Oddiy va kistli buyrakdagi nefronlarning uch o'lchovli arxitekturasi

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Tomas Blan1,2,7, Nikolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5, Liza Turinskiy1, Serj Garbay1, Kle’ment Nguyen1, Martine Burtin1, Je’rard Fried16, Terzi1,8 va Marko Pontoglio1,8

Cistanche buyraklar uchun foydalidir

KALİT SO'ZLAR: buyrak kistasi kasalligi; buyrak; nefron; nefronoftiza;to'qimalarni tozalash

Buyrak funktsiyasi nefronlarning murakkab uch o'lchovli tuzilishiga juda bog'liq. Ularning shaklining har qanday buzilishiga olib kelishi mumkinbuyrak funktsiyasining buzilishi. An'anaviy gistologik usullar uch o'lchamli to'qimalarni qayta tiklash uchun katta cheklovlarni taqdim etadi. Bu erda biz fiziologik va patologik sharoitlarda yagona nefronlarni qayta tiklash uchun to'qimalarni tozalash, ko'p fotonli mikroskopiya va raqamli kuzatuvni birlashtirdik. to'plamlarinefronlarvazifasiga koʻra joylashishi, shakli va oʻlchami boʻyicha farqlanuvchilar aniqlandi. Qizig'i shundaki, nefronlar samolyotlarda yotishga moyil. Ushbu texnikaning modeliga qo'llanilgandakistli buyrak kasalligi, kistalar faqat o'ziga xos nefron segmentlarida rivojlanishi aniqlandi. Xuddi shu segment bo'ylab kistalar oddiy kengaymagan kanalchalar ichida joylashgan. Bundan tashqari, kistalarning shakllari nefron segmentiga qarab o'zgarib turadi. Shunday qilib, bizning topilmalarimiz bitta nefron darajasida buyraklarning murakkab tuzilishini ko'rish uchun qimmatli strategiyani taqdim etadi va eng muhimi, sistogenez kabi patologik jarayonlarni tushunish uchun asos yaratadi.

Tarjima bayonoti

Tozalash usullari morfologik o'zgarishlarning patologik oqibatlarga olib kelishini tushunish uchun noyob vositadir. Buyraklar suv, metabolitlar va elektrolitlar bilan ishlash orqali tana gomeostazini ta'minlaydigan muhim organlar bo'lib, ular nefronlarning murakkab 3-o'lchovli tuzilishiga juda bog'liqdir. Ushbu strukturaviy tashkilot o'zgarganda, buyrak patofiziologiyasi paydo bo'ladi. Ushbu tadqiqotda biz optik tozalashga asoslangan kuchli usulni ishlab chiqdik,

fiziologik va patologik sharoitlarda bitta nefron darajasida buyrakni o'rganish uchun multifoton mikroskopiya va raqamli izlash. Xususan, biz polikistik buyrakni birinchi 3-oʻlchovli rekonstruksiyani yagona nefronlar miqyosida taʼminlaymiz. Bu usul bir nechta patologik kontekstlarda qo'llanilishi mumkin, bu bizga buyraklarning yomonlashuvining murakkab jarayonini yaxshiroq tushunishga va natijada ko'proq maqsadli terapevtik strategiyalarni ishlab chiqishga imkon beradi.

Buyrak o'zining murakkab 3-o'lchovli (3D) nefron tuzilishi orqali tana gomeostazini ushlab turadi. Ushbu strukturaviy tashkilot o'zgarganda, buyrak patofiziologiyasi paydo bo'ladi.Surunkali buyrak kasalliklaribuyrak lezyonlarining rivojlanishi bilan tavsiflanadi. Ajablanarlisi shundaki, patologlar surunkali buyrak kasalliklarida lezyonlar tarqalishining keng heterojenligi haqida xabar berishdi.1,2 Bu nefronning o'ziga xos segmentlari turlicha zararlanishi yoki muqobil ravishda, ba'zi nefronlarning umuman jarohatlanishga turli xil sezuvchanligiga ega ekanligini aks ettiradimi? , noma'lum. Ushbu muammoni hal qilish uchun patologik sharoitlarda nefronlarning 3D shaklini qayta tiklash majburiydir.

Bizning bilimimizga ko'ra,nefronlarfaqat ketma-ket 2D bo'limlar yordamida to'liq rekonstruksiya qilingan.3–5 Garchi standart gistologik kesma yuqori aniqlikni ta'minlasa ham, 3D rekonstruksiya qilish mashaqqatli va qiyin. Bu, birinchi navbatda, mexanik buzilishlar bilan bog'liq bo'lib, bu kesish jarayonining muqarrar ta'siridir. Bundan tashqari, 2D tasvirlardan 3D rekonstruksiya qilish butun o'rnatilgan to'qimalarda 3D tuzilmalarni bevosita tasvirlashga imkon bermaydi.

Multifoton mikroskopiya qalin bo'laklardagi morfologik o'zgarishlarni aniqlash qobiliyatini yaxshiladi. Biroq, muhim cheklash yorug'lik tarqalishi tufayli sayoz chuqurlikdir. Sinishi ko'rsatkichlari farqlarini minimallashtirish orqali kliring agentlari chuqurliklarni tasvirlash qobiliyatini keskin yaxshiladi.6,7 Birinchi kliring agenti bir asr oldin taqdim etilganiga qaramay,8 yaqinda bir nechta tozalash protokollari ishlab chiqildi, asosan miya uchun. .9–17 Yaqinda oʻtkazilgan tadqiqotlar ularning jigar, oshqozon osti bezi yoki buyrak kabi boshqa qattiq aʼzolarni tasvirlash imkoniyatlarini koʻrsatdi.18–26

buyrak kasalligi uchun cistanche

Buyrakning polikistik kasalligi, bir nechta siliyer genlardagi mutatsiyalarni o'z ichiga olgan genetik jihatdan heterojen kasallik, eng keng tarqalgan irsiy buyrak kasalligidir.27,28 Polikistik buyrak kasalligi buyrakning to'liq yo'q qilinishiga olib keladigan kistalarning rivojlanishi bilan tavsiflanadi.28 Mikrodiseksiya tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, kistalar Avtosomal dominant polikistikada bo'lgani kabi nefron segmentining "tashqariga surilishi" sifatida ham rivojlanadi.buyrak kasalligi; avtosomal retsessiv polikistiklarda bo'lgani kabi, yig'ish kanallarining (CD) ektatik kengayishi sifatidabuyrak kasalligi; yoki faqat nefronoftizada (NPHP) bo'lgani kabi medullar kanalchalarida.27,29 Biroq, kistalar qanday qilib 3D shaklda rivojlanib, bir-biri bilan va oddiy qo'shni kanalchalar bilan qanday tashkil topishi hali noma'lum.

Bu erda biz optik tozalashni multifotonli mikroskopiya bilan birlashtirdik, bu qanday qilib yangi tushunchalar beradinefronlarfiziologik sharoitda shakllangan va tashkil etilgan va ular kasallik paytida qanday o'zgartiriladi, masalan, sistogenez. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, nefronlarning 3 turi mavjud va tomirlar nefronning fazoviy tuzilishiga ta'sir qilishi mumkin. Qizig'i shundaki, biz nefronlarning o'ziga xos tekisliklarda yotishga moyilligini kuzatdik. Kutilmaganda, biz ushbu texnikani jck sichqonlariga qo'llaganimizda, biz kistalar faqat o'ziga xos nefron segmentlarida normal kanalchalar bilan aralashgan fusiform kistalar bilan rivojlanganligini kuzatdik.

