Antioksidant fermentlar, glutation peroksidaza, tiol peroksidaza va katalazaning melanin-dekolorizatsiya faolligi

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinxan Kim²· Uk Min Cho²· Ee Taek Xwang³· Hyung Seo Xvang⁴· Jiho Min¹

Abstrakt

Melanin terining rangini aniqlashning eng muhim omilidir. Go'zallik uchun terida allaqachon ishlab chiqarilgan melanin birikmalarini parchalash bo'yicha ko'plab tadqiqotlar olib borilmoqda. Ushbu tadqiqot lizosomal fraktsiyada uchta antioksidant ferment - glutation peroksidaza (GPX), tiol peroksidaza (TPX) va katalazaning melanin rangini kamaytirishga ta'sirini o'rgandi. Melanin eritmasi fermentlar va vodorod periks bilan ishlov berildi, so'ngra 48 soat davomida reaksiyaga kirishdi. GPX va TPX melaninni rangsizlantirdi va ular orasida GPX samaraliroq edi, ammo Katalaz samarali emas edi. GPX shuningdek, B16F10 melanoma hujayralarida melanin ishlab chiqarishni inhibe qildi. Deyarli barcha mikroorganizmlarda mavjud bo'lgan GPX reaktiv kislorod turlari tomonidan hujayraning himoya mexanizmida muhim rol o'ynaydi. Bundan tashqari, u sitotoksik emas edi, lekin melanin rangini rangsizlantirishda sezilarli darajada samarali bo'ldi. Shuning uchun biologik va mikrobiologik sohada uni terini oqartiruvchi kosmetikada qo'llash imkoniyati yuqori.

Kalit so'zlar Melanin · Glutation peroksidaza (GPX) · Tiol peroksidaza (TPX) · Katalaza · B16F10 · Lizosoma

Cistanche terini oqartiruvchi tarkibiy qismdir.

Kirish

Toza yuz zamonaviy odamlar uchun go'zallikning muhim elementlaridan biridir, ayniqsa osiyoliklar oq teriga ishtiyoq bilan qarashadi. Melanin birikmasi teri rangini aniqlashda eng muhim omil hisoblanadi. U qora yoki jigarrang rangga ega bo'lgan eumelanin va pushtidan qizil rangga olib keladigan feomelanindan ajralib turadi [1]. Melanin birikmasi epidermisning bazal qatlamida joylashgan melanotsit hujayralarida tirozin oksidlanishi bilan sintezlanadi; va bu pigmentning teridagi asosiy roli zararli ultrabinafsha nurlanishini blokirovka qilish orqali dermisni himoya qilishdir [2, 3]. Biroq, agar terida juda ko'p melanin birikmalari mavjud bo'lsa, bu terini qorong'i va iflos qiladi va melazma kabi giperpigmentatsiyaga olib kelishi mumkin [4].

Ushbu muammolarni hal qiladigan terini parvarish qilish kosmetikasi bilan bog'liq ko'plab tadqiqotlar o'tkazildi, ammo hozirda ishlab chiqilgan terini oqartiruvchi kosmetika vositalarining ko'pchiligi melanin sintezini bir necha mexanizmlar orqali inhibe qilish funktsiyasiga ega, masalan, tirozin oksidlanishini blokirovka qilish yoki ultrabinafsha nurlanishi. melanin sintezi [5]. Ushbu mahsulotlar samarali bo'lishi uchun uzoq vaqt talab etiladi va giperpigmentatsiya kabi o'ziga xos alomatlar uchun samarali emas [6]. Hozirgi vaqtda melaninni olib tashlashning odatiy usuli allaqachon ishlab chiqarilgan lazer bilan davolashdir [7]. Agar bunday muolajalarsiz ushbu muammolarni hal qila oladigan materiallar ishlab chiqilsa, ular biologik va kosmetika sohasida katta foyda keltiradi.

