Sitrus patogenlari va Cistanche o'rtasidagi o'zaro ta'sirda ishtirok etadigan ikkilamchi metabolitlarning antifungal potentsiali

Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Tsitrus mevalari jahon iqtisodiyotiga muhim ta'sir ko'rsatadi, chunki ular boshqa mevalarga nisbatan eng ko'p ishlab chiqarishga ega; masalan, 2018/19 yillar uchun jahon apelsin ishlab chiqarish 54,3 million tonnaga yetishi prognoz qilinmoqda. Sitrus mevalarining sifatiga ta'sir qiluvchi asosiy omil - bu hosildan keyinqo'ziqorin kasalliklari,Xususan, Penicillium digitatum sabab bo'lgan yashil mog'or, hosildan keyingi davrda sitrus yo'qotishlarining 90 foiziga javobgardir1,3. O'rim-yig'imdan keyingi kasalliklarga qarshi kurashish uchun sintetik fungitsidlar keng qo'llaniladi, bu sog'liq va atrof-muhit muammolarini keltirib chiqaradi. Bundan tashqari, ba'zi qo'ziqorin shtammlari tez-tez ishlatiladigan fungitsidlarga qarshilik ko'rsatdi. Sifatidaantifungalqarshilik katta tashvishga aylanmoqda, yangi bioaktiv birikmalarni izlash fungitsidlardan keng foydalanishni chetlab o'tishda muhim rol o'ynaydi7. Mikroorganizmlar foydali biologik faollik, ya'ni potentsialga ega tabiiy mahsulotlarning asosiy manbalaridan biri hisoblanadiantifungallar, antibiotiklar, saratonga qarshi vositalar, sirt faol moddalar. Biroq, mikroblarning genetik salohiyati va xilma-xilligi bilan bir qatorda, ko'plab mikrobial biosintetik genlar laboratoriyada qo'llaniladigan g'ayritabiiy etishtirish sharoitida faollashtirilmaydi va metabolitlarning faqat bir nechta qismiga kirish mumkin10. Mikrobial manbalardan tabiiy mahsulotlarni topishdagi cheklovlarni bartaraf etish uchun bir nechta strategiyalar, ya'ni OSMAC yondashuvi10,11, epigenetik modifikatsiyalardan foydalanish va birgalikda etishtirish14 amalga oshiriladi. Tabiiy muhitni taqlid qiladigan, cheklangan makon va ozuqa moddalari uchun mikrobial raqobatni namoyish qiluvchi qo'shma madaniyatlar biologik faol ikkilamchi metabolitlarni ishlab chiqarishga olib keladigan jim gen klasterlari va himoya mexanizmlarini faollashtirishi mumkin bo'lgan asosiy ekologik kuch ekanligi aniqlandi. Birgalikda madaniyat tajribalari yuqori darajada 1 Kimyo instituti, Campinas universiteti, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Braziliya. 2 Tabiiy va gumanitar fanlar markazi, ABC Federal universiteti, 09210-580, Santo André, SP, Braziliya. 3Biomolekulyar kimyo kafedrasi, Leybnits nomidagi Tabiiy mahsulotlarni tadqiq qilish va infektsiya biologiyasi instituti – Xans Knöll instituti, Yena, Germaniya. 4Tabiiy mahsulotlar kimyosi kafedrasi, Fridrix Shiller universiteti Yena, 07743, Yena, Germaniya. Bu nafaqat yangi birikmalarni aniqlash, balki tabiatdagi mikroorganizmlar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni boshqaradigan kimyoviy hodisalarni tekshirish uchun ham muhimdir. Bugungi kunga kelib, tsitrus qo'zg'atuvchisi qo'ziqorinlari bir xil muhitda boshqa mikroorganizmlar bilan qanday o'zaro ta'sir qilishi va endofit mikroorganizmlarga yoki boshqa fitopatogenlarga qarshi hujum va himoya mexanizmlari qanday ekanligi haqida hech qanday ma'lumot yo'q. Ushbu ma'lumot mikroblarning o'zaro ta'sirida ishtirok etadigan yangi ikkilamchi metabolitlarning ochilishiga olib kelishi mumkin va infektsiya jarayonida mikrobial ekologiyaning ahamiyati haqida yaxshiroq ma'lumot beradi. Bu erda biz Penicillium digitatum va Penicillium citrinum o'rtasidagi o'zaro ta'sirni ko'rsatamiz, bu esa yangi izlashga qaratilgan.antifungalo'rim-yig'imdan keyingi kasalliklarni nazorat qilish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan birikmalar. Shu maqsadni hisobga olgan holda, ikkilamchi metabolitlarni ishlab chiqarishni rag'batlantirish va ularning o'zaro ta'sirida fazoviy taqsimotiga asoslangan biologik roli haqida dastlabki tushunchalarni berish uchun birgalikda madaniyat strategiyasi va MSI qo'llanildi. Qiziqarli metabolitlar ajratildi va barcha tuzilmalar Mass-spektrometriya va NMR tajribalari asosida aniqlandi. Shunga qaramay,antifungalYangi qo'ziqorin metabolitlarining potentsialini o'rganish uchun tahlillar va konfokal mikroskopiya tahlillari o'tkazildi.antifungalagentlar.

