Turli xil Kadsura Coccinea ekstraktining foto-himoya va anti-melanogen xususiyatlari

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) va UVC (100–280 nm) bilan tavsiflangan quyosh ultrabinafsha (UV) nurlanishi sitotoksiklik, genotoksisite natijasida teri saratoni va foto qarishini keltirib chiqaradigan eng muhim ekologik omil hisoblanadi. , va fototoksiklik. Xususan, UVA va UVB nurlanishi kunlik UV nurlanishining mos ravishda 95% va 3% dan ortig'ini tashkil qiladi [8]. UVA va UVB nurlanishi terining epidermal va/yoki dermal qatlamlariga kirib, bilvosita yoki to'g'ridan-to'g'ri reaktiv kislorod turlarini (ROS) qo'zg'atishi mumkin, bu oksidlovchi shikastlanishga va hujayra o'limiga olib keladi. So'nggi o'n yilliklarda ultrabinafsha nurlanishi teri salomatligi uchun jiddiy muammoga aylandi va hanuzgacha butun dunyo bo'ylab xavfli tarqalmoqda [9-11]. UV nurlanishi keratinotsitlarning to'g'ridan-to'g'ri va izchil stimulyatori bo'lib, terining epidermis hujayralari massasining taxminan 95 foizini tashkil qiladi. Keratinotsitlar mikrobial, kimyoviy va jismoniy xavf-xatarlarga qarshi birinchi to'siq bo'lib ishlaydi va UVA va UVB nurlanishidan himoya qilishga yordam beradi. Keratinositlar UVA va UVB nurlariga ta'sir qilganda, hujayra ichidagi ROS hosil bo'ladi, bu esa apoptozni qo'zg'atadi [12-14].

Melanotsitlar teri epidermisining biologik himoyasida muhim rol o'ynaydigan melanin pigmentlarining ishlab chiqarilishi va miqdori uchun javobgardir; ularning disregulyatsiyasi giperpigmentatsiya yoki gipopigmentatsiya buzilishiga olib kelishi mumkin [15,16]. Melanotsitlar teri epidermisining bazal qatlamida tarqalgan bo'lib, ularga quyosh nuri ta'siri, reaktiv kislorod turlari (ROS) va melanotsitlarni ogohlantiruvchi gormonlar (-MSH) ta'sir qiladi [17,18]. Tirozinaza, mis oqsillari oilasining -3 tipidagi a'zosi, evolyutsion jihatdan saqlanib qolgan metalloprotein bo'lib, u melanogenez va monofenol monooksigenaza, katexolaz va difenollar faoliyatida hal qiluvchi rol o'ynaydi. Tirozinaza, tirozinaza bilan bog'liq protein-1 (TRP-1) va tirozinaza bilan bog'liq protein-2 (TRP-2) ning pastga regulyatsiyasi aniq katalitik ta'sirga ega. TRP{14}} 5,6-digidroksiindol-2-karboksilik kislota oksidazasi, TRP-2 esa DOPAxrom tautomerazadir [19,20]. Bundan tashqari, mioftalmoz bilan bog'liq transkripsiya omili (MITF) va cAMPga javob beruvchi elementni bog'lovchi protein (CREB) transkripsiya omillari bo'lib, ular asosan melanogenezni tartibga soladi va stimulyatsiya rejimi va intensivligi haqidagi ma'lumotlarni kodlaydi [17,21]. Ko'plab tadqiqotlar MITF va CREB yo'llari melanogenezni tartibga solishini ta'kidladi. MITF melanogenez bilan bog'liq fermentlarning transkripsiyasining asosiy omili va melanogenezning markaziy regulyatoridir. -MSH cAMP bilan bog'liq bo'lgan bog'lovchi protein (CREB) ishtirokidagi signalizatsiya mexanizmi orqali MITF ning ifodalanishiga olib keladi. Keyinchalik, MITF o'ziga xos melanogen genlar va fermentlarning transkripsiyasini rag'batlantirish uchun M-box ketma-ketligi (AGTCATGTGCT) bilan yadroga kiradi. Bundan tashqari, fosforlangan CREB Mitf transkripsiyasini ko'tarish uchun Mitf promouteridagi CRE konsensus elementi bilan bog'langan -MSH tomonidan rag'batlantirilishi ma'lum [21-24].

Ushbu tadqiqotda KC ildizi (KCR), poyasi (KCS), barg (KCL) va meva (KCF) ekstraktlari har tomonlama taqqoslandi va ularning fotoprotektiv va anti-melanogen xususiyatlariga ko'p baho berildi.

