ortiq har kuni Ka (50 mg/kg, tajribalar davomida bir martalik in'ektsiya, Jingzhu Biotechnology, Nankin, Xitoy) qabul qildilar. in'ektsiya haftalari. Oxirgi MPTP in'ektsiyasidan bir hafta o'tgach, sichqonlar guruhlarga ko'r bo'lgan xatti-harakatlar testidan o'tkazildi. Shundan so'ng, barcha sichqonlar 40 mg / kg natriy pentobarbital bilan behushlik qilindi va miya oqsillarini aniqlash va immunogistokimyo yoki qPCR tahlili uchun qurbon qilindi.

2.4. In vivo stereotaksik jarrohlik va eksperimental muolajalar

Natriy pentobarbital behushligi (40 mg/kg, ip) ostida stereotaksik jarrohlik ta'riflanganidek amalga oshirildi [25]. Sichqoncha Atg5 va nazorat qiluvchi shRNK AAV yaratish uchun qadoqlash vektorlari (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) bilan transfektsiya qilindi. Mikroin'ektsiya uchun anesteziya qilingan sichqonlar stereotaksik apparatga joylashtiriladi. Ularga DG (AP:-0,3 mm; ML:±0,13 mm; DV:-0,45 mm) ga qaratilgan shisha elektrod orqali 1 mkl AAV AOK qilingan. 0,25 mkl/daq. Keyin igna qo'shimcha 2-daqiqada ushlab turildi. Virus mikroin'ektsiyasidan 2 hafta o'tgach, sichqonlar MPTP-induktsiyali PD modeli o'tkazuvchanligiga va (yoki)Ka bilan davolashga duchor bo'ldi.

Atg5 shRNK Hanbio Biotechnology(Shanghai, China) Co., Ltd kompaniyasidan olingan. Atg5 jimjitligi uchun primerlar qo'shimcha 1-jadvalda ko'rsatilgan.

2.5. Xulq-atvor tahlili

MPTP yoki sho'r suvning yakuniy in'ektsiyasidan bir hafta o'tgach, rotarod testi va qutb testi [27] oldin tavsiflanganidek amalga oshirildi. Rotarod testi uchun sichqonlar tajriba boshlanishidan oldin ketma-ket 2 kun davomida kuniga ikki sinovda (12-20 rpm tezlashtirilgan tezlik bilan 6 min) aylanishga moslashtirildi. Keyin sichqonlar ketma-ket boshqa 3 kun davomida 20 rpm da 300 soniya davomida sinovdan o'tkazildi. Yiqilishning kechikishi Rotarod tahlil tizimi (Jiliang, Shanxay, Xitoy) yordamida qayd etilgan. Ustun sinovi uchun sichqonlar vertikal yog‘och ustunning (qo‘pol sirtli, balandligi 50 sm, diametri 1 sm) boshini yuqoriga ko‘tarib qo‘yildi. Barcha sichqonlar sinovdan 2 kun oldin apparatga o'rganib qolgan va keyin uchinchi kuni uch marta sinovdan o'tgan. Umumiy vaqt (T-jami, sichqon to'rtta panjasi bilan polga yetib borguniga qadar) va burilish vaqti (T-burilish, sichqonchani butunlay pastga burish uchun) qayd etildi. Tajriba har bir xulq-atvor testi uchun sichqoncha guruhlariga ko'r bo'ldi va sinov uch marta o'tkazildi.

2.6. Miya namunalari to'plami

Yakuniy xatti-harakatlar testlaridan so'ng, sichqonlar natriy pentobarbital (40 mg / kg, ip) bilan behushlik qilindi. qPCR, western blotting va yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) tahlili uchun hayvonlardan butun miya tezda ajratib olindi, so'ngra o'rta miya va striatum to'qimalari tezda ajratilib, suyuq azot bilan oldindan muzlatilgan. Barcha namunalar tahlil qilinguncha -80 darajada saqlangan.

