KLRG1 o'simta rivojlanishi va immunoterapiya reaktsiyasi bilan bog'liq bo'lgan o'simtaga infiltratsiya qiluvchi CD4 T hujayralarining quyi to'plamlarini belgilaydi

Abstrakt

Immuno-onkologiyada biomarkerlarni aniqlash va maqsadni aniqlashning hozirgi usullari o'sma immunitetining statik suratlariga tayanadi. Antitumor immun javoblarining vaqtinchalik xarakterini batafsil tavsiflash uchun biz 34-parametrli spektral oqim sitometriyasi panelini ishlab chiqdik va muhim kontekstlarda yuqori o'tkazuvchanlik tahlillarini o'tkazdik.

Biz saratonga qarshi immuno-tahrirlash (NPKC1) va immun nazorat punkti blokadasi (ICB) javobini (MC38) takrorlaydigan ikkita alohida klinikadan oldingi modellardan foydalandik va immun nazorati va qochish va/yoki ICB javobining asosiy burilish nuqtalari va atrofidagi bir nechta tegishli to'qimalarni profilladik.

Maqsadlar oqsillar, fermentlar va retseptorlar kabi hujayralardagi muhim biomolekulalarga tegishli. Maqsadni aniqlash - bu biomolekulalarning o'ziga xos xususiyatlari va funktsiyalarini kasalliklarni davolashda va dori vositalarini ishlab chiqishda qo'llash uchun aniqlash uchun kimyoviy va biologik usullardan foydalanish.

Immunitet deganda organizmning begona patogenlarning kirib kelishiga va endogen anormal hujayralar o'sishiga qarshilik ko'rsatish qobiliyati tushuniladi. Immun tizimining yadrosi immun hujayralari va molekulalar bo'lib, ular o'z maqsadlari bilan yaqin aloqada va o'zaro ta'sirda.

Kasallikni davolashda va dori vositalarini ishlab chiqishda maqsadni aniqlash va immunitet o'rtasidagi bog'liqlik juda muhimdir. Misol uchun, ko'plab dori vositalarining ta'sir qilish mexanizmi terapevtik ta'sirga erishish uchun maqsadni tanib olish, o'ziga xos oqsillarni, fermentlarni, retseptorlarni va boshqa molekulalarni nishonga olish, ularning funktsiyalariga ta'sir qilish va signal uzatishni tartibga solishdir. Immun tizimidagi hujayralar va molekulalar ham dorilarning nishoni bo'lishi mumkin. Masalan, saratonga qarshi dorilar saraton hujayralarining immun reaktsiyasiga ta'sir qilish va hujayra apoptozi va proliferatsiyasini tartibga solish orqali terapevtik ta'sirga erishadi.

Shu sababli, dori vositalarini ishlab chiqish va klinik davolashda maqsadli identifikatsiya va immunitet omillarini har tomonlama hisobga olish dori vositalarini yanada samarali ishlab chiqishga va terapevtik ta'sirni yaxshilashga olib kelishi mumkin. Shu nuqtai nazardan, biz immunitetni yaxshilashimiz kerak. Cistanche immunitetni oshirishi mumkin. Cistanche turli xil antioksidant moddalarga boy, masalan, vitamin C, vitamin C, karotinoidlar va boshqalar. Bu ingredientlar erkin radikallarni tozalashi, oksidlovchi stressni kamaytirishi va immunitetni yaxshilashi mumkin. tizim qarshiligi.

Cistanche tubulosa ekstrakti kukunini bosing

Mashinani o'rganishga asoslangan ma'lumotlarni tahlil qilish KLRG1 ekspressiyasining naqshini aniqladi, bu o'simta modellari bo'ylab o'simta yuki bilan konstruktiv ravishda bog'langan va ICBga javoban regressiyaga uchragan o'smalarda yo'qolgan intratumoral effektor CD4 T hujayra populyatsiyalarini noyob tarzda aniqladi. Xuddi shunday, Helios-KLRG1 plyus o'simta infiltratsiyasini tartibga soluvchi T hujayralari (Tregs) to'plami o'simtaning immunitet muvozanatidan qochishga o'tishi bilan bog'liq va ICBga javob beradigan o'smalarda ham yo'qolgan.

