RPTEC/TERT1 inson buyrak hujayralari modelidan foydalangan holda P‑gp‑mediatsiyalangan dori-darmon oʻzaro taʼsirini in vitro baholash

edmund.chen@wecistanche.com

Kirish P-glikoprotein (P-gp) inhibitiv potentsialini in vitro baholash dori-darmonlarni ishlab chiqish jarayonida muhim masaladir, chunki u klinik ahamiyatga ega dori-darmon o'zaro ta'sirini (DDI) prognoz qilish imkonini beradi [1-3]. P-gp ATP-bog'lovchi kasseta (ABC) tashuvchisi superoilasiga tegishli bo'lib, MDR1 ko'p dori-darmonlarga chidamlilik geni (ABCB1 nomi bilan ham tanilgan) tomonidan kodlangan. Ushbu membrana tashuvchisi o'simta hujayralarida haddan tashqari ifodalanganligi va ko'plab saratonga qarshi dorilarga qarshilik ko'rsatishi ma'lum. Barcha fiziologik to'siqlar ichida joylashgan, jumladan, ichak, jigar vabuyraklar, P-gp ksenobiotiklardan himoya qiladi, bu substratlarning ovqat hazm qilish traktidan so'rilishini cheklaydi va ularning safro va siydikga chiqishini osonlashtiradi. Shunday qilib, P-gp turli xil terapevtik sinflarning farmakokinetikasida muhim rol o'ynaydi [5-7]. Antikanser agentlari, antifungallar va yurak-qon tomir preparatlari kabi ko'plab dorilar P-gp substratlari va / yoki ingibitorlari ekanligi ma'lum va ularning ko'pchiligi klinik jihatdan muhim o'zaro ta'sirlarda ishtirok etadi [8-10]. Shu sababli, AQSh oziq-ovqat va farmatsevtika idorasi (FDA) P-gp inhibitör potentsialini dori rivojlanishining dastlabki bosqichlarida baholashni buyuradi. Shu maqsadda olib borilgan in vitro tahlillari odatda P-gp-ni ifodalovchi hujayra liniyalari yordamida giyohvand moddalarni tashish bo'yicha tadqiqotlarga asoslanadi. Aniqroq aytganda, FDA ko'rsatmalari P-gp inhibisyoni natijasida klinik DDI xavfini baholash uchun in vitro yarim maksimal inhibitiv kontsentratsiya (IC50) qiymatlarini aniqlashni tavsiya qiladi. Shu maqsadda ko'plab eksperimental tahlillar o'tkazildi va ularning aksariyati Caco-2 yoki MDCK-MDR1 modellari [11-13] yordamida ichakdan so'rilishi bilan bog'liq dori vositalarining o'zaro ta'siriga qaratilgan.

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK KASALLIKLARINI SOZLADI

beribuyrakEliminatsiya, shuningdek, dori vositalarining turli sinflari uchun umumiy yo'q qilish yo'lidir, ABC tashuvchilari orqali faol quvurli sekretsiya ham ushbu o'zaro ta'sirlarda asosiy rol o'ynashi mumkin [14]. Biroq, in vitro ma'lumotlarbuyrakP-gp vositachiligidagi DDIlar cheklangan. Bu qisman prognoz qilish uchun in vitro modellarining ishlab chiqilmaganligi va tavsiflanmaganligi bilan bog'liqbuyrakgiyohvand moddalarni tashish. Turli xil inson hujayra chiziqlari orasida RPTEC/TERT1 modeli baholash uchun va'da ko'rsatadi.buyrakdorilarning o'zaro ta'siri. Ushbu hujayra liniyasi sog'lom inson donoridan olingan va abadiylashtirilgan proksimal tubula hujayralaridan yaratilgan. Bundan tashqari, ushbu model yordamida P-gp ning ifodasi va funksionalligi ko'rsatildi, bu esa uning taxmin qilish qobiliyatini tasdiqladi.buyrakdori efukslari [15, 16]. Shu nuqtai nazardan, ushbu tadqiqot RPTEC / TERT1 modelidan foydalangan holda P-gp inhibitör potentsialini o'rganish uchun mo'ljallangan. Birinchidan, har bir sinovdan o'tgan dori uchun inhibisyon profilini olish uchun rodamin 123 (R123) to'planishi skrining tahlili o'tkazildi. Ushbu skrining asosida ikkita P-gp substrat dorisining hujayra ichidagi to'planishiga ularning konsentratsiyasiga bog'liq ta'sirini baholash uchun to'rtta dori tanlangan: apiksaban va rivaroksaban.

Kalit so‘zlar:buyrak hujayrasi, buyrak modeli, buyrak preparati, buyrakni yo'q qilish, buyraklar.