Immunohistokimyoviy tahlil uchun sichqonlar 4 foizli paraformaldegid (PFA) bilan trans-kardial perfuziya qilingan. Miyalar ekstraksiya qilingan, mahkamlangandan so'ng, suvsizlangan, OCT (Tissue-Tek) ga joylashtirilgan va miyaning ketma-ket bo'limlari muzlatish mikrotomi yordamida har bir qatlam va o'rta miya orqali kriyoseksiya qilingan (har bir tilim uchun 30 mkm) (Leica CM1950, Nusl, Germaniya) ). Barcha bo'limlar oltita alohida seriyada yig'ildi va miya bo'laklari 50 foizli glitserinda saqlangan va tahlil qilinguncha -20 darajada muzlatilgan.

TEM uchun sichqonlar 【12】 ta'riflanganidek 2,5 foiz glutaraldegid va 2 foiz paraformaldegid bilan perfuziya qilingan. Kichik bir qism (<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunogistokimyoviy tahlil

Miya bo'laklari PBS da yuvilib, keyin 3 foiz H2O, 1 0 daqiqa davomida, so'ngra 1 soat davomida 5 foiz BSA qo'shilgan PBSda 0,3 foiz Triton X-100 bilan inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, slaydlar bir kechada 5 foiz BSA o'z ichiga olgan PBSda 4 daraja haroratda bir kechada birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi, so'ngra yuvildi va xona haroratida 1 soat davomida ikkilamchi antikorlarda inkubatsiya qilindi, so'ngra diaminobenzidin (DAB) bilan inkubatsiya qilindi yoki o'rnatildi. DAPI (Life Technologies, Cat P36931) 5 daqiqa davomida immunofluoresan bo'yash sifatida. Nissl bo'yash uchun slaydlar kresil binafsha (CV) eritmasida (0,1 g kresil binafsha, 99 ml H, O va 1 foiz sirka kislotasi 1 ml) birlashtirildi. xona haroratida 30 daqiqa davomida, keyin spirt va ksilen bilan suvsizlanadi. Tasvirlar kuzatildi va fotosuratlar Olympus BX52 mikroskopida (Olympus America Inc., Melville, NY, AQSh) olingan. SNpcdagi TH-musbat va Nissl-musbat neyronlarning umumiy soni MicroBrightField Stereo-Investigator dasturi (MicroBrightField, Williston, VT, AQSh) bilan optik fraksiyalash usuli yordamida serologik usulda olingan.

2.7. Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) tahlili

Sichqonlarning striatal namunalari {0}},1 M perklorik kislota (100 mkl perklorik kislotada 1 mg to'qimalar) va 0,1 mM EDTA bilan bir hil holga keltirildi, ultratovush va santrifüj bilan ishlov berildi. 20,{7}} aylanish tezligida 30 daqiqa davomida xabar qilinganidek [27]. Keyin o'lchash uchun supernatant suyuqliklar yig'ildi. Mobil faza 90 mM monobazik natriy fosfat, 1,7 mM 1-oktan sulfon kislota, 50 mM sitrat, 50 mM EDTA, 0,2 ml/min oqim tezligi bilan 10 foiz asetonitrildan tashkil topgan aralash eritmadir. Parallel ravishda miqdoriy standart egri chiziqni hisoblash uchun dopamin va dihidroksi-fenil sirka kislotasi (DOPAC) (Sigma-Aldrich, AQSH) uchun standart eritma 0,1 M HClO4 da tayyorlandi. 10 ul hajmdagi tayyorlangan supernatant yoki standart eritma yuborildi. mobil fazaga kiritildi va ESA Coulochem ⅢI elektrokimyoviy detektori (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific) tomonidan sinovdan o'tkazildi. Namunalar o'lchandi va cho'qqilar miqdori aniqlandi. Monoaminlarning kontsentratsiyasi ClarityChrom dasturi (Knauer, Germaniya) yordamida standart bilan solishtirish orqali aniqlandi va keyin qatlamdagi tarkib suyultirish nisbatiga ko'ra aylantirildi.DA va DOPAC ning standart egri chizig'i qo'shimcha shakl 1a va b da ko'rsatilgan.