Tasdiqlash tadqiqotlari buyrak saratonida kasallikning rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan o'simtaga infiltratsiya qiluvchi CD4 T hujayralarida KLRG1 imzolarini tasdiqladi. Ushbu topilmalar KLRG1 va CD4 T hujayralari populyatsiyasini saratonga qarshi immunitetni qo'shimcha tekshirish uchun quyi to'plamlar sifatida ko'rsatadi va dinamik biomarker va / yoki maqsadni aniqlash mexanizmi sifatida uzunlamasına spektral oqim profilini ko'rsatadi.

Kirish

Immunoterapiya endi saraton kasalligini davolashning ustunidir. Biroq, ko'pgina immunoterapevtik vositalarga javoblar kam uchraydi, cheklangan miqdordagi o'sma turlari bilan cheklangan va oldindan aytish qiyin (1). Javob berish tezligini yaxshilash va javobni bashorat qiluvchi biomarkerlarni ishlab chiqish o'sma immunologiyasi sohasining asosiy maqsadidir, ammo bu hali ham qiyin.

Ko'p sonli murakkab ko'p hujayrali o'zaro ta'sirlar har qanday bemorda o'smaga qarshi immunitet reaktsiyasining natijasini boshqarishi mumkin. Shuning uchun, odatda, bitta biomarkerlar - yoki individual yo'llarning terapevtik modulyatsiyasi - saraton kasalliklarining ko'pchiligida emas, balki ba'zilarida foydali bo'ladi.

Misol uchun, hozirda keng tarqalgan klinik foydalanishda immun bilan bog'liq uchta biomarker mavjud; (i) to'g'ridan-to'g'ri o'lchanadigan yoki DNK ta'mirlash apparatida (2-4) o'chirib qo'yadigan mutatsiyalar mavjudligi bilan o'lchanadigan o'sma mutatsion yuki (TMB), (ii) immunohistokimyo (IHC) (5) orqali PD-L1 ifodasi va (iii) Immunoskor (6) deb ataladigan o'smalar ichida va uning atrofidagi CD8 T hujayralari mavjudligi bilan o'lchanadigan oldindan mavjud immunitet.

Har biri ma'lum kontekstlarda immunoterapiyaga javob bilan sezilarli darajada bog'liq bo'lsa-da, bu bashorat qiluvchilarning sezgirligi va o'ziga xosligi sub-optimal bo'lib qoladi (7). Ushbu unimodal yondashuvlar, ehtimol, to'qimalarda va vaqt o'tishi bilan yuzaga keladigan bunday reaktsiyalarning dinamik tabiatini o'z ichiga olgan o'smaga qarshi immunitetning asosiy mexanizmlarini to'liq qamrab ololmaydi.

Shunday qilib, biomarkerlarni aniqlash va maqsadni o'zaro to'qimalarda, bo'ylama usulda aniqlashda yuqori multiplekslangan bir hujayrali immun profilini yaratish yondashuvlarini qo'llash ko'proq prognozli va translyatsion foyda bilan nuanslangan immun fenotiplarini ta'minlashi mumkin.

Shu maqsadda biz saraton immuno-tahrirlash siklining turli fazalari bilan bog‘liq bo‘lgan oqsil darajasidagi immun fenotiplarini, jumladan, immundan qochish va o‘simta o‘sishi hamda immun nazorat punkti bilan bog‘liq 34-parametrli spektral oqim sitometriyasi paneli va yuqori o‘lchamli ma’lumotlarni tahlil qilish quvurini ishlab chiqdik. preklinik modellarda blokada (ICB) javobi.

Biz NPK-C1 va ICB bilan davolash qilingan MC38 modellarini o'simta rivojlanishidagi asosiy burilish nuqtalari ustida va atrofida bir nechta to'qimalarni (o'simta, drenajlash va drenajlanmaydigan limfa tugunlari va qon) tahlil qildik. Bu tabiiy va ICB tomonidan qo'zg'atilgan o'simta regressiyasi, immun muvozanatiga o'tish va keyinchalik muvozanatdan nazoratsiz o'simta qochishiga o'tish dinamikasining chuqur tavsifini osonlashtirdi. Buyrak saratonining insonning bir hujayrali ma'lumotlar to'plamida tekshirish tadqiqotlari ushbu topilmalarning tarjimaviy ahamiyatini tasdiqladi.