Materiallar va uslublar

ReaktivlarApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroksaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin va dabigatran eteksilat (Illsachimdan sotib olindi. Frantsiya). Verapamil, ketokonazol, simvastatin, amiodaron, rodamin 123, Hankning muvozanatli tuz eritmasi (HBSS) va HEPES eritmasi Sigma-Aldrichdan (Sent-Kventin-Fallavier, Frantsiya) sotib olingan.

Hujayra madaniyati  RPTEC/TERT1 xujayralari American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Fransiya) dan olingan va Dulbecco's Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) dan iborat gormonal aniqlangan, sarumsiz muhitda o'stirilgan. 1 foizli antibiotik/antimikotik aralashma (penitsillin-streptomitsin, amfoterisin B) 37 daraja va 5 foiz CO 2. Barcha tajribalar uchun hujayralar 96-quduq plastinkalariga zichligi 50,000 ekilgan. har bir quduqdagi hujayralar va 14 kunlik madaniyatdan keyin o'sish uchun ishlatilgan. Muhit har 2 kunda yangilanib turdi va hujayralar 27-oʻtishdan 34-oʻtishgacha foydalanildi. Kako{14}} hujayralari ham ATCCdan sotib olindi. Hujayralar 10% FBS, 1% muhim bo'lmagan aminokislotalar va 1% antibiotik/antimikotik aralashma (penitsillin-streptomitsin, amfoteritsin B) bilan to'ldirilgan Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missuri, AQSH)dan iborat madaniy muhitda saqlangan. ) 37 daraja va 5 foiz CO2. Kako{21}} xujayralari 96-quduq plastinkalariga har bir quduqqa 5 × 10 3 hujayra zichligida ekilgan va 14 kunlik kulturadan keyin o‘stirish uchun foydalanilgan. Inson proksimal quvurli epiteliya hujayralari (HPTECs) BIOPREDIC (Rennes, Frantsiya) dan olingan va gidrokortizon, EGF, insulin, transferrin va natriy selenit bilan to'ldirilgan DMEM/F12 da o'stirilgan. Hujayralar har bir quduqqa 6600 hujayra zichligida 96-yaxshi kollagen bilan qoplangan kultura plitalariga ekilgan va 11 kunlik kulturadan keyin oʻsishda foydalanilgan.

Rhodamin 123 to'planish skrining tahlili  P-gp inhibitiv potentsiali RPTEC/TERT1 hujayralarida rodamin 123 ning hujayra ichidagi to'planishini turli toifadagi dorilar mavjudligi va yo'qligida o'lchash yo'li bilan aniqlandi. 14 ta sinovdan o'tgan dorilar orasida siklosporin A (10 µM), ketokonazol (50 µM), verapamil (100 µM) va amiodaron (50 µM) P-gp inhibitörleri sifatida ishlatilgan. P-gp substratlari (10 µM) sifatida apiksaban, rivaroksaban va dabigatran eteksilat - uchta to'g'ridan-to'g'ri og'iz antikoagulyantlari (DOACs) ishlatilgan. Varfarin (50 mkM) ingibitor bo'lmagan sifatida ishlatilgan va nilotinib, krizotinib, erlotinib va ​​idelalisib kabi saratonga qarshi dorilar 10 mkM konsentratsiyada ularning inhibisyon profillarini bilmasdan ishlatilgan. Kako{14}} xujayralari bilan bir nechta shartlar qayta ishlab chiqarilgan, ular FDA tomonidan dorilarni tashish bo'yicha tadqiqotlar uchun tasdiqlangan. Shu tarzda, verapamil (100 mkM), siklosporin A (10 mkM), nilotinib (10 mkM) va DOAC (10 mkM) mavjudligi va yo‘qligida Kako{16}} hujayralarida rodamin 123 ning hujayra ichidagi tutilishi aniqlandi. ). Qisqacha aytganda, 96-quduq plastinkalarida 14 kunlik madaniyatdan so‘ng hujayralar HBSSda 10 mM HEPES (v/v) bilan eritilgan har bir dori bilan 37 darajada 10 daqiqa davomida oldindan inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar 10 µM rodamin 123 bilan 45 daqiqa davomida 37 darajada inkübe qilindi. Nihoyat, sovuq HBSS/HEPES eritmasida uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar xona haroratida 45 daqiqa davomida 1 foiz natriy borat o'z ichiga olgan natriy dodesil sulfat (SDS) eritmasida lizing qilindi. Hujayra ichidagi rodamin 123 miqdori to'lqin uzunliklarini 485/535 nm ga o'rnatib, Infnite M nanospektrofuorometri (Life Sciences, TECAN, Shveytsariya) yordamida aniqlandi. Ma'lumotlar hech qanday potentsial P-gp ingibitorlariga ta'sir qilmagan nazorat hujayralarida rodamin 123 to'planishining foizlari sifatida ifodalangan va o'zboshimchalik bilan 100 foiz to'planish darajasiga o'rnatilgan.