CHISTACHI O'TI

Materiallar va uslublar

Qo'ziqorin madaniyati.Tadqiqotlarda qoʻllanilgan Te P. digitatum (PD) shtammi CECT20796 qoʻshilish kodi ostida Ispaniya tipidagi madaniyat toʻplamiga (CECT) saqlanadi. P. citrinum (PC) shtammi Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Braziliya) tomonidan taqdim etilgan. P. digitatum va P. citrinum tijorat kartoshka dekstrozli agarda (PDA) (Acumedia) yetishtirildi. PDA 15 daqiqa davomida 103 KPa (121 daraja) da avtoklavlangan. PDA plitalari 25 daraja zulmatda 7 kun davomida saqlangan. Sporlar agar sirtini steril distillangan suv bilan yuvish va 106 yoki 105 spora mL-1 yakuniy konsentratsiyasiga suyultirish orqali yig'ib olindi.

Birgalikda o'sish sharoitlari qo'ziqorin spora eritmasi (106 spora ml-1) qarama-qarshi tomondan emlangan. Plitalar qorong'i joyda 25 daraja haroratda 7 kun davomida inkubatsiya qilindi.

MSI tahlillari va konfokal mikroskopiya uchun in vitro ko-kultura steril mikroskop slaydni Petri idishiga joylashtirish orqali tayyorlandi, keyin 11 ml PDA22 quyiladi va emlashlar mikroskop slaydlari ustida amalga oshirildi. Plitalar 72 soat davomida 25 daraja qorong'ilikda inkubatsiya qilindi. In vivo ko-kultura uchun etuk apelsinlar (Citrus sinensis) sirt sterilizatsiya qilingan va yaralangan23. P. citrinum o'z ichiga olgan kichik PDA bo'lagi yara joyiga emlangan. Infektsiyalangan va nazorat qilinadigan apelsinlar 500 ml steril stakanlarda 25 daraja qorong'ilikda saqlanadi. 10 kundan so'ng, mevalar P. citrinum inoculumning qarama-qarshi ekvator mintaqasida yaralangan va P. digitatum 106 spora mL-1 eritmasi bilan zararlangan. Mevalar 5 kundan ortiq qorong'i joyda 25 daraja haroratda saqlanadi.

Mass Spectrometry Imaging (MSI) tahlili va MS tasvirini yaratish.

Kuluçka muddati tugagandan so'ng, mikroskop slaydlari Petri idishlaridan olib tashlandi va agarni to'liq suvsizlantirish uchun 1 soat davomida vakuumli eksikatorga qo'yildi (Angolini va boshq., 2015). MSI tahlillari to'g'ridan-to'g'ri kokulturani o'z ichiga olgan mikroskopda, musbat rejimda, Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap bilan birlashtirilgan desorbsion elektrosprey ionlash (DESI) manbasi Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201 yordamida amalga oshirildi. Mass-spektrometr. MSI maʼlumotlari 70.000 m/z 200 massiv ajralish kuchi bilan olingan. Amaldagi DESI konfiguratsiyasi avvalgi ish bilan bir xil edi22. Tasvirlar Dm/z=± 0,07 quti kengligi bilan Firefly ma'lumotlarini o'zgartirish dasturi (2.1.05 versiyasi) yordamida yaratilgan va Novartis BioTibbiyot Tadqiqotlari Instituti tomonidan ishlab chiqilgan BioMap dasturi (3.8.0.4 versiyasi) yordamida qayta ishlangan. BioMap-da har bir tasvirni qayta ishlash jarayonida ranglarni masshtablash belgilangan qiymatga o'rnatildi. MS spektrlari Thermo Fisher Scientific tomonidan ishlab chiqilgan Xcalibur dasturi (3.0.63 versiyasi) bilan qayta ishlandi.

Birgalikda o'tkazilgan tajribalardan metabolitlarni ajratib olish.

In vitroda ko-kulturaning barcha tarkibi kichik bo'laklarga bo'linib, Erlenmeyer kolbasiga o'tkazildi. Ekstraksiya metanol yordamida amalga oshirildi. Kolbalar ultratovushli vannada 1 soat davomida ultratovushga o'tkazildi va vakuumli filtrdan o'tkazildi. Erituvchi pasaytirilgan bosim ostida olib tashlandi va oxirgi ekstrakt -20 darajada saqlanadi.

In vivo ko-kultura uchun apelsin po'stlog'i mikroorganizmlar orasidagi interfeys zonasida (2 sm × 2 sm) kesildi va ultratovushli hammomda 1 soat davomida 5 ml metanol bilan ekstraktsiya qilindi. Ekstraktlar filtrlanadi, N2 ostida quritiladi va -20 daraja haroratda saqlanadi.

Mass-spektrometriya tahlili (MS).

