Buyrak interkalatsiyalangan hujayralar fagotsitar va ichki uropatogen ichak tayoqlarini kislotalaydi.

edmund.chen@wecistanche.com

Buyrakinterkalatsiyalangan hujayralar vakuolyar ATPaz ifodasi orqali kislota-asos gomeostazida ishtirok etadi. Bu erda biz oltita inson interkalatsiyalangan hujayra subtiplari, shu jumladan bitta hujayra transkriptomikasidan aniqlangan gibrid asosiy interkalatsiyalangan hujayralar haqida xabar beramiz. Fagosomalarning kamolotga yetishi biologik jarayon bo'lib, interkalatsiyalangan hujayralarning ikkita kichik turida uropatogen Escherichia coli ta'siridan keyin biologik yo'l tahlili darajasi oshadi. Sichqonchaning real vaqtda konfokal mikroskopiya vizualizatsiyasibuyrakEscherichia coli yoki pHrodo Green E. coli BioParticles ifodalovchi yashil lyuminestsent oqsil bilan to'ldirilgan kanalchalar interkalatsiyalangan hujayralar bakteriyalarni faol ravishda fagotsitozlaydi, so'ngra fagolizosomalarni kislotalaydi. Bundan tashqari, interkalatsiyalangan hujayralar in vivo eksperimental UTIdan keyin vakuolyar ATPaz ifodasini oshirdi. Birgalikda olingan interkalatsiyalangan hujayralar transkripsiyaga yordam beradigan javob beradibuyrakmudofaa, bakteriyalarni yutish va ichki bakteriyalarni kislotalash. Interkalatsiyalangan hujayralar makrofaglar kabi professional fagotsitlarning xususiyatlariga ega epiteliya hujayrasini ifodalaydi.

Kalit so‘zlar:buyrak kasalligi;buyrak to'qimasi; buyrak hujayralari; buyrak; buyrak

Buyrak yig'uvchi kanalcha kislota-asos regulyatsiyasi uchun terminal joy 1 hisoblanadi. Yig'uvchi tubula asosiy hujayralar va interkalatsiyalangan hujayralardan (IC) iborat. Asosiy hujayralar (ShK) tuz va suvning rezorbsiyasiga vositachilik qiladi va sitoplazmatik aquaporin 2 (AQP2) 2 bilan tavsiflanadi. IClar kislota-asos gomeostazini saqlashga yordam beradi va uchta tavsiflangan kichik tipga ega, A tipi (A-IC), B tipi (B-IC) va A-nonB 2,3. A-IC'lar apikal vakuolyar H-ATPase (V-ATPase) orqali protonlarni chiqaradi va bikarbonatni bazilyar xlorid / bikarbonat (Cl - / HCO 3) tashuvchisi, anion almashinuvi 1 (AE1 / band 3 / SLC4A1) 1,4 orqali qayta hosil qiladi. B-IC'lar HCO 3 - ni apikal Cl - / HCO 3 tashuvchisi, pendrin (SLC26A4) orqali chiqaradi va bazolateral V-ATPase 2,3 ni ifodalaydi. Kemiruvchilarning A-nonB bo'lmagan IClari apikal pendrin va V-ATPazaga ega, ammo AE1 yo'q va yig'ish kanali va birlashtiruvchi naychada (CNT) 3 aniqlangan. Ko'paygan dalillar pH ni tartibga solishning an'anaviy funktsiyasi bilan bir qatorda IC uchun tug'ma immunitet rolini qo'llab-quvvatlaydi. Birinchidan, distal bilan bog'liq bo'lmagan o'nta bemorlarning aksariyatibuyrakquvurli atsidoz, IC disfunktsiyasi bilan tavsiflangan holat, UTI tarixi borligi haqida xabar berilgan 5 . Ikkinchidan, uropatogen Escherichia coli (UPEC), erkaklarda o'tkir piyelo-nefritning 70 foizida va ayollarda 80 foizda ajratilgan organizm 6,7 IC sitoplazmasida tanlab lokalizatsiya qilinadi. Uchinchidan, biz IClar ribonukleaz 7 (RNASE7) 8-11 kabi antimikrobiyal peptidlarni (AMP) ifodalashini aniqladik. Ushbu AMPlar boshlang'ich va / yoki infektsiyaga javoban bir qator patogenlarga, shu jumladan bakteriyalarga qarshi bevosita faollikka ega 8-11 . To'rtinchidan, biz va boshqalar mustaqil ravishda g'ayritabiiy IC rivojlanishi bo'lgan sichqonlar siydik yo'llari infektsiyalari (UTI) va / yoki pielonefrit 12,13 uchun sezuvchanlikni oshirganligini xabar qildik. Beshinchidan, IClar yallig'lanishni sezadi va vositachilik qiladi 14 . Nihoyat, biz izolyatsiya qilingan sichqon IClarida tug'ma immun gen ifodasini ko'rsatdik 15,16