Oldingi tadqiqotlarda biz allaqachon ishlab chiqarilgan melanin birikmalarini rangsizlantirish yo'lini topishga harakat qildik. Lizosoma va melanin korrelyatsiyasiga oid tadqiqot hisobotlari mavjud. Differentsial keratinotsitlar, xususan, hujayra organellalarining miqdorini nazorat qiluvchi asosiy avtofagiya funktsiyalari turiga ko'ra tashqi melanosomalarni buzishi yoki peroksisoma kabi nuqsonli organellalarni olib tashlashi mumkin [8]. Sitoplazmadan lizosomalargacha bo'lgan avtofagik yo'l odam epidermalkeratinositlarida melanosomalarning parchalanishida muhim rol o'ynaydi [9]. Ushbu ma'lumotlar lizosomal o'ziga xos fermentlar melanin degradatsiyasiga hissa qo'shishini isbotlaydi. Ilgari biz lizosomal fraktsiyadagi fermentning melanin rangini pasaytiradigan faolligini topdik, bu peroksisomalar va lizosomalardagi chiqindi moddalar va hujayrali qoldiqlarni parchalash uchun gidrolizatlarni o'z ichiga olgan kompleks [10, 11]. Ushbu hujjat melanin rangini pasaytirish uchun lizosomal fraktsiyada tanlangan uchta ferment, glutation peroksidaza, tiol peroksidaza, katalaza ta'sirini o'rgandi. Ushbu peroksidazalar reaktiv kislorod turlari (ROS) tomonidan kelib chiqqan hujayra shikastlanishidan himoya qiladi va barcha eukaryotlarda mavjud [12].

Reaktiv kislorod turlari (ROS) hujayralardagi kislorodning normal metabolizmining tabiiy mahsuloti sifatida hosil bo'ladi va atrof-muhit ta'sirida ko'payishi mumkin. Yuqori darajada ishlab chiqarilgan ROS hujayralarga zarar etkazishi mumkin. ROSning hujayraga zararli ta'siri quyidagilardan iborat [12, 13]: DNK yoki RNKning shikastlanishi, lipidlardagi ko'p to'yinmagan yog'li kislotalarning oksidlanishi, oqsillardagi aminokislotalarning oksidlanishi va kofaktorlarning oksidlanishi orqali o'ziga xos fermentlarning oksidlovchi deaktivatsiyasi. Hujayralar neytrallanadi. Bunday to'qimalarning shikastlanishini oldini olish uchun antioksidlanish tizimi bilan ROS. Ushbu tizimda metabolizm natijasida hosil bo'lgan superoksid-anion juda halokatli; Superoksid dismutaza (SOD) tomonidan vodorod peroksidga aylantirilgan bo'lsa-da, vodorod periks hali ham reaktivdir. Vodorod peroksid Katalaz tomonidan H2O ga aylanadi va GPX katalizi orqali glutationdan glutatyondisulfid (GSSG) ishlab chiqarishda iste'mol qilinadi. TPX GPX ga o'xshash ishlaydi [13].

Ushbu tadqiqot uchta antioksidant ferment, GPX, TPX va Katalazning melaninni rangsizlantiruvchi ta'sirini o'rgandi. Natijada, GPX va TPX melanin rangini kamaytirishda samarali bo'ldi. Ular orasida GPX melaninni rangsizlantirish faolligining optimal kontsentratsiyasida sitotoksiklikka ega emas edi va melanin sintezini samarali ravishda inhibe qildi. Shu sababli, bu GPX nafaqat antioksidant faollikni emas, balki lizosomal fraktsiyaning melanin rangini yo'qotish mexanizmida muhim rol o'ynashini isbotlaydi va yagona ferment sifatida yangi oqartiruvchi kosmetik vositaning potentsialini taklif qiladi.

Materiallar va uslublar

Peroksidaza va peroksidaza faolligini tahlil qilish

Uchta peroksidaza kontsentratsiyasi (Glutation peroksidaza, tiol peroksidaza va katalaza) Bioassay Systems'dan sotib olingan tahlil to'plami (Peroksidaza tahlil to'plami, D2PD-100, QuantiChromTM) orqali aniqlandi. Glutation peroksidaza 2(GPX2, NBP1-78,824, Novus) va tiol peroksidaza (TPX,NBP1-78,805, Novus) Novus va Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich) dan sotib olingan. ) Sigma-Aldrichdan sotib olingan.