Ekstraktlar metanolda suyultirildi va Thermo Scientific QExactive® gibrid Quadrupol-Orbitrap massa spektrometrida tahlil qilindi. Tahlillar 115–1500 m/z diapazoni, 3,4 kV kapillyar kuchlanish, 280 daraja kirish kapillyar harorati, S-linza bilan musbat rejimda amalga oshirildi. 100V. 5 mkl namuna AOK qilindi. Statsionar bosqich: Termo Scientific ustuni Accucore C18 2,6 mkm (2,1mm×100mm). Mobil faza: 0,1 foiz chumoli kislotasi (A) va asetonitril (B). Eluent profili (A/B): 15 daqiqa ichida 95/5 dan 2/98 gacha, 5 daqiqa ushlab turing, 1,2 daqiqa ichida 95/5 gacha va 7,8 daqiqa ushlab turing. Umumiy ish vaqti har bir yugurish uchun 29 minut va oqim tezligi 0,2 mLmin−1 edi. In'ektsiya hajmi: 5 µL.MS/MS to'qnashuvdan kelib chiqqan dissotsiatsiya (CID) tomonidan 100–800 m/z diapazonida va to'qnashuv energiyasi 10 dan 50 V gacha bo'lgan diapazonda amalga oshirildi. Namunalar to'g'ridan-to'g'ri 5,0 µL min-1 oqim tezligi bilan elektrosprey bilan to'ldirilgan. MS va MS/MS ma'lumotlari Thermo Fisher Scientific tomonidan ishlab chiqilgan Xcalibur dasturi (3.0.63 versiyasi) yordamida qayta ishlandi.

CISTANCHE QO'SHIMCHALARINI FOYDA OLING: Immunitetni yaxshilang

Metabolitlarni ajratish (HPLC tahlili).

Ikkilamchi metabolitlarni ajratishga Phenomenex ustuni Luna 5µm Fenil-Geksil (25{{10}}×4,6 mm) va CBM bilan jihozlangan SHIMADZU taniqli HPLC LC-20AT{{6} yordamida erishildi. }Aloqa shinasi moduli, SPD-M20A fotodiodli massiv detektori va SIL-20Avtonamuna oluvchi. Mobil faza: suv (0,1 foiz chumoli kislotasi) (A) va asetonitril (B). Eluent profili (A/B): 50 daqiqa ichida 65/35 dan 50/50 gacha, 20 daqiqa ichida 40/60 gacha. Umumiy ish vaqti 70 minut va oqim tezligi 1,0 ml min−1 edi. In'ektsiya hajmi 5 µL edi. Preparatni HPLC tozalash Phenomenex ustuni Luna 5µm Fenil-Geksil (250×10mm)da Waters 2998 fotodiod massivi detektori va Waters fraksiya kollektori III bilan jihozlangan Waters 1525 Binary HPLC nasosi yordamida bir xil optimallashtirilgan gradient sharoitlarida amalga oshirildi. Oqim tezligi 4,7 mLmin-1 ga o'rnatildi va in'ektsiya hajmi 200 µL edi.

NMR spektroskopiyasi.

1H NMR, 13C NMR va 2D tajribalari Bruker Avance III 500 (1H 500.13MHz va 13C 125.7MHz) va Bruker Avance III 600 (1H 600.17MHz) da amalga oshirildi. Deyterlangan xloroform (CDCl3; 7,23 ppm), dimetil sulfoksid (DMSO; 2,50 ppm va 39,51 ppm) va tetrametilsilan (TMS; 0,0 ppm) erituvchi va ichki mos yozuvlar sifatida ishlatilgan. Kimyoviy siljishlar (d) (ppm) va ulanish konstantalari (J) Gerts (Hz) da ifodalangan.

Molekulyar tarmoq tahlili.

Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu) da onlayn ish oqimidan foydalanib, P. citrinum metabolitlari uchun molekulyar tarmoq yaratilgan. Ma'lumotlar m/z prekursorining ortiqcha /-17 Da ichidagi barcha MS/MS cho'qqilarini olib tashlash orqali filtrlandi. MS/MS spektrlari butun spektr boʻylab plyus /−50Da oynasida faqat eng yuqori 6 ta choʻqqini tanlab, oyna filtridan oʻtkazildi. Keyin ma'lumotlar konsensus spektrlarini yaratish uchun 0.2 Da va MS/MS fragmentlari ionlariga nisbatan 0.2Da tolerantligi bilan MS-Cluster bilan klasterlangan. Bundan tashqari, 2 dan kam spektrni o'z ichiga olgan konsensus spektrlari bekor qilindi. Keyin tarmoq yaratildi, unda chekkalar kosinus balli 0,65 dan yuqori va 2 dan ortiq mos cho'qqilarga ega bo'lish uchun filtrlanadi. Ikki tugun orasidagi keyingi chekkalar tarmoqda faqat tugunlarning har biri bir-birining eng o'xshash 10 ta tugunida paydo bo'lgan taqdirdagina saqlanadi. Keyin tarmoqdagi spektrlar GNPSning spektral kutubxonalariga qarshi qidirildi. Kutubxona spektrlari kirish ma'lumotlari bilan bir xil tarzda filtrlangan. Tarmoq spektrlari va kutubxona spektrlari o'rtasida saqlangan barcha mosliklar 0,5 dan yuqori ball va kamida 5 ta mos cho'qqiga ega bo'lishi kerak edi.