2.8. Hujayra madaniyati va davolash usullari

Mezensefalik birlamchi neyron madaniyati ilgari ta'riflanganidek o'tkazildi [12]. Qisqacha aytganda, 14/15 (E14/15) embrion kunida C57BL/6 sichqonlarining mezensefalik to'qimalari ehtiyotkorlik bilan olib tashlandi, membranalar va yirik qon tomirlarini olib tashlash uchun mexanik ravishda ajratildi. va keyin parchalanadi. Keyin ular tripsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, AQSH) bilan hazm qilindi va keyin bitta hujayrali suspenziya olish uchun 100- mkm filtrdan oʻtkazildi. Keyin hujayralar poli-L-lizin ustiga qoʻyildi. - 2,5×10 darajali hujayralar/ml boʻlgan neyrobazal muhit (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, AQSH) boʻlgan, B27 bilan toʻldirilgan, oldindan qoplangan 12-/24-quduq plitalari (2 foiz v:v, Cat 17504044,GibcoTM) va penitsillin/streptomitsin(0,5 foiz v:v). Kulturalar namlangan kamerada (37 daraja, 5 foiz CO2 inkubatori) saqlangan. Madaniy muhit har 3 kunda almashtirilib turiladi. va hujayralardan 7-10 kunda foydalanish mumkin.

Hujayra liniyalari: SH-SY5Y hujayra liniyalari 10 foiz FBS va 1 foiz penitsillin/streptomitsinda 37 daraja va 5 foiz CO2 namlangan inkubatorda yetishtirildi. Tajribalarda SH-SY5Y hujayralari MPP (200 mkM) yoki turli dozalarda Ka (0,3,30,60,100,300,600 mkM) bilan 24 soat davomida ishlandi. Ka (3,10,30,60mkM,3 h) astarlangan SH-SY5Y hujayralari 24 soat davomida MPp plus (400 mM) bilan rag'batlantirildi. Ka （30 mM, 3 h） (yoki bo'lmasdan) 3-MA （3 mM, 1 h） yoki -tokoferol (50 mkM, 1h, Sigma-Aldrich, 47783) primed-SH-SH5Y hujayralari bilan stimulyatsiya qilindi. MPP plus （200 mM） 24 soat davomida.

2.9. Hujayra hayotiyligi CCK8 tahlili

Ka bilan davolashning o'zgargan hujayra hayotiyligi Hujayralarni hisoblash to'plami-8(CCK-8 Kit, Selleck, Xyuston, TX, AQSh) tomonidan aniqlandi. Qisqasi, SHSY5Y hujayralari 96- ichiga ekilgan. quduq plitasi va keyin 24 soat davomida Ka (3,30,60,100,300,600 mkM) turli konsentratsiyalari bilan ishlov beriladi. Keyin har bir quduqqa 4 soat davomida 10ulof CCK-8 reagent qo'shildi. Nihoyat, absorbans Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) tomonidan 450 nm da aniqlandi.

2.10.ATP tahlili

Hujayradagi ATP darajalari ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Xitoy〕ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq) tomonidan aniqlandi. Davolanishdan so'ng hujayralar lizing qilindi va 12,{1}} rpm tezlikda 5 daqiqa davomida 4 daraja va santrifüj qilindi. supernatantlar yig'ildi.96-quduq plastinkasidagi 20 mkl namunaga ishchi eritma (100 mkl) qo'shildi va lyuminesans darhol avtomatik mikroplata o'quvchida o'lchandi. Barcha namunalardagi o'lchovlar oqsil kontsentratsiyasigacha normallashtirildi.

2.11. Na plus -K -ATPase tahlili

Na plus -K plus -ATPase o'lchovi uchun (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Xitoy) hujayralar ultratovushga o'tkazildi va supernatantni olish uchun 6000 rpm da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Na plus -K plus -ATPase detektorining reaksiya eritmalari qo'shildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq inkubatsiya qilindi. Keyin 660 nm da absorbans aniqlandi. Barcha namunalarning o'lchovlari oqsil kontsentratsiyasiga normallashtirildi.