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK FOYDALANISHINI YAXSHATLADI

IC siydik yo'llarini infektsiyadan qanday himoya qilishini tushunish juda muhim, chunki UTI tez-tez uchrab turadi. Ayollarning 50 foizdan ortig'i hayoti davomida UTI bilan kasallanadi va UTI barcha tibbiy tashriflarning 1-6 foizini tashkil qiladi 17. Bakteriyalar yuqoriga ko'tarilgandabuyraklarnatijada pielonefrit, mumkin bo'lgan asoratlar gipertoniya, surunkalibuyrak kasalligi, va urosepsis 18,19. Amerika Qo'shma Shtatlarida har yili taxminan 250,000 pielonefrit holati kuzatiladi 17. Ko'p dori qarshiligi UTI va boshqa infektsiyalarni davolashda muhim muammo sifatida paydo bo'ladi 20 . Shuning uchun, IClar ko'tarilgan uropatogenlardan himoya qilish uchun foydalanadigan mexanizmlar rivojlanish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan terapevtik maqsadlar bo'lishi mumkin.buyrak- spesifik pielonefritni davolash. Ko'pgina IC tadqiqotlari hayvonlar modellarini o'z ichiga olganligi sababli, asosiy ilmiy tadqiqotlarni klinik yordamni yaxshilashga yo'naltirish uchun inson IClarini yaxshiroq tushunish kerak bo'ladi.

Chunkibuyrakmurakkab organ bo'lib, mRNK profillarini izohlash qiyin bo'lishi mumkin. Masalan, nefron alohida quvurli segmentlar va hujayra subtiplari bilan mintaqaviy ixtisoslashuvga ega. ThebuyrakEndotelial, epiteliy, interstitsial va biriktirilgan yallig'lanish hujayralarini o'z ichiga oladi, ularning barchasi aniq biologik funktsiyalar va genlarni ifodalash naqshlariga ega. Yagona hujayrali RNK ketma-ketligi (scRNA-seq) asosiy bosqichda yoki stress omillariga javoban turli xil hujayra turlarini aniqlash va profillash uchun tez rivojlanayotgan metodologiyani ifodalaydi 21 . Bu erda biz insonning scRNA-seq texnologiyasidan foydalanishni ko'rsatamizbuyrakIClar uchta A-IC, bitta gibrid IC-PC, bitta A-nonB IC va bitta B-ICni o'z ichiga olgan olti xil kichik to'plamdan iborat. RNK tezligini tahlil qilish UPEC ta'sirida shaxsiy kompyuterlardan A-IC pastki to'plamlariga transkripsiyaning o'zgarishini aniqladi. Ingenuity Pathway tahlili UPEC ta'sirida A-IC quyi to'plamida asosiy biologik yo'l sifatida fagosoma etukligini aniqladi. Ushbu yo'lda V-ATPazalar asosiy ishtirok etadigan komponentlardir. Biz intravital mikroskopiyadan foydalanib, in vivo UPEC ning IClar tomonidan o'zlashtirilishini va ushbu IClarda ichkilashtirilgan UPECning kislotalanishini tasdiqladik. Nihoyat, sichqonchaning UTI modeli V-ATPase (Atp6v1b1) mRNK ifodasining o'sishini ko'rsatdi. Ushbu tadqiqot epiteliya hujayralarini bakterial fagotsitlar sifatida ifodalovchi V-ATPazani o'rganish va terapevtik manipulyatsiya qilish uchun asos yaratadi.

Natijalar

Inson IClari magnit-faollashtirilgan hujayralarni saralash (MACS) orqali mast/ildiz hujayra o'sish omili retseptorlari (CD117/c-KIT) bilan qoplangan magnit boncuklar bilan boyitilishi mumkin. Odambuyrakto'qimalar, birinchi navbatda normal chegaralaridanbuyrakommaviy rezektsiyalar, 2–4- mm bo'laklarga bo'linib, so'ngra Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) da, Kooperativ Inson To'qimalari Tarmog'i [https://www.chtn.org] tomonidan muz ustidagi laboratoriyamizga olib borildi. Biz c-KIT ni inson IClarini saralash uchun hujayra sirt belgisi sifatida baholadik, chunki c-KIT sichqoncha 22da bu maqsadda muvaffaqiyatli ishlatilgan. c-KIT va inson IC belgisi V-ATPase, B1 subunit (gen ATP6V1B1) insondagi bir xil hujayralarni birgalikda belgilaganligi haqidagi xulosaga asoslangan c-KIT ifodasi inson IClarida lokalizatsiya qilinganbuyrakbo'lim (Qo'shimcha 1-rasm) 22,23 . CD45 plyus immun hujayralari va o'lik hujayralarni olib tashlashni o'z ichiga olgan magnit saralashdan keyin; c-KIT-musbat taxmin qilingan IC-larning boyitilganligi ATP6V1B1 mRNK ifodasi bilan ko'rsatildi, bu c-KIT-manfiy hujayralarga nisbatan c-Kit-musbatda 8-12- barobar ortdi. SLC4A1 va SLC26A4 ikkalasi ham IClarda o'zgaruvchan tarzda boyitilgan bo'lib, bu metodologiya yordamida A-IC va/yoki B-IC boyitish mumkinligini ko'rsatdi (2-rasm). Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan buyrak to'qimalarining foni qo'shimcha 1-jadvalda keltirilgan.