DOAC hujayra ichidagi to'planish tahlili va IC50 ni aniqlash Oldingi rodamin 123 skrining tahlilidan RPTEC/TERT1 hujayralarida apiksaban va rivaroksabanning (1{16}} mM) hujayra ichidagi toʻplanishiga ularning konsentratsiyaga bogʻliq taʼsirini oʻrganish uchun toʻrtta dori tanlandi. P-gp inhibitörleri sifatida ketokonazol, krizotinib va ​​nilotinib, ingibitor bo'lmaganlar sifatida warfarin tanlangan. Siklosporin A (1{19}} µM) tashuvchilarning keng spektrli inhibitori sifatida ishlatilgan. IC50 qiymatlarini aniqlash uchun DOAC va nilotinib o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarni o'rganish ikki uyali modelni solishtirish uchun Caco-2 hujayralarida takrorlandi. Barcha birikmalar yakka o'zi yoki 1 foiz HEPES (v/v) va 1 foiz DMSO (v/v) bilan to'ldirilgan HBSS transport buferidagi bog'langan inhibitor bilan suyultirildi. Inkubatsiyadan oldin barcha eritmalar 37 darajaga oldindan qizdirildi va pH 7,4 ga o'rnatildi. Krizotinib va ​​nilotinib saratonga qarshi dorilar uchun ularning eruvchanligi va sitotoksik potentsiali yomonligi sababli konsentratsiyalari 0,1 dan 25 mkM gacha bo'lgan. Ketokonazol va warfarin uchun konsentratsiyalar 0,1 dan 100 mkM gacha bo'lgan. Qisqacha aytganda, 14 kunlik madaniyatdan so'ng, HBSSda 1% HEPES (v/v) bilan eritilgan barcha dorilar 10 daqiqa davomida 37 darajada oldindan inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar 10 mkM apiksaban yoki rivaroksaban bilan 60 daqiqa davomida 37 darajada inkubatsiya qilindi. Nihoyat, sovuq HBSS/HEPES eritmasida uch marta yuvilgandan so'ng, hujayralar Triton X-100 ning 0,2 foizli eritmasida xona haroratida 45 daqiqa davomida lizing qilindi. Keyin hujayra ichidagi DOAC miqdori suyuq xromatografiya-mass-spektrometriya (LC-MS) bilan aniqlandi. Ma'lumotlar DOAC to'planishining foiz ortishi sifatida ifodalangan va DOAC hujayra ichidagi lular to'planishi nazorat hujayralarida o'zboshimchalik bilan 100 foizga o'rnatildi. DOAC to'planishini oshirish uchun yarim maksimal samarali kontsentratsiya (EC50) qiymatlariga mos keladigan P-gp faolligini inhibe qilish uchun IC50 qiymatlari Rdagi 'nls()'funktsiyasi bilan ortib borayotgan to'planishning tortilmagan chiziqli bo'lmagan eng kichik kvadratchalar regressiya modellashidan aniqlandi. dasturiy ta'minot, quyidagi tenglamaga muvofiq (1-tekis):

Suyuq xromatografiya - Mass-spektrometriya tahliliApiksaban (m/z 460.19793) va rivaroksaban (m/z 436.07285) miqdorini aniqlash Ultimate U300{{18} yordamida amalga oshirildi. }} suyuq xromatografiya tizimi (Dionex, Sunnyvale, CA, AQSH) Q-Exactive Plus massa spektrometri (ThermoFisher, Bremen, Germaniya) bilan birlashtirilgan. LC ajratish Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) analitik ustun (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, AQSH) va 0,6 ml/min oqim tezligi yordamida amalga oshirildi. . A mobil fazasi 0,1 foiz chumoli kislotasi (FA) ga ega suv va B harakatchan fazasi 0,1 foiz FA bo'lgan atsetonitril edi. Rivaroksaban uchun gradient: 0–0,3 min, 10 foiz B; 0,3-1 min, chiziqli 10 foizdan 70 foizgacha B; 1-1,5 min, 70 foiz B; 1,51 daqiqa, 3 daqiqagacha boshlang'ich sharoitga qayting. Apiksaban uchun gradient: 0-0,3 min, 10 foiz B; 0,3-0,7 min, chiziqli 10 dan 90 foizgacha B; 0,7-1,5, 90 foiz B; 1,51 daqiqa, 3 daqiqagacha boshlang'ich sharoitga qayting. Aniqlash elektrosprey-musbat parallel reaksiya monitoringi (PRM) rejimida 35,000 ruxsatda (m/z 200 da) amalga oshirildi. Ichki standartlar (IS) apiksaban uchun [13C,2H7]-apiksaban (m/z 468.2452) va rivaroksaban uchun [13C6]-rivaroksaban (m/z 442.09297) edi. Har bir dori va uning tegishli IS uchun maqsadli ion (miqdorini aniqlash uchun) va tasdiqlovchi ion kuzatildi. Rivaroksaban va uning IS uchun maqsadli ion m/z 144,95125 va moslashtiruvchi ionlar m/z 231,11280 va m/z 237,13298 edi. Apiksaban va uning IS uchun maqsadli ion m/z 199,08656 va moslashtiruvchi ionlar m/z 282,12387 va m/z 241,06062 edi.