Ushbu tahlil to'plami H2O2 va peroksidaza jarayonida rezorufin hosil qiluvchi elektron donor bo'yoqdan foydalanadi. Tahlil xona haroratida (RT) amalga oshirildi va rangning intensivligi 57 0 nm da o'lchandi. Peroksidazalar elektron donor bo'yoq bilan RT da 10 daqiqa davomida 0,6% vodorod periks bilan reaksiyaga kirishdi. Reaktsiyadan so'ng, to'xtatuvchi reagent qo'shildi va namunaning absorbsiyasi mikroplastinka spektrofotometriyasi bilan o'lchandi. Faoliyat quyidagicha hisoblandi:

Peroksidaza faolligi=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reaktsiya hajmi(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Namuna hajmi(𝜇L)

(U/L). Fermentning bir birligi (U) tahlil sharoitida daqiqada 1 mkmol rezorufin hosil bo'lishini katalizlaydi. Bu yerda RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN va RH2O mos ravishda Namuna, Namuna bo'sh, Resorufin va Suvning yutilishi; va n - namunani suyultirish omili. Ushbu tahlil uchun [Resorufin] 50 mkM. Reaktsiya hajmi 100 mkl va bu tadqiqotda namuna hajmi 10 mkl.

Glutation peroksidaza (GPX), tiol peroksidaza (TPX) va katalaza bilan melanin rangsizlanishi

Melanin eritmasi {0}}, 1 mM PBS (Fosfat tamponlangan sho'r suv, pH: 7,0) va tirozinni vodorod peroksid bilan oksidlash natijasida tayyorlangan melanin kukunini (Sintetik, Sigma) o'z ichiga oladi. Melanin tarkibi 450 nm da absorbans bilan o'lchandi. Melanin kontsentratsiyasini aniqlash uchun sintetik melaninning haqiqiy standartidan standart egri chizilgan (R2=0.999, ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Melaninning rangsizlanishini tekshirish uchun 1 mM vodorod periks bilan (50 dan 1000 gacha) mU/L peroksidazalarni (GPX, TPX, Katalaz) o'z ichiga olgan 100 ppm melanin eritmasi RTda reaksiyaga kiritildi va har kuni o'lchandi. Melaninning rangsizlanish qiymati reaktsiyadan keyingi melanin kontsentratsiyasini dastlabki qiymatdan ayirish yo'li bilan aniqlandi.

Cistanche melanin sintezini inhibe qiladi.

Hujayra madaniyati

B16F10 sichqonlari melanoma hujayralari (KCLB 80008) Korean Cell Line Bank (KCLB, Seul, Koreya) dan sotib olindi. Hujayralar 4500 mg/l glyukoza, 4 mM l-glutamin, 1 mM natriy piruvat, unga 10 foiz homila sigir zardobi (FBS), 20 mM HEPESll, 20 mM penitsilin, 4500 mg/l glyukoza, 4 mM l-glutamin, 1 mM natriy piruvat o'z ichiga olgan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) da o'stirildi. va hujayralar 37 daraja haroratda 5 foiz CO2 o'z ichiga olgan namlangan sharoitda inkübe qilingan. Muhit har 2 kunda almashtirildi (d) va hujayralar tripsin/EDTA eritmasi yordamida yig'ib olindi.