2. Materiallar va usullar

2.1. KC ekstraktlarini tayyorlash

Pusan ​​Milliy Universitetining Miryang kampusida 9 L plastik idishda uch yoshli KC 15 o'simligi o'stirildi. KC ushbu tadqiqot muallifi professor Young Whan Choi tomonidan aniqlangan. Ushbu namunalar vaucher namunalari sifatida (kirish raqami KC- PDRL-1) Pusan ​​Milliy Universitetining Tabiiy resurslar va hayot fanlari kolleji bog‘dorchilik biobiologiyasi bo‘limi gerbariyida saqlangan. Oʻsimliklar oʻtkazuvchanlik darajasi 1.0 mS·sm−1 boʻlgan va quyidagi elementlarni oʻz ichiga olgan (me·L−1 da): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; va S, 4. Portdagi KC xalati 2020 yil dekabr oyida ildizlar, poyalar, barglar va mevalarni tasniflash orqali yig'ib olindi (1A-rasm). Yig'ilgan namunalar zudlik bilan muzlatilgan quritgichda liyofilizatsiya qilindi va vinil qoplarda 20 ◦C da tahlil qilinguncha saqlanadi. KC (20 g) ning quritilgan ildizlari, poyalari, barglari va mevalari mayda kukun holiga keltirildi va xona haroratida etil spirti bilan ekstraksiya qilindi. Qisqacha aytganda, KC ning EtOH ekstraktlarini filtrlash va bug'lantirish 45 ◦C da past bosim ostida, so'ngra liyofilizatsiya bilan amalga oshirildi. Nihoyat, qattiq ekstrakt (50 mg/ml) keyingi tajribalar uchun dimetil sulfoksidda (DMSO) eritildi.

cistancheherba epimedium sagittatumekstrakti

2.2. KC ekstraktlarining umumiy polifenolik va flavonoid tarkibi

Yuqorida ta'riflanganidek [25], KC ildizi, poyasi, bargi va mevasi ekstraktlarining umumiy polifenol va flavonoid tarkibi Folin-Ciocalteu (umumiy polifenol) va alyuminiy xlorid (flavonoid) kolorimetrik usullar yordamida o'lchandi. Absorbsiya Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Buyuk Britaniya) yordamida 700 nm (umumiy polifenol) va VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Uoltham, MA, AQSh) yordamida 510 nm (flavonoid) da o'lchandi. .

Standart egri chiziqlar standart sifatida gallik kislota (umumiy polifenol) va quercetin (flavonoid) yordamida tuzilgan va natijalar KC ildizi, poyasi, bargi va meva ekstrakti va kversetin ekvivalentining grammiga (GAE/g) gallik kislota ekvivalenti sifatida ifodalangan. navbati bilan KC ildizi, poyasi, bargi va meva ekstraktining grammiga (QE/g).

2.3. DPPH va ABTS tahlili

KC ildizi, poyasi, bargi va meva ekstraktining ({0}},5 mg/ml) DPPH va ABTS radikallarini tozalash faolligi biroz oʻzgartirishlar bilan avvalroq tavsiflangan usul [25] boʻyicha oʻlchandi. KC ildizi, poyasi, bargi va meva ekstraktlari (0,5 mg/ml) mikroplastiklarda DPPH eritmasi (60 mM) bilan aralashtirildi. Namunalar kuchli silkitilgandan so'ng, ular qorong'i joyda 25 ◦C da 0,5 soat davomida saqlangan. 7 mM ABTS va 2,6 kaliy persulfatning zaxira eritmalari xona haroratida 18 soat davomida qorong'i joyda distillangan suvda tayyorlandi. KC ildizi, poyasi, bargi va meva ekstrakti (0,5 mg/ml) ishchi eritma bilan aralashtiriladi va keyin qorong'i joyda xona haroratida 0,5 soat turishga ruxsat beriladi. Namuna aralashmalarining absorbsiyasi 510 nm (DPPH) yoki 734 nm (ABTS) da kuzatildi.

2.4. Hujayra madaniyati

Birikkan keratinotsitlar (HaCaT) va yopishtirilgan melanotsitlar (B16F10) tarkibida 10 foiz FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, AQSH) va 1 foiz penitsillin/streptomiya o'z ichiga olgan DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, AQSH) kultura eritmasida emlangan. Corporation, Carlsbad, CA, AQSH) va 37 ◦C da 5 foiz CO2 bilan o'stirilgan. Yopilgan HaCaT va B16F10 hujayralarining o'sishi muntazam ravishda kuzatildi va vosita har ikki-uch kunda o'zgartirildi. Logarifmik o'sish bosqichidagi hujayralar keyingi tajribalar uchun ishlatilgan.