Natijalar

Rhodamin 123 to'planish skrining tahliliRodamin 123 to'planishi skrining tahlili RPTEC/TERT1 hujayralarida turli inhibisyon profiliga ega 14 ta dori bilan amalga oshirildi (1-rasm). Kutilganidek, siklosporin A, keng spektrli inhibitori ishtirokida rodamin 123 ning hujayra ichidagi to'planishi eng yuqori ko'rsatkichlardan biri bo'lib, nazorat hujayralariga nisbatan to'planishi 75 foizga oshgan. P-gp ning o'ziga xos inhibitori bo'lgan verapamilning mavjudligi rodamin 123 to'planishining 57 foizga oshishiga olib keldi, bu P-gp ning ishtirokini ko'rsatdi. Xuddi shu tarzda, kuchli P-gp inhibitori sifatida tavsiflangan ketokonazol, verapamilga nisbatan rodamin 123 ning hujayra ichidagi to'planishining ko'proq (66 foiz) oshishiga olib keldi va bu uning inhibisyon profilini tasdiqladi. Aksincha, o'rtacha P-gp inhibitori sifatida tavsiflangan amiodaronning qo'shilishi to'planishning 59 foizga oshishiga olib keldi, bu verapamil sabab bo'lganiga o'xshaydi. Antikanser agentlari nilotinib, axitinib, krizotinib, erlotinib va ​​idelalisib uchun turli inhibisyon profillari kuzatildi. Nilotinib qo'shilishi rodamin 123 (71 foiz) to'planishining kuchli o'sishiga olib keldi, bu sezilarli inhibitiv potentsialdan dalolat beradi, keyin esa aksitinib 57 foizga saqlanishning oshishiga olib keldi. Boshqa tomondan, krizotinib va ​​erlotinib o'rtacha va past darajadagi inhibitiv potentsialni ko'rsatdi, rodamin 123 to'planishi mos ravishda 23 va 16 foizga oshadi. Idelalisib rodamin 123 ning to'planishiga ta'sir qilmadi; Xuddi shu narsa warfaringa ham tegishli edi

ingibitor bo'lmagan sifatida tanlangan. Uchta DOAC orasida apiksaban va rivaroksaban rodamin 123 ni ushlab turishning biroz oshishiga olib keldi: mos ravishda 33 foiz va 12 foiz. Qizig'i shundaki, dabigatran eteksilat, dabigatranning oldingi dorisi va P-gp ning ma'lum substrati, potentsial P-gp inhibitori sifatida ta'riflanmagan bo'lsa-da, rodamin 123 ni ushlab turishning taxminan 50 foizga oshishiga olib keldi. Nihoyat, simvastatin qo'shilishi fuoresan substratning to'planishining ozgina oshishiga olib keldi (32 foiz). Ushbu skrining asosida RPTEC/TERT1 modelida apiksaban va rivaroksabanning hujayra ichidagi to'planishiga konsentratsiyaga bog'liq ta'sirini baholash uchun to'rtta dori tanlandi. Ketokonazol P-gp inhibisyonu uchun ijobiy nazorat sharti sifatida tanlangan va varfarin salbiy nazorat holati uchun P-gp ning inhibitori bo'lmagan sifatida tanlangan. Nilotinib va ​​krizotinib mos ravishda kuchli va o'rtacha P-gp inhibitörleri sifatida tanlangan. Bir nechta shartlar Caco-2 namunaviy modeli bilan takrorlandi. Hujayralarda R123 ning hujayra ichidagi to'planishi inhibisyonni nazorat qilish shartlari uchun apiksaban va rivaroksaban (10 mkM), nilotinib (10 mkM) va siklosporin A (10 mkM) va verapamil (100 mkM) bilan kombinatsiyalangan (yoki yo'qligi) so'ng aniqlandi. (2A-rasm). Kutilganidek, verapamil va siklosporin A R123 ni ushlab turishning mos ravishda 297% va 275% ga yuqori o'sishiga olib keldi. Xuddi shu tarzda, nilotinib R123 ning hujayra ichidagi to'planishining yuqori o'sishiga olib keldi (229 foiz), bu uning inhibitiv salohiyatini tasdiqladi. R123 ni DOAC bilan birlashtirish boshqa dorilar bilan solishtirganda R123 (40-44 foiz) to'planishining ozgina oshishiga olib keldi. Bundan tashqari, siklosporin A ning yo'qligi va mavjudligida rodamin 123 ning hujayra ichidagi to'planishi.buyrakRPTEC/TERT1 hujayralari bilan olingan natijalarning ishonchliligini tekshirish uchun ushbu tadqiqotda asosiy inson hujayralari ham tekshirildi (2B-rasm). Ushbu tahlillar siklosporin A ning mavjudligi R123 tutilishini 71 foizga oshirganligini ko'rsatdi. Bu qiymat RPTEC/TERT1 hujayralari bilan bir xil sharoitlarda olingan qiymatga yaqin edi (siklosporin A bilan 75 foizga o'sish). Shuning uchun P-glikoprotein faolligi RPTEC/TERT1 modeli va asosiy inson hujayralarida o'xshash edi.

