Kaempferol autofagiyani rag'batlantirish orqali LD-mitoxondriyal zararni engillashtiradi: Parkinson kasalligining oqibatlari 1-qism

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Annotatsiya:Rivojlanayotgan dalillar shuni ko'rsatadiki, kutilmagan lipid tomchilari (LD) cho'kishi va peroksidlanish organellalar stressini tezlashtirishi va neyrodegenerativ kasalliklar (NDDs) patogenezida hal qiluvchi rol o'ynaydi. Oldingi tadqiqotimizda biz kaempferol (Ka), tabiiy flavonoid kichik molekula ekanligini tasdiqladik. , LPS bilan bog'liq Parkinson kasalligi (PD) bo'lgan sichqonlarga neyroprotektiv ta'sir ko'rsatdi. Bundan tashqari, oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, autofagiya hujayralardagi LD cho'kmasini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi. Joriy tadqiqotda biz Ka ning TH va neyronlarning yo'qolishidan va MPTP / p-induktsiyali PD sichqonlarida xulq-atvor etishmovchiligidan himoyalanganligini ko'rsatdik, bu substantia nigra pars compacta (SNpc) da kamaytirilgan lipid oksidlanish stressi bilan birga. Madaniy neyron hujayralarida Ka ko'rsatdi. nisbatan xavfsiz konsentratsiya oralig'i va sezilarli darajada bostirilgan LD to'planishi va MPP plus tomonidan indüklenen uyali apoptoz. Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Ka ning himoya ta'siri otofagiyaga, xususan lipofagiyaga bog'liq. Tanqidiy jihatdan Ka lizosomalarda LD degradatsiyasiga vositachilik qilish uchun avtofagiyani qo'llab-quvvatladi, bu esa lipidlarning cho'kishi va peroksidlanishini va natijada mitoxondriyal shikastlanishni engillashtirdi, natijada neyronlarning o'limini kamaytiradi. Bundan tashqari, AAV-shAtg5-vositalangan Atg5 yiqitishi PD sichqonlarida Ka ning lipid oksidlanishiga qarshi neyroprotektiv ta'sirini bekor qildi. Bu ish shuni ko'rsatadiki, Ka lipid peroksidatsiyasi orqali mitoxondriyal shikastlanishni inhibe qilish orqali lipid-autofagiyani rag'batlantirish orqali PDda dopaminerjik neyron degeneratsiyasini oldini oladi va PD va tegishli NDDlar uchun potentsial yangi terapevtik strategiyani taqdim etadi.

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

1.Kirish

Parkinson kasalligi (PD) keng tarqalgan neyrodegenerativ kasallik (NDD) bo'lib, u substantia nigra pars compacta (SNpc) []dagi dopaminerjik (DA) neyronlarning progressiv yo'qolishi bilan patologik xarakterlanadi. Ushbu kasallikning aniq etiologiyasi va tabiiy yo'nalishi hali to'liq aniqlanmagan bo'lsa-da, PD patogenezida ko'plab tizim darajasidagi jarayonlar va disfunktsiyalar, jumladan mitoxondriyal funktsiyalar, dopamin gomeostazi, neyroinflamatsiya va autofagiya ishtirok etgan. 2]. Oxirgi hisobotlar shuni ko'rsatdiki, lipid tomchilari (LD) bilan bog'liq lipotoksiklik PD patologiyasida ishtirok etishi mumkin [3,4]. LDlar endoplazmatik retikulum (ER) membranasidan chiqadigan va odatda neytral lipidlarni saqlashning hujayra ichidagi joylari bo'lib xizmat qiladigan yuqori dinamik organellalardir [5]. Yaqinda LDlar yog 'kislotalarini (FA) saqlashga qaraganda ancha kengroq rol o'ynashi va ko'plab kasalliklarda ishtirok etishi ko'rsatildi. Masalan, miyeloid hujayralar, shu jumladan makrofaglar, leykotsitlar va eozinofillar yallig'lanish va stressga javoban LD hosil qiladi va LDlar yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarish va saqlash joylari bo'lib, keyinchalik antigen taqdimoti va patogenlarni tozalashda ishtirok etadi [6]. Muhimi, aterosklerozda LDga boy ko'pikli hujayralar kasallikning barcha bosqichlarida zararli ekanligi isbotlangan [7].