NATIJALAR

Eksperimental sozlash

Butun shaklni o'rganishnefronlarularning atrof-muhitiga nisbatan biz optik tozalash va multifoton mikroskopiyaga asoslangan usulni qabul qildik (Qo'shimcha rasm S1A). Turli xil optik tozalash protokollarini taqqoslab, biz buyraklar uchun benzil spirti / benzil benzoat (BABB) samaradorlik nuqtai nazaridan eng mos ekanligini aniqladik (Qo'shimcha S1B va C rasmi va S1 qo'shimcha jadvali).

3D rekonstruksiya va raqamli kuzatuv yuqori aniqlik va yuqori signal-fon nisbati bilan yuqori sifatli tasvirlarni talab qiladi. Biz mahalliy floresan tomonidan taqdim etilgan optik signal buyrak bo'limlarida bir xil emasligini kuzatdik. Xususan, medulladan olingan tasvirlar past signal-fon nisbati bilan yomon kontrastga ega edi (Qo'shimcha rasm S2). Signal-fon nisbatini yaxshilash uchun biz kesmalarni davriy Schiff kislotasi bilan bo'yadik (qo'shimcha rasm S1D), chunki biz empirik tarzda bu binoni 2-foton floresansi paytida yupqa qismlarda yuqori kontrastni keltirib chiqarganini ta'kidladik. Biroq, signal qalin davriy kislota - Shiff bo'yalgan buyrak bo'limlarida bir xil emas edi (qo'shimcha rasm S1E). Shuning uchun biz buyrak qismlarini floroxrom bilan bog'langan lektinlar bilan bo'yadik: glomeruli va kanalchalarni bo'yaydigan yeryong'oq aglutinini va bug'doy urug'i aglutinini va qon tomirlarini belgilovchi Griffonia simplicifolia aglutinin. fon nisbati butunlay oshdibuyrak bo'limlari, xy tekisligida ham, z o'qida ham sezilarli yaxshilanish bilan (qo'shimcha S1E rasm va qo'shimcha film S1).

3D nefron segmentini vizualizatsiya qilish

Butun nefronlarning shaklini tasavvur qilish uchun biz glomerulusning siydik qutbidan boshlanib, CD birikmasida tugaydigan yo'llarini kuzatdik (Qo'shimcha film S2). Amaldagi lektinlar global miqyosda barcha nefron segmentlarini bog'lashiga qaramay, biz diqqat bilan tekshirilganda, bu lektinlar turli nefron segmentlarida bazal yoki luminal membranalarni bo'yash usulida o'ziga xos naqsh bilan tavsiflanganligini payqadik. Boshqacha qilib aytganda, biz turli xil nefron segmentlarini aniqlash uchun lektinni bo'yashning stereotipik naqshidan foydalandik. Shunday qilib, biz 6 ta ob'ektni osongina aniqlashimiz mumkin: proksimal tubula (PT), Henle halqasining ingichka bo'lagi (TL), HL ning qalin ko'taruvchi a'zosi (TAL), distal konvolyutsiya naychasi (DCT), birlashtiruvchi naycha (CNT). ) va CD. PT va TL o'rtasidagi o'tish odatiy PT cho'tka chegara signalining to'satdan yo'qolishi va TLda deyarli yo'q bo'lgan lümen kengligining pasayishi bilan tavsiflangan (1a-rasm). Aksincha, TL va TAL o'rtasidagi o'tish tashqi quvur diametri va nisbatan doimiy lümen kengligida sezilarli o'sish bilan tavsiflanadi (1b-rasm). Umumannefronlar, TAL ning DCT ga o'tishi tizimli ravishda glomerulusning tomir qutbida topilgan. Ushbu o'tish tashqi quvur diametrining keskin kengayishi bilan tavsiflanadi, bu asosan lümen diametrining sezilarli darajada oshishi bilan bog'liq edi (1c-rasm). DCT va CNT o'rtasidagi o'tish quvur diametri va lümenining qisqarishi bilan tavsiflanadi (1d-rasm). Nihoyat, CNT va kortikal CD o'rtasidagi bog'liqlik, ikkala quvur diametri va lümeninin keskin o'sishi bilan tavsiflangan (1e-rasm). Ushbu morfologik o'tishlarning miqdoriy ko'rsatkichlari statistik jihatdan ahamiyatli edi (1f-rasm) va uning muvofiqligi maxsus quvurli markerlar bilan bo'yash bilan tasdiqlangan (Qo'shimcha rasmlar S3-S5 va qo'shimcha film S3-S5).

PTlarning shakli va o'lchamlari ularning chuqurligiga qarab farqlanadi

Qalin bo'yashbuyrak bo'limlaributun PT segmentlarining fazoviy evolyutsiyasi koordinatalarini kuzatish imkonini berdi. Qizig'i shundaki, biz ularning shakli nihoyatda o'zgaruvchanligini va ularning glomeruli korteksdagi joylashuvi bilan aniqlanganligini aniqladik. Global miqyosda biz 3 ta naqshni aniqladik. Birinchi korteks korteksning eng tashqi qismini (eng tashqi 30 foizi buyrak kapsulasiga yaqin) egallagan eng yuzaki nefronlarga (SNs) javob berdi (2a-rasm; Qo'shimcha film S6). Ularning o'ralgan qismlari o'z glomerulusi atrofida atigi 6 dan 7 gacha bo'lgan ixcham tuzilmalarni hosil qilib, juda kichik va zich o'ralgan joylarni egallagan. Ushbu SNlarning konvolyutsiyasi medulla ichiga tushadigan uzun va to'g'ri to'g'ri pars bilan tugaydi. Ushbu spektrning qarama-qarshi tomonida biz ikkinchi naqshni kuzatdiknefronlarkorteksning eng chuqur qismida (40 foizga ko'proq ichki chuqurlik), medulla (juxtamedullar nefronlar [JNs]) yonida joylashgan (2a-rasm; S6 qo'shimcha rasm va qo'shimcha film S6). Ularning PTlari dastlabki qisqa halqa bilan xarakterlanadi, u muntazam ravishda papilla tomon pastga tushadi va keyin U buyrak kapsulasiga qarab ko'tariladi. SN dan farqli o'laroq, JN proksimal konvolutsiyali kanalchalari o'zlarining glomerululari atrofida rivojlangan va juxtamedullar korteksdagi katta, bo'shashgan domenlarni egallagan katta bobinlar bilan tavsiflangan. JN larning PT ning konvolyutsiyali qismi 10 dan 15 gacha konvolyutsiyaga ega bo'lib, katta domenlarni hosil qiladi. Nihoyat, uchinchi naqsh korteksning o'rta qismida joylashgan nefronlarni o'z ichiga oladi (o'rta nefronlar [MNs]) (2a-rasm; Qo'shimcha film S6). Qizig'i shundaki, bu naychalar SN va JN o'rtasidagi o'tishni ifodalovchi shakli va fazoviy yo'nalishiga ega edi. Darhaqiqat, ular SN dan kattaroq, lekin JN dan kichikroq bo'lgan 8 dan 9 gacha bo'lgan sarg'ishlarni o'z ichiga olgan. Bundan tashqari, MN larda JN ga qaraganda uzunroq pars recta bor edi. Qizig'i shundaki, PT shakllarini global taqqoslash shuni ko'rsatdiki, SN va MN bir hil naqshga ega, JN esa juda heterojen edi (qo'shimcha rasm S6). Bundan tashqari, bir nechta nefronlarning fazoviy rekonstruksiyasi PTlar hech qachon aralashmasligini aniqladi (Qo'shimcha film S6), bu har bir nefron korteksda o'ziga xos bo'shliqni egallashini ko'rsatadi.

Morfometrik tahlillar SN va JN ning o'lchami va shaklidagi katta farqlarni tasdiqladi, MN uchun oraliq jihat. JN ning PT SN ning PT dan 2-katta ko'proq uzunroq edi (2b-rasm); biroq, SNlarda JN larga qaraganda to'g'rilik kattaroq edi (2c-rasm), bu JN kanalchalari ancha burilishli ekanligi kuzatuviga mos keladi (2a-rasm; S6 qo'shimcha rasm).