Materiallar va usullar

Sichqoncha. Erkak va urg'ochi C57BL/6J sichqonlari ({2}} haftalik) Jekson laboratoriyasidan (Bar Harbor, ME) sotib olingan. Foydalanish vaqtida sichqonlar 6-8 haftalik edi. Barcha hayvonlar NIH va Amerika laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish assotsiatsiyasi qoidalariga qat'iy muvofiq joylashtirilgan. Ushbu tadqiqot uchun barcha tajribalar va protseduralar Kolumbiya universiteti tibbiyot markazi hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi (IACUC) tomonidan tasdiqlangan.

Hujayra chiziqlari. NPK-C1 hujayra liniyasi (dastlab LM7304) Kolumbiya universitetida doktor Kori AbateShen tomonidan taqdim etilgan. Batafsil ma'lumot uchun oldingi havolalarga qarang(8,9). NPK-C1 xujayralari R10 da saqlangan bo'lib, ular 10% FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/ml penitsillin va 100 mg/ml streptomitsin (Gibco; Gaithersburg) bilan to'ldirilgan RPMI muhitidan (Corning; Corning, NY) tashkil topgan. MD). MC38 yo'g'on ichak karsinomasi hujayralari Kerafastdan sotib olindi va 10 foiz FBS, 100 U/ml penitsillin va 100 mg/ml streptomitsin (Gibco; Gaithersburg, MD) bilan to'ldirilgan DMEM (Corning; Corning, NY) dan tashkil topgan D10da yetishtirildi.

Tumor Challenge va Terapiya in'ektsiyalari. 70-90 foiz qo‘shilish joyidagi NPK-C1 hujayralari yoki 50-75 foiz qo‘shilish joyidagi MC38 hujayralari 0 bilan yig‘ildi.05 foiz tripsin (Gibco, Gaithersburg, MD) bilan yuvildi. PBS, hisoblangan va muzli sovuq PBSda 10x106 hujayra/ml da qayta suspenziya qilingan. 0-kuni 6-8 haftalik sichqonlar oʻng qanotga 1x106 NPK-C1 yoki MC38 hujayralari bilan implantatsiya qilindi. O'simta o'lchovlari X, Y va Z o'lchamlarida (mos ravishda eng katta diametr, eng kichik diametr va eng katta balandlik) har 2-3 kunda raqamli kaliper yordamida qayd etilgan va o'simta hajmi X*Y*Z ga ko'paytirib hisoblangan. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,k) yoki kalamush IgG2a izotip antikori (Bio X Cell; Livan, NH) steril PBSda suyultirildi va 200 ug/da qorin bo'shlig'iga (IP) in'ektsiya yo'li bilan kiritildi. MC38 implantatsiyasidan keyingi 3, 6, 9 va 12-kunlarda sichqoncha uchun ml.

To'qimalarni yig'ish. Sichqoncha evtanaziyasidan so'ng, 0,2 foizli geparin (StemCell Technologies; Vancouver, BC) bilan qoplangan shpritsli igna yordamida yurak ponksiyoni orqali ~200 ul qon ajratildi va 10 ul 0,5M bo'lgan naychalarga muz ustiga qo'yildi. EDTA (Korning; Korning, NY). O'simtani drenajlovchi va drenajlanmagan inguinal limfa tugunlari ajratildi va muz ustida 150 ul R10 muhiti bo'lgan 48-quduq plastinkalariga joylashtirildi.

O'smalar yig'ib olindi, massa olindi va 50 mg gacha bo'lgan o'simta kubiklarga bo'lindi va X-Vivo 15 muhitiga (Lonza; Bazel, Shveytsariya) muz ustida 5 ml Eppendorf naychalariga joylashtirildi. DNase (40 ul 20 mg/ml eritma; Roche; Bazel, Shveytsariya) va Kollagenaza D (125 ul 40 mg/ml eritma; Roche; Bazel, Shveytsariya) o'simta namunalariga 37oC da shakerda inkubatsiya qilishdan oldin qo'shildi. 30 daqiqa. Digest reaktsiyalari vortekslash (30 soniya) va 5 ml R10 muhitini qo'shish orqali to'xtatildi. O'simta hazm qilishlari 70 mkm filtrlar (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) orqali filtrlangan va pelletlangan. Qon namunalari 2 ml ACK buferida (Quality Biological; Gaithersburg, MD) ketma-ket ikki 2-daqiqalik inkubatsiya bilan eritrotsitlar parchalandi va granulalar hosil qilishdan oldin R10 da söndürüldü. Limfa tugunlari 48-quduq plitasidagi 1 ml shpritsli piston yordamida jismoniy qismlarga ajratildi, so'ngra suspenziyalar 40-um filtrlari orqali filtrlandi. Barcha namunalar bo'yash uchun U-pastki 96-quduqli plitalarga joylashtirildi.

