Cistanche Deserticola dan past molekulyar og'irlikdagi saxaridlar tomonidan makrofaglarning faollashishi

Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

［ Abstmuomala］

dan past molekulyar og'irlikdagi saxaridlarning immun faollashuv ta'siri va mexanizmini o'rganishCistanche deserticola(LMSC) sichqonchaning peritoneal makrofaglarida, RAW264. 7 hujayra. RAW264. 7 hujayra oddiy nazorat guruhiga, LPS musbat nazorat guruhiga va LMSC davolash guruhlariga bo'lingan. RAW264. 7 ta hujayra 3,91 dan 62,5 g·L gacha bo'lgan LMSC ning turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi - 1. Neytral qizil tahlil makrofaglarning fagotsitar faolligini aniqlash uchun ishlatilgan. NO to'plami va makrofag faollashuvi bilan bog'liq protein ifoda darajalari (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IKB, p-IKB, NF-kB va p-NF-kB) yordamida YO'Q ajralish aniqlanmadi. Western blot yordamida aniqlangan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, LMSC makrofaglarga faollashtiruvchi ta'sir ko'rsatdi; u RAW264 da NO ning chiqarilishini sezilarli darajada oshirishi mumkin. 7 hujayradan iborat bo'lib, TNF- va IL-6 sitokinlarining ifodalanishiga yordam beradi. Bundan tashqari, LMSC IKK, IKB va NF-kB p65 fosforillanishini sezilarli darajada oshirdi. Bundan tashqari, LMSC ning asosiy tarkibiy qismlaridan biri bo'lgan mannitol makrofaglarning fagotsitik faolligini sezilarli darajada oshirdi. Ushbu natijalar LMSC NF-kB signalizatsiya yo'lini yuqori tartibga solish orqali makrofaglarni faollashtirishi mumkinligini ko'rsatdi va mannitol LMSC ning asosiy faol komponentlaridan biri bo'lishi mumkin.

［Kalit so'zlar］ Past molekulyar og'irlikdagi saxaridlar; Cistanche deserticola; immunitetni faollashtirish; makrofag; yallig'lanish omili; NF-kB

Cistanche deserticola YC Maturkumiga mansub oʻsimlik hisoblanadiCistanche deserticolaYC Ma. Uning go'shtli poyasidan dori sifatida foydalanish mumkin. Buyrak yangini oziqlantirish, mohiyat va qonni oziqlantirish va ichaklarni namlash funktsiyalariga ega. U "cho'l ginseng" nomi bilan mashhur. Cistanche kimyoviy tarkibiy qismlariga feniletanoid glikozidlar, iridoid glikozidlar, shakarlar, lignanlar va boshqa ko'plab turlar kiradi. Zamonaviy farmakologik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Cistanche neyroproteksiya, o'smaga qarshi, immunitetni tartibga solish, yallig'lanishga qarshi va antioksidant kabi ko'plab biologik faollikka ega [1]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Cistanche va polisaxaridlarning kaynatmalari makrofaglarning fagotsitar qobiliyatini va sekretsiya funktsiyasini sezilarli darajada yaxshilashi mumkin [2-3]. Biroq, uning past molekulyar og'irlikdagi uglevodlarining faolligini o'rganish bo'yicha hisobot yo'q. Shuning uchun ushbu tadqiqot RAW264 in vitro madaniyat tizimidan foydalangan. Cistanche past molekulyar og'irlikdagi uglevodlarning immunomodulyatsion faolligini va tegishli mexanizmlarini o'rganish uchun 7 sichqoncha peritoneal makrofaglari. Ushbu tadqiqot har tomonlama tushunish uchun ko'proq eksperimental dalillar keltirishi mumkinCistanchening immunomodulyator ta'sirikelajakda, uning klinik qo'llanilishini yanada ko'proq boshqarish uchun.