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish (MTT tahlili)

Glutation peroksidazaning B16F10 melanoma hujayrasiga toksik ta'siri namunaning yopishgan hujayraning hayotiyligiga ta'sirini aniqlash uchun ishlatiladigan umumiy usul bo'lgan MTT tahlili bilan tasdiqlangan. Ushbu tahlilda mitoxondrial tomonidan formazanga qaytarilishi mumkin bo'lgan 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromid (MTT) qo'llaniladi. jonli hujayradagi ferment. 3 × 103 hujayralar har bir quduqqa 96-quduq plastinkasiga ekilgan va 24 soat davomida inkubatsiya qilingan. Keyin har bir quduqqa namuna qo'shildi va 72 soat davomida inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, vosita 0,5 mg / ml MTT o'z ichiga olgan vositaga almashtirildi va 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, MTT bo'yoq reagenti olib tashlandi va hosil bo'lgan formazan DMSO tomonidan 30 daqiqa davomida eritildi. Nihoyat, formazan kontsentratsiyasi mikroplastinkali spektrofotometriya yordamida 570 nm da oʻlchandi. Hujayra hayotiyligi quyidagicha hisoblandi: hujayra hayotiyligi (foiz)=(namuna − Ablank)/(Acontrol − Ablank)*100.

hind tilida cistanche

Melanin tarkibini tahlil qilish

3 × 105 B16F10 xujayralari bir 6-quduq plastinkasiga ekilgan va yopishib olish uchun 24 soat davomida inkubatsiya qilingan. Har bir quduqning muhiti turli konsentratsiyali ferment va 10 nM -MSH bo'lgan bittasi bilan almashtirildi, keyin 72 soat davomida inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, barcha quduqlar DPBS buferi bilan yuvildi va 0,5 foizli tripsin/EDTA eritmasi yordamida yig'ib olindi. Santrifüj orqali olingan hujayralarning granulalari 10% DMSO o'z ichiga olgan 200 mL 1 N NaOH bilan 80 daraja 1 soat davomida lizing qilindi. Nihoyat, parchalangan melanin tarkibi 450 nm da absorbans bilan o'lchandi. Fermentning melanin ishlab chiqarishni inhibe qilish samaradorligi 100 mg / ml arbutin yordamida ijobiy nazorat bilan solishtirish orqali aniqlandi.

Natijalar

Glutation peroksidaza (GPX), tiol peroksidaza (TPX) va katalazaning peroksidaza faolligi

Ushbu tadqiqot in vitro va in vivo melanin birikmalarini rangsizlantirish uchun lizosomal fraksiya bilan davolashni qo'llash bo'yicha kengaytmali tadqiqotlardir. Oldingi tadqiqotda biz Hela hujayralari, S. cerevisiae, tovuq tuxumidan ajratilgan lizosomal fraksiya melanin rangini kamaytiradigan ta'sirga ega ekanligini aniqladik.melanin dekolorizatsiyasining samaradorligi lizosomal fraktsiyaning membrana bilan bog'lanmagan mikrosomal fraktsiyasining, shu jumladan lizosomalar va peroksisomalarning peroksidaza faolligi bilan bog'liq edi. Peroksidazalarning melanin rangini kamaytirish ta'sirini tasdiqlash uchun uchta peroksidaza tanlandi: glutation peroksidaza (GPX), tiol peroksidaza (TPX) va katalaza. Ushbu fermentlar hujayralardagi reaktiv kislorod turlaridan kelib chiqadigan oksidlovchi stressni kamaytirishda muhim rol o'ynaydi [14].

Ushbu fermentlarning faolligi tahlil to'plami (Peroksidaza tahlil to'plami, D2PD-100, QuantiChrom™) bilan aniqlangan. Bu usul peroksidaza reaktsiyasi jarayonida pushti rang hosil qiluvchi elektron donor bo'yoqning oksidlanishiga asoslangan edi [15]. Peroksidaza faolligi quyidagi birliklar yordamida ifodalangan: 1 birlik=1 U=tahlil sharoitida daqiqada 1 mkmol rezorufin hosil bo'lishi. 1-jadvalda uchta peroksidaza, GPX, TPX va katalaza faolligi va kontsentratsiyasi jamlangan.