2.12. Western bloting tahlili

Hujayralar yoki miya to'qimalari RIPA buferida (50 mM Tris(pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 foiz NP-40(FNNO021, Thermo), 0,5 foiz natriyda lizing qilindi. deoksixolat (D6750, Sigma), 0,1 foiz SDS (74255, Sigma) proteaza va fosfataza inhibitörleri (Roche, Shanxay, Xitoy) bilan to‘ldirilgan. Protein kontsentratsiyasi Micro BCA to‘plami (Beyotime, Shanxay, Xitoy) yordamida aniqlangan. A {{13} Har bir namunadagi protein SDS-PAGE orqali poliakrilamid TGX jellari yordamida ajratildi (Bio-Rad, Hercules, Kaliforniya, AQSh) va keyin poliviniliden diftorid (PVDF) membranalariga (Millipore, Bedford, MA) o'tkazildi. Bloklangandan so'ng, PVDF membranalar bir kechada TBSTda 4 daraja haroratda turli o'ziga xos birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilingan, keyin yuvilgan va mos keladigan horseradish peroksidaza (HRP) konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlarda 1 soat davomida xona haroratida inkubatsiya qilingan.Immunoreaktiv tasmalar vizualizatsiya qilingan va kuchaytirilgan xemiluminesans (ECL) plyus aniqlash rea bilan aniqlangan. (Pirs, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) va ImageQuantM LAS 4000 tasvirlash tizimi (GE Healthcare, Pitsburg, PA, AQSh) yordamida tahlil qilingan.

2.13. Haqiqiy vaqtda miqdoriy (Q) - va teskari transkripsiya (RT) - PCR

Jami RNK Trizol reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSh) yordamida miya to'qimalari va madaniyatli hujayralardan olingan. Teskari transkripsiya TAKARA PrimeScript RT reaktiv to'plami (TaKaRa, Yaponiya) yordamida amalga oshirildi. Real vaqtda qPCR StepOnePlus asbobida (Applied Bio-tizimlar) SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) yordamida amalga oshirildi. Primerlar General (Shanxay, Xitoy) tomonidan sotib olingan va tasdiqlangan. QPCR uchun ishlatiladigan primerlar qo'shimcha 2-jadvalda ko'rsatilgan.

2.14. Laktat dehidrogenaza (LDH) tahlili

Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga ko'ra, hujayralar 96-quduq plastinkasiga 5000 hujayra/quduqqa qo'yildi va LDH darajasini tahlil to'plami (Nankin Jiancheng biomuhandislik instituti) bilan o'lchash uchun madaniy muhit yig'ildi. Keyin namunalarning absorbsiyasi Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) tomonidan 450 nm da aniqlandi.

2.15.BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 va MitoTracker chuqur qizil rangga bo'yalgan

Jonli hujayralar PBS bilan yuvildi va 2ug/ml BOD-IPY 493/503(InvitrogenTM, Cat D3922) yoki BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1）（2.0 mkM bilan inkubatsiya qilindi. , InvitrogenTM, Cat D3861）PBS da 15 daqiqa davomida 37 daraja. MitoTracker Deep Red bo'yash uchun jonli hujayralar PBS da 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) bilan 30 daqiqa davomida hujayralar 37 da inkubatsiya qilindi. PBS da ikki marta yuvildi va 10 daqiqa davomida 3,5 foizli PFAda mahkamlandi, so‘ngra Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) bilan 10 daqiqa davomida yuvilib, teskari bo‘yab, tasvirga olish uchun shisha slaydlar ustiga qo‘yildi.Tasvirlar kuzatildi va flüoresan mikroskop yordamida fotosuratlar olindi. (Olimp, Tokio, Yaponiya).