Oqim sitometriyasi. Namunalar PBS bilan yuviladi. O'lik hujayralar 100 ul PBS plyus Live/Dead Fixable Blue bo'yoqda (1:500; Invitrogen; Waltham, MA) qayta suspenziya bilan bo'yalgan. Bu va boshqa barcha bo'yash yoki mahkamlash bosqichlari xona haroratida yorug'likdan himoyalangan plastinka silkitgichda 30 daqiqa davomida amalga oshirildi. Namunalar PBS bilan 2 marta yuvildi, keyin TruStain FcX (1:50; BioLegend; San-Diego, CA) va TruStain Monocyte Blocker (1:20); BioLegend; San-Diego, Kaliforniya) va muz ustiga qo'yilgan.

Yuzaki antikorlar Brilliant Stain Plus buferi (BD; Franklin Lakes, NJ) bilan to'ldirilgan FACSda optimal suyultirishda (qo'shimcha S1 jadvaliga qarang) tayyorlangan, so'ngra blokirovka qiluvchi eritmada namunalarga qo'shilgan. Bo'yalgandan so'ng, namunalar FACS buferi bilan 2 marta yuvildi va 100 ul FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit buferiga (eBioscience; San-Diego, CA) mahkamlandi. Namunalar ikki marta 1X o'tkazuvchanlik buferi (1X PW) bilan yuvilgan va keyin 1X PW va hujayra ichidagi antikorlarda bo'yalgan. Keyin namunalar 1X PW da ikki marta yuvildi, keyin 100 ul FluoroFix buferiga (BioLegend: San-Diego, Kaliforniya) mahkamlandi, ikki marta FACS bilan yuvildi, keyin 200 ul FACSda qayta suspenziya qilindi va keyingi kuni olish uchun 96 quduqli plastinkalarga muhrlandi. Cytek Aurora 5-lazer sitometri.

Bir vaqtning o'zida bo'yalgan splenotsit namunalari bitta dog'ni nazorat qilish uchun ishlatilgan. Tahlil va statistika. Uzunlamasına profil yaratish tajribalari MC38 va NPK-C1 modellari uchun har birida bir marta o'tkazildi. Vaqt nuqtasida jami n=10-25 ta sichqon baholandi. Flow sitometriya ma'lumotlari FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ) da tahlil qilindi va yuqori o'lchamli plagin algoritmlari UMAP va FlowSOM FlowJo Exchange'dan yuklab olindi. Yuqori o'lchamli tahlil uchun 30 ming jonli CD45 plyus o'simtaga infiltratsiya qiluvchi hujayralar va 15 ming jonli CD45 plyus qon yoki LN dan olingan hujayralar birlashtirilgan.

Barcha o'lchamlarni kamaytirish va klasterlash FlowJo da amalga oshirildi. Statistik tahlillar GraphPad Prism v9.3.1 da amalga oshirildi. Korrelyatsiya koeffitsientlarini yaratish uchun Pearson korrelyatsiyasi qo'llanildi va guruhlar o'rtasidagi klaster chastotalarini solishtirish uchun Welch tuzatishi bilan juftlashtirilmagan Student T-testlaridan foydalanildi. Bir hujayrali analitik usullar avval tavsiflangan (10,11).

KLRG1 regulon Obradovic va boshqalar (11) dan konsensus metaVIPER KLRG1 regulonidan olingan. KLRG1 regulon imzosini hisoblash uchun biz regulonlar genlari xususiyat sifatida va KLRG1 maqsad sifatida tasodifiy o'rmon regressiyasi modelini o'rnatdik, so'ngra ularning KLRG1 ifodasiga ta'sirini aniqlash uchun regulon genlarining Gini ahamiyatini hisoblab chiqdik. Har bir hujayraning KLRG1 regulon balli hujayradagi barcha regulon genlarining ekspressiya o'lchovlarining og'irlik sifatidagi muhim ballari bilan og'irlikdagi yig'indisi bilan berilgan.

For more information:1950477648nn@gmail.com