Antifungal tahlillar.

Ko-kultura ekstraktining birja eritmasi metanolda tayyorlandi va keyinchalik PDAda 0,5 mgml-1 konsentratsiyasigacha suyultirildi. Olingan eritmadan 15 ml Petri idishiga quyiladi, so‘ngra agar plastinka markazida 105 sporali mL-1 P. digitatum eritmasidan 15 ul inokulyatsiya qilinadi. Nazorat tahlili ham o'tkazildi. Plitalar 96 soat davomida 25 daraja qorong'ilikda inkubatsiya qilindi. Uchunantifungaltahlillar natijasida 2,5 ml PDA 6, 9 va 10 (400 µgmL−1) bilan to‘ldirildi va har bir eritma 6-quduqli mikroplastinkaga quyiladi. 105 sporali mL−1 P. digitatum eritmasidan 5ul har bir agar plastinaning markaziga sepildi. Salbiy nazorat uch nusxada amalga oshirildi. Mikroplastinka 96 soat davomida 25 daraja qorong'ilikda inkubatsiya qilindi. 1 va 4 birikmalarining minimal inhibitiv kontsentratsiyasini (MIC) aniqlash uchun Klinik va Laboratoriya Standartlari Instituti (2008)24 tavsiyasiga ko'ra, bir nechta o'zgartirishlar bilan mikro bulonni suyultirish tahlili o'tkazildi. 1 va 4 ning zaxira eritmalari suvda (5 foiz metanol) tayyorlandi va keyinchalik YES muhitida 600 mkg mL-1 dan 1 mkg mL-1 gacha bo'lgan konsentratsiyalar oralig'ida suyultirildi. Har bir eritmaning 195 ulsi 96-quduq mikroplyonkasiga oʻtkazildi, soʻngra 5 ul 105 sporali mL−1 P. digitatum eritmasi inokulyatsiya qilindi. Tahlillar ikki nusxada va nazorat uch nusxada amalga oshirildi. Musbat nazorat sifatida itrakonazol (100 mkgmL-1) ishlatilgan. Salbiy nazorat YESda metanol bilan amalga oshirildi. Mikroplastinkalar 96 soat davomida 25 daraja qorong'ilikda inkubatsiya qilindi.

Konfokal lazerli skanerlash mikroskopiyasi.

Kuluçka muddati tugagandan so'ng, mikroskop slaydlari Petri idishidan olib tashlandi. In vitro ko-kultura namunalari 20 daqiqa davomida Kongo qizil (0, suvda 25% w/v) bilan bo'yalgan va distillangan suvda qisqa muddat yuvilgan. Namunalar Leica TCS SP5 mikroskopi bilan tahlil qilindi. Qo'zg'alish He-Ne lazerining 543 nm emissiya chizig'i orqali amalga oshirildi va 570 va 680 nm oralig'ida chiqarilgan yorug'lik to'plandi.

FOYDACISTANCE: Immunitetni yaxshilash

Natijalar va muhokama

MSI P. digitatum va P. citrinum o'rtasidagi o'zaro ta'sirda potentsial antifungallarni ochib beradi.

Yangisini ko'rish uchunantifungaltsitrus mevalarini himoya qilish va o'rim-yig'imdan keyingi kasalliklarni nazorat qilish potentsialiga ega bo'lgan birikmalar, biz P. digitatum va boshqa sitrus patogeni P. citrinumni o'z ichiga olgan hamkorlik strategiyasini qo'lladik. Birgalikda madaniyat - bu mikroorganizmlar o'rtasidagi raqobat yangi metabolitlarni ishlab chiqarishga olib kelishi mumkin bo'lgan tabiatdan ilhomlangan strategiya. Oldingi ishda Trichophyton rubrum va Bionectria ochroleuca o'rtasidagi birgalikda etishtirish PS-990 ning yangi sulfatlangan analogini ishlab chiqarishni keltirib chiqardi, bu esa qo'ziqorinlarning o'zaro ta'sirida bu birikma yanada sulfatlanganligini ko'rsatadi26. Shuningdek, zamburug'larning o'zaro ta'siridan olingan birikmaning yana bir misoli tetrapeptid siklo-(L-leysil-trans-4-gidroksi-L-prolil-D-leysil-trans-4-gidroksi-L-prolin) ajratilgan. Phomopsis sp.ning hamkorlikdagi bulonidan. K38 va Alternaria sp. E33; siklik tetrapeptid tijorat fungitsidi triadimefon27 bilan solishtirganda fitopatogen zamburug'larga nisbatan o'rtacha va yuqori darajada inhibitiv faollik ko'rsatdi. Shunday qilib, birgalikda etishtirish tajribalari asosiy sitrus fitopatogenlarini, ayniqsa, P. digitatum keltirib chiqaradigan yashil mog'orni inhibe qila oladigan birikmalarni topish uchun maqbul yondashuvdir.