1-rasm|Nefron segmentlarini aniqlash uchun ishlatiladigan morfologik mezonlar. (a-e) Nazorat sichqonlarida nefronning turli segmentlarining morfologiyasi. Nefronlar glomerulusning siydik qutbidan yig'uvchi kanalgacha (proksimal tubula [PT]: firuza; Henle halqasining ingichka bo'lagi [TL]: och kulrang; Henle halqasining qalin ko'taruvchi qismi [TAL]: to'q kulrang; distal konvolyutsiyali tubula [DCT]: pushti; birlashtiruvchi naycha [CNT]: sariq; kortikal yig'uvchi kanal [CCD]: to'q sariq). Oklar turli nefron segmentlarining diametrini ko'rsatadi. (Davomi)

1-rasm|(Davomi) (f) Turli nefron segmentlarining tashqi quvur diametrini aniqlash. Ma'lumotlar o'rtacha SEM sifatida ifodalanadi. Tukey-Kramer testidan keyin dispersiya tahlili: **P < 0.01,="" ***p=""><>

3-rasm|Uch o'lchovli (3D) nefronni qayta qurish 3 xil turdagi nefronlarni aniqlaydi. (a) Nazorat qiluvchi sichqonlarda yuzaki korteksdagi (ko'k), o'rta korteksdagi (yashil) va juxtamedullar mintaqadagi (qizil) glomeruliyadan yig'ish kanaligacha bo'lgan butun nefronning (chap panellar) vakili 3D tasvirlari. 3 xil turdagi nefronlar uchun nefron segmentatsiyasi (o'ng panellar). Bar ¼ 150 mm. (b) 3 turdagi nefronlar uchun Henle halqasining 2 a'zosi orasidagi masofani miqdoriy aniqlash. (c) Nefron uzunligini aniqlash (davomi)

3-rasm|(davomi) Nefronlarning 3 turi. d) nefronning turli segmentlari uzunligini nefron turiga ko'ra miqdoriy aniqlash. Ma'lumotlar o'rtacha -SEM sifatida ifodalanadi. Tukey-Kramer testidan so'ng dispersiya tahlili: juxtamedullar nefron (JN) va yuzaki nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" va="" o'rta="" nefron="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001.="" cnt,="" birlashtiruvchi="" naycha;="" dct,="" distal="" burmalangan="" tubula;="" pt,="" proksimal="" tubula;="" tal,="" henle="" halqasining="" qalin="" ko'tarilgan="" a'zosi;="" tl,="" henle="" halqasining="" ingichka="">

Glomerulyar kattaligi chuqurlikka qarab o'zgaradi

Keyin 3 ta zonaning har biridan tasodifiy tanlangan glomeruli chuqurligi va diametrini tahlil qildik. Morfometrik tahlillar shuni ko'rsatdiki, glomerullar JN va SNlarda buyrak kapsulasidan o'rtacha 783 va 355 mm masofada joylashgan. Avval xabar qilinganidek, biz glomeruliyalarning kattaligi ularning chuqurligiga qarab o'zgarishini kuzatdik. Xususan, JN larning glomerulyar hajmi SN va MN larga qaraganda 3 marta katta edi (2d-rasm).

3D nefronni qayta tiklash

Keyin biz butun nefronlarning PT dan CNTgacha bo'lgan fazoviy evolyutsiyasini kuzatdik. Ularning 3D rekonstruktsiyasining global ko'rinishi nefron shakli SN, MN va JNs o'rtasida farq qilishini tasdiqladi (3a-rasm; Qo'shimcha film S7). Bu farq, asosan, PT tuzilishi bilan bog'liq edi. Bundan tashqari, biz HLning boshqa 3D fazoviy tashkilotga ega ekanligini kuzatdik. Xususan, TL va TAL SN va MN larga qaraganda JNlarda uzoqroq ajratilgan (3b-rasm). Morfometrik tahlillar shuni ko'rsatdiki, JN global miqyosda SN ga qaraganda 2-katta uzunroq (3c-rasm). Kattalashtirilgan uzunlik barcha nefron turlarida o'xshash mutlaq uzunlikka ega bo'lgan TAL va DCTdan tashqari barcha segmentlarda mutanosib ravishda taqsimlangan (3d-rasm). Bu nefron cho'zilishi hayratlanarli darajada bir hil naqshli jarayon ekanligini ko'rsatdi.

Yoysimon tomirlar juxtamedullar PT konvolyutsiyasiga ta'sir qiladi

Kengroq nuqtai nazarga ega bo'lish uchunbuyrak tuzilishi, biz Griffonia simplicifolia agglutinin bo'yalishidan foydalandik, bu bizga yoysimon tomirlar va ularning shoxlarini kortikal nurlanish tomirlariga kuzatish imkonini berdi (4a-rasm; Qo'shimcha film S8). Qizig'i shundaki, nefronlar va tomirlarning 3D rekonstruktsiyasi shuni ko'rsatdiki, yoysimon tomirlar yaqin atrofdagi tubulalar bilan hayratlanarli parallel fazoviy tashkilotda bo'lishga moyil. Xususan, biz aniq JNs (cheklangan JN) tomonidan ta'qib qilinadigan yo'l yaqin atrofdagi kemaning yo'lidan borishga intilishini kuzatdik (4b-rasm; Qo'shimcha film S9). Shunisi e'tiborga loyiqki, bu moyillik (faqat JN nefronlarining kichik to'plamida kuzatiladi) PT shakllarining katta heterojenligini hisobga olgan (Qo'shimcha rasm S6). Morfometrik tahlillar shuni ko'rsatdiki, "cheklangan" PTlar "cheklanmagan"larga qaraganda sezilarli darajada uzunroq va ko'proq burilishli (to'g'riligi pasaygan) (4c va d-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, ikkala SN va MN ning egilgan qismlari yoysimon tomirlar ustida joylashgan va ular cheklanmagan.

Naychalar tekislikda yotishga moyildir

Qizig'i shundaki, nefronlarning 3D shakllarini tekshirish ularning tekislikda yotishga moyilligini ko'rsatdi (5a-rasm; S1 qo'shimcha film0). Ushbu parametrni miqdoriy aniqlash va ushbu konformatsiyaning mumkin bo'lgan statistik moyilligini baholash uchun biz tubulalarning halqalari bilan belgilangan tekislikdan egilishning umumiy tendentsiyasini o'lchadik. Bizning o'lchovlarimiz shuni ko'rsatdiki, bir xil ketma-ket o'lchangan burchaklar va ketma-ket nuqtalar orasidagi uzunlik bilan yaratilgan tasodifiy yurishning simulyatsiya qilingan modeli bilan solishtirganda (5b-rasm), kanalchalar tekislikdan kichikroq og'ish bilan rivojlanishga moyil edi (5-rasm). Bu tubulalar tekislik bo'ylab o'z yo'llarini cheklashga moyilligini ko'rsatdi. Kuzatilgan farqlar juda statistik ahamiyatga ega edi (P <>

cistanche buyraklar faoliyatini yaxshilashi mumkin

3D nefron rekonstruktsiyasi kista rivojlanishining o'ziga xos naqshini ochib beradi