2.16. Hoechst va PI bo'yash

Hujayralar Hoechst 33,342 (1 ul 5 00 ul PBS, Sigma, Cat B2261) va (yoki) PI (0,1 ul 500 ul PBS, Solarbio ichida suyultirilgan) bilan bo'yalgan, so'ngra CA1120 daqiqa davomida mahkamlangan. va floresan mikroskopda (Olimp, Tokio, Yaponiya) kuzatilgan.

2.17. Oqim sitometriyasi

Hujayralar hazm qilindi va D-hank bilan yuvildi, so'ngra Annexin V-FITC (5 ul 5 00ul PBS) / PI (500 ul PBSda suyultirilgan 0,1 ul) apoptoz to'plami (CA1020, Solarbio, Pekin,) bilan bo'yaldi. Chian) ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq. Shundan so'ng, apoptotik hujayralar oqim sitometriyasi yordamida tahlil qilindi (guava easyCyteTM 8, Millipore, AQSh). Mitoxondriyal ROS va mitoxondriyal membrana potentsial o'lchovlari nashr etilgan 【12】 sifatida amalga oshirildi. SH-SY5Y xujayralari MitoSOX (2,5 mkM, Invitrogen, AQSh) yoki iyul (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, AQSH) bilan 37 darajada 30 daqiqa davomida bo'yalgan. Ikki marta PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar oqim sitometrik tahlillari uchun 1 foiz FBS o'z ichiga olgan sovuq PBSda qayta suspenziya qilindi. Ma'lumotlar FCS Express dasturi bilan tahlil qilindi (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, AQSh).

2.18. Dengiz otlarining nafas olish tahlillari

Tirik SH-SY5Y hujayralarida mitoxondrial nafas olish funktsiyasi Seahorse hujayradan tashqari oqim (XFe96) analizatori (Agi-lent, Santa Klara, AQSh) yordamida kislorod iste'moli tezligidagi o'zgarishlar (OCR). SH-SY5Y hujayralari 3 × 103 da urug'langan holda o'lchandi. hujayralar/quduqlar Seahorse hujayra madaniyati plitalariga yopishib olishlari va tajriba vaqtida taxminan 80 foiz qo'shilish darajasiga erishishlari mumkin edi. Ertasi kuni hujayralar Ka bilan oldindan ishlov berildi va keyin yana 24 soat davomida MPp plyusga ta'sir qildi. OCR bazal sharoitda aniqlandi, keyin 1 mkM oligomisin, 1 mkM FCCP, shuningdek, 1 mkM rotenon va antimitsin A qo'shildi.

2.19. Statistik tahlil

Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etildi. Farqning ahamiyati Studentning t-testi, Ikki tomonlama dispersiya tahlili yoki bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va keyin Tukeyning post hoc testi bilan aniqlandi. Farq P da sezilarli deb hisoblangan<>

3. Natijalar

Natija 1. Ka vosita disfunktsiyasini tiklaydi va MPTP/p PD modeli sichqonlarining striatumida dopamin darajasini oshiradi

Kaon PD patogenezining neyroprotektiv ta'sirini o'rganish uchun 4-oylik erkak C57BL/6 sichqonlariga MPTP/p PD modelini yaratish uchun neyrotoksin MPTP yuborildi va Ka bilan davolash qilindi (la-rasm). Model induksiyasidan so'ng, turli guruhlardagi sichqonlarning motor va xatti-harakatlarini baholash uchun rotarod testi va qutb testi ishlatilgan. Ko'rsatilganidek, MPTP bilan davolash qilingan sichqonlarda rotarodning ishlash muddati sezilarli darajada kamaydi va bu ta'sir Ka tomonidan oldini oldi (1b-rasm). Ka, shuningdek, sichqonlarning tana og'irligiga ta'sir qilmasdan, qutb testida aylanish vaqti va umumiy vaqtni qisqartirish bilan ko'rsatilgandek, MPTP tomonidan qo'zg'atilgan xatti-harakatlarning kamchiliklarini tikladi (rasm le). Bundan tashqari, HPLC tahlili shuni ko'rsatdiki, striatumdagi dopamin darajasi MPTP / p-shartli sichqonlarda sezilarli darajada kamaydi va bu daraja Ka bilan davolash orqali tiklandi (1f-rasm. Ka bilan davolash dihidroksida MPTP / p-induktsiyasini ham engillashtirdi. -fenil sirka kislotasi (DOPAC, dopaminning metaboliti) striatumdagi darajalari (1-rasm) Bu natijalar Ka vosita disfunktsiyasini tiklaydi va MPTP qo'zg'atgan PD sichqonlarida striatumdagi dofamin darajasini oshiradi.