Integratsiyalashgan klaster tahlili oltita IC kichik turini aniqladi.ScRNA-seq 1861 yilda dissotsilangan holda yakunlandibuyrakyuqorida aytib o'tilganidek, IC uchun boyitilgan hujayralar. Boyitilgan IClar bittaning oddiy chegaralaridan olinganbuyrakommaviy rezektsiya. Sifat nazorati (QC) filtrlash UPEC in vitro 1 soat davomida ta'sirlangan 859 hujayra va 1 soat davomida in vitro sho'rlangan 1002 hujayra tomonidan o'tkazildi. Seurat funktsiyasi tahlili saralangan hujayra preparatida 12 ta klasterni aniqladi (1a-rasm). Har bir klasterdagi eng ko'p saqlangan to'qqizta marker qo'shimcha rasmda keltirilgan. 3–14. Umuman olganda, IC subtiplari 1861 hujayradan 1066 (57 foiz) ni tashkil etdi. Oltita klaster IC subtiplarini ifodalagan. Xususan, biz uchta A-IC, bitta B-IC, bitta A-nonB-IC va bitta gibrid PC-IC kichik turi(lar)ni topdik.BuyrakChen va uning hamkasblari tomonidan tavsiya etilgan epiteliya hujayralari nomenklaturasi, ilgari hujayra tipidagi belgilar yoki 12 klasterdan birini boshqalardan ajratib turadigan konservatsiyalangan markerlar har bir klasterga hujayra turini belgilash uchun ishlatilgan (2-qo'shimcha jadval). , 1b-rasm, c, 2-rasm) 24-28.

A-IC subtipi va gibrid PC-IC oqsili ifodasi scRNA-seq natijalari bilan bog'liq. Biz asosiy scRNA-seq topilmalarini tasdiqladik, xususan, SLC8A1 (shuningdek, Na plyus / Ca plyus almashtirgich 1 (NCX1) deb ham ataladi) gibrid PC-IC uchun marker va A (Hsp70) protein oilasi a'zosi 1A (HSPA1A) issiqlik zarbasi. erta o'sish javobi bilan birga 1 (EGR1) A-IC subtiplarini farqlay oladigan belgilar (3-rasm). Chunki biz oddiy chegaralardan foydalandikbuyraksaraton rezektsiyalari, biz SLC8A1, HSPA1A va EGR1 ekanligini tasdiqladikbuyrakifoda naqshlari odatdagidek ko'rinadiganga mos edibuyrakhttp://www.proteinatlas.org saytida mavjud bo'lgan Inson oqsili atlasidagi to'qimalar (qo'shimcha 15-rasm) 29

Ilgari sichqonlarda ko'rsatilgan kanal hujayralari pastki tipidagi marker profillarini yig'ishbuyrakhujayralar insonda katta darajada saqlanib qoladibuyrakhujayralar. Kelajakdagi sichqoncha modeli topilmalarini inson patofiziologiyasi uchun kontekstuallashtirish muhim bo'lganligi sababli, biz Chen va boshqalar tomonidan amalga oshirilgan scRNA-seq tadqiqotlarida ilgari aniqlangan sichqonchani yig'uvchi kanal hujayralari belgilarining inson IC ifodasini baholadik. 22 va Ransick va boshqalar. 30 . Natijalarning nuqta grafigi 4-rasmda keltirilgan. Sichqonchani yig'uvchi kanal hujayralari tipidagi belgilar asosan odam yig'uvchi kanal hujayralarida saqlanadi.

A-IC kichik turi A 1 soat UPEC ta'sirida nisbiy foizda ortadi. Klasterlardagi hujayralar foizlari ta'sir qilish turi o'rtasida mos edi, bundan mustasno A-IC kichik turi A/klaster 0, bu 16,2 foizdan 20,1 foizga oshgan va A-IC kichik turi C/klaster 5, 9,4 dan kamaydi. 6,6 foizga, sho'r suv va UPEC ta'sirlari bilan, P =0,03 (1-jadval).