Protokolimiz tartibsiz patologik to'qimalarda nefronlarni kuzatish imkonini beradimi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz NPHP va kist kasalligining keng qo'llaniladigan modeli jck sichqonlarida kistalarning shakllari va fazoviy tarqalishini tavsifladik.31–33 3D tasvirlar shuni ko'rsatdiki, shunga qaramay ko'zga ko'ringan kistalar paydo bo'lishida nefronlarning umumiy 3D kursi nazorat sichqonlarinikidan sezilarli darajada farq qilmadi (Qo'shimcha film S11). Xuddi shunday, morfometrik tahlillar nefronlarning global uzunligi, glomerulyar hajmi va har birining uzunligini tasdiqladi.nefronsegment nazorat sichqonlari bilan solishtirish mumkin edi (Qo'shimcha rasm S7). Shunisi e'tiborga loyiqki, kista rivojlanishi tufayli biz HLda TLni TALdan farqlay olmadik. Barcha nefronlarda fusiform kistalar paydo bo'ldi (Qo'shimcha filmlar S11 va S12). Eng hayratlanarli xususiyatlardan biri fusiform kista kengayishlari bir xil bo'ylab bir nechta joylarda sodir bo'lganligini kuzatish edi.nefronsegment (Qo'shimcha filmlar S12 va S13). Qizig'i shundaki, biz kistalar PT va HL tushuvchi oyoq-qo'llarda hech qachon rivojlanmaganligini kuzatdik (6a-rasm; Qo'shimcha film S12). Aksincha, ular asosan HL ko'tarilgan oyoq-qo'llarida, DCT'larda, CNTlarda va CD larning yuqori qismida CNT bilan uzluksizlikda aniqlangan (6a-rasm; Qo'shimcha film S12). Xususan, biz DCT, shuningdek, CNT segmentlarida ularning distal qismlarida kistalar rivojlanish ehtimoli o'ziga xos tarzda oshganligini kuzatdik (6b-rasm). 3D rekonstruksiya tasvirlarining miqdoriy morfometrik tahlillari shuni ko'rsatdiki, kistaning umumiy hajmi har bir kishi uchunnefronCNTda ayniqsa yuqori edi (7a-rasm). Bundan tashqari, biz HL va DCTdagi kistlarning kattalashishi SN va MN larga qaraganda JNlarda ko'proq ekanligini kuzatdik (7a-rasm; Qo'shimcha film S12). Bundan tashqari, kist bilan kasallanish JNlarda boshqa nefron turlariga qaraganda sezilarli darajada yuqori bo'lgan (7b-rasm). Shuningdek, biz o'rtacha glomerulyar masofa (eng yaqin 5 glomeruliya bo'yicha hisoblangan) ayniqsa kistli sichqonlarda, ayniqsa yuzaki korteksda ortib borishini kuzatdik (Qo'shimcha rasm S8).

Ko'p sonli kistalarni 3D rekonstruksiya qilish ularning shakli va hajmi jihatidan juda o'zgaruvchanligini aniqladi (6c-rasm; S11 va S13 qo'shimcha filmlar). HL ko'tarilgan oyoq-qo'llarida kistalar kichik diametrli fusiform shaklga ega edi. DCTda kistalar ancha sferik va kattaroq shaklga ega bo'lib, kengaytirilmagan kanalchalar orasida joylashgan. Qizig'i shundaki, DCT va CNT o'rtasidagi o'tish muntazam ravishda oddiy kengaymagan struktura bilan tavsiflangan. Bundan farqli o'laroq, CNTda biz CD bilan bevosita aloqada bo'lgan qo'shni kengaygan kista tuzilishini muntazam ravishda kuzatdik. Qizig'i shundaki, CD-da bu struktura asta-sekin oddiy tubula o'lchamiga qisqardi. Distalda, CD ning qo'shni qismida boshqa kistalar aniqlanmadi. Yana bir izchil xususiyat HL ko'tarilgan oyoq-qo'llarida kistlarning o'ziga xos fazoviy tashkil etilishi edi. Darhaqiqat, SNlarda kistalar chuqurroq va halqaga yaqinroq bo'lsa-da, ular yuzakiroq va JNlarda DCTga yaqinroq edi (6c-rasm). Yana kistalar MNlarda oraliq joyni egallagan (6c-rasm).

5-rasm|Nefron kanalchalari yassi tuzilishga ega bo'ladi. (a) Nefron proksimal tubulasining odatiy yo'li. Bu yo'l uning tekislikda yotishga moyilligini ko'rsatadi. Yo'lning evolyutsiyasi tekisligi to'g'ri aylantirilganda va kuzatuvchining nuqtai nazariga moslashtirilganda yaxshiroq ko'rinadi (chap tomonda boshqa burchakda tasvirlangan bir xil quvurli segmentning o'ng tomonidagi rasmga qarang). burchak). (b) 4 ta segmentdan tashkil topgan quvurli yo'lning sxematik tasviri (misol sifatida ko'rsatilgan ma'lum quvur yo'lini belgilaydigan 5 nuqta). Yo'llarning "o'z tekisligidan" chiqib ketish darajasi bu erda "beta" sifatida ko'rsatilgan burchak bilan ifodalanishi mumkin. (Davomi)

5-rasm|(Davomi) Bu burchak tekislikka nisbatan p{1}}p4 segmenti orasida o'lchanadi (to'g'ridan-to'g'ri oldingi p3, p2 va p1 nuqtalari bilan belgilanadi) va sxemada quyuq kulrang to'rtburchaklar bilan ifodalanadi. Keyin beta burchaklarni hisoblash quvurli yo'ldagi nuqtalar to'plami bo'ylab rekursiv hisoblab chiqildi. Ushbu beta burchaklarining egilish darajasini baholash uchun biz har bir quvurli yo'lning bir xil ketma-ket alfa burchaklari to'plamidan (barcha ketma-ket segmentlar orasida o'lchangan) foydalanib, tasodifiy yurishni (Monte-Karlo simulyatsiyasi [MCs]) taqlid qildik. Bu tasodifiy yurish bir xil alfa burchaklari va tasodifiy beta burchaklari bilan yaratilgan yo'l. (c) beta burchaklarining global taqsimlanishining skripka syujetlari va proksimal kanalchada (PT), Henle halqasining ingichka bo'lagida (TL), Henle halqasining qalin ko'taruvchi a'zosida (TAL), distal burama tubuladagi MCs natijasi ( DCT) va biriktiruvchi tubula (CNT). MCs, P <>

MUHOKAZA

An'anaviy gistologik usullar nefronlarning global shakliga ta'sir qiluvchi patologik o'zgarishlarni aniqlash qobiliyatida cheklangan. Bu erda biz normal va patologik sharoitlarda misli ko'rilmagan fazoviy tafsilotlar bilan buyrak arxitekturasi bo'yicha muhim savollarni hal qilish potentsialiga ega bo'lgan to'qimalarni tozalashga asoslangan kuchli yondashuvni taqdim etamiz. Natijalarimiz o'zlarining funktsional xususiyatlariga mos keladigan joylashuvi, shakli va o'lchamlari bilan farq qiluvchi 3 turdagi nefronlarning mavjudligini tasdiqladi. Bundan tashqari, biz nefronlar tekislikda yotishga va kemaning fazoviy tuzilishiga moslashishga moyilligini ko'rsatdik. Qizig'i shundaki, biz ushbu texnikani modelga qo'llaganimizdakistli buyrak kasalligi, biz kistalar hammada rivojlanishini kuzatdik

nefronlar, lekin faqat ma'lum segmentlarda. Qizig'i shundaki, biz kista shakli nefron segmentiga qarab o'zgarib turishini va bir xil nefron bo'ylab kistalar oddiy kengaymagan kanalchalar bilan birlashishini ko'rsatdik. Umuman olganda, bu natijalar nefronlar va tomirlarning fazoviy joylashuvining birinchi 3D tavsifini beradi va eng muhimi, sistogenez kabi patologik jarayonni tushunish uchun asos bo'ladi.