DOACs hujayra ichidagi to'planish tahlili: IC50 va I1/IC50 nisbatlarini aniqlash In vitro RPTEC/TERT1 hujayralarida 1{8}} mM doimiy konsentratsiyada va nilotinib, krizotinib, ketokonazolning ortib borayotgan kontsentratsiyasida apiksaban va rivaroksabanning P-gp vositachiligida tashilishini baholash uchun hujayra ichidagi to‘planish tadqiqotlari o‘tkazildi. , va warfarin (2, 3-rasm). IC50 qiymatlarini aniqlash uchun apiksaban va rivaroksabanning saqlanishini modellashtirish baholandi. DOAClarni nilotinib bilan birlashtirish eng past IC50 qiymatlariga olib keldi: rivaroksaban va apiksaban uchun mos ravishda 0,85 mkM va 1,37 mkM (4, 5-rasm). Krizotinib bilan kombinatsiya rivaroksaban va apiksaban uchun mos ravishda 10,1 mkM va 12,2 mkM IC50 qiymatlarini berdi. Ajablanarlisi shundaki, DOAClarni ketokonazol bilan birlashtirish eng past IC50 qiymatlarini keltirmadi (rivaroksaban va apiksaban uchun mos ravishda 16,5 mkM va 16,9 mkM). Nihoyat, kutilganidek, warfarin bilan kombinatsiyalangan edi

Inhibitor bo'lmagan sifatida tanlangan, ikkita DOACning hujayra ichidagi tutilishiga ta'sir qilmadi. Shunday qilib, hujayra modellari bilan taqqoslash uchun nilotinib kontsentratsiyasining ortishi bilan apiksaban va rivaroksabanning Kako{1}} hujayralari ichida hujayra ichidagi to'planishi tekshirildi. Qizig'i shundaki, RPTEC/TERT1 modelida kuzatilganidek, rivaroksaban (4,16 mkM) uchun IC5{16}} qiymati apiksaban (9,35 mkM) uchun olinganidan past edi. Shunisi qiziqki, Caco-2 hujayralarida kuzatilgan IC5{24}} qiymatlari bir xil inhibitor uchun RPTEC/TERT1 hujayralarida olinganidan yuqori bo‘lgan. DDI ning klinik ahamiyatini in vitro ma'lumotlaridan bashorat qilish mumkin. FDA ko'rsatmalariga ko'ra, [I1]/IC50 nisbati har bir dori kombinatsiyasi uchun hisoblab chiqilgan. Bu nisbat in vivo kontsentratsiyasini tegishli ta'sir ko'rsatishi ma'lum bo'lganlar bilan solishtirish imkonini beradi. RPTEC/TERT1 hujayralarida apiksaban uchun nisbatlar mos ravishda nilotinib, krizotinib va ​​ketokonazol bilan 3,1, 0,06 va 17,4 edi (1-jadval). Caco{21}} hujayralarida apiksaban va nilotinib o'rtasidagi o'zaro ta'sir uchun [I1]/IC50 nisbati 0,46 edi (1-jadval). Rivaroksaban uchun nisbatlar RPTEC/TERT1 hujayralarida apiksaban uchun olinganidan bir oz yuqori edi: nilotinib, krizotinib va ​​ketokonazol uchun mos ravishda 5,1, 0,08 va 17,7 (2-jadval). Xuddi shu tarzda, Caco-2 hujayralarida rivaroksaban va nilotinib o'rtasidagi o'zaro ta'sir uchun kuzatilgan [I1]/IC50 nisbati apiksaban uchun olinganidan yuqori bo'lgan 1,03 ni tashkil etdi (2-jadval).