Gibrid PC-IC hujayralari UPEC ta'sirining 1 soatiga javoban o'zlarining RNK tezligini shaxsiy kompyuterlardan uzoqda va A-IC ga o'zgartiradilar. Yaqinda transkripsiyalangan unspliced ​​pre-mRNK va etuk birlashtirilgan mRNKning nisbiy ko'pligi mRNK ko'pligining o'zgarishini hisoblash uchun ishlatilishi mumkin, mRNK tezligi 31 deb ataladi. Yagona hujayrali tadqiqotlarda ijobiy mRNK tezligi genlarning yuqori tartibga solinishini ko'rsatadi, bu erda salbiy mRNK tezligi genlar pastga regulyatsiya qilinishini anglatadi 31. RNK tezligi yo'nalishi hujayraning boshqa hujayra turiga qarab mRNK ifoda traektoriyasiga ega ekanligini ko'rsatadi 31,32. UPEC ta'siriga javoban mRNK tezligi 5-rasmda keltirilgan. Muhimi shundaki, gibrid PC-IC'lar UPECga javoban o'zlarining RNK tezligini shaxsiy kompyuterlardan uzoqda va IC'larga o'zgartiradilar. Bundan tashqari, IClar o'zlarining transkripsiya faolligini saqlab turadilar, boshqalarda transkripsiya faolligi minimal bo'ladibuyrakhujayra turlari.

Buyrakning tug'ma immun profili UPEC ta'siridan 1 soat keyin bir hujayrali ekspressiv o'zgarishlarni ko'rsatadi.UPEC va 1 soat davomida tuz ta'siridan so'ng tanlangan tug'ma immun genlarning scRNA-seq ifoda naqshlari Qo'shimcha shakllarda keltirilgan. 16 va 17. Asosiy topilmalar A-IC subtiplari A va B, gibrid PC-IC va B-IClarda AMP adrenomedullin (ADM) ning yuqori ifodasini o'z ichiga oladi. Shaxsiy kompyuterlar dastlabki bosqichda adrenomedullinni ifodalamaydi, ammo UPEC ta'siriga javoban sezilarli darajada oshdi. UPEC ta'siridan so'ng A-B bo'lmagan IClarda sitokin-induktsiyali SH2-o'z ichiga oqsil (CISH) va 1-avtointegratsiya omili (BANF1) uchun to'siq ifodasi sezilarli darajada indüklenir. Interleykin 18 (IL18), galektin 3 (LGALS3), beta defensin 1 (DEFB1) va signal o'tkazgich CD24 lipokalin 2 / neytrofil jelatinaza bilan bog'liq lipokalin (LCN2 / NGAL) faqat aniqlangan.

gibrid PC-IClarda va faqat minimal tollga o'xshash retseptorlari 4 mRNK ifodasi mavjud edi. Biz scRNA-seqda ribo-nukleaza 7 (RNASE7) ifodasini aniqlamadik. Biz RNASE7 mRNK ifodasini magnit bilan tartiblangan birlashtirilgan IC va IC bo'lmaganda baholadik.buyrakhujayralar. RNASE7 mRNK ifodasi IClarda to'rtdan birida aniqlanganbuyraklar(Qo'shimcha 18-rasm).

Fagosoma kamolotining biologik jarayoni 1 soat davomida UPEC ta'sirida bo'lgan IClar bilan bog'liq.Har bir klaster bilan bog'liq bo'lgan o'nta etakchi biologik yo'llar Ingenuity Pathway Analysis tomonidan aniqlangan p qiymati bo'yicha tartiblangan. A-IC kichik turi A/klaster 0, A-IC kichik turi B/ klaster 3 va A-IC kichik turi C/klaster 5 ning yig'ish kanali tomonidan tayinlangan uchta klaster sho'r suv bilan solishtirganda UPEC ta'siridan keyin differentsial biologik yo'l jarayonlariga ega edi (1-rasm). 6a–c). A-IC kichik turi C/klaster 5da UPEC va sho'r suv ta'siriga uchragan hujayralardagi fagosomalarning kamolotga yetishi yuqori o'rindagi funktsiya bo'lib, A-IC kichik turi A/klasterida 0 ikkinchidan birinchi o'ringa va to'rtinchidan uchinchi eng yuqori pozitsiyaga ko'tarildi. A-IC kichik turi B/ klasterida 3. Qolgan yig'ish kanali hujayralari subtiplarining hech birida (Qo'shimcha 19-rasm) UPEC ta'siridan keyin sho'r suv bilan solishtirganda farq qiladigan eng yaxshi o'nta bog'liq yo'l yo'q edi. A-IC kichik turi A/klaster 0 uchun fagosomalarning yetilish darajasiga olib kelgan gen ekspresyon profili qo'shimcha 3-jadvalda keltirilgan.

IC Atp6v1b1 mRNK ifodasi javoban ortadiin vivo eksperimental pielonefrit.Ingenuity fagosoma etuklik yo'li V-ATPazani IClarda ishtirok etganligini ta'kidladi (qo'shimcha jadval 3). V-ATPase UPEC ta'sirida faollashtirilganligini aniqlash uchun biz sichqonchaning UTI modelidan foydalandik. Transuretral UPEC va tuzli inokulyatsiyadan bir soat o'tgach, IClarda tdTomato (tdT, qizil lyuminestsent oqsil varianti) ifodalangan "IC reporter" sichqonlari evtanizatsiya qilindi va IClar dissotsiatsiyalanganidan boyitilgan.buyrak hujayralari. Boyitilgan IC'lar sho'r suv nazorati bilan solishtirganda UPEC inokulyatsiyasi bo'lgan sichqonlarda yuqori Atp6v1b1 mRNK ifodasiga ega edi (6d-rasm).