Buyrakning optik tozalanishi yuqori darajadagi avtofluoresans va hujayra zichligi tufayli qiyin. Turli xil kliring protokollarini taqqoslab, biz BABBda eng chuqur qismida joylashgan tuzilmalarni vizuallashtirish va rekonstruksiya qilishni amalga oshirish uchun kuchli texnikani aniqladik.buyrak, ya'ni medulla. Bundan tashqari, BABB tez va kengaytirilishi mumkin va tozalangandan so'ng, namunalar tasvirni olishdan oldin bir necha oy davomida saqlanishi mumkin. Ushbu texnikaning yana bir asosiy afzalligi uning arzonligi. Tozalash vositalari tuzilmalarning kichrayishi yoki kengayishiga olib kelishi mumkin.9-17 Biroq, buyrak hajmining bu modifikatsiyalari izotropik bo'lgani uchun nisbiy o'lchovlarga ta'sir qilishi yoki ularning talqinini noto'g'ri talqin qilishi kutilmaydi. Eng muhim cheklovlardan biri bu juda ko'p vaqt talab qiladigan tuzilmalarning izohlari. Shunga qaramay, bu cheklovni tezda yengib o'tishi kerak bo'lgan chuqur o'rganishga asoslangan texnikalar soni ortib bormoqda.

Klassik usullar bilan olingan natijalarga muvofiq, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, nefronlar o'zlarining holatiga ko'ra shakli va uzunligi bo'yicha farqlanadi. Xususan, biz JNlarning ko'proq rivojlangan burmalangan PT va katta glomeruli borligini va SN dan 2 baravar uzunroq ekanligini kuzatdik. Kengaytirilgan uzunlik uyg'un jarayonning natijasidir, chunki cho'zilish proportsional ravishda barcha nefron segmentlariga ta'sir qiladi. Shuningdek, biz JNlarning kattaroq HLga ega ekanligini kuzatdik. Umuman olganda, bu ma'lumotlar SN va JN mikroanatomiyasi sezilarli darajada farq qilishini va MN oraliq xususiyatlarni namoyish etishini aniq ko'rsatadi. Qizig'i shundaki, fiziologik tadqiqotlar nefronlarning ham funksional jihatdan farqlanishini ko'rsatdi.2 Bu farqlar asosidagi morfogenetik hodisalar hali ma'lum emas. Shunday qilib, JN ning o'ziga xos tuzilishi ularning funktsiyalarining o'ziga xosligini hisobga olishi mumkin, deb taxmin qilish jozibali.

Qizig'i shundaki, birinchi marta nefronlar va ularning atrofidagi tomirlarning 3D rekonstruktsiyasini ta'minlash orqali biz yoysimon tomirlar va nefronlarning kichik guruhi o'rtasida fazoviy cheklanishni aniqladik. Shunday qilib, kemalar yo'lni belgilashi mumkin deb o'ylash mumkinnefronlarRivojlanish jarayonida uzayadi.34,35 Nefronlarning 3D shakllarini hisoblash simulyatsiyalari bilan birgalikda tekshirish ham nefronlarning hech qachon aralashmasligini va har bir nefron bir tekislikda yotishga moyilligini ham aniqladi. Ushbu kuzatishning funktsional ahamiyati haligacha ochib berilishi kerak.

Kist rivojlanishi davridapolikistik buyrak kasalligihali ham qiziq jarayon. NPHP, kista rivojlanishi bilan tavsiflangan patologik holat, bolalar va o'smirlarda oxirgi bosqichli buyrak kasalligini keltirib chiqaradigan eng keng tarqalgan genetik kasallikdir. Hozirgacha yigirmata NPHP geni aniqlangan.36 Ular orasida NEK8 hech qachon mitozda bo'lmagan A bilan bog'liq kinazlar oilasining a'zosini kodlaydi, bu siliya funktsiyasi va hujayra siklining rivojlanishida rol o'ynaydi.37 Nek8 dastlab mutatsiyaga uchragan gen sifatida tavsiflangan. jck sichqonlari.32 Shunisi e'tiborga loyiqki, xuddi shu protein domenidagi mutatsiya odamlarda NPHP9 ga olib kelishi ko'rsatilgan.38 2D tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, kista rivojlanishi polikistik buyrak kasalligining turli shakllarida keskin farq qiladi.27,29 Xususan, , NPHPda kistalar faqat CD va DCT dan olingan ko'rinadi.31 Garchi ma'lumotli bo'lsa-da, bu immunohistokimyoviy tadqiqotlar o'ziga xos quvurli belgilarning yo'qolishi39 sun'iy ravishda bu kuzatuvni hisobga olish imkoniyatiga qarshi bahslasha olmaydi. Shunday qilib, bizning 3D tadqiqotimiz kist rivojlanishining faqat ma'lum nefron segmentlarini o'z ichiga olishi mumkin bo'lgan jarayon ekanligi haqidagi birinchi aniq dalillarni beradi. Qizig'i shundaki, NIMA (Hech qachon mitoz geni A) - Related Kinase 8 (NEK8) barcha nefron segmentlarining sitoplazmasida ifodalangan bo'lsa-da, uning siliyadagi ifodasi DCT va CD bilan cheklangan. Faqatgina ushbu segmentlar kistalar rivojlanishiga moyil bo'lganligi sababli, biz NEK8 siliyer funktsiyasining buzilishi kist shakllanishi uchun hal qiluvchi voqea ekanligini taxmin qilishimiz mumkin. Qizig'i shundaki, biz fusiform kistalar oddiy kengaymagan kanalchalar bilan uzluksizligini ham kuzatdik. Resessiv germline mutatsiyasining faqat hujayralar kichik to'plamida patologik fenotipga olib kelishi, autosomal dominant polikistik uchun taklif qilinganidek, ikkinchi hodisa bu hujayralarda kista rivojlanishiga sabab bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.buyrak kasalligi.40,41

Shuningdek, biz kistaning kengayishi JNlarda SNga qaraganda ko'proq ustun ekanligini kuzatdik, hech bo'lmaganda PT va CNT o'rtasida joylashgan kistalarni hisobga olgan holda. Izchil ravishda, glomeruloskleroz kontekstida glomerulyar lezyonlar SNsga qaraganda JNlarda tez-tez topilganligi xabar qilingan.nefronGlomerulyar fifiltratsiya tezligi va transport/fermentativ faollik JN ning yomonlashishiga sezuvchanligini oshiradi, bu qo'shimcha tekshirishga loyiq qiziqarli gipotezadir.

Xulosa qilib aytganda, biz aniq belgilangan ichki tuzilmalarning (nefronlar, tomirlar va kistalar) fazoviy va miqdoriy taqsimotini to'g'ridan-to'g'ri qayd etish uchun etarli molekulyar o'ziga xoslik va ruxsatga ega bo'lgan buyraklarni 3D formatida tasvirlashning yangi usulini tasvirlaymiz. To'g'ridan-to'g'ri miqdorni aniqlashning qulayligi, tezligi va qobiliyatini hisobga olgan holda, biz ushbu uslub buyrak patofiziologiyasini tushunish uchun kuchli vositaga aylanishini taxmin qilamiz.

6-rasm|Uch o'lchovli (3D) nefron rekonstruktsiyasi kistalarning faqat o'ziga xos nefron segmentlarida rivojlanishini ko'rsatadi. (a) JK sichqonlarida yuzaki korteksdagi (ko'k), o'rta korteksdagi (yashil) va juxtamedullar mintaqadagi (qizil) glomeruliyadan yig'ish kanaligacha butun nefron (chap panellar) kista hajmini ko'rsatadigan vakillik 3D tasvirlari. 3 xil turdagi nefronlar uchun nefron segmentatsiyasi (o'ng panellar). Bar ¼ 150 mm. (b) JK sichqonlarida turli nefron segmentlarida kistalar rivojlanish ehtimoli. (Davomi)

6-rasm|(Davomi) Gorizontal o'q 50 ta qutiga to'g'ri keladigan nefronlarning normallashtirilgan uzunligi (proksimal naycha [PT], firuza; Henle halqasi [HL], oq; distal burama naycha [DCT], pushti; birlashtiruvchi naycha [CNT], sariq) . (c) HL (chap panellar), DCT (o'rta panellar) va CNTs va yuzaki (yuqori panellar), o'rtadagi kortikal yig'ish kanallari (CCD) (o'ng panellar) ning ko'tarilgan a'zolarining kista hajmini ko'rsatadigan 3D kistalarning rekonstruksiya tasvirlari. (o'rta panellar) va jck sichqonlarida juxtamedullar (pastki panellar) nefronlari. Bar ¼ 50 mm.