Cistanche immunitetni yaxshilashga yordam beradi

Biroq, LDlar markaziy asab tizimida (CNS) keng o'rganilmagan, bir nechta maqolalarda inson miya to'qimalarida LDlarning gistologik mavjudligi haqida xabar berilgan [8,9]. Shunga qaramay, LDlar miyada muhim funktsiyalarga ega bo'lishi mumkin, chunki yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar gliadagi yig'ilgan LDlar Drosophila modelida neyrodegeneratsiyani tezlashtirishini tasdiqladi [10]. Yaqinda sichqonlarda neyronlar, glial fibrilyar kislotali oqsil (GFAP) va astrositlar va ionlangan kaltsiyni bog'lovchi adapter molekulasi-1 (IBA-1) kabi yog'li qizil rangli O-musbat lipidli hujayralar mavjudligi xabar qilingan. ) mikroglia, ko'plab miya hududlarida mavjud va yoshga bog'liq jarayonlarda ishtirok etishi ko'rsatilgan [11]. Bizning oldingi ishimiz, shuningdek, PD sichqonchasi modelida miyada LD to'planishining ko'payishini ko'rsatdi [12]. Birgalikda olib borilgan ushbu tadqiqotlar LDlarning boshqa NDDlar kabi PD patogenezida ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi.

Odatda, hujayra ichidagi LDlar lizosomalarda parchalanadi va ozuqa moddalarining kamayishi davrida muqobil energiya manbai sifatida iste'mol qilish uchun FAni mitoxondriyalarga etkazib beradi [13]. Biroq, neyronlar energiya ishlab chiqarish uchun mitoxondrial FA iste'mol qilish uchun past imkoniyatlarga ega [14]. Bu xususiyat neyronlarni LD to'planishi va peroksidlanishga ayniqsa sezgir qiladi. Bundan tashqari, LDlarning to'planishi FA oksidlanish tezligini oshiradi va mitoxondriyal elektron tashish zanjiriga doimiy bosim o'tkazadi, bu oksidlovchi stressni kuchaytirish uchun I va II [15] elektron transport zanjiri komplekslari tomonidan reaktiv kislorod turlarini (ROS) ishlab chiqarishni oshiradi. Lipidlarning ortiqcha yuklanishi, shuningdek, nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidazalari va boshqa oksidlovchi fermentlar kabi ekstramitoxondrial manbalar tomonidan ROS ishlab chiqarishga olib keladi. Antioksidant fermentlarning kamayishi va neyronlarda FA iste'mol qilish qobiliyatining pastligi bilan birgalikda LD to'planishi oksidlovchi stressga vositachilik qiladi va keyinchalik mitoxondriyal shikastlanishga, lizosomal disfunktsiyaga, nuqsonli autofagiyaga va yallig'lanish reaktsiyalarining faollashishiga olib kelishi mumkin [16,17]. Agar to'plangan LDlarni inhibe qilish yoki olib tashlash mumkin bo'lmasa, yuqori faol neyronlar neyrodejeneratsiyani keltirib chiqaradigan patofiziologiyaga uchraydi [17]. Dalillar shuni ko'rsatadiki, autofagiya deb ataladigan lizosoma vositachiligidagi katabolik jarayon bir nechta to'qimalarda hujayrali LD gomeostazini saqlashda hal qiluvchi rol o'ynaydi [17,18]. Batafsil ma'lumki, LDlar avtofagosomalarda tanlab sekvestrlanishi va lizosomal kislota lipazalari tomonidan parchalanish uchun lizosomalarga etkazilishi mumkin, bu jarayon maxsus lipofagiya deb nomlanadi [19]. Shu sababli, LDlarni va ularning otofagik olib tashlash yo'lini nishonga olish neyrodejeneratsiyani boshqarish uchun yangi yondashuv bo'lishi mumkin.