Munozara

So'nggi o'n yilliklarda o'tkazilgan ko'plab tadqiqotlar P-gp ning dori farmakokinetikasida muhim rolini ko'rsatdi [17-19]. P-gp vositachiligida dori vositalarining o'zaro ta'siriga tartibga soluvchi qiziqish ortib borayotganligi sababli, dori vositalarining inhibitiv potentsialini o'rganish uchun in vitro tahlillari dori vositalarini ishlab chiqish va klinik amaliyotning muhim jihati hisoblanadi. Shu maqsadda ko'plab in vitro tahlillari o'tkazildi va prognoz qilingan ichak so'rilishi bo'yicha bog'liq ma'lumotlarning aksariyati Caco-2 va MDCK-MDR1 hujayra liniyalaridan olingan [20-22]. Shu bilan birga, dori vositalarining faol naychali sekretsiyasi haqida kam ma'lumotlar mavjud bo'lib, u ham giyohvand moddalarni yo'q qilishda asosiy rol o'ynaydi va ABC tashuvchilarning mavjudligiga bog'liq. Bu kuzatish aniq belgilanmaganligi bilan bog'liqbuyrakPreparatni bashorat qilish uchun hujayra chiziqlaribuyrakefux. Bu maqsad in vitro talab qiladibuyrakfiziologik to'siqni yaqindan taqlid qiluvchi model. Bir nechta ABC tashuvchilarni (ayniqsa P-gp) ifodalovchi RPTEC/TERT1 inson hujayra liniyasi oldingi tadqiqotda ko'rsatilgandek yaxshi alternativ bo'lib ko'rinadi [16]. Shu nuqtai nazardan, ushbu ish P-gp inhibitiv salohiyatini baholash uchun RPTEC / TERT1 modelini qo'llashni o'rganib chiqdi. Bizning ma'lumotlarimizga ko'ra, bu ish inson yordamida P-gp inhibisyonu tadqiqotlari ma'lumotlarini taqdim etish uchun birinchi hisoblanadibuyrakhujayralar.

P-gp inhibitör potentsialini aniqlash uchun in vitro tahlillari odatda digoksin yoki rodamin 123 [23-25] kabi maxsus mos yozuvlar P-gp substratidan foydalanishga asoslanadi. Foydalanish qulayligi tufayli flüoresan problar yuqori o'tkazuvchanlik tahlillari uchun foydalidir. Bundan tashqari, rodamin 123 keng ko'lamli tadqiqotlarda P-gp faolligini aniqlash uchun keng qo'llanilgan [26-28]. Shu tarzda, RPTEC/TERT1 hujayralarida rodamin 123 to'planishi tahlillari ushbu tadqiqotda 14 ta dori vositalarining inhibisyon profillarini aniqlash uchun o'tkazildi. Ushbu dorilar orasida kuchli P-gp inhibitörleri sifatida siklosporin A, ketokonazol va verapamil tanlangan. Ushbu inhibitorlar o'zlarining muhim P-gp inhibitör potentsiallari bilan keng tavsiflangan, bu esa digoksin va rodamin 123 transportining modulyatsiyasiga olib keladi [27, 29, 30]. Kutilganidek, bu dorilar RPTEC/TERT1 hujayralarida eng yuqori rodamin 123 tutilishiga olib keldi. Aksincha, RPTEC / TERT1 modelining ishonchliligini tasdiqlovchi salbiy nazorat sifatida ishlatilgan warfarin bilan R123 ni ushlab turishning o'sishi kuzatilmadi. Qizig'i shundaki, barcha sinovdan o'tgan dorilar orasida DOAClar, shu jumladan dabigatran eteksilat, apiksaban va rivaroksaban - R123 ni ushlab turishning aniq oshishiga olib keldi, garchi ular ilgari inhibitorlar sifatida tavsiflanmagan bo'lsa ham, faqat P-gp substratlari [31, 32]. Bu kuzatuv dorilar P-gp ning bir xil bog'lanish joylari bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin bo'lgan "raqobatbardosh" inhibisyonning mavjudligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. P-gp uchun eng yaxshi tavsiflangan joylar H joyi (Hoechst 33342 bog'lash uchun) va R joyi (rodamin 123 bog'lash uchun). Shu bilan birga, bir nechta boshqa noma'lum dori-darmonlarni bog'laydigan joylar ushbu o'zaro ta'sirlarda rol o'ynashi mumkin, bu esa DOAClarning R123 to'planishiga turli ta'sirini tushuntirishi mumkin [33, 34]. Shunday qilib, ma'lum bir dori uchun kuzatilgan P-gp inhibisyonu in vitro tadqiqotlar paytida ishlatiladigan substratga bog'liq [28, 35]. Shuning uchun, dorilarning taxminiy P-gp inhibitör potentsiallarini aniq tasvirlash uchun turli xil dori-darmonlarni bog'lash joylari bilan o'zaro ta'sir qiluvchi turli xil P-gp substratlaridan foydalanish ko'rib chiqilishi kerak. Shunisi qiziqki, rhodamin 123 skriningidan olingan bir nechta shartlar RPTEC/TERT1 hujayralarini giyohvand moddalarni tashish bo'yicha tadqiqotlardagi namunaviy model bilan solishtirish uchun Caco-2 hujayralarida ham o'tkazildi. Kutilganidek, siklosporin A, verapamil va nilotinib rodaminni ushlab turishning eng yuqori o'sishiga olib keldi. Caco-2 va RPTEC/TERT1 hujayralarida bir xil inhibisyon profillari kuzatildi. Biroq, Caco-2 modelidagi oʻzaro taʼsirlar natijasida hosil boʻlgan rodamin 123 tutilishining ortishi RPTEC/TERT1 hujayralarida kuzatilganidan koʻra koʻproq boʻlgan, bu modellar oʻrtasida P-glikoprotein ifodasida potentsial farq borligini koʻrsatadi. tadqiqotda P-gp ning dorilar tomonidan potentsial inhibisyonini baholash va tasdiqlash uchun ikkinchi usul ishlatilgan.