Cistanche deserticola juda ko'p effektlarga ega, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

1. Materiallar

RAW264. 7 ta hujayra Xitoy Tibbiyot fanlari akademiyasining Hujayra markazidan sotib olindi; homila sigir zardobi (FBS) PAN Biotech, Germaniyadan sotib olindi; antibiotiklar va DMEM muhiti Zhongke Machen Technology Co., Ltd kompaniyasidan sotib olindi. Escherichia coli O55: B5 (LPS) dan lipopolisaxarid AQShning Sigma kompaniyasidan sotib olindi. Azot oksidi (NO) to'plami Nankin Jiancheng biomuhandislik institutidan sotib olindi. ECL xemiluminesans to'plami AQShning Thermo Fisher shahridan sotib olindi; antikor Cell Signaling Technology, AQShdan sotib olindi; Cistanche cistanche total glikozidlari, cistanche past molekulyar og'irlikdagi shakar va cistanche polisaxaridlari bizning tadqiqot guruhimiz tomonidan o'z-o'zidan ishlab chiqarilgan. Sistanx jami glikozidlarining massa ulushi 78,76 foizni tashkil etdi. Past molekulyar og'irlikdagi shakarlarning massa ulushiCistanche deserticola58. 00 foiz va ning massa ulushiCistanche deserticolapolisaxaridlar 65,24 foizni tashkil qiladi. Tanon-5200Multi gel tasvirlash split tizimi Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.dan xarid qilingan; Sunrise-Basic mikroplata o'quvchi TECAN kompaniyasidan sotib olindi.

2. Usul

2. Makrofaglarning fagotsitar faolligini o'lchash uchun 1 neytral qizil usul

Sichqonchaning peritoneal makrofaglarini logarifmik o'sish bosqichida oling, tripsinizatsiyadan so'ng hujayralarni hisoblang, hujayralar sonini 5 × 104 hujayra/ml ga sozlang va ularni 96-kuyuq hujayra madaniyati plastinkasiga, 100 mkl/quduqqa seping. , 37 gradusda 5 foiz CO2 sharoitida yetishtiriladi, hujayralar devorga yopishgandan so'ng, madaniyat supernatantini tashlang, DMEM muhiti (10 foiz FBS plus 1 foiz P / S), LPS (1 mg · L - 1) va Cistanche qo'shing. cistanche mos ravishda umumiy glikozidlar,Cistanchejami polisaxaridlar va Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi qandlar (mos ravishda 3,91 ~ 62,5 g · L -1, administratsiyadan oldin filtrli membrana bilan filtrlanadi) ekilgan. 48 soat kultivatsiyadan so‘ng har bir quduqqa 100 mkl 0,075 foiz neytral qizil fiziologik fiziologik eritma qo‘shing, 4 soat davomida kultivatsiyani davom ettiring, supernatantni aspiratsiya qiling, PBS bilan 3 marta yuving, hujayra lizatini (muzlik sirka kislotasi) qo‘shing. -etanol 1:1) 100 mkL, uni 2 soat davomida 4 darajaga qo'ying va hujayralar parchalangandan keyin absorbansni (A540 nm) o'lchang.

2. 2 Hujayra supernatantida NO ajralish miqdorini aniqlash

RAW264 inokulyatsiyasi. 48-Quduq plastinkasida 7 ta hujayra (1 × 105 hujayra/ml, 500 mkl/quduq), tun davomida inkubatsiyadan so‘ng hujayra madaniyat muhitini aspiratsiya qiling, DMEM muhitini qo‘shing (10 foiz FBS va 1 foiz P/S), 500 LPS (1 mg·L -1) va Cistanche cistanche jami glikozidlari, jami polisakkaridlar va past molekulyar og'irlikdagi shakarlarning har biri mL (mos ravishda 3,91 ~ 62,5 g·L -1). 24 soatlik induksion madaniyatdan so'ng, supernatant yig'ildi. NO to'plami bilan har bir guruhning hujayra supernatantida NO kontsentratsiyasini aniqlang, ko'rsatmalarga rioya qiling va nihoyat mikroplastinka o'quvchi bilan absorbansni (A570 nm) aniqlang.