Natija 2. Ka MPTP/p PD modeli sichqonlarining SNpc da DA neyronlarining yo'qolishini engillashtiradi

Keyinchalik, Kaon MPTP / p tomonidan qo'zg'atilgan DA neyronal buzilishning neyroprotektiv ta'sirini yanada baholash uchun biz tirozin gidroksilazasini (THD plyus murin SNpcdagi neyronlarni immuno-bo'yash orqali tekshirdik. 2a va b da ko'rsatilganidek, MPTP / p sezilarli pasayishni keltirib chiqardi. TH plyus neyronlar sonida, bu Ka bilan davolash natijasida engillashtirildi.Bundan tashqari, Nissl tomonidan aniqlanganidek, SNpcdagi umumiy neyronlarning stereologik soni.

1-rasm. Ka davolash vosita disfunktsiyasini engillashtiradi va MPTP / p PD modeli sichqonlarining striatumidagi dopamin darajasini oshiradi.

(a) eksperimental loyihaning sxematik diagrammasi. (b) Rotarod sinovi uchun novda ustidagi vaqt ketma-ket uch kun davomida o'lchandi. (cd) Qutbni sinash uchun aylanish (burilish vaqti) va qutbga tushish vaqti (ko'tarilish vaqti) qayd etildi. (e) Tadqiqot oxirida sichqonchaning tana vazni o'lchandi. (fg) Striatumdagi dopamin (DA) va dihidroksi-fenil sirka kislotasi (DOPAC) yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi bilan tahlil qilindi. Ma'lumotlar (b,c,d) da har bir guruh uchun o'rtacha ± SEM.n =9-10 sifatida ifodalanadi; n =6-8 har bir guruh uchun (f, g).ns, muhim emas, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

binoni, TH hujayralarining yo'qolishi hujayra o'limini aks ettiradi, lekin TH ekspressiyasining pasayishini emas, balki Ka bilan davolash MPTP bilan davolash qilingan sichqonlarning SNpcdagi Nissl-musbat neyronlar sonining 43,3 foizdan 25,4 foizgacha kamayishini tiklaganligini ko'rsatdi. Fig.2c va d).Bundan tashqari, Ka Western blotting bilan o'lchangan TH va DAT protein ifodasida MPTP-induktsiyasini sezilarli darajada yaxshiladi (2e-g-rasm). Ushbu dalil Ka ning PD sichqoncha modeliga neyroprotektiv ta'sirini tasdiqlaydi.

Natija 3. Ka MPTP/p bilan ishlov berilgan sichqonlarning SNpc da LD vakuolalarining to'planishi va oksidlovchi stressni kamaytiradi.