2.5. UVA va UVB nurlanishi

Keratinotsitlar UVA yoki UVB nurlanishiga (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Germaniya) 5 8 Vt trubkalar bilan ta'sir ko'rsatdilar, ular energiyaning katta qismini 365 nm da emissiya cho'qqisida chiqaradi. UVA) yoki 312 nm (UVB). UVA nurlanish dozalari 20 J/sm2 va UVB nurlanish dozalari 50 mJ/sm2 edi.

2.6. CCK-8 va LDH tahlillari orqali hujayra hayotiyligi va sitotoksikligini o'lchash

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish uchun HaCaT keratinotsitlariga CCK-8 tahlil to'plamidan (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) Hujayralarni hisoblash to'plami-8 (CCK-8) eritmasi qo'shildi. va B16F10 melanoma hujayralari suspenziyalari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq va 37 ◦C da 4 soat davomida inkubatsiya qilinadi. Qisqacha aytganda, 2 104 hujayralar 24- quduq plastinkasining har bir qudug‘iga ekilgan va 5 foiz CO 37 ◦C da 24 soat davomida inkubatsiya qilingan. Qisqacha aytganda, 2 104 hujayralar 24-quduq plastinkasining har bir qudug‘iga ekilgan va 5 foiz CO 37 ◦C da 24 soat davomida inkubatsiya qilingan. 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng har bir quduqqa CCK{19}} reagenti qo'shildi va hujayralar yana 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. HaCaT keratinotsitlar madaniyati muhitida hujayradan tashqari laktat dehidrogenaza (LDH) chiqarilishini aniqlash uchun sitotoksisiteni aniqlash to'plami (Roche Applied Science, Shveytsariya) ishlatilgan. Absorbsiya VICTOR Multilabel Plate Reader yordamida 450 nm (CCK-8) va 490 nm (LDH) da tahlil qilindi.

2.7. Keratinositlarda hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishni baholash

Hujayra ichidagi ROS darajalari {0}}(va-6)-xlorometil-2′,7'-dikxlorid-hidrofluoresein diasetat asetil ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific) yordamida tahlil qilindi. Waltham, MA, AQSH). Barcha protseduralar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Qisqasi, KC boshqa qisman ekstraktlar (0,5 mg/ml) bilan ishlov berishdan so'ng, Keratinositlar (HaCaT) fosfat tamponlangan tuz (PBS) bilan yuvildi va CM-H2DCFDA (5 mkM) bilan 0,5 soat davomida inkubatsiya qilindi. qorong'u. Shundan so'ng, hujayra ichidagi ROS hosil bo'lishi Carl Zeiss floresan mikroskop yordamida vizualizatsiya qilindi; floresan intensivligi oqim sitometri (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, AQSh) yordamida floresan bo'yoq (CM-H2DCFDA) asosida o'lchandi.

2.8. Apoptoz tahlili

Ta'sir qilish va davolashdan so'ng, HaCaT keratinotsitlari tripsinlangan va santrifüj qilingan. Keyinchalik, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, olingan hujayralarning apoptozi flüoresan izotiyosiyanat (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, AQSh) yordamida baholandi. Qisqacha aytganda, keratinotsitlar ikki marta PBS bilan yuvildi va aneksinni bog'lash tamponidagi keratinotsitlar olindi va FITC/Annexin V (komponent A) va propidium yodid (PI) ishchi eritmasi bilan aralashtirildi. Xona haroratida qorong'ida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, keratinotsitlar apoptozisi o'lchandi va apoptotik hujayralar foizi oqim sitometri (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, AQSh) yordamida hisoblandi. FL1 (FITC/Nexin V) va FL3 (PI) kanallari uchun signallar aniqlandi va bo'yalgan hujayralarning kvadrant marker binoni va nuqta chizmalari o'rnatildi.