2. 3. Western blot

RAW264 inokulyatsiyasi. 6-Quduq plastinkasida 7 ta hujayra, tun davomida inkubatsiyadan keyin hujayra madaniyati muhitini aspiratsiya qiling, DMEM muhitini (10 foiz FBS plyus 1 foiz P/S), LPS (1 mg·L - 1) qo'shing vaCistanchejami Polisaxaridlar va past molekulyar og'irlikdagi shakar (3,91 ~ 62,5 g · L -1) har biri 2 ml ni tashkil etdi va supernatant 24 soatlik indüksiyon madaniyatidan keyin tashlandi. Hujayralar ikki marta PBS bilan yuvildi va tashlandi. Tripsinizatsiyadan so'ng hujayralar pipetka bilan quyiladi. Santrifüj qiling, supernatantni olib tashlang, 100 mkL NP40 Lizis buferini qo'shing va 40 daqiqa davomida muz ustida lizing. Santrifüjdan so'ng, supernatant olindi va protein kontsentratsiyasi BCA usuli bilan aniqlandi va har bir gistonning oqsil kontsentratsiyasi teng ravishda o'rnatildi. Bir xil miqdordagi protein namunalarini oling va ularni doimiy bosim ostida 12 foiz SDS-PAGEga ajrating. Keyin 350 mA doimiy oqim bilan membranani 1 soat davomida o'tkazish uchun Bio-Rad transfer elektroforez tankidan foydalaning va oqsilni PVDF membranasiga o'tkazing (PVDF membranasini oldindan ishlov berish: metanolda namlash va uzatish tamponi bilan muvozanatlash). Xona haroratida 1 soat davomida 5 foizli yog‘sizlangan sut (tarkibida 0,1 foiz Tween-20 bo‘lgan TBST bilan tuzilgan) bilan bloklangandan so‘ng, membrana 3 marta TBST bilan yuvildi va membrana protein birlamchi antikor seyrelticisida 4 darajada inkubatsiya qilindi. kechada daraja. Membrana har kuni 3 marta TBST bilan yuvildi va 1 soat davomida inkubatsiya qilish uchun mos keladigan suyultiruvchi qo'shildi. Membrana 3 marta TBST bilan yuvilgan va chiziqlar ECL chemiluminescence ishlab chiqaruvchisi bilan ishlab chiqilgan.

2. 4 ta ma'lumotlarni tahlil qilish

Ma'lumotlar x ± s sifatida ifodalanadi va farqning ahamiyati dispersiyani bir tomonlama tahlil qilish uchun GraphPad Prism 6 statistik dasturi yordamida tekshiriladi. P.ni oling<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Natijalar

3. 1. Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi qandlar, umumiy glikozidlar va jami polisaxaridlarning RAW264 ning fagotsitik faolligiga ta'siri. 7 hujayra

Cistanche kimyoviy komponentlari ustida olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiCistancheasosan oʻz ichiga oladifeniletanoid glikozidlar, iridoid glikozidlar va uglevodlar. Bu tajribada sistanxning umumiy glikozidlari (jumladan, fenetil spirti glikozidlari va iridoid glikozidlari), past molekulyar qandlar va qandlar tanlab olinadi. Jami polisakkaridlarning uchta faol joyi RAW264 faollashuviga ta'siri uchun tekshirildi. 7 hujayra. Cistanche cistanche polisaxaridi va past molekulyar og'irlikdagi shakar RAW264 ning fagotsitik faolligini sezilarli darajada oshirishi mumkin. 7 hujayradan iborat, ammo umumiy glikozidlarni boshqarish guruhining fagotsitik faolligi sezilarli darajada o'zgarmaydi. Bundan tashqari, ijobiy nazorat dori LPS ham RAW264 ning fagotsitik faolligini sezilarli darajada yaxshilagan. 7 hujayralar, shakl 1da ko'rsatilganidek. Yuqoridagi natijalar Cistanche ning past molekulyar og'irlikdagi shakarlari va polisaxaridlari RAW264 ni faollashtirish ta'siriga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. 7 hujayra.

3. 2. Cistanche total glikozidlari, past molekulyar qandlar va jami polisaxaridlarning hujayra supernatantidagi azot oksidi (NO) tarkibiga ta'siri.

RAW264-da Cistanche-ning uchta faol saytining faollashuv ta'sirini qo'shimcha tekshirish uchun. 7 hujayra, turli dorilar tomonidan rag'batlantirilgan hujayra supernatantlarida NO ning tarkibi aniqlandi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, LPS guruhida NO ning chiqarilishi bo'sh nazorat guruhiga qaraganda sezilarli darajada yuqori edi (P).<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchesezilarli ta'sir ko'rsatmadi. Yuqoridagi natijalar shuni ko'rsatadiki, polisakkaridlar va past molekulyar og'irlikdagi Cistanche shakarlari RAW264 dan NO ning chiqarilishiga yordam beradi. 7 hujayra. Ular orasida 2-rasmda ko'rsatilganidek, past molekulyar og'irlikdagi Cistanche shakarlarining ta'siri ayniqsa muhimdir.