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK DIALIZINI YANGILAYDI

Rodamin 123 to'planishi tahliliga asoslanib, apiksaban va rivaroksabanning hujayra ichidagi to'planishiga ularning konsentratsiyasiga bog'liq ta'sirini aniqlash uchun to'rtta dori tanlandi. P-gp apiksaban va rivaroksaban efuxida asosiy rol o'ynashi ko'rsatilgan [32, 36]. Shuning uchun nilotinib, krizotinib va ​​ketokonazolning IC50 qiymatlari baholandi, DOAClar "qurbon" dorilar sifatida tanlangan. Bizning ma'lumotlarga ko'ra, ushbu tadqiqot insonda DOAClar bilan hujayra ichidagi to'planish tadqiqotlarini o'tkazish uchun birinchi hisoblanadi.buyrakhujayralar. Nilotinib va ​​krizotinib uchun olingan IC50 qiymatlari rodamin 123 to'planishi tahlilidan olingan ularning inhibisyon profillariga mos edi. R123 ni ushlab turishning kuchli o'sishiga sabab bo'lgan Nilotinib, ikkita DOAC uchun eng past IC50 qiymatini taqdim etdi, bu uning yuqori inhibisyon potentsialini tasdiqladi. Bu natija, shuningdek, MDR1-transfektsion hujayralarda [3H]-paklitakselning hujayra ichidagi to‘planishining konsentratsiyaga bog‘liq o‘sishini ko‘rsatgan oldingi tadqiqotga mos keladi, bu uning inhibitor profiliga ega ekanligini ko‘rsatadi [37]. Krizotinib uchun R123 tahlili o'rtacha inhibitiv potentsialni ko'rsatdi, R123 tutilishi nilotinibdan ko'ra kamroq oshdi. Bu kuzatuv avvalgi tadqiqot tomonidan qo‘llab-quvvatlanadi, bunda krizotinib MDR{12}}transfektsion hujayralarda hujayra ichidagi R123 va doksorubitsin to‘planishini oshirgan [38]. Bu natija, shuningdek, nilotinib uchun mos keladigan qiymatlardan yuqori bo'lgan DOAClar bilan aniqlangan IC50 qiymatlariga ham mos keladi va bu uning o'rtacha inhibisyon profilini tasdiqlaydi. Ammo shuni ta'kidlash joizki, nilotinib yoki krizotinibning 10 mkM konsentratsiyasi rodamin 123 va DOAClarni ushlab turishning bir xil o'sishiga olib kelmadi. Rodamin skriningida nilotinib substratning saqlanishini taxminan 71 foizga oshirdi, DOAC uchun esa bu taxminan 40 foizni tashkil etdi. Bundan farqli o'laroq, krizotinib rodaminning saqlanishini (23 foizga) kichik o'sishiga olib keldi, lekin bir xil kontsentratsiyada DOAClarning (taxminan 50 foiz) saqlanishini ko'proq oshiradi. Yuqorida muhokama qilinganidek, bu kuzatuvni P-gp-dagi bog'lanish joylaridagi farqlar bilan izohlash mumkin. Ma'lumki, ko'pgina dorilar o'zaro ta'sir qiladi va R bilan bog'lanish joyidan ko'ra H bilan bog'lanish joyi bilan raqobatlashadi (bu erda rodamin 123 bog'lanadi) va aksincha [39]. Qizig'i shundaki, kuchli P-gp inhibitori sifatida ma'lum bo'lgan ketokonazol nilotinibga qaraganda rodamin 123 ni ushlab turishning biroz kichikroq o'sishiga olib keldi (mos ravishda 66 foizga nisbatan 71 foiz). Shunga qaramay, xuddi shunday qiymat Caco{28}} hujayralarida kuzatildi, bu erda ketokonazol mavjudligi R123 to'planishining 60 foizga oshishiga olib keldi [40]. IC50 qiymatlarini aniqlash uchun hujayra ichidagi DOAC to'planishi ham nilotinib va ​​krizotinib bilan solishtirganda yuqori qiymatlarni ko'rsatdi. Qizig'i shundaki, digoksinni P-gp substrati sifatida ishlatadigan LLC-PK1 yoki Caco{36}} modellarida topilgan IC50 qiymatlarining aksariyati ketokonazol uchun 3 dan 4 mkM gacha bo'lgan [41, 42]. Bu qiymatlar ushbu tadqiqotda topilgan qiymatlardan ancha farq qiladi (apiksaban va rivaroksaban bilan mos ravishda 16,5 mkM va 16,9 mkM). Ushbu kuzatish P-gp inhibitör potentsialini aniqlashda substrat va foydalanilgan modelni tanlash hal qiluvchi ta'sir qilishini tasdiqlaydi. Bundan tashqari, yaqinda o'tkazilgan tadqiqot shuni ko'rsatdiki, in-vitro uyali modellarda ABC tashuvchilarning ifoda darajalari giyohvand moddalarni tashish tahlillariga va shuning uchun P-gp [43] bilan bog'liq DDIlarni baholashga ta'sir qiladi. Darhaqiqat, P-gp substrati sifatida rivaroksabandan foydalangan holda verapamil uchun IC50 qiymatlarini aniqlash MDCKMDR1 va Caco-2 hujayra modellari o'rtasida IC50 qiymatlari mos ravishda 6,94 mkM va 21,2 mkM bo'lgan heterojenlikni aniqladi [43]. Bundan tashqari, ushbu tadqiqotda nilotinibning apiksaban va rivaroksabanning hujayra ichidagi to'planishiga konsentratsiyaga bog'liq ta'siri ham Kako{61}} hujayralarida o'rganildi. Qizig'i shundaki, nilotinib uchun IC50 qiymatlari RPTEC/TERT1 hujayralariga qaraganda Caco{63}} hujayralarida sezilarli darajada yuqori bo'lgan. Ushbu kuzatishni ushbu modellar orasidagi P-gp ifodasidagi farq bilan izohlash mumkin. Bundan tashqari, ma'lumki, P-gp taqsimoti ko'rib chiqilgan to'qimalarga bog'liq. Fallon va boshqalar. yilda P-gp darajasi yuqori ekanligini ko'rsatdibuyrakodamlardagi jigar to'qimalariga qaraganda [45]. Boshqa tomondan, P-gp ning ifoda darajasi ichakdagiga qaraganda yuqoriroq ko'rinadibuyrakto'qima [46]. RPTEC/TERT1 modeli kabi tashuvchilarni haddan tashqari ifoda etmaydigan inson hujayralaridan foydalanish qo'shimcha ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin. Ushbu ma'lumotlar to'qimadagi P-gp miqdori yoki in vitro modeli yoki IC50 qiymatlari kabi bir nechta parametrlarni birlashtirish orqali fiziologik asoslangan farmakokinetik modellashtirishda (PBPK) ishlatilishi va hisoblanishi mumkin.