Ikkala apelsin (in vivo) va sintetik muhitda (in vitro) birgalikda o'stirishda biz P. citrinum va P. digitatum o'rtasida uzoq masofali o'sish inhibisyonini vizual tarzda kuzatdik. Zamburug'larning o'zaro ta'sirida jim genlar faollashishi va zararli metabolitlarni bir sherikdan ikkinchisiga zararsizlantirish mumkin16,28. Tese tomonidan qo'zg'atilgan metabolitlar odatda qo'shma madaniyatlarning qattiq muhitida qarama-qarshilik zonasida lokalizatsiya qilinadi16. Biroq, suyuq (LC-MS) yoki gaz (GC-MS) xromatografiyasi bilan bog'langan massa spektrometriyasi kabi metabolitlarni aniqlash va tushuntirish uchun qo'llaniladigan muntazam yondashuvlar molekulalarning fazoviy taqsimoti haqida ma'lumot bermaydi.

Molekulyar fazoviy taqsimot haqida ma'lumotni massa spektrida aniqlangan har bir ion uchun tasvirlarni yaratuvchi kuchli vosita bo'lgan massa spektrometriyasi (MSI) yordamida olish mumkin16. Mikrob tizimlari va ularning ikkilamchi metabolitlarini tushunish uchun MSI dan foydalanish yangilik emas va bu usul muvaffaqiyatli qo'llanilgan tadqiqotlarni adabiyotlarda topish mumkin30. Masalan, MSI Bacillus subtilis 3610 va Streptomyces coelicolor A3 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tekshirish uchun qo'llanilgan. Bakterial koloniyalarning DESI tasviri fazoviy ravishda bakterial koloniyalarda lokalizatsiya qilingan 57 ta signalni aniqladi, bu surfaktin va plipastatin kabi ba'zi ikkilamchi metabolitlarni aniqlashga olib keldi31. Bundan tashqari, MSI tahlili shuni ko'rsatdiki, S. coelicolor B. subtilis ishtirokida inhibe qilingan ma'lum ikkilamchi metabolitlarni ishlab chiqarishga ega, bu bakteriyalar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni aniqladi31.

Shuning uchun, sitrus patogenlari o'rtasidagi o'zaro ta'sirda ishtirok etadigan ikkilamchi metabolitlarni aniqlash uchun biz DESI-MSI ni to'g'ridan-to'g'ri ko-kulturali agar yuzasiga qo'lladik, bu birikmalarning qarama-qarshilik zonasiga tarqalishini vizualizatsiya qilish uchun. MSI signallari ionlar uchun [M plus H] plus m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 459,1645, m/z 459,1645, m/z 62,08m3/z, m/z 62,08.9/z da olingan. z 527,2862, m/z 511,2894 va m/z 448,2938 (S1-S10-rasm). Biz qayd etilgan barcha ionlar zamburug'lar o'rtasidagi qarama-qarshilik zonasida aniqlangan va to'planganligini kuzatdik (1-rasm). Ushbu birikmalar qo'ziqorin va qo'ziqorin o'zaro ta'siri bilan bog'liq bo'lishi mumkin va potentsial yangi mikroblarga qarshi vositalar bo'lishi mumkin. m/z 625, 609, 527, 511 va 448 ionlar P. citrinum tomonidan ishlab chiqarilgan, m/z 519, 503, 475, 460 va 459 ionlari esa P. digitatumning qarshi hujumidek tuyuldi. , bu ikki sitrus patogenlari o'rtasidagi kimyoviy urushni ochib beradi. MSI tahlillari orqali in vitroda aniqlangan te ionlari apelsinlarni substrat sifatida ishlatgan holda in vivo (S11-S20-rasm) ko-kulturalar ekstraktida ham aniqlandi (2-rasm).

O'zaro ta'sirda ishtirok etadigan metabolitlarni tavsiflash uchun keng ko'lamli etishtirish tajribasidan ko-kultura ekstrakti olindi va MSI tahlillari orqali dastlab aniqlangan qiziqish birikmalari preparativ HPLC bilan ajratildi va tandem massa spektrometriyasi va NMR tahlillari orqali tavsiflandi.