2.9. Hujayra ichidagi melanin tarkibi va tirozinaz faolligini tahlil qilish

Hujayra ichidagi melanin tarkibi va tirozinaza faolligi tahlillari biroz o'zgartirilgan protsedura qaerdan farq qilishini tushuntirish orqali o'lchandi [24]. Melanositlar 48 soat davomida 0,5 mkM -MSH yakuniy konsentratsiyasi va 0,5 mg/mL KC boshqa qisman ekstraktlar bilan ishlov berildi. Melanosit granulalari 1 soat davomida 80 ◦C da 10% DMSO tarkibida 1 N NaOH bilan lizing qilindi. Nisbiy melanin tarkibi VICTORMultilabel Plate Reader yordamida 475 nm da absorbansni o'lchash orqali aniqlandi. Hujayra ichidagi tirozinaza faolligi L-DOPA yordamida dopaxrom ishlab chiqarish tezligini o'lchash yo'li bilan aniqlandi. Melanositlar muzdek sovuq PBS bilan yuvildi va 1 foiz (h/v) Triton X-100 o'z ichiga olgan PBSda lizing qilindi. Tirozinaz substrati L-DOPA (2 mg / ml) bir xil fosfat lizis tamponida tayyorlangan. Har bir ekstrakt 96-quduq plastinkasiga joylashtirildi va L-DOPA eritmasini qo‘shish orqali ferment tahlili boshlandi. 1 soat davomida inkubatsiyadan so'ng, dopaxrom ishlab chiqarishni tahlil qilish uchun VICTOR Multilabel Plate Reader yordamida absorbans 475 nm da o'lchandi. Har bir o'lchov qiymati nazoratning foizi sifatida ifodalangan. Arbutin (A, 0,5 mg/ml) ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan.

Cistancheechinacosidetirozinaz inhibitori hisoblanadi.

2.10. Miqdoriy real vaqtda PCR

Jami RNK melanotsitlarning har bir guruhidan RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germaniya) yordamida ajratilgan. Teskari transkripsiya cDNKning birinchi zanjirini olish uchun ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq yuqori sig'imli cDNA teskari transkripsiya to'plami (Thermo Fisher Scientific, Mayami, OK, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Keyin iplar Bio-Rad Chromo4TM asbobi va SYBR Green qPCR master aralashmasi (Thermo Fisher Scientific, Mayami, OK, AQSh) yordamida real vaqtda miqdoriy PCR (qRT-PCR) uchun shablon sifatida ishlatilgan. PCR 95 ◦C da 5 daqiqa davomida oldindan denatürasyon ostida, 95 ◦C da 15 soniya davomida denatürasyon va 55-58 ◦C da 30 soniya davomida tavlanish ostida amalga oshirildi. GAPDH mRNK tirozinaza, TRP-1 va TRP{14}} mRNK uchun ichki ma'lumotnoma sifatida ishlatilgan. Nishon gen ifodasining nisbiy qiymati=2−∆∆CT. Primer ketma-ketliklari quyidagicha edi: tirozinaz-sezgi (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3'), tirozinaz-anti-sezgi (5'-tggtgcttcatgggc aaaatc-3'), TRP-1-sezgi (5" ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sezgi (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sezgi (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP{38}}antisense (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sezgi (5′-aggtggtctcctctgacttc-3') va GAPDH-antisense (5′-taccaggaaatgagctt) -3').

2.11. Western Blotting

Melanotsitlar sutemizuvchilar oqsilini ekstraksiya qilish reagenti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) yordamida yig'ib olingan va lizislangan. Barcha protseduralar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Barcha oqsil kontsentratsiyasi Bio-Rad oqsil tahlili to'plami (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida aniqlandi. So'ngra, yuklash buferi oqsil supernatantiga qo'shildi va aralashtiriladi. Aralash 10 daqiqa qaynatiladi va oqsillar Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida ajratildi va Hybond poliviniliden diftorid membranasiga o'tkazildi (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, AQSh). Immunodetatsiya tirozinaza (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), fosforlangan CREB(p-CREB 1) yordamida amalga oshirildi: 1000), CREB(1:1000) va -tubulin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverli, MA, AQSh) SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) yordamida. Membran bir kechada birlamchi antikorlar bilan 4 ◦C da inkubatsiya qilindi. Echkiga qarshi quyon (IgG) ikkilamchi antikori (1:5000, hujayra signalizatsiya texnologiyasi) membranaga qo'shildi va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Protein bantlari kuchaytirilgan Pirs ECL western blotting substrati (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSH) yordamida kuzatildi va maqsadli oqsil tasmasi intensivligining -tubulin tasmasi intensivligiga nisbati sifatida miqdoriy belgilandi.

2.12. Statistik tahlil

Barcha tahlillar mustaqil ravishda kamida uch marta takrorlandi. Barcha statistik parametrlar o'rtacha standart xato (SEM) sifatida taqdim etiladi. Statistik tahlillar bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) yordamida amalga oshirildi, keyin Dunnning post-hoc testi o'tkazildi. p < 0.01="" yoki="" p="">< 0,05="" qiymati="" muhim="" deb="">

flavonoidlar uchun test

3. Natijalar

3.1. KC ning bir nechta qisman ekstraktining antioksidant xususiyatlarini taqqoslash

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 foiz) > KCF (8,7 ± 1,1 foiz) (1E-rasm).