RPTEC/TERT1 modelida ketokonazol uchun topilgan IC5{4}} qiymatlari adabiyotda kuzatilganidan yuqori bo'lsa-da, og'iz orqali yuboriladigan dorilar uchun potentsial klinik ahamiyatga ega DDIlarning bashoratchisi sifatida tasdiqlangan [I1]/IC50 nisbati ko'rsatdi. FDA tomonidan belgilangan 0,1 chegarasidan yuqori bo'lgan yuqori qiymatlar. Ushbu natija ketokonazolni birgalikda qo'llash bilan apiksaban ta'sirining ikki baravar oshishini ko'rsatadigan klinik tadqiqotga mos keladi [44]. Birgalikda bu natijalar RPTEC/TERT1 modeli P-gp inhibitör potentsialini baholash uchun istiqbolli vosita ekanligini ko'rsatadi.

CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK OG'RIG'INI YANGILAYDI

Xulosa

Tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, RPTEC / TERT1 modelini qo'llash turli dorilar sinflarining P-gp inhibitör potentsiallarini baholash uchun qulaydir. Rhodamin 123 to'planishi tahlillari dastlabki dori tekshiruvini o'tkazishga imkon berdi. Shu bilan birga, P-gp ning R joyi bilan o'zaro ta'sir qilmaydigan dorilarning P-gp inhibitör potentsiallari, shuningdek, bashoratlarni tasdiqlash uchun qo'shimcha substratlar yordamida tekshirilishi kerak. Apiksaban va rivaroksabanning hujayra ichidagi to'planishi natijasida aniqlangan IC50 qiymatlari rodamin 123 bilan kuzatilgan inhibisyon profillariga mos keladi. Bundan tashqari, ketokonazol va varfarinning mos ravishda P-gp ning kuchli inhibitori va ingibitor bo'lmagani sifatida ishlatilishi tasdiqlandi. RPTEC/TER1 modelining P-gpga qarshi dori vositalarining inhibitiv potentsiallari haqida in vitro ma'lumotlarini olish uchun foydalanilganda ishonchliligi. Nihoyat, RPTEC/TERT1 modeli yordamida olingan natijalarni Caco{12}} hujayralari yordamida olingan natijalar bilan solishtirish ma'lum dori uchun inhibitiv profilni tasdiqlash uchun turli hujayra modellarida in vitro tadqiqotlar o'tkazish muhimligini ta'kidladi.