DESI-MSI tahlillari natijasida olingan aniq massalar (1-jadval) orqali P. digitatum tomonidan ishlab chiqarilgan indol alkaloidlari mavjudligini tasdiqlash mumkin edi. Ionlar [M plus H] plus m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960 va m/z 459,1645 mos ravishda triptoquialanin A (1), trylanquiaine (tritolanin) ga mos keladi. 3), 15-dimetil-2-epi-fumikinazolin A (4) va deoksitriptokvialanon (5) (3-rasmda keltirilgan kimyoviy tuzilmalar). Ushbu birikmalar triptoquialaninlarning biosintetik yo'lining bir qismidir32 va avval yashil mog'or kasalligi bilan kasallangan apelsinlarning DESI-MSI tahlili paytida aniqlangan23. Murakkab 1 P. digitatum33 tomonidan ishlab chiqarilgan asosiy ikkilamchi metabolit sifatida xabar qilingan. Shunga qaramay, 1 ta biosintezni tartibga solish uchun mas'ul bo'lgan ushbu genning o'chirilishi P. digitatumning sitrusga qarshi patogenligida ishtirok etmasligini ko'rsatdi, chunki mutantlarning infektsiya qobiliyati o'zgarmagan34. Triptokvialaninlarning aniq biologik roli haligacha noma'lum34 va bu tadqiqot ushbu alkaloidlarning qo'ziqorin o'zaro ta'sirida ishtirok etgan holda triptoquialaninlarning yangi biologik faolligini ta'minlaydi. Ionning MS/MS si [M plyus H] plus m/z 625.3951 m/z 594.3533, 576.3427, 449.2430 va 431.2325 da boʻlaklarga hosil boʻldi (S21-rasm), xuddi shu fragmentatsiya uchun A6ning namunasi olingan (6) P. citrinum va Pseudoalteromonas sp. o'rtasidagi hamkorlikdagi madaniyatni o'z ichiga olgan tadqiqotda. OT5919. Shuningdek, GNPS ma'lumotlar bazasi m/z 625 dagi ion sitrin A bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi. Ushbu birikma uchun olingan tandem massa spektri ma'lumotlar bazasida yotqizilgan 6 ta tandem massa spektri bilan umumiy besh fragmentga ega (S22-rasm). Bundan tashqari, u Moree va boshqalar tomonidan bildirilgan sitrin A bilan o'xshash MS / MS parchalanish naqshini baham ko'radi. (2014). Xabar qilinishicha, sitrinidlar ko-kultura sharoitida koʻproq hosil boʻladi va birgalikda madaniyat interfeyslarida toʻplanadi, bu P. citrinumning boshqa mikroorganizmlarga qarshi mudofaa reaktsiyasini koʻrsatadi. o'zaro ta'sir. Biz MSI tahlili bilan dastlab aniqlangan m/z 609 dagi ion 6-aralashmaning bir xil klasterida (m/z 625) guruhlanganligini kuzatdik (S23-rasm), bu birikma sitriniga o'xshash metabolit ekanligini ko'rsatdi. Molekulyar tarmoq tahlilida tegishli metabolitlar bir xil klasterlarda guruhlangan, chunki ular o'xshash MS/MS spektriga ega.

m/z 609.4010 da [M plus H] plus ioni uchun olingan aniq massa C35H53N4O5 molekulyar formulali birikmaga mos keladi. Parchalanish namunasi m/z 578.3583, 464.2905, 451.2586 va 433.2482 da boʻlaklarga berdi (Qoʻshimcha S24-rasm). Tozalangan metabolit uchun olingan 1 H NMR va 1 H{17}} H COSY spektrlari (S25–S26-rasmlar va S1-jadval) Bian va boshq. (2013)37. Bu lotinda DH 4.0 da epoksid xarakterli signal yoʻq edi va dH 6.9 da vinil vodorod uchun signal kuzatilishi mumkin edi, bu epoksid guruhining yoʻqligi va sitrin A37 bilan solishtirganda qoʻsh bogʻlanish mavjudligini koʻrsatadi. Adabiyotda birinchi marta deoksisitrinadin A (7) mikroorganizm tomonidan ishlab chiqarilgan ikkilamchi metabolit sifatida qayd etilgan.

DESI-MSI tomonidan ionlar uchun [M plus H] plus m/z 527,2862 va 511,2894 da olingan aniq massalar mos ravishda C28H38N4O6 va C28H38N4O5 elementar tarkibiga ega bo'lgan birikmalarni ko'rsatdi. MS/MS m/z 511 dagi ion m/z 527 bilan solishtirganda o'xshash tuzilishga ega ekanligini aniqladi, faqat kislorod atomining yo'qligi bundan mustasno. Ionning m/z 527 da parchalanishi m/z 281, 247, 219, 182 va 120 fragmentlarni hosil qildi (S27-rasm), m/z 511 da ion m/z 265, 247, 261 hosil bo‘ldi. , va 120 (S30-rasm). Xuddi shu parchalanish modeli Penicillium canescens ning Phe-Val-Val-Tyr (8) tetrapeptidlari ketma-ketligi haqida xabar berilgan. Shunga qaramay, tetrapeptidlar 8 va Phe-Val-Val-Phe (9) yaqinda Penicillium roqueforti tomonidan ishlab chiqarilgan ikkilamchi metabolitlar sifatida qayd etilgan. Izolyatsiya qilingan birikmalarning 1 H va 13C NMR tahlillari (S28–S32-rasmlar va S{42}}S3 jadvallari) MS/MS orqali olingan natijalarni tasdiqladi va m/z 527 va m/z 511 da ionlar mos keladi degan xulosaga keldi. mos ravishda 8 va 9. Ushbu tetrapeptidlarning qo'ziqorin kimyoviy urushida ishlab chiqarilishi ajablanarli emas, chunki kichik peptidlar mikroblarga qarshi faolligi bilan mashhur40. Bu P. citrinumning ikkilamchi metabolitlari sifatida 8 va 9 ning birinchi hisoboti. Ion uchun [M plus H] plus m/z 448,2938 da aniq massa C28H38N3O2 molekulyar formulali birikmani taklif qildi, ikkinchi darajali metabolit xrizogenamid A (10) ning bir xil tarkibi (xato =-4,6 ppm). Murakkab 10 izolyatsiya qilindi va 1 H va 13C NMR tahlillari (S33-S34-rasm va S4-jadval) uning tuzilishini tasdiqladi; Bu xrizogenamid A ning zamburug'li o'zaro ta'siri haqida birinchi xabar. Murakkab 10 birinchi marta Penicillium chrysogenum № 005, o'simlik bilan bog'langan endofitik qo'ziqorinning ikkilamchi metaboliti sifatida xabar qilingan.Cistanche deserticola. Shuningdek, 10 P. citrinum shtammining ikkilamchi metaboliti sifatida qayd etilgan42. P. citrinum tomonidan ishlab chiqarilgan metabolitlarning tuzilmalari 4-rasmda keltirilgan.