IClar UPEC ni in vivo fagotsitlaydi.Biz singlni to'ldirish uchun metodologiyani ishlab chiqdikbuyrakbuzilmagan jonli sichqonchada UPEC bilan tubulabuyrak.Yashil lyuminestsent oqsil (GFP) ifodalovchi UPEC agregatlari "IC reporter" sichqonlarining bitta buyrak tubula lümeniga mikroperfüzyon qilingan, kanalchalar bo'ylab oqayotgani, luminal sirtga tanlab yopishganligi va intravital mikroskopiya paytida IClar (7-rasm) tomonidan ichkilashtirilganligi tasvirlangan.

IC'lar in vivo va fagolizosomalarni o'z ichiga olgan UPECni kislotalaydiin vitro.Shuningdek, biz tubulalarni pHrodo Green E. coli BioParticles bilan perfuziya qildik, ular kislotalanganda faqat floresanlanadi. Ushbu biozarrachalarning o'zlashtirilishi va floresansi faqat IClarda intravital mikroskopiya paytida ko'rish mumkin (8-rasm). Imaris segmentatsiyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, pHrodo Green E. coli BioParticles bilan perfuziyalangan 2 tubula ichidagi tdT plus IClarda yashil floresans vaqt o'tishi bilan nazorat tdT plyus tubula bilan solishtirganda sezilarli darajada oshdi (9a, b-rasm). Floresansiya uyali asosda baholanganda, pHrodo Green E. coli BioParticles bilan quvurli perfuziyadan so'ng vaqt o'tishi bilan 12/16 (75 foiz) tdT plyus hujayralar yashil floresansning o'sishini ko'rsatdi (9b-rasm). Har bir hujayradan olingan chiziqli regressiya natijalari qo'shimcha 4-jadvalda keltirilgan. Fagotsitoz va PHrodo Green E. coli BioParticles ning IC tomonidan kislotalanishining jonli in vivo intravital ko'rish natijalari in vitro oqim sitometriyasi tahlili yordamida tasdiqlangan. Murinbuyrak hujayrasiIC lar (CD45 - tdT plyus) endogen tarzda tdT ni ifodalovchi "IC reporter" sichqonlaridan olingan suspenziya pHrodo Green E. coli BioParticles bilan hujayralarga nisbatan faqat media bilan ta'sirlangan. CD45 plyus hujayra suspenziyasidagi rezident immun hujayralari ijobiy nazorat sifatida va CD45 - tdT - (ICs bo'lmagan) hujayralar salbiy nazorat sifatida o'rnatildi. Faqat ommaviy axborot vositalari bilan solishtirish

biozarrachalar ta'siri, biozarralarni olish va kislotalanishni ko'rsatadigan yashil floresans CD45 plyus hujayralarining {0}},7 dan 62,8 foizigacha oshdi. Ushbu topilma neytrofillar kabi professional fagotsitlar tomonidan kutilgan bakterial o'zlashtirilishini ko'rsatadi. Qizig'i shundaki, IC larning 22,2 foizi yashil biozarralarni o'zlashtirgan bo'lsa, 5,6 foizga nisbatan (Qo'shimcha 2-rasm0), media nazorati IClarning 0,7 foizida va IC bo'lmaganlarning 0 foizida o'zlashtirilgan.

Munozara

ICni o'rganish qiyin, ayniqsa odamlarda, chunki ular faqat 7 foizni tashkil qiladibuyrakhujayralar, bir qator kichik tiplardan iborat bo'lib, madaniyatda o'z fenotipini saqlamaydi 33 . Chen va boshqalar. 22 sichqonchada bir hujayrali tahlilni xabar qildibuyrakhujayralar va Lake va boshqalar. insonda bir yadroli RNK ketma-ketligi haqida xabar berdibuyrakhujayralar 34,35. Ushbu tadqiqotlar A-IC ning ikkita kichik turini aniqladi. Bu erda biz yashovchan boyitilgan inson IClarida bir hujayrali ketma-ketlikni amalga oshirish uchun metodologiyani ishlab chiqdik. Biz barchasini ketma-ketlashtirish o'rniga hayotiy IC uchun boyitilganbuyrakhujayralar ushbu hujayra turiga diqqatni kuchaytirishga imkon beradi. Bizning asosiy topilmalarimiz (a) UPEC ta'siriga javoban gibrid kompyuterlar-IC'lar RNK tezligi yo'nalishini shaxsiy kompyuterlardan uzoqroqqa va A-IC'larga o'zgartirishi mumkinligini aniqlash, (b) A-IC ning kamida uchta kichik turi mavjud va ularning nisbiy chastotalar UPEC ta'siriga javoban o'zgarishi mumkin, (c) fagosomalarning etukligi bir nechta A-IC quyi turlarida etakchi biologik yo'ldir va UPEC ta'sirida nisbiy ahamiyatini oshirishi mumkin va (d) IClar jonli tasvirni ko'rish paytida UPECni in vivo fagotsitozlaydi va kislotalaydi. sichqonlar.