So'nggi yillarda NDDni potentsial davolash va strategiyalar uchun manba sifatida tabiiy mahsulotlar va parhez agentlarini o'rganish katta qiziqish uyg'otdi [20]. Kaempferol (Ka) tabiiy polifenolli kichik molekula bo'lib, uni Xitoyning bir qator dorivor o'tlarida va parhez manbalarida topish mumkin [21]. Ka antibakterial, qarishga qarshi va immunomodulyator ta'sir ko'rsatishi, shuningdek, antioksidant va neyroprotektiv ta'sir ko'rsatishi haqida xabar berilgan [20,22,23]. Ilgari, Ka BV2 mikroglial hujayralardagi yallig'lanishni in vitro [24] inhibe qilishi va DA neyronlarining in vivo neyroinflamatsiyaga chidamliligini oshirishi haqida xabar berilgan edi [25]. Biroq, Ka ning PDdagi LDlarga ta'siri hali tekshirilmagan.

LD ning ahamiyatini va PDda ishtirok etadigan LD, mitoxondriya va avtofagiya [16] o'rtasidagi yaqin aloqani hisobga olgan holda, biz Ka LD peroksidatsiyasini inhibe qiladi va PDda DA neyrodejeneratsiyasini oldini oladi, deb taxmin qilamiz. Ushbu tadqiqotda biz Ka ning LD to'planishini inhibe qilish orqali sichqon PD modelida neyrodegeneratsiyadan sezilarli darajada himoyalanganligini ko'rsatdik. Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Ka avtofagiyani qo'zg'atdi va mitoxondriyal disfunktsiyani va mitoxondrial ROS (mtROS) ishlab chiqarishni yumshatish uchun oksidlangan LDlarning to'planishini kamaytirdi va shu bilan neyronlarning apoptotik o'limini oldini oldi. Ushbu tadqiqotda olingan natijalar PD kabi NDDlarda Ka tabiiy molekulasidan foydalanish bo'yicha to'g'ridan-to'g'ri klinik qarorlarni qabul qilishga yordam beradi.

2. Materiallar va usullar

2.1. Eksperimental hayvonlar

C57BL/6J sichqonlari (erkak, 4-oylik) Nankin tibbiyot universiteti hayvon yadrosidan (Nankin) olingan. Sichqonchalar Nankin Tibbiyot Universitetining Tibbiyot fakultetining Hayvonlar Resurs Markazida va Nankin Drum Tower kasalxonasidagi hayvonlar bo'limida parvarishlangan va o'stirilgan. Atrof-muhit harorati 22 ± 2 daraja va yorug'lik/qorong'u aylanish davri 12:12 soat bo'lgan xonada sichqonlar oziq-ovqat va suvdan erkin foydalanishlari mumkin. Hayvonlarga oid barcha protseduralar Milliy sog'liqni saqlash institutlari laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha qo'llanmaning ko'rsatmalariga qat'iy muvofiq amalga oshirildi.

2.2. Reaktivlar

MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99.0 foiz ,96,353 in vitro tajribalar uchun Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh) olingan. BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) Thermo Fisher Scientific'dan xarid qilingan. Hayvonlar tajribasi uchun Ka steril fiziologik eritmada 16% SBE{15}}CDda 10% DMSO eritmasida eritildi. Hujayra tajribalari uchun Ka DMSO (Sigma-Aldrich) va PBS (yakuniy DMSO kontsentratsiyasi 0,01 foiz), pH 7,4 da tayyorlangan.

2.3. Metil{2}}fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP)-induktsiyali PD sichqoncha modelini induksiyalash va davolash

MPTP/p-toksikligining PD modelidagi Ka ning ta'sirini baholash uchun sichqonlar (erkak, 4-5 oylik) sho'r suv bilan davolash qilingan guruhga, MPTP bilan davolash qilingan guruhga, MPTP va Ka bilan ishlov berilgan guruhga tasodifiy bo'lingan. guruh, va Ka yolg'iz davolash guruhi. MPTP bilan davolash qilingan guruhda sichqonlar ilgari tasvirlanganga o'xshash protokol bilan surunkali MPTP administratsiyasini oldilar [26]: MPTP fiziologik eritmada eritildi va teri ostiga 25 mg / kg dozada yuborildi, so'ngra 250 mg / kg probenetsid (dimetil sulfoksidda eriydi) intraperitoneal (ip) in'ektsiya 5 hafta davomida har 3,5 kunda 1 soatlik interval bilan. Nazorat qiluvchi sichqonlar sho'r suv va probenetsid in'ektsiyasini oldi. MPTP plyus Ka bilan davolash qilingan guruhda sichqonlar Ka (50 mg/kg, tajribalar davomida bir martalik in'ektsiya / kun, Jingzhu Biotechnology, Nankin, Xitoy) MPTP bilan davolashdan oldin har kuni 3 kun davomida intraperitoneal (.p.) oldi va 5 dan ortiq. MPTP in'ektsiya haftalari. Oxirgi MPTP in'ektsiyasidan bir hafta o'tgach, sichqonlar guruhlarga ko'r bo'lgan xatti-harakatlar testidan o'tkazildi. Shundan so'ng, barcha sichqonlar 40 mg / kg natriy pentobarbital bilan behushlik qilindi va miya oqsillarini aniqlash va immunogistokimyo yoki qPCR tahlili uchun qurbon qilindi.