3. 3. Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi shakarning RAW264 da TNF- va IL{5}} oqsilini ifodalashiga ta'siri. 7 hujayra

TNF- RAW264 faollashtirish jarayonida paydo bo'ladigan muhim yallig'lanish vositachisi. 7 ta hujayralar, ular boshqa sitokinlarning (masalan, IL-6) sintezi va chiqarilishiga yordam beradi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, TNF- va IL-6 ifodasi Cistanche cistanchening past molekulyar og'irlikdagi shakarini rag'batlantirgandan so'ng sezilarli darajada oshdi, bu Cistanche'nin past molekulyar og'irlikdagi shakari TNF ifodalanishiga yordam berishi mumkinligini ko'rsatdi. - va RAW264 da IL{11}}. 7 hujayra, shu bilan hujayra immunitetini faollashtiradi Fagotsitoz, 3-rasmga qarang.

3. 4. Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi shakarning IKK /IKB /NF-kB signalizatsiya yo'liga tartibga soluvchi ta'siri

RAW264 ni faollashtirishda Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi shakarlarning potentsial mexanizmini o'rganish uchun. 7 hujayra, mualliflar uning IKK / IKB / NF-kB klassik signalizatsiya yo'liga tartibga soluvchi ta'sirini o'rgandilar. Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi shakar NF-kB fosforillanishini va uning yuqori oqimdagi asosiy signal oqsillari IKK va IKB ning fosforlanishini sezilarli darajada oshirishi va umumiy IKB oqsilining ifodalanishini kamaytirishi mumkin, bu uning IKK ga faollashtiruvchi ta'siri borligini ko'rsatadi. IKB / NF-kB signalizatsiya yo'li. Ijobiy nazorat dori LPS ham xuddi shunday tartibga soluvchi ta'sirga ega. Xulosa qilib aytganda, Cistanchening past molekulyar og'irlikdagi shakarlari IKK /IKB /NF-kB signalizatsiya yo'lini faollashtirishi mumkin, shu bilan TNF- va IL-6 kabi sitokinlarning sintezi va chiqarilishiga olib keladi va nihoyat immunitetni keltirib chiqaradi. RAW264 ni faollashtirish. 7 hujayra, 4-rasmga qarang.

3. 5. Cistanche past molekulyar og'irlikdagi shakarlarda makrofag faollashtiruvchi ta'sirga ega faol moddalarni skrining qilish.

Laboratoriyamiz tarkibidagi past molekulyar shakarlarni tahlil qildiCistancheDastlabki bosqichda va uning tarkibida asosan mannitol (16,53 foiz), saxaroza (8,34 foiz), fruktoza (25,38 foiz) va glyukoza (7,75 foiz) va boshqa moddalar borligini aniqladi. Shunday qilib, muallif yuqoridagi komponentlarning makrofaglarga faollashuv ta'sirini tekshirish uchun neytral qizil usuldan foydalangan. Mannitol makrofaglarning fagotsitik faolligini dozaga bog'liq holda sezilarli darajada oshirishi mumkin, boshqa komponentlarning ta'siri esa sezilarli emas. Bu shuni ko'rsatadiki, mannitol 5-rasmda ko'rsatilganidek, makrofaglarni faollashtirish uchun Cistanche cistanche past molekulyar og'irlikdagi qandlarning asosiy faol komponentlaridan biri bo'lishi mumkin.

4. Munozara

Lydanaceae oilasiga mansub parazit oʻsimlik boʻlgan Cistanche cistanche immunomodulyator taʼsirga ega ekanligi maʼlum qilingan, shuning uchun uning tarkibida immunomodulyator moddalar boʻlishi kerak. Ushbu tajribada muallif sichqonning peritoneal makrofaglarining fagotsitar faolligini turli tozalangan qismlarida tekshirdi.Cistancheva Cistanche ning past molekulyar og'irlikdagi shakarlari va polisaxaridlari makrofaglarni faollashtirish ta'siriga ega ekanligini aniqladilar, ammo Cistanchening umumiy glikozidlari aniq emas. Shu bilan birga, muallif past molekulyar og'irlikdagi shakar makrofaglarni past konsentratsiyalarda faollashtirishi mumkinligini aniqladi, shuning uchun mualliflarCistanchepast molekulyar og'irlikdagi shakar keyingi tadqiqotlar markazi sifatida.