Ko'payib borayotgan dalillar NDD'larda LDlarning ishtirokini ko'rsatdi [10], izchil ravishda, bizning oldingi ishimiz MPTP tomonidan qo'zg'atilgan PD sichqonlari [12] SNpc da ko'paygan LDlarni aniqladi. LDlarni osongina aniqlash mumkin va bir hil amorf tarkibga ega bo'lgan yumaloq, past zichlikli tuzilmalarni ko'rsatishi mumkin [28]. Odatda, LD to'planishining oldini olish uchun autofagiya orqali parchalanishi mumkin [29]. Ka PDda LDlarni tartibga sola oladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun LDlarning to'planishi nazorat SNpc, MPTP/p va MPTP/p plyus Ka sichqonlarida transmissiya elektron mikroskopi (TEM) orqali tahlil qilindi. Oldingi ishimizda ko'rsatilgandek [12], MPTP/p sichqonlarida LD larning soni va hajmi sho'r suv bilan ishlangan nazoratlarga nisbatan ko'paygan (3a va b-rasm) va Ka bilan davolash qilingan sichqonlarda sezilarli darajada kamaydi (3c-rasm). e). Bundan tashqari, Ka bilan davolash qilingan sichqonlarda LDlar elektron zich lipofussin granulalari sifatida aniqlangan avtolizosomalar yaqinida, o'ralgan yoki tomonidan degradatsiyaga uchragan. TH* neyronlarini neytral lipidlarni maxsus belgilovchi va odatda LDlarni aniqlash uchun ishlatiladigan bo'yoq bo'lgan BODIPY bilan keyingi gistologik bo'yash shuni ko'rsatdiki, SNpcdagi BODIPY LD larning soni ham, o'lchami ham PD sichqonlarida nazoratga qaraganda yuqori bo'lgan. va Ka davolash bilan sezilarli darajada kamaydi (Fig.3f-h).

Agar LDni o'z vaqtida parchalab bo'lmasa, to'plangan LDlar peroksidlanishdan o'tishi va neyrotoksiklikni va kasallikning rivojlanishini kuchaytiradigan mitoxondrial ROS vositachiligidagi stressga hissa qo'shishi mumkin [4]. Shunday qilib, biz xabar qilinganidek, erkin FA toksikligi (Gpx8), neytrallashtiruvchi oksidlovchi turlar, superoksid radikallari (Sod3) va vodorod periks (Cat) va FA metabolizmidan (Acsbg1 va Dbi) himoya qilish bilan bog'liq genlarning ekspression profillarini batafsil ko'rib chiqdik [31] , bularning barchasi MPTP bilan davolash qilingan sichqonlarning SNpc darajasida nazorat bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaydi va bu ta'sirlar Ka bilan davolash qilingan PD sichqonlarida yaxshilandi (3i-rasm). Xuddi shunday, MPTP/p ham mRNK ifoda darajasini oshirdi

2-rasm. Ka MPTP/p PD modeli sichqonlarining SNpc da DA neyronlarining yo'qolishini yaxshilaydi.

(ab) tirozin gidroksilaza (TH)-musbat neyronlarning mikrofotosuratlari (a) va substantia nigra pars compacta (SNpc)(b)dagi TH-musbat neyronlarning stereologik soni. O‘lchov chiziqlari ko‘rsatilgandek. -musbat hujayralar (c) va SNpc (d) dagi kresil binafsha-musbat hujayralarning stereologik soni. Masshtab satri, 120 mkm.（Masalan） SNpc（e）da TH va DAT oqsili ifodasining Western blot tahlili va miqdoriy tahlil（f,g）. Miqdoriy ma'lumotlar sho'rlangan nazorat guruhiga normallashtiriladi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Natija 4. Ka SH-SY5Y hujayralarini MPP plus-induktsiyali apoptozdan himoya qiladi

MPP plus, MPTP ning faol metaboliti mitoxondriyal kompleks fermentlarni inhibe qiladi va PD bilan bevosita bog'liq bo'lgan hujayra o'limiga sabab bo'ladi [32]. Keyinchalik biz Ka in vitroda MPP plyus tomonidan qo'zg'atilgan neyronal apoptozni oldini olishi mumkinligini tekshirdik. Shakl 4a va b da ko'rsatilganidek, MPPt (400 mkM, 24 h) SH-SY5Y hujayralaridan LDH chiqarilishini keltirib chiqardi va Ka (30 va 60 mM) hujayraning omon qolishiga ta'sir qilmasdan LDH chiqishini sezilarli darajada susaytirdi (4a-rasm). Ka 30 mkM konsentratsiyada sezilarli himoya ta'sirini keltirib chiqarganligi sababli (4b-rasm), biz keyingi tajribalarda ushbu konsentratsiyadan foydalandik.Hoechst/PI bo'yash natijalari, shuningdek, Ka MPP plyus induktsiyalangan xromatin kondensatsiyasi bo'lgan hujayralar foizini sezilarli darajada kamaytirishini ko'rsatdi. (Fig.4c va d)va hujayra apoptozi, bu Hoechst floresansi intensivligining oshishi (4c-rasm) va Hoechst/PI-bo'yalgan hujayralar ulushi (Hoechst plus /PI plus) (Fig.4e). oqim sitometriyasi orqali aniqlangan, MPPt induktsiyalangan hujayra apoptozisi, Annexin V bilan bo'yalgan hujayralar (AV plus /PI- va AV plyus /Prt) ulushining ortishi bilan tasdiqlanadi, Ka bilan himoyalangan (4f va g-rasm). MPP plyus - apoptoz bilan bog'liq protein ekspressiyasidagi o'zgarishlar, B ning ko'tarilishi bilan tasdiqlanadi cl-2, Baxning pastga regulyatsiyasi (4hi-j-rasm) va kaspazaning qisqarishi-3(4h, k-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, Ka MPp plyusning hujayra omon qolishiga zararli ta'sirini yo'q qilishi mumkin.