2.4. In vivo stereotaksik jarrohlik va eksperimental muolajalar

Natriy pentobarbital anesteziyasi (40 mg/kg, ip) ostida stereotaksik jarrohlik ta'riflanganidek bajarildi [25]. Sichqoncha Atg5 va nazorat qiluvchi shRNK AAV yaratish uchun qadoqlash vektorlari (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) bilan transfektsiya qilindi. Mikroin'ektsiya uchun anesteziya qilingan sichqonlar stereotaksik apparatga joylashtiriladi. Ularga DG(AP:-0,3 mm; ML:±0,13 mm; DV:-0,45 mm) ga yo'naltirilgan shisha elektrod orqali 1mLAAV AOK qilingan. 0,25 mkl/min. Keyin igna virus mikroin'ektsiyasidan so'ng qo'shimcha 2-min.2 hafta davomida ushlab turildi, sichqonlar MPTP-induktsiyali PD modeli o'tkazuvchanligiga va (yoki) Ka bilan davolashga duchor qilindi.

Atg5 shRNK Hanbio Biotechnology (Shanxay, China) Co., Ltd kompaniyasidan olingan. Atg5 sukunati uchun primerlar qo'shimcha 1-jadvalda ko'rsatilgan.

2.5. Xulq-atvor tahlili

MPTP yoki sho'r suvning yakuniy in'ektsiyasidan bir hafta o'tgach, rotarod testi va qutb testi [27] oldin tavsiflanganidek amalga oshirildi. Rotarod testi uchun sichqonlar tajriba boshlanishidan oldin ketma-ket 2 kun davomida kuniga ikki sinovda (12-20 rpm tezlashtirilgan tezlik bilan 6 min) aylanishga moslashtirildi. Keyin sichqonlar ketma-ket boshqa 3 kun davomida 20 rpm da 300 soniya davomida sinovdan o'tkazildi. Yiqilish kechikishi Rotarod tahlil tizimi (Jiliang, Shanxay, Xitoy) yordamida qayd etilgan. Qutbli sinov uchun sichqonlar boshini yuqoriga ko'tarib, vertikal yog'och ustunning tepasiga qo'yildi (qo'pol sirtli, balandligi 50 sm, diametri 1 sm). Barcha sichqonlar sinovdan 2 kun oldin apparatga o'rganib qolgan va keyin uchinchi kuni uch marta sinovdan o'tgan. Umumiy vaqt (T-jami, sichqon to'rtta panjasi bilan polga yetib borguniga qadar) va burilish vaqti (T-burilish, sichqonchani butunlay pastga burish uchun) qayd etildi. Tajriba har bir xulq-atvor testi uchun sichqoncha guruhlariga ko'r bo'ldi va sinov uch marta o'tkazildi.

2.6. Miya namunalari to'plami

Yakuniy xatti-harakatlar testlaridan so'ng, sichqonlar natriy pentobarbital (40 mg / kg, ip) bilan behushlik qilindi. QPCR, western blotting va yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) tahlillari uchun butun miya hayvonlardan, keyin o'rta miya va miyadan tezda ajratildi. striatum to'qimalari tezda parchalanib, suyuq azot bilan oldindan muzlatilgan. Barcha namunalar tahlil qilinguncha -80 darajada saqlangan.