Past molekulyar og'irlikdagi sitanx shakarining TNF- va IL-6 sitokinlarining ekspressiyasiga ta'sirini o'rganib, mualliflar past molekulyar og'irlikdagi sistanche shakari TNF- va IL-6 ifodasini sezilarli darajada oshirishini aniqladilar. past molekulyar og'irlikdagi cistanche shakar sichqonlarga ta'sir qilishini yana isbotladi. Peritoneal makrofaglar faollashtiruvchi ta'sirga ega. Shunday qilib, muallif uning potentsial harakat mexanizmini batafsil o'rganib chiqdi. Tadqiqotga ega bo'ling

Bakterial lipopolisaxarid (LPS) JAK2/STAT3, NF-kB, p38/ERK va MAPK [4-8] kabi signal yo'llari orqali sichqoncha makrofaglari va sichqoncha glial hujayralarining faollashuviga olib kelishi mumkinligi ko'rsatilgan. NF-kB yo'li klassik yo'l sifatida tan olingan, shuning uchun bu yo'ldagi signal oqsillari ushbu tajribada sinovdan o'tkazildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Cistanche'nin past molekulyar og'irlikdagi shakarlari NF-kB fosforillanishini va asosiy yuqori oqim signalizatsiya oqsillari IKK va IKB fosforillanishini sezilarli darajada oshirishi mumkin, bu esa past molekulyar og'irlikdagi shakarlarni ko'rsatadi.CistancheIKK / IkB / NF-kB signalizatsiya yo'li orqali sichqonning peritoneal gigantlarini faollashtirishi mumkin. Fag hujayralari yallig'lanish sitokinlarini chiqaradi va keyin hujayra immunitetini faollashtirishda rol o'ynaydi.

Laboratoriyaning dastlabki bosqichida past molekulyar og'irlikdagi shakar ekstraktining kimyoviy tarkibiCistanche deserticolatizimli tahlil qilindi. Aniqlanishicha, past molekulyar og'irlikdagi qandlar asosan mannitol, saxaroza, fruktoza va glyukoza kabi monomerlarni o'z ichiga oladi. Keyingi tadqiqotlar mannitol makrofaglarning fagotsitik faolligini sezilarli darajada yaxshilashi mumkinligini aniqladi. Shu sababli, mannitol hujayra immun funktsiyasini faollashtiradigan past molekulyar og'irlikdagi shakarlarning asosiy komponenti bo'lishi mumkinligi taxmin qilinadi.

Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot Vitro madaniyat tizimida makrofagdan foydalangan va past molekulyar og'irlikdagi shakarlarningCistanchemakrofaglarga sezilarli faollashtiruvchi ta'sir ko'rsatadi va NF-kB signalizatsiya yo'li orqali sichqonchaning peritoneal makrofaglarini faollashtirishi va keyin rol o'ynashi mumkin. Past molekulyar og'irlikdagi qandlardagi mannitol makrofaglarning fagotsitar faolligini faollashtirishda muhim rol o'ynashi mumkin.

Ma'lumotnomalar

[1] Tu Pengfey, Guo Yuxay. Cho'l Cistanche va uning egasi Tamarixni etishtirish texnikasi [M]. Pekin: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Syaoxia, Chen Jun, Pen Yanli. ning farmakologik ta'sirining tadqiqot sharhiCistanche deserticolapolisakkarid [J]. Oziq-ovqat va dorilar, 2015, 17 (2): 136.

[3] Vang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan va boshqalar. Cistanche polisaxaridining makrofag faollashuvi [J]. Xitoy farmakologik byulleteni, 2009, 25 (6): 787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Bakterial lipopolisaxaridning biologik faolligi va mexanizmi [J]. Tibbiyot fanlari sharhi, 2010, 16 (2): 166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao va boshqalar. p38 /MAPK yo'li orqali LPS va NF-kB faollashuvi RAW264 da HIF-1 ifodasini keltirib chiqaradi. 7 hujayra [J]. Chongqing tibbiyot universiteti jurnali, 2016 yil, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen va boshqalar. JAK2/STAT3 signalizatsiya yo'li lipopoli shakar tomonidan mikrogliyaning ［J］ faollashuvida ishtirok etadi. Uchinchi harbiy tibbiyot universiteti jurnali, 2009, 31 (12): 1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin va boshqalar. Mulbaskum glikozidlari BV-2 mikrogliyaning lipopolisakkaridlar bilan qo'zg'atadigan yallig'lanishini va uning mexanizmini [J] inhibe qiladi. Xitoy an'anaviy xitoy tibbiyoti jurnali, 2016, 41 (13): 2506.