Glutation peroksidaza (GPX), tiol peroksidaza (TPX) va katalazaning melaninni rangsizlantirish faolligi

Peroksidazalarning melaninni rangsizlantirish ta'sirini tasdiqlash uchun 1{12}}0 ppm melanin eritmasi 1 mM vodorod peroksid va har bir peroksidazaning (50 dan 1000 gacha) mU/L konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Namunalar RT da 2 kun davomida reaksiyaga kiritildi, so'ngra dastlabki konsentratsiya bilan solishtirildi. 1-rasmda 48 soatdan keyin melanin kamayishi ko'rsatilgan. 1-rasmda TPX va GPX melaninni rangsizlantirish faolligiga ega ekanligi haqidagi dalillar ko'rsatilgan. Katalaza melanin rangini kamaytirishga ta'sir qilmadi (1a-rasm). TPX melanin birikmalarini rangsizlantirishda samarali bo'ldi va samaradorlik 1 µU/mL konsentratsiyada ishlov berilganda eng yaxshi bo'ldi (1b-rasm). GPX shuningdek, melanin rangini pasaytirish faolligiga ega bo'lib, u 0,2 mkU/mL konsentratsiyada eng yaxshi bo'lgan va yuqori konsentratsiyalarda asta-sekin pasaygan (1c-rasm). Bu qiymat faqat vodorod periks bilan ishlov berilgan nazorat bilan solishtirganda, melanin rangining 175 foizga yaxshilanganligini bildiradi. GPX TPX bilan solishtirganda konsentratsiya va peroksidaza faolligi jihatidan samaraliroq edi. 0,2 µU/ml GPX va 1 mM vodorod periks bilan ishlov berishmelanin eritmasi 4 kun davomida 100 ppm melaninning 13 foizini rangsizlantirdi (1-rasm).2). Biroq, na GPX, na TPX vodorod peroksid yo'qligida rangni pasaytirish effektini ko'rsatmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

1-jadval Fermentlarning o'ziga xos ma'lumotlari, glutation peroksidaza 2, tiol peroksidaza va katalaza

Glutation peroksidaza (GPX) va H2O2on B16F10 hujayra hayotiyligi ta'siri

GPX ning B16F10 melanoma hujayralarining hayotiyligiga ta'siri melanin sintezini inhibe qilish testidan oldin MTT tahlili bilan tasdiqlangan. Davolash uchun vodorod periksning to'g'ri kontsentratsiyasini topish uchun sitotoksiklik turli konsentratsiyalarda 72 soat davomida vodorod periks bilan ishlov berish orqali baholandi. 0.1 mM konsentratsiyasida H2O2 hujayralarga 72 soat davomida hujayra zaharli ta'siriga ega bo'lmagan, 1 mM dan yuqori konsentratsiyada esa katta toksiklik kuzatilgan. (3a-rasm). GPX ning hujayra omon qolishiga ta'siri keyinchalik sitotoksik bo'lmagan 0.1 mM vodorod periks mavjudligida baholandi. GPX konsentratsiyasi 0,5 mU/ml dan past bo'lgan B16F10 hujayralariga sitotoksik ta'sir ko'rsatmadi, bu melanin rangsizlanish tadqiqotlarida samarali bo'ldi (3b-rasm).

1-rasmFaqat vodorod periksni davolash bilan solishtirganda melanin rangining nisbiy pasayishi.

B16F10 melanoma hujayralarida glutation peroksidaza (GPX) va H2O2on melanin sintezining ta'siri

Biz melaninni rangsizlantirishda eng samarali bo'lgan GPX ning mel-anotsitlarda melanin sinteziga ta'sirini o'rgandik. 4-rasmda har bir namuna bilan 72 soat davomida davolangan B16F10melanoma hujayralarida melanin miqdori ko'rsatilgan. 0,05 mkU/ml GPX va 0,1 mM H2O2 bilan davolash melanogenezni nazorat qilish bilan solishtirganda 43 foizga eng ko'p inhibe qilishga olib keldi (faqat -MSH bilan davolash). Bu ijobiy nazoratdan (Arbutin va -MSH bilan davolash) 153 foizga va fermentsiz vodorod peroksidga qaraganda 22 foizga yuqori edi, GPX bilan davolashda vodorod peroksid yo'qligida melaninning keskin pasayishi kuzatilmadi, shuningdek, bu fikrni tasdiqlaydi. (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Natijada, GPX melanin birikmalarini ishlab chiqarishni inhibe qildi, ammo hujayralardagi melaninsintezga GPX tomonidan vodorod peroksidetan ko'proq ta'sir ko'rsatdi.