IC'lar 36,37 polaritesini o'zgartirib, atsidozga javoban farqlanadi. IC'lar AQP{2}} 38-xujayralarni ifodalovchi hujayralardan paydo bo'lishi haqida xabar berilgan. 2017-yilda Chen va uning hamkasblari Slc4a1 yoki Slc26a4 bilan birgalikda Aqp2 ni bir hujayrali profillash yo‘li bilan ifodalovchi ikki musbat hujayralarni aniqladilar. Ushbu topilmalar keyingi yil Park va uning hamkasblari tomonidan tasdiqlangan 22,35. 2019-yilda biz oqsil va mRNK immunobelinglash orqali gibrid PC-IClar mavjudligini ko'rsatdik 15 . Xususan, V-ATPase B1 lyuminestsent immunobeling bilan aniqlangan sichqon IClarining 9 foizi, shuningdek, floresan in situ gibridizatsiyasi 15 tomonidan aniqlangan Aqp2 mRNKni ham ifoda etdi. Ushbu tadqiqot inson populyatsiyasini aniqladibuyrak- AQP2, ATP6V1G3 va SLC4A1 ni ifodalovchi gibrid PC-IC-larga mos keladigan kanal hujayralarini yig'ish. tSNE va UMAP uchastkalarida ushbu gibrid hujayralar shaxsiy kompyuterlarga eng yaqin to'plangan, ammo IC marker ifodasi asosida an'anaviy shaxsiy kompyuterlardan ajralib turardi. SLC8A1 ifodasi ushbu hujayra turiga xos edi. Qizig'i shundaki, SLC8A1 epiteliyadan mezenximaga o'tishda yuqori darajada ishtirok etadi. Xususan, SLC8A1 ning yo'qligi E-kaderin 39 ning -katenin vositachiligida destabilizatsiyasi orqali epitelial hujayra fenotiplarini o'zgartiradi. Bu erda biz IClar uropatogen ta'siriga javoban farqlanishini ko'rsatamiz. Gibrid PC-IC xujayralari UPEC ga javoban o'zlarining RNK tezligini, mRNK ifodasining vaqt hosilasini, shaxsiy kompyuterlardan uzoqda va A-ICs tomon o'zgartiradilar. Sichqonlarda Ransick va boshqalar. 30 Slc8a1 ifodasini birinchi navbatda distal konvolyutsiyalangan tubulada va birlashtiruvchi tubuladagi shaxsiy kompyuterlarga o'xshash hujayralarda aniqladi. Bizning konfokal mikrokopiyamizdagi tasvirlarni baholashbuyrakSLC8A1 ifodasi, biz SLC8A1 ni AQP2-musbat kanalchalarida (masalan, yig'uvchi kanallar yoki bog'lovchi tubulalarda) ifodalovchi ajratilgan hujayralarni topdik. Shuningdek, biz AQP{5}}manfiy tubulalarni aniqladik, ularda ko'pchilik hujayralar SLC8A1 ni ifodalaydi, bu sichqonlarda yuqorida aytib o'tilgan distal burmalangan Slc8a1 ifodasiga mos keladi. Ba'zi A-IC subtiplari UPEC ta'siridan keyin differentsial etakchi biologik yo'llarga ega va A-IC kichik turi UPECga javoban nisbiy chastotada ortdi. Ushbu topilmalar A-IC kichik turi A tug'ma immunitet variantini ko'rsatishi mumkinligini ko'rsatadi. SLC8A1 ning IC farqlashdagi roli kelajakdagi tadqiqotlarda tekshirishni kafolatlaydi.

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK EKSIZLIGINI YAXSHILADI

Biz 1861 odamda scRNA-seqni o'tkazdikbuyrakhujayralar, ulardan 1066 tasi IC. Sichqoncha eksperimental modellarini inson patofiziologiyasiga moslashtirish uchun odam va sichqon IClarini solishtirish muhim bo'ladi. Chen va uning hamkasblari c-KIT bilan murin IC'lari uchun boyitilgan va scRNA-seq 22 ni amalga oshirgan. Ular 74 ta hujayrani shaxsiy kompyuterlar, 87 tasini A-IC va 23 ta hujayrani B-IC 22 deb tasnifladilar. Ransick va boshqalar. 30 ta 688 ICda scRNA-seq amalga oshirildi. Ular IC uchun boyitmadi, balki ularni bo'lishdibuyrakzonal farqlarni baholash uchun korteks, ichki medulla va tashqi medulla ichiga 30 . Biz sichqonchani yig'uvchi kanal hujayralari tipidagi marker ifodasi asosan odam yig'uvchi kanal hujayralarida saqlanib qolganligini ko'rsatdik. Sichqonlarning odamlar bilan taqqoslanadigan A-IC subtiplari bormi yoki yo'qmi, ko'proq miqdordagi sichqon IClarini maqsadli bir hujayrali baholashni talab qiladi.