USULLARI

Hayvonlar

Hayvonlar bilan bog'liq barcha protseduralar "Vétérinaires de la Prefecture de Parij Police Services" va Parij Dekart universitetining axloqiy qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Ikki oylik FVB/N sichqonlari (n¼ 20) buyrakni tozalash uchun eksperimental holatni o'rnatish uchun ishlatilgan. Keyinchalik tadqiqot 2-haftalik jck erkak sichqonlarda (n ¼ 4) va nazorat ostidagi bolalarda (n ¼ 3) o'tkazildi.

Buyrak to'qimalarini tayyorlash

O'ldirishdan oldin sichqonlar yurak ichidagi kateterizatsiya orqali 25 ml geparinlangan fiziologik eritma (1000 IU/l), so'ngra 75 ml 4 foizli paraformaldegid fosfat-buferli tuz (PBS) bilan perfuziya qilindi. Tajribalar ksilazin (Rompun 2 foiz, Bayer, Leverkusen, Germaniya, 6 mg/g tana vazni) va ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Fransiya, 120 mg/g tana vazni) anesteziyasi ostida o‘tkazildi.

Tozalash tadqiqotlari uchun buyraklar 4 foizli paraformaldegidda 4 soat davomida mahkamlangan va 4 foizli agaroza ichiga yotqizilgan va buyrak hilumini o‘rab turgan 1.{4}}qalinlikdagi bo‘laklar kesilib, PBSda 4 C da saqlanadi.Buyrak bo'limlariavval bo'yalgan, keyin esa tozalangan.

Yupqa kesmalarda immunohistokimyoviy tadqiqotlar uchun,buyraklarBir kechada 4 foizli paraformaldegidda fiksatsiya qilindi va parafin bilan singdirilgan va 4- mm kesmalar kesildi.

Bo'yash

Davriy kislota - Shiff bo'yash. 1.{1}}mm buyrak boʻlaklari tozalashdan oldin toza yoki 1:100 PBS bilan suyultirilgan davriy kislota-Schiffda xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.

Yupqa parafin o'rnatilgan qismlarda immunohistokimyo. Parafin o'rnatilgan buyraklarning to'rt mikrometrli bo'limlari antigen olish uchun qizdirildi va kanalchalarni (rodamin yeryong'oq aglutinin [RL-1072-5] va rodamin bug'doy urug'i [RL-1072-5] kuzatish uchun floroxrom bilan bog'langan lektinlar bilan bir kechada 4C da inkubatsiya qilindi. 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, 1:200 da suyultirilgan) va alohida quvurli segmentlarni tasvirlash uchun segmentga xos birlamchi antikor (biotinillangan Lotus tetragonolobus lektin [B-1325], Vector Laboratories, 1 nisbatda suyultirilgan: 100; sichqoncha anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Germaniya, 1:200 da suyultirilgan; echki anti AQP2 [C-17], Santa Cruz, 1:200 da suyultirilgan) . Ertasi kuni qismlar xona haroratida ikkilamchi antikor bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilindi (Alexa Fluor 488 konjugati [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; sichqonchaga qarshi Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; hammasi 1:500 nisbatda suyultirilgan) 40,6-diamidino-2-fenilindol bilan bo‘yalgan. Barcha tasvirlar Nikon Eclipse E800 mikroskopi (Champigny sur Marne, Fransiya) yordamida olingan va FiJi dasturi yordamida tayyorlangan (versiya 1.50).

Qalin bo'laklarda lektin bilan bo'yash. Qalinligi 1.{1}} mm boʻlgan buyrak boʻlaklari Texas Red yoki fluorescein izotiosiyanat qoʻshilgan lektinlar: yeryongʻoq aglutinini (RL-1072-5) va bugʻdoy urugʻi aglutinini (RL{{6})da 1 oy davomida 4 C da inkubatsiya qilindi. }), 0,1% PBS azid va 0,1% Triton-X da 1:100 nisbatda suyultiriladi. Keyin bo'limlar tozalashdan oldin har kuni 2 hafta davomida PBS bilan yuvildi.

Optik tozalash

Skalani tozalash uchun 1.{1}}mm buyrak qismlari ScaleA2 (4 M karbamid, 0,1 foiz Triton X-100, 10 foiz glitserin) yoki ScaleB4 da inkubatsiya qilindi. (8 M karbamid, 0,1 foiz Triton X-100) 2 hafta, 1 yilgacha, 4 C da.

BABB ni tozalash uchun 1.{1}} mm buyrak boʻlaklari xona haroratida etanol bilan ketma-ket chayishda suvsizlandi. Keyin namunalar BABB (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) da 1:2 nisbatda kamida 2 kun davomida 4C da inkubatsiya qilindi.

Ikki fotonli mikroskopda tasvir olish

Mai Tai HP titanium-safir lazeri (Spectra-Physics, Santa Klara, CA) bilan jihozlangan teskari multifotonli mikroskopda (LaVision BioTec) to'qimalar suvli jel bilan tasvirlangan (qo'shimcha rasm S1A). Qo'zg'alish to'lqin uzunligi quvvatning 8 foizida 815 nm edi. Biz 20 suvga botirish ob'ektividan foydalandik (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokio, Yaponiya]; raqamli diafragma, 0,95; ish masofasi, 2,0 mm). Fluoressensiyani olish uchun biz 593/40 nm tarmoqli o'tkazgichli filtrli 80 foizda skanerlanmagan detektordan foydalandik.

Birinchi qadam eng mos keladigan markaziy maydonlarni tanlashga yo'l-yo'riq ko'rsatish uchun suboptimal olish parametrlaridan (400 mm 400 mm va 1011 1011 piksel, 10 foiz o'xshashlik va o'rtacha chiziq 2) foydalanib, o'rta z stackida 2D mozaik tasvirni olishdan iborat edi. (Qo'shimcha rasm S9A). Qiziqarli xy grid va z maydonlari aniqlangandan so'ng, yuqori sifatli tasvirlarni olish uchun parametrlar o'rnatildi. Bunday yondashuv qiziqish hududini z stack uchun 5 12 fifieldsgacha qisqartirdi. Keyin buyrakning o'rta qismidagi buyrak tolasini o'rab turgan 850 z stack/optik bo'laklarni (1-mm qadam o'lchami) oldik.buyrak bo'limi.