3.2. UVA, UVB yoki nurlanishsiz KC ning bir nechta qisman ekstraktlari bilan ishlov berilgan yashovchan va shikastlangan keratinotsitlarni solishtirish

Biz KCR, KCS, KCL va KCF onkeratinositlarining ta'sirini o'rganish uchun quyidagi tajribalarni o'tkazdik. Birinchidan, barcha ekstraktlar UVA, UVB yoki nurlanishsiz HaCaT keratinotsitlariga qo'llanilgan. CCK-8 tahlili shuni ko'rsatdiki, ekstraktlar keratinotsitlar hayotiyligi konsentratsiyasini 0,5 mg/ml ni sezilarli darajada o'zgartirmagan. Keyinchalik, keratinotsitlar UVA yoki UVB nurlanishida KCR, KCS, KCL va KCF bilan ishlov berildi. UVA va UVB nurlanishi keratinotsitlar hayotiyligini sezilarli darajada inhibe qildi, CCK-8 2A-rasmda ko'rsatilgan. Biroq, biz UVA va UVB nurlangan keratinotsitlarning hayotiyligi quyidagi tartibda oshganligini aniqladik: KCL, KCR, KCS va KCF (2A-rasm). Shuningdek, hujayradan tashqari LDH chiqarilishini o'lchash orqali zararlangan keratinotsitlarni kuzatdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, UVA yoki UVB nurlanishi LDH chiqishini sezilarli darajada osonlashtirdi; biroq, KCL, KCR, KCS va KCF bu tartibda UVA yoki UVB ta'sirida LDH chiqarilishini sezilarli darajada susaytirdi (2B-rasm). Yuqoridagi eksperimental natijalar shuni ko'rsatdiki, UVA yoki UVB nurlanishining keratinotsitlarga antiproliferativ va sitotoksik ta'siri KCL, KCR, KCS va KCF tartibida yumshatilgan. Ta'kidlash joizki, KCL nazorat darajasini nazorat qilish uchun hujayra hayotiyligini tiklashi mumkin.

Shakl 2. UVA, UVB yoki nurlanishsiz KCR, KCS, KCL va KCF ekstraktining keratinotsitlarning hayotiyligi va sitotoksiklik ta'siri.

3.3. UVA va UVB nurlanishining mavjudligi yoki yo'qligida KC ning bir nechta qisman ekstrakti bilan ishlov berilgan keratinotsitlarda hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishni taqqoslash

ROS ning hujayra ichidagi ishlab chiqarilishi keratinotsitlarning jiddiy shikastlanishiga olib kelganligi sababli, ular UVA yoki UVB nurlanishidan kelib chiqadigan shikastlanishning potentsial vositachilari hisoblanadi. Bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, UVA yoki UVB nurlanishi endogen ROS ishlab chiqarishga olib keladi [12,14]. Biz UVA yoki UVB-nurlangan keratinotsitlarda endogen ROS darajasining oshganligini aniqlashni maqsad qildik. Shunga ko'ra, biz floresan mikroskopiya va oqim sitometriyasi yordamida CM-H2DCFDA probining hujayra ichidagi floresans intensivligini tahlil qildik. Floresan mikroskopiya natijasida CM-H2DCFDA bo'yalgan tasvirlari nazorat, KCR, KCS, KCL va KCF bilan ishlov berilgan keratinotsitlarda ozgina bo'yashni va UVA yoki UVB nurlangan keratinotsitlarda sezilarli bo'yashni ko'rsatdi (3A-rasm). Oqim sitometriyasining miqdoriy natijalariga ko'ra, UVA va UVB nurlanishi keratinotsitlardagi hujayra ichidagi ROS darajasini nazoratdagi (5,7) bilan solishtirganda mos ravishda 27,2 ± 4,5 foizga va 34,1 ± 4,2 foizga oshirdi. ±0,2 foiz ). Bundan tashqari, floresan mikroskopiya natijalariga o'xshab, hujayra ichidagi ROS darajasi UVA yoki UVB nurlanishining mavjudligida KCL> KCR> KCS> KCF tartibida KC ekstraktlari bilan bostirilganligi tasdiqlandi (3B-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, KC ning bir nechta qisman ekstraktlari endogen ROS darajasini pasaytirish orqali keratinotsitlar shikastlanishini sezilarli darajada inhibe qilgan.

Shakl 3. KCR, KCS, KCL va KCF ekstraktining UVA, UVB yoki nurlanmagan keratinotsitlarda hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