Biz immun va yallig'lanish vositachisi galektin 3 (LGALS3) va ADM kabi tug'ma immun oqsillarining scRNA-seq IC ifodasini aniqladik, biz ilgari kemiruvchilar IC 15,40-42 da xabar bergan edik. Shu bilan birga, Lipokalin 2 (LCN2 / NGAL), RNASE7 va to'lovga o'xshash retseptorlari 4 (TLR4) kabi ilgari IClarda qayd etilgan ba'zi asosiy tug'ma immunitet oqsillari minimal ifodalangan yoki bir hujayrali darajadagi inson IClarida ko'rinmagan. Bizning tahlilimiz 6,9. IClarda LCN2 / NGAL va TLR4 ifodalarining kamligi Ransick va boshqalar bilan birgalikda tadqiqot guruhimiz tomonidan sichqon IClarida xabar qilingan narsalarga mos keladi. 30buyrakcellexplorer/] 15 . Chen va boshqalar. 22 IClarda ba'zi TLR4 va NGAL mRNK ifodasi haqida xabar berdi, lekin shaxsiy kompyuterlarga qaraganda bir necha baravar kamroq. Biz RNASE7 ifodasi uchun birlashtirilgan inson IClarini baholadik va uni IClarda 4 tadan 1 tadan aniqladik.buyraklar(Qo'shimcha 18-rasm), uning ifodasi mintaqaga, vaqt nuqtasiga va fiziologik sharoitlarga qarab intervalgacha bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. UPEC ga javoban A bo'lmagan IClarda induktsiya qilingan CISH ifodasi o'pka va taloqda Mycobacterium tuberculosisga tug'ma immun javobini tartibga solish uchun ko'rsatildi 43 . IClar bakteriyalarni bir necha daqiqa davomida fagotsitozlashdi va scRNA-seq uchun bizning hujayralarimiz nisbatan qisqa 1 soat vaqt uchun UPEC ta'siriga duchor bo'ldi. AMP ifodasi yoki hujayra o'limini tartibga solish kabi boshqa IC yo'llari UPEC ta'siridan keyin keyingi vaqtlarda ko'proq namoyon bo'ladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun kelajakdagi tadqiqotlar zarur.

Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 mkm plazma membranasi konverti tomonidan 44 . "Professional fagotsitlar", miyeloiddan kelib chiqadigan immunitet hujayralari, shu jumladan makrofaglar, neytrofillar va osteoklastlar bosqinchi mikroblarni mikrobiota va sog'lom hujayralardan ajratadi, maqsadni fagosoma ichiga oladi, reaktiv kislorod turlarini (ROS) hosil qiladi, AMPlarni chiqaradi va antigenlarni taqdim etadi. boshqa hujayralar 45-49. Muhim ahamiyatga ega, ko'pchilik mikroblarni o'ldirish uchun etarli bo'lgan kislotali mikro muhitni yaratadigan fagolizosomalarning V-ATPase tomonidan mustahkam kislotalanishi professional fagotsitlarning o'ziga xos xususiyati hisoblanadi 48,50 . Misol uchun, V-ATPazni bafilomisin A1 bilan inhibe qilish makrofagning bakteritsid faolligini 51 bostiradi. Ba'zi epiteliya hujayralari mikroblarni fagotsitozlaydi, ammo bakterial o'ldirishda professional fagotsitlarga qaraganda kamroq samaralidir va professional bo'lmagan fagotsitlar 52 sifatida tavsiflangan. IC'lar fagotsitoz va antigen-taqdim etish qobiliyatiga ega bo'lgan epiteliya nasl-nasabini ifodalaydi (6-9-rasmlar), shuningdek, ROSni yaratish uchun mustahkam AMP ifodasi va saxiy mitoxondriyalar; Shunday qilib, IC'lar yuqorida aytib o'tilgan professional bo'lmagan fagotsitlarga qaraganda makrofaglarga nisbatan ko'proq bakterial o'ldirish potentsialiga ega ko'rinadi 8,53-55. A-ICs ilgari 56 sitoplazmatik pufakchalarga dekstranning apikal endositozining yuqori sur'atlariga ega ekanligi isbotlangan. Biz taxmin qilamizki, UPEC ning IC fagotsitozi makrofaglar bilan umumiy xususiyatlarning kengayishi, jumladan V-ATPase ifodasi, redoks potentsiali, AMP sekretsiyasi va endositoz qobiliyatlari 8,16,49,57,58. IC'lar UPEC dan boshqa uyali qoldiqlarni va bakteriyalarni professional fagotsitlarga o'xshash tarzda fagotsitlashi mumkinmi yoki yo'qligini aniqlash kerak.