Antifungal tahlillar.

Biz tekshirdikantifungalko-kulturada ishlab chiqarilgan metabolitlarning faolligi va P. digitatum ko-kultura ekstraktini o'z ichiga olgan agar muhitida emlangan. Nazorat bilan solishtirganda, biz P. digitatum radial o'sishining 67 foizga qisqarishini kuzatdik (S35-rasm), bu qo'ziqorin bilan kurashda ishtirok etgan metabolitlarning antifungal agentlar sifatida salohiyatga ega ekanligini ko'rsatadi. Ushbu gipotezani tasdiqlash uchun biz ajratilgan birikmalarni sinab ko'rdik va 6, 9 va 10 (400 µg ml-1) birikmalari nazorat bilan solishtirganda P. digitatum radial o'sishini mos ravishda 48 foiz, 41 foiz va 61 foizga kamaytirganini kuzatdik. (5-rasm), antifungal faollikni tasdiqlaydi. Sitrinidlar P. sitrinumning boshqa mikroorganizmlarga qoʻshma kulturalarga qarshi reaksiyasida ishtirok etishi aniqlangan, ammo ularning biologik muhitdagi biologik roli hozirgacha nomaʼlum19. Murakkab 6 Mycobacterium ulcerans MN209 da Buruli yaraga qarshi faolligi uchun sinovdan o'tkazildi, ammo qiziqarli MIC kuzatilmadi43; shuningdek, leykemiya va karsinoma hujayralariga qarshi 6 ning sitotoksik faolligi xabar qilingan44. Natijalarimiz adabiyotda sitrinarinlarning mikroblarga qarshi faolligi to'g'risidagi birinchi hisobot bo'lib, qo'ziqorin va qo'ziqorin o'zaro ta'sirida ushbu birikmalarning biologik roli haqida birinchi ma'lumotni berishi mumkin. Bundan tashqari, xrizogenamid A hech qachon mikroblarga qarshi vosita sifatida qayd etilmagan. Murakkab 10 neyrotsitlarga oksidlovchi stressdan kelib chiqqan hujayralar o'limiga qarshi himoya ta'sirini ko'rsatdi41, ammo adabiyotda 10 uchun boshqa biologik faollik haqida xabar berilmagan. D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr qo'llangan antifungal tahlillar ushbu tetrapeptidning B. subtitrlari va soya fitopatogeni Fusarium virguliforme 38 ga qarshi inhibitiv faollikka ega ekanligini aniqladi. Bundan farqli o'laroq, D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr yoki D-Phe-L-Val-D-Val-L mavjudligida E. coli, B. subtilis va S. cerevisiae inhibisyonu yo'q. -Fi kuzatildi39. Triptokvialaninlarning antifungal faolligi ham baholandi, chunki bu birikmalar P. digitatumning kimyoviy urushda P. citrinumga qarshi kimyoviy javobi bo'lib tuyuldi. Tryptoquialanines 1 va 4 sinovdan o'tkazildi va P. citrinumga qarshi antifungal faollikni aniqladi. 1 va 4 birikmalar MIK 300 µgmL-1 ga ega bo‘lib, P. citrinum spora ishlab chiqarishni inhibe qildi (S36-rasm). Bizning ma'lumotlarga ko'ra, bu triptoquialaninlarning mikroblarga qarshi faolligi haqidagi birinchi hisobotdir. Yaqinda 1 Ae ga qarshi insektitsid birikma sifatida ko'rsatildi. aegypti lichinkalari23; antifungal faollik P. digitatum virulentligi uchun bu birikmalar talab qilinmasa, triptoquialaninlarning sitrus-patogen muhitdagi roli haqida ko'proq tushuncha berishi mumkin.