Immunohistokimyoviy tahlil uchun sichqonlar 4 foizli paraformaldegid (PFA) bilan trans-kardial perfuziya qilingan. Miyalar ekstraksiya qilingan, mahkamlangandan so'ng, suvsizlangan, OCT (Tissue-Tek) ga yotqizilgan va miyaning ketma-ket bo'limlari muzlatish mikrotomi yordamida har bir qatlam va o'rta miya bo'ylab kriyoseksiya qilingan (har bir tilim uchun 30 um) (Leica CM1950, Nussloch, Germaniya) ). Barcha bo'limlar oltita alohida seriyada yig'ildi va miya bo'laklari 50 foizli glitserinda saqlangan va tahlil qilinguncha -20 darajada muzlatilgan.

TEM uchun sichqonlar 【12】 ta'riflanganidek 2,5 foiz glutaraldegid va 2 foiz paraformaldegid bilan perfuziya qilingan. Kichik bir qism (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunogistokimyoviy tahlil

Miya bo'laklari PBS da yuvilib, 3% H2O2 bilan 1{4}} daqiqa davomida yuvildi, so'ngra 1 soat davomida 5% BSA bilan to'ldirilgan PBSda 0,3% Triton X-100 bilan inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, slaydlar bir kechada 5 foiz BSA o'z ichiga olgan PBSda 4 daraja haroratda bir kechada birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi, so'ngra yuvildi va xona haroratida 1 soat davomida ikkilamchi antikorlarda inkubatsiya qilindi, so'ngra diaminobenzidin (DAB) bilan inkubatsiya qilindi yoki o'rnatildi. DAPI (Life Technologies, Cat P36931) 5 daqiqa davomida immunofluoresan bo'yash sifatida. Nissl bo'yash uchun slaydlar kresil binafsha (CV) eritmasida (0,1 g kresil binafsha, 99 ml H2O va 1% sirka kislotasi 1 ml) xona haroratida 30 daqiqa davomida birlashtirilib, keyin spirt va ksilen bilan suvsizlanadi. Tasvirlar kuzatildi va fotosuratlar Olympus BX52 mikroskopida (Olympus America Inc., Melville, NY, AQSh) olingan. SNpcdagi TH-musbat va Nissl-musbat neyronlarning umumiy soni MicroBrightField Stereo-Investigator dasturi (MicroBrightField, Williston, VT, AQSh) bilan optik fraksiyalash usuli yordamida serologik usulda olingan.

2.7. Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) tahlili

Sichqonlarning striatal namunalari {0}}, 1 M perklorik kislota (100 mkl perklorik kislotada 1 mg to'qimalar) va 0,1 mM EDTA bilan homogenlashtirildi,

2.17. Oqim sitometriyasi

Hujayralar hazm qilindi va D-hank bilan yuvildi, keyin Annexin V-FITC (5 ul 5 00ul PBS)/PI (500 ul PBSda suyultirilgan 0,1 ul) apoptoz to'plami (CA1020, Solarbio, Beijing, 5 ul) bilan bo'yaldi. Chian) ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq. Shundan so'ng, apoptotik hujayralar oqim sitometriyasi yordamida tahlil qilindi (guava easyCyteTM 8, Millipore, AQSh). Mitoxondriyal ROS va mitoxondriyal membrana potentsial o'lchovlari nashr etilgan 【12】.SH-SY5Y hujayralari MitoSOX (2,5 mkM, Invitrogen, AQSh) yoki JCl (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, AQSh) bilan bo'yalgan. ） 37 °C da 30 daqiqa. PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, hujayralar oqim sitometrik tahlil qilish uchun 1 foiz FBS o'z ichiga olgan sovuq PBSda qayta suspenziya qilindi. Ma'lumotlar FCS Express dasturi bilan tahlil qilindi (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, AQSh).

2.18. Dengiz otlarining nafas olish tahlillari

Tirik SH-SY5Y hujayralarida mitoxondriyal nafas olish funktsiyasi Seahorse hujayradan tashqari oqim (XFe96) analizatori (Agi-lent, Santa Klara, AQSh) yordamida kislorod iste'moli darajasi (OCR) o'zgarishi orqali o'lchandi. 3 × 103 hujayra / quduqqa ekilgan SH-SY5Y hujayralariga Seahorse hujayra madaniyati plitalariga yopishib olish va tajriba vaqtida taxminan 80 foiz qo'shilish darajasiga erishishga ruxsat berildi. Ertasi kuni hujayralar Ka bilan oldindan ishlov berildi va keyin yana 24 soat davomida MPP plyusga ta'sir qildi. OCR bazal sharoitda aniqlandi, keyin 1 mkM oligomisin, 1 mkM FCCP, shuningdek, 1 mkM rotenon va antimitsin A qo'shildi.