Tasvirni tikish, qayta ishlash va kuzatish

Har bir stek Preibisch va boshqalar tomonidan ishlab chiqilgan usul bo'yicha plitka qo'yilgan, bu Fidji dasturiy ta'minotining (http://fifiji.sc/Fiji) "Grid/Collection stitching" plaginidan foydalanib, katta hajmdagi rasmlar to'plamini tikish imkonini beradi. . Tikuvdan so'ng biz ikkita qo'shni tasvir o'rtasida muhim siljishni kuzatganimiz sababli, biz Python-da moslashtirilgan dastur yozdik. Ushbu dastur tasvir siljishini qoplaydi, bu bizga tasvirlarni to'g'ri tekislash imkonini beradi (Qo'shimcha rasm S9B). Tikilgan tuzatilgan tasvirlar Imaris 8.4.2 versiyasi (Bitplane, Tsyurix, Shveytsariya) yordamida tahlil qilindi. Naychalar va tomirlar Imarisning filament tracer paketining qo'lda rejimidan foydalangan holda kuzatildi va biz MATLAB bilan ishlab chiqilgan Imaris Xtension bilan birlashtirildi (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Qo'shilish{{12) }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (Qo‘shimcha S9C rasm). Glomeruli va kistalar Imaris sirt paketining qo'lda rejimidan foydalangan holda 3D rekonstruksiya qilindi. 3D glomeruli fazoviy tashkiloti Imarisning dog'lar to'plamining qo'lda rejimidan foydalangan holda ko'rsatildi.

Morfometriya

Naychali segment uzunligi, nefron uzunligi va to'g'riligi Imarisning fifilament izlovchi paketi yordamida aniqlandi. Imaris dasturiga ko'ra, to'g'rilik 2 nuqta orasidagi masofa va nefron segmenti yo'lining uzunligi o'rtasidagi nisbat sifatida aniqlangan. 3 ta yovvoyi sichqonlarda 31 ta PT va 12 ta butun nefron qayta tiklandi va oʻlchandi, 4 ta sichqonda esa 37 ta PT va 17 ta butun nefron qayta tiklandi va oʻlchandi. Kist va

glomerulyar hajmlar Imarisning "yuzaki paketi" yordamida aniqlandi. O'ttiz bir va 34 glomeruli mos ravishda yovvoyi va jck sichqonlarida o'lchandi. Hammasi bo'lib yetmish to'rtta kist o'lchandi.

Quvurli burilishlarning "tekislikdan tashqaridagi" burchaklari ("beta" sifatida ko'rsatilgan) tekislik (ketma-ket 3 nuqta bilan belgilangan) va kosmosdagi keyingi ketma-ket to'rtinchi nuqta bilan yo'nalish o'rtasida o'lchandi (5b-rasm). Kuzatilgan moyillikning statistik ahamiyatini baholash uchun biz bir xil alfa burchaklari to'plamiga ega bir xil segmentlar tomonidan tuzilgan tuzilmalarda beta burchaklarining tasodifiy aylanishi bilan beta burchaklarining taqsimlanishini simulyatsiya qildik (Monte-Karlo simulyatsiyasi).

Bo'ylab kistli lezyon rivojlanish ehtimolini hisoblash uchunnefronsegmentlar, biz har bir nefronni kosmosdagi nuqtalar to'plami bilan ifodaladik. Har bir nuqta normal tuzilishga nisbatan kistaning mavjudligi va segment turiga qarab izohlangan. Har bir standartlashtirilgan uzunlikdagi ehtimollik (50 qutiga o'rnatilgan) kistli izohli nuqtalar soni va qutidagi umumiy nuqtalar soni o'rtasidagi nisbat sifatida hisoblab chiqilgan.

O'rtacha glomerulyar masofani hisoblash uchun biz har bir glomeruliya uchun eng yaqin 5 glomerulda hisoblangan o'rtacha glomerulyar masofani ko'rib chiqdik.

Ma'lumotlarni tahlil qilish va statistika

Ma'lumotlar o'rtacha SEM sifatida ifodalanadi. Eksperimental guruhlar o'rtasidagi farqlar muhim bo'lsa (P < {0}}.05),="" tukey-kramer="" testi="" orqali="" kuzatilgan="" dispersiya="" tahlili="" yordamida="" baholandi.="" faqat="" 2="" guruh="" solishtirilganda,="" mann-whitney="" testidan="" foydalanilgan.="" statistik="" tahlillar="" graph="" prism="" dasturi="" (san-diego,="" ca,="" 9.0.0="" versiyasi)="" yordamida="" amalga="">

OSHHOR QILISh

Barcha mualliflar raqobatdosh manfaatlar yo'qligini e'lon qilishdi.

MAQDAT

Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Federativ de Recherche Necker tuzilmasining gistologiya va tasvirlash platformalariga texnik yordam uchun minnatdorchilik bildiramiz. Qo'lyozmani tanqidiy o'qib chiqish uchun Per Isnard, Mari-Claire Gubler va Nikolas Kupervasserga minnatdorchilik bildiramiz. Ushbu ish Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Parij Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Men kimman, Roche Pharma tadqiqotlari va erta rivojlanish (Basel) tomonidan qo'llab-quvvatlandi. , Shveytsariya) va Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Parij, Fransiya).

MUALFOLAR HISSALARI

TB, NG va MZ tajribalarni ishlab chiqdi va amalga oshirdi va ma'lumotlarni tahlil qildi. FB, LT, MGT va SG ham ba'zi tajribalar o'tkazdilar va ma'lumotlarni tahlil qildilar. MB va CN sichqoncha bilan tajriba o'tkazdilar. TB va MZ ham qo‘lyozmani yozishga hissa qo‘shgan. GF qo'lyozmani qayta ko'rib chiqdi. FT va MP kontseptual asosni taqdim etdilar va tadqiqotni ishlab chiqdilar, loyihani nazorat qildilar va maqola yozdilar.

cistanche buyrakni tonlashi mumkin

QO'SHIMCHA MATERIAL

Qo'shimcha fayl (PDF)

S1-rasm. Eksperimental sozlash, olish tartibi va tasvirni qayta ishlash.

S2-rasm. Xy va z rezolyutsiyalarida avtofluoresans signalining chegaralari.

S3-rasm. PT va TL o'rtasidagi o'tishning ikki o'lchovli tasviri 4- mm parafin o'rnatilgan buyrak qismlarida.

S4-rasm. TAL va DCT o'rtasidagi o'tishning ikki o'lchovli tasviri 4- mm parafin o'rnatilgan buyrak qismlarida.

S5-rasm. DCT va CNT o'rtasidagi o'tishning ikki o'lchovli tasviri 4- mm parafin o'rnatilgan buyrak qismlarida.

S6-rasm. Uch o'lchovli rekonstruksiya proksimal tubulalarning 3 xil shaklini ochib beradi.

S7-rasm. Uch o'lchovli rekonstruksiya nefronlarning uzunligi va segmentatsiyasiga kistalar ta'sir qilmasligini ko'rsatadi.

S8-rasm. Nazorat va kistli buyraklardagi glomerullarning zichligi.

S9-rasm. Sotib olish tartibi va ishlov berishdan keyingi tasvirni qayta ishlash.

S1-jadval. Tozalash usullarini taqqoslash. Qo'shimcha fayl (filmlar)

Film S1. Lektinni bo'yash piksellar sonini va signal-fon nisbatini sezilarli darajada yaxshilaydi.

Film S2. Tubulaning yo'lini kuzatish.

Film S3. Proksimal tubula va Henle halqasining ingichka qismi o'rtasidagi birikmani ko'rsatadigan tozalangan buyrakning uch o'lchovli rekonstruktsiyasi.

Film S4. Henle halqasining qalin ko'tarilgan a'zosi va distal burmalangan tubula o'rtasidagi birikmani ko'rsatadigan tozalangan buyrakning uch o'lchovli rekonstruktsiyasi.

Film S5. Distal burmalangan tubula va birlashtiruvchi tubula o'rtasidagi birikmani ko'rsatadigan tozalangan buyrakning uch o'lchovli rekonstruktsiyasi.

Film S6. Proksimal tubulalarning shakli va hajmi ularning chuqurligiga qarab farqlanadi.

Film S7. Nazorat qiluvchi sichqonlarda uch o'lchovli nefron rekonstruktsiyasi.

Film S8. Tomirning yoysimon tomirdan kortikal nurlanishli tomirgacha bo'lgan yo'lini kuzatish.