FOYDACISTANCHE: Antibakterial

Kimyoviy urush P. digitatum hujayra devorini birgalikda madaniyatda o'zgartiradi.

Ikkilamchi metabolitlarning ta'sirini o'rganishqo'ziqorino'zaro ta'sir, birgalikda madaniyat namunalari Kongo qizil rangga bo'yalgan va konfokal lazerli skanerlash mikroskopida kuzatilgan. Kongo qizili odatda 1,4 bog'lanishni o'z ichiga olgan polisaxaridlarni bo'yash uchun ishlatiladi, masalan,qo'ziqorinhujayra devori komponenti xitin45,46. P. digitatum hyphae qarama-qarshilik zonasida (namuna) kuzatildi va interfeys mintaqasidan (nazorat) uzoqda joylashgan gifalar bilan taqqoslandi (S37-rasm). Nazorat gifalari bir xilda Kongo qizil rang bilan bo'yalgan, interfeys mintaqasidagi gifalar esa tartibsiz yamoqlar bilan o'zgartirilgan bo'yash naqshini ko'rsatdi (6-rasm). Xuddi shunday bo'yash naqshlari nokaut mutant zamburug'lar uchun olingan, ularda o'chirilgan genlar hujayra devorini tashkil qilishda rol o'ynagan; Natijada, mutantlar nuqsonli hujayra devorlari va tartibsiz bo'yashni ko'rsatdi25,46,47. Shunga qaramay, 36 daraja bilan ishlov berilgan P. ostreatus P89 uchun Calcofluor White bilan g'ayritabiiy bo'yash kuzatildi; yuqori haroratda o'zgargan xitin taqsimoti va hujayra devorining yaxlitligi48. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, P. digitatum hyphae, birgalikda madaniyat davomida tarqalgan metabolitlar bilan aloqada bo'lib, Kongo Qizil qo'ziqorin hujayra devori tuzilmalari bilan bog'langanligi sababli nuqsonli hujayra devoriga ega. Zamburug'li hujayra devori mikroblarga qarshi vositalarning jozibador maqsadi hisoblanadi, chunki ular sutemizuvchilar hujayralarida mavjud emas49,50. Xulosa qilib aytganda, mikroskopiya tahlili va antifungal tahlillar qo'ziqorinlarning o'zaro ta'sirida ishtirok etadigan metabolitlarning potentsialga ega ekanligini tasdiqlaydi.antifungalagentlari va bu fitopatogenlar xost uchun boshqa mikroorganizmlar bilan raqobat qilish uchun ishlab chiqilgan tabiatdagi mexanizm bo'lishi mumkin (7-rasm).

Xulosa

Yangi tabiiy mikroblarga qarshi vositalarni izlash butun dunyo qishloq xo'jaligiga hosildan keyingi kasalliklarning iqtisodiy ta'siri bo'yicha tabiiy mahsulotlarni tadqiq qilishning istiqbolli sohasidir. Bundan tashqari, fungitsidlarga chidamli qo'ziqorin shtammlarining paydo bo'lishi yangi kashfiyotlarga olib keladiantifungalsintetik birikmalarni almashtirish uchun vositalar juda muhimdir. Bir xil xost uchun raqobatlashadigan fitopatogenlar P. digitatum va P. citrinum o'rtasida birgalikda etishtirishdan foydalanib, biz qo'ziqorinlarning o'zaro ta'sirini kuzatdik. MSI texnikasi orqali biz mikroorganizmlar orasidagi interfeys zonasiga zararsizlantirilgan ikkilamchi metabolitlarni aniqladik. Triptokvialaninlar, sitrinadinlar, xirsogenamid A va tetrapeptidlar katta antifungal faollikni namoyish etdi, bu ko-kulturalar va MSI texnikasi yangi tabiiy mikroblarga qarshi vositalarni qidirishda yaxshi kombinatsiya ekanligini tasdiqlaydi.

Shu kungacha sitrus patogen zamburug'larining o'zaro ta'siri haqida hech qanday ma'lumot yo'q. Bizning ma'lumotlarimiz sitrus mikrobial ekologiyasida rol o'ynaydigan birikmalarni aniqladi. Bundan tashqari, biz o'rganilayotgan metabolitlarning katta salohiyatga ega ekanligini ko'rsatdikantifungalagentlari, chunki qo'ziqorin hujayra devorlari asosiy maqsadlaridan biri hisoblanadiantifungalbirikmalar. Sintetik fungitsidlar o'rniga tabiiy antifungal sifatida aniqlangan birikmalardan foydalanish qo'shimcha tekshirish kerak. Ushbu maqola yangi tadqiqot imkoniyatlarini ochadi va atrof-muhit va inson salomatligiga hissa qo'shadi, tabiiy manbalardan olingan birikmalardan foydalanish orqali qishloq xo'jaligi uchun xavfsizroq strategiyalarni izlashga yordam beradi.

FOYDACISTANCHI QO'SHIMCHA: Immunitetni yaxshilaydi