2.19. Statistik tahlil

Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etildi. Farqning ahamiyati Studentning t-testi, Ikki tomonlama dispersiya tahlili yoki bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va keyin Tukeyning post hoc testi bilan aniqlandi. Farq P da sezilarli deb hisoblangan<>

3. Natijalar

Natija 1. Ka vosita disfunktsiyasini tiklaydi va MPTP/p PD modeli sichqonlarining striatumida dopamin darajasini oshiradi

Kaon PD patogenezining neyroprotektiv ta'sirini o'rganish uchun 4-oylik erkak C57BL/6 sichqonlariga MPTP/p PD modelini yaratish uchun neyrotoksin MPTP yuborildi va Ka bilan davolash qilindi (la-rasm). Model induksiyasidan so'ng, turli guruhlardagi sichqonlarning motor va xatti-harakatlarini baholash uchun rotarod testi va qutb testi ishlatilgan. Ko'rsatilganidek, MPTP bilan davolash qilingan sichqonlarda rotarodning ishlash muddati sezilarli darajada kamaydi va bu ta'sir Ka tomonidan oldini oldi (Fig.1b). Ka, shuningdek, sichqonlarning tana vazniga ta'sir qilmasdan, qutb testida aylanish vaqti va umumiy vaqtni qisqartirish bilan ko'rsatilgandek, MPTP tomonidan qo'zg'atilgan xatti-harakatlarning kamchiliklarini tikladi (Fig.1e). Bundan tashqari, HPLC tahlili shuni ko'rsatdiki, striatumdagi dopamin darajasi MPTP / p-shartli sichqonlarda sezilarli darajada pasaygan va bu daraja Ka bilan davolash orqali tiklangan (1f-rasm). Ka bilan davolash, shuningdek, striatumdagi dihidroksi-fenil sirka kislotasi (DOPAC, dopamin metaboliti) darajasining MPTP / p-induktsiyali pasayishini engillashtirdi (1g-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, Ka vosita disfunktsiyasini tiklaydi va MPTP bilan qo'zg'atilgan PD sichqonlarida striatumda dopamin darajasini oshiradi.

Natija 2. Ka MPTP/p PD modeli sichqonlarining SNpc da DA neyronlarining yo'qolishini engillashtiradi

Keyinchalik, Kaon MPTP / p tomonidan qo'zg'atilgan DA neyron buzilishining neyroprotektiv ta'sirini yanada baholash uchun biz tirozin gidroksilazani (THD plyus murin SNpc-dagi neyronlarni immuno-bo'yash orqali tekshirdik. 2a va b-rasmda ko'rsatilganidek, MPTP / p sezilarli pasayishni keltirib chiqardi. TH plyus neyronlar sonida, bu Ka bilan davolash orqali engillashtirildi.Bundan tashqari, Nissl tomonidan aniqlanganidek, SNpcdagi umumiy neyronlarning stereologik soni

1-rasm. Ka davolash vosita disfunktsiyasini engillashtiradi va MPTP / p PD modeli sichqonlarining striatumidagi dopamin darajasini oshiradi.

(a) eksperimental loyihaning sxematik diagrammasi. (b) Rotarod sinovi uchun tayoqdagi vaqt ketma-ket uch kun davomida o'lchandi. (cd) Qutbni sinash uchun burilish (burilish vaqti) va qutbga tushish vaqti (ko'tarilish vaqti) qayd etilgan. (e) Tadqiqot oxirida sichqonchaning tana vazni o'lchandi, (fg) Striatumdagi dopamin (DA) va dihidroksi-fenil sirka kislotasi (DOPAC) yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi bilan tahlil qilindi. Ma'lumotlar (b, C, d) har bir guruh uchun o'rtacha ± SEM.n =9-10 sifatida ifodalanadi; n=6-8 har bir guruh uchun(f,g).ns, muhim emas,*P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

binoni, THt hujayralarining yo'qolishi hujayra o'limini aks ettiradi, lekin TH ekspressiyasining pasayishini emasligini tasdiqladi va Ka bilan davolash MPTP bilan ishlov berilgan sichqonlarning SNpc dagi Nissl-musbat neyronlar sonining 43,3 foizdan 25,4 foizgacha kamayishini tiklaganligini ko'rsatdi ( Fig.2c va d).Bundan tashqari, Ka Western blotting bilan o'lchangan TH va DAT protein ifodasida MPTP-induktsiyasini sezilarli darajada yaxshiladi (Fig.2e-g). Ushbu dalil Ka ning PD sichqoncha modeliga neyroprotektiv ta'sirini tasdiqlaydi.