Yagona tasvirni konfokal tasvirlashbuyrakBakteriyalar bilan in vivo jonli ravishda perfuziya qilingan tubula hujayra madaniyati va ajratilgan kanalchalarning perfuziyasi kabi oldingi in vitro usullarida kengayadi. Bu erda biz fagotsitozning IC funktsiyasi yoki yo'qligini tirik sichqonlarda to'g'ridan-to'g'ri tekshirish uchun metodologiyani ishlab chiqdik. Intravital mikroskopiya ishlaydigan sichqon ichidagi dinamik hujayra jarayonlarini murakkab o'rganish imkonini beradibuyraklar59 . Intravital mikroskopiyadan foydalanish bo'yicha oldingi strategiyalar proksimal tubula endositozini o'rganish uchun sichqonlarga intravital bo'yoqlar yoki markerlarni tizimli ravishda kiritishni o'z ichiga olgan.buyrakqon oqimining dinamikasi va qon tomir yoki glomerulyar o'tkazuvchanlik 60 . Intravital mikroskopiya murakkab jarrohlik usullari bilan birlashtirilganda, infektsion jarayonlarning dastlabki vaqtlarini baholash qiyin bo'lgan nuqtalarni o'rganish mumkin 61 . Ilgari, bakteriyalar qon oqimini, neytrofillarni jalb qilishni va siydik obstruktsiyasini baholash uchun kalamushning proksimal tubulalarida mikroperfuziya qilingan 62,63. UTIlarning aksariyati ko'tarilgan patogenlar tufayli yuzaga keladi va dastlab yig'ish kanali 64,65 bilan uchrashadi. Shunday qilib, biz yig'ish kanali mezbon-patogen o'zaro ta'sirini baholash uchun muhim quvurli hudud ekanligini taklif qilamiz. Bizning intravital model tizimimiz klassikani samarali tarzda qayta yaratadi

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK KASALLIKLARINI SOZLADI

Yagona yig'uvchi tubula perfuziyasini o'rganish, lekin buzilmagan jonli sichqonchadabuyrak,qon, limfa va neyron ta'minoti va immunitet hujayralari bilan o'zaro ta'sir qilish qobiliyati saqlanib qoladi. Piyelonefritning patofiziologiyasi erkak va ayol farqiga ega. Masalan, odamlarda urg'ochilarda o'tkir pielonefrit rivojlanish ehtimoli besh baravar ko'p, ammo erkak sichqonlarda androgen vositachiligida pielonefritning kuchayishi 66,67. Ransick va uning hamkasblari proksimal tubula hujayralarida, xususan, organik anion tashuvchilarda 30 farqli erkak va ayol farqlarini ko'rsatdilar. Erkak IClari bizning bitta hujayrali ketma-ketlikda va intravital tadqiqotlarimizda baholandi. IC larning bakterial himoyadagi roli tufaylibuyrakva elektrolitlar muvozanati, fagotsitoz va bitta hujayrali gen ifodasi kabi IC funktsiyalaridagi jinsga bog'liq xilma-xillik kelajakdagi tadqiqotlar uchun asosiy yo'nalishlar bo'ladi. Ushbu tadqiqot cheklovlarga ega. UPEC ning bizning scRNA-seqimizdagi inson IC-lariga ta'siri in vitro bittaga bo'lganbuyrakva in vivo UPEC ta'siriga nisbatan farqlarga ega bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, bizning topilmalarimiz insonning anatomik mintaqasini aks ettirdibuyrakRansick va boshqalar tomonidan ko'rsatilgandek, turli joylardan namuna olingan va kelajakdagi tadqiqotlar mintaqaviy xilma-xillikka ega bo'lishi mumkin. 30 . IClar bizning scRNA-seqimizdagi hujayralarning 57 foizini tashkil etdi, ular IC tarkibidagi ~7 foizdan boyitilgan.buyraklarasosiy 33 da. Bizning namunamiz boshqa epitelial va endotelial hujayra turlarini o'z ichiga olgan, ammo IClarni boyitishdan oldin ajratilgan CD45 va immun hujayralari uchun salbiy bo'lgan (1-rasm, qo'shimcha 1-rasm). scRNA-seq yordamida maqsadli IClarni alohida aniqlash va baholash mumkin edi. Gematopoetik ildiz hujayralari c-KIT ni ifodalaydi, lekin ular, ehtimol, ifodalamaydibuyrakyashovchi miyeloid hujayra populyatsiyalari 68. Biz sog'lom odamda mavjud bo'lgan boshqa c-KIT-ekspressiv hujayralarni aniqlamadikbuyraklar, stromal hujayralar / telotsitlar kabi 69 . Henle va proksimal tubulaning ba'zi bir izolyatsiya qilingan halqasi c-KIT pozitivligi ilgari xabar qilingan.buyrakimmunohistokimyo bizning scRNA-seq natijalariga mos keladi 70