Munozara

Ushbu tadqiqotda tadqiqotchilarimiz GPX, TPX va katalaza, hujayralardagi oksidlovchi stressni kamaytiradigan antioksidantlarning melanin birikmalarining rangsizlanishiga optimal kontsentratsiyasi va ta'sirini aniqladilar. Sintezlangan melanin birikmalaridan foydalangan holda hujayradan tashqari eksperimentlar natijasida GPX va TPX melaninni rangsizlantiruvchi ta'sirga ega, ammo Katalaz emas. Ligninni parchalovchi fermenti lakkaz, lignin peroksidaza kabi ba'zi zamburug'lar vodorod peroksid ishtirokida melaninni parchalashi mumkinligi haqida xabarlar mavjud [16-18]. Ushbu tadqiqot orqali barcha eukariotlarda va antioksidantlarda mavjud bo'lgan antioksidantlarning mavjudligi tasdiqlandi. ligninni buzuvchi fermentlar emas, melaninni rangsizlantiruvchi faollikka ega. GPX va TPX vodorod peroksid borligida melanin rangini ham kamaytirishi mumkin bo'lsa-da, bu fermentlar lizosomal fraktsiyaning melaninni rangsizlantirish mexanizmining asosiy komponenti sifatida harakat qilish imkoniyatiga ega.

Melanin rangini vitroda kamaytirish uchun eng samarali bo'lgan GPX melanin sinteziga ta'sirini aniqlash uchun B16F10 melanoma hujayralari bilan davolandi. B16F10 melanoma hujayralarida GPX melanin birikmalarining rangsizlanishida samarali bo'lgan konsentratsiyalarda sitotoksik emas edi va birgalikda ishlangan vodorod periks konsentratsiyasi 0,1 mM ni tashkil etdi, toksikligi yo'q. Vodorod periksni davolash melanin sintezini sezilarli darajada inhibe qildi va GPX bilan ishlashda preparatning konsentratsiyaga bog'liqligi yo'q bo'lganda samaradorlik yaxshilandi. Vodorod periks fermentlar tomonidan tez iste'mol qilinganligi sababli, ishlov beriladigan fermentning kontsentratsiyasi qanchalik yuqori bo'lsa, vodorod peroksid tomonidan melanin sintezining inhibisyonu shunchalik past bo'ladi, deb talqin qilish mumkin. GPX bilan davolashda vodorod peroksid yo'qligida melaninning keskin kamayishi kuzatilmagani ham bu fikrni qo'llab-quvvatlaydi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Natijada, GPX melanin birikmalarini ishlab chiqarishni inhibe qildi, ammo hujayralardagi melaninsintezga GPX tomonidan vodorod peroksidetan ko'proq ta'sir ko'rsatdi. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, antioksidant fermentlar melanosomalarni hazm qiladigan otofagiya mexanizmlarida melanin degradatsiyasini keltirib chiqaradi.

cistanche tabletkalari

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun bu yerni bosing.

Xulosa

Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, glutation peroksidaza (GPX) va tiol peroksidaza (TPX) melaninning rangsizlanishiga yordam beradi va GPX melanin sintezini samarali ravishda inhibe qiladi. Natijalar antioksidant fermentlar melanosomalarni hazm qiladigan otofagiya mexanizmlarida melanin degradatsiyasini keltirib chiqaradi degan gipotezani qo'llab-quvvatlaydi. Aniq bir xulosaga kelish uchun teri hujayralarida, keratinotsitlarda va melanotsitlarda melanosoma hazm qilish mexanizmini o'rganish talab qilinishi mumkin.