Natija 5. Ka SH-SY5Y hujayralarida mitoxondrial shikastlanishga vositachilik qiluvchi MPp plyus sabab bo'lgan LD to'planishi va lipid peroksidatsiyasini bostiradi.

Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, kutilmagan LD to'planishi lipid peroksidatsiyasi bilan bog'liq stressning kuchayishiga olib kelishi va neyrodegeneratsiyaga yordam beradigan mitoxondriyal disfunktsiyani tezlashtirishi mumkin [10]. Bizning oldingi ishimiz, shuningdek, SNpcdagi LDlarning ortishi sichqonlarda PD patologiyasi bilan bog'liqligini ko'rsatdi [12]. Ka ning himoya ta'siri in vitro LD to'planishi bilan bog'liqligini tekshirish uchun biz birinchi navbatda BODIPY 493/503 yordamida SH-SY5Y hujayralarida LDga xos bo'yashni amalga oshirdik va LD cho'kmasining ko'payishini kuzatdik (neytral lipidlarning yuqori darajalari)

Shakl 3. Ka MPTP / p bilan ishlov berilgan sichqonlarning SNpc da elektron zich LD vakuolalarining to'planishi va lipid oksidlanishini kamaytirdi.

(ac) Elektron yorqin vakuolalar (lipid tomchilari), avtolizosomalar (ALS) yoki lipofusin o'z ichiga olgan lizosomalar (Lys) ni o'z ichiga olgan elektron zich avtofagik vakuolalarni ko'rsatadigan vakillik EM tasvirlari (a), MPTP / p bilan ishlov berilgan sichqonlarning SNpc. (b) va MPTP/p plyus Ka (c). shkala barlari, 500 nm. Oldingi ishimizda ko'rsatilganidek (a, b) bilan (PMID: 29967574). (de) Ko'rsatilgan sichqonlarda SNpcdagi neyron boshiga elektron yorqin LD vakuolalarining miqdorini aniqlash. n =3 ta sichqon,10-12 ta neyron. (fh) Tuzli, MPTP/p- va MPTP/p hamda Ka bilan ishlov berilgan sichqonlarning o'rta miya qismlari BODIPY (LDs) va TH (DA) neyronlari uchun bo'yalgan. Eng oʻngdagi panellarda BODIPY plus TH plus neyronlarning kattalashtirishlari koʻrsatilgan. Oklar LDlarni ko'rsatadi.(gh), BODIPY miqdori va LD raqami va hajmi. (ii) ko'rsatilgan sichqonlarning SNpcsida FFA toksikligi bilan bog'liq genlar (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1 va Dbi) (i) va oksidlovchi stress genlarining (Nox1, Nox2 va Nox4) (j) mRNK ifodasi tahlil qilindi real vaqt rejimida qPCR.n=4-5 har bir guruh, uchta mustaqil tajriba. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi; ns, muhim emas, * P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Ushbu maqoladan olinganhttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.1019112020-yil 23-noyabrda olingan