Natija 3. Ka MPTP/p bilan ishlov berilgan sichqonlarning SNpc da LD vakuolalarining to'planishi va oksidlovchi stressni kamaytiradi.

Ko'payib borayotgan dalillar NDD larda LD larning ishtirokini ko'rsatdi [10], izchil ravishda, bizning oldingi ishimiz MPTP tomonidan qo'zg'atilgan PD sichqonlarining SNpcsida LDlarning ko'payishini aniqladi [12]. LDlarni osongina aniqlash mumkin va bir hil amorf tarkibga ega bo'lgan yumaloq, past zichlikli tuzilmalarni ko'rsatishi mumkin [28]. Odatda, LD to'planishining oldini olish uchun autofagiya orqali parchalanishi mumkin [29]. Ka PDda LDlarni tartibga sola oladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun LDlarning to'planishi nazorat SNpc, MPTP/p va MPTP/p plyus Ka sichqonlarida transmissiya elektron mikroskopi (TEM) orqali tahlil qilindi. Oldingi ishimizda ko'rsatilgandek [12], MPTP/p sichqonlarida LD larning soni va hajmi sho'r suv bilan ishlangan nazoratlarga nisbatan ko'paygan (3a va b) va Ka bilan ishlov berilgan sichqonlarda sezilarli darajada kamaygan (3c-rasm). e). Bundan tashqari, Ka bilan davolash qilingan sichqonlarda LDlar elektron zich lipofussin granulalari sifatida aniqlangan avtolizosomalar yaqinida, o'ralgan yoki tomonidan degradatsiyaga uchragan. TH plyus neyronlarini neytral lipidlarni maxsus belgilovchi va odatda LDlarni aniqlash uchun ishlatiladigan bo'yoq bo'lgan BODIPY bilan keyingi gistologik bo'yash shuni ko'rsatdiki, SNpcdagi BODIPY plus LD larning soni ham, hajmi ham PD sichqonlarida nazoratga qaraganda yuqori bo'lgan. , va Ka bilan davolash bilan sezilarli darajada kamaydi (3f-h-rasm).

Agar LD ni o'z vaqtida parchalab bo'lmasa, to'plangan LDlar peroksidlanishdan o'tishi va neyrotoksiklikni va kasallikning rivojlanishini kuchaytiradigan mitoxondrial ROS vositachiligidagi stressga yordam berishi mumkin [4]. Shunday qilib, biz xabar qilinganidek, erkin FA toksikligi (Gpx8), neytrallashtiruvchi oksidlovchi turlar, superoksid radikallari (Sod3) va vodorod periks (Cat) va FA metabolizmidan (Acsbg1 va Dbi) himoya qilish bilan bog'liq genlarning ekspressiv profillarini ko'rib chiqdik [31] , bularning barchasi MPTP bilan davolash qilingan sichqonlarning SNpc darajasida nazorat bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaydi va bu ta'sirlar Ka bilan davolash qilingan PD sichqonlarida yaxshilandi (3i-rasm). Xuddi shunday, MPTP/p ham mRNK ifoda darajasini oshirdi

MPTP/p sichqonlarining SNpc tarkibidagi Nox1, Nox2 va Nox4 kabi NADPH oksidaza subbirliklari, ular Ka bilan ishlov berish bilan qo'shimcha ravishda to'xtatildi (3j-rasm). Birgalikda bu ma'lumotlar Ka MPTP / p-induktsiyali LD to'planishi, peroksidlanish va ROS vositachiligidagi stressni engillashtiradiganligini ko'rsatadi.

Ushbu maqola ScienceDirect Redox Biology jurnalining bosh sahifasida mavjud bo'lgan Mundarija ro'yxatidan olingan: www.elsevier.com/locate/redox