Film S9. Yoysimon tomirlar juxtamedullar proksimal tubulalarning shaklini modellashtiradi.

Film S10. Nefronlar tekislikda yotishga moyil.

Film S11. Uch o'lchovli nefron rekonstruktsiyasi kist rivojlanishining o'ziga xos naqshini ko'rsatadi.

Film S12. Uch o'lchovli nefron segmentatsiyasi kistalarning o'ziga xos nefron segmentlarida rivojlanishini ko'rsatadi.

Film S13. Polikistik buyrakdagi nefronlar va tomirlarning fazoviy joylashishi va o'zaro bog'liqligi

ADABIYOTLAR

1. Boy AR. Lipoid nefrozda juxtamedullar glomeruliyaning hozirgacha ta'riflanmagan zaifligi. Bull Jons Xopkins Xosp. 1957;100:173–186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Nefron anatomiyasining heterojenligi. Buyrak Int Suppl. 1987;20:S25–S39.

3. Kristensen EI, Grann B, Kristoffersen IB va boshqalar. Sichqoncha nefronining uch o'lchovli rekonstruktsiyasi. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB va boshqalar. Sichqoncha proksimal tubulasining raqamli uch o'lchovli rekonstruktsiyasi va ultrastrukturasi. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.

5. Zhai XY, Tomsen JS, Birn H va boshqalar. Sichqoncha nefronining uch o'lchovli rekonstruktsiyasi. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Biz hozir aniq ko'rishimiz mumkin: optik tozalash va buyrak morfometriyasi. Curr Opin Nefrol Gipertenziyalari. 2017;26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Keng miqyosdagi biologik to'qimalarni tozalash va markalash usullari. Mol hujayralari. 2016;39:439–446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Leyptsig, Germaniya: S. Hierzel; 1914 yil.

9. Hama H, Kurokava H, Kawano H va boshqalar. O'lchov: FL floresan ko'rish va shaffof sichqon miyasini rekonstruksiya qilish uchun kimyoviy yondashuv. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N va boshqalar. 3DISCO yordamida erituvchi bilan tozalangan organlarning uch o'lchovli tasviri. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P va boshqalar. ClearT: neyron va neyron bo'lmagan to'qimalarni yuvish vositasi va erituvchisiz tozalash usuli. Rivojlanish. 2013;140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. SeeDB yordamida fiksatsiyalangan miya namunalarini optik tozalash. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deissero K. Nerv tizimini xaritalash uchun CLARITY. Nat usullari. 2013;10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisserot K. Buzilmagan to'qimalarni tez va yuqori aniqlikdagi tasvirlash uchun ilg'or CLARITY. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP va boshqalar. Butun tanani tozalash orqali shaffof buzilmagan to'qimalarda bitta hujayrali fenotiplash. Hujayra. 2014;158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D va boshqalar. Kimyoviy kokteyllar va hisoblash tahlillari yordamida bir hujayrali o'lchamlari bilan butun miyani tasvirlash. Hujayra. 2014;157:726–739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H va boshqalar. Katta yoshli sichqonchaning organlarida tomografik molekulyar tasvirlash va 3D miqdorini aniqlash. Nat usullari. 2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP va boshqalar. Sichqonchaning tozalangan organlarining multifoton mikroskopiyasi. J Biomed opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Vu Z, Simon DJ va boshqalar. iDISCO: hajmni ko'rish uchun katta to'qimalar namunalarini immunobellashning oddiy, tezkor usuli. Hujayra. 2014;159: 896–910.

20. Li H, Park JH, Seo I va boshqalar. To'qimalarni elektroforetik tozalash texnologiyasining CLARITY buzilmagan qattiq a'zolar, jumladan, miya, oshqozon osti bezi, jigar, buyrak, o'pka va ichaklarda qo'llanilishi yaxshilandi. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI va boshqalar. Glomerulyar kapillyar bosimning oshishi va hajmi SHR juxtamedullar korteksida glomerulosklerozga vositachilik qiladi. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.

22. Anjelotti ML, Antonelli G, Konte C, Romagnani P. Buyrakni ko'rish: yorug'likdan o'ta o'lchamli mikroskopgacha. Nefrol dial transplantatsiyasi. 2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE va boshqalar. Butun glomeruliyadagi podotsitlarni hisoblash va o'lchash uchun uch o'lchovli usulni tasdiqlash. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Sichqoncha buyrak ichki medullasining siydikni konsentratsiyalash mexanizmida uch o'lchovli arxitekturaning roli. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT va boshqalar. Buyrakdagi optik tozalash kaliy ta'sirida tubulalarning qayta tuzilishini aniqlaydi. Hujayra vakili 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E va boshqalar. Buyrakning birlashgan strukturaviy va funktsional tasviri proksimal tubula endositozidagi asosiy eksenel farqlarni aniqlaydi. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Sovuq bahor Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC va boshqalar. Buyrakning polikistik kasalligi. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.

29. Uilson PD. Buyrakning polikistik kasalligi. N Engl J Med. 2004;350:151–164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Lektin konjugatlari bilan aniqlanganidek, sichqon buyragining embrion rivojlanishida glikozillanish naqshidagi o'zgarishlar. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.

31. Smit LA, Bukanov NO, Husson H va boshqalar. Voyaga etmagan kist buyrak sichqonlarida polikistik buyrak kasalligining rivojlanishi: patogenezi, siliyer anomaliyalari va inson kasalliklari bilan umumiy xususiyatlar haqida tushunchalar. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.

32. Liu S, Lu V, Obara T va boshqalar. Nek-oilaviy kinaz romanidagi nuqson sichqon va zebra baliqlarida buyrak kisti kasalligini keltirib chiqaradi. Rivojlanish. 2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J va boshqalar. Polikistik buyrak kasalligining sichqoncha modelida sistogenezni erta aniqlash va terapiyaga javob berish uchun magnit-rezonans T2 xaritasi va diffuziya-vaznli ko'rish. Buyrak Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B va boshqalar. Buyrakdagi nefron tomirlarining ixtisoslashuvining molekulyar determinantlari. Nat Commun. 2019 yil; 10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Polikistik buyrak kasalligida endotelial-epitelial aloqa: qon tomir endotelial o'sish omili signalizatsiyasining roli. Hujayra signali. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Ko'p genlar - bitta kasallikmi? Nefronoftiza (NPHP) va NPHP bilan bog'liq kasalliklarning genetikasi. Old pediatr. 2017;5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sobir SR, Bayliss R. Protein kinazalarining NEK oilasi tomonidan hujayra siklini tartibga solish. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT va boshqalar. NEK8 mutatsiyalari siliyer va sentrosomalarning lokalizatsiyasiga ta'sir qiladi va nefronoftizaga olib kelishi mumkin. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.

39. Uilson PD. Polikistik buyrak kasalligi epiteliyasida apiko-bazal qutblanish. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.

40. Happe H, Leonhard WN, van der Val A va boshqalar. Pkd{1}}deletsiya sichqonlarining buyraklardagi zaharli quvurli shikastlanishi sistogenezni tezlashtiradi, bu hujayralarning tartibsiz polaritesi va kanonik Wnt signalizatsiya yo'llari bilan birga keladi. Hum Mol Genet. 2009;18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garsiya-Gonsales MA va boshqalar. Kritik rivojlanish kaliti Pkd1 yo'qolganidan keyin buyrak kistasi shakllanishining kinetikasini belgilaydi. Nat Med. 2007;13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Pishgan buyraklarning chuqur kortikal glomeruliyalarining og'ir fokal glomerulyar sklerozga noyob sezuvchanligi mexanizmi. Pediatr Res. 1990;28:270–276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Plitkali 3D mikroskopik tasvirni olishning global optimal tikuvi. Bioinformatika. 2009;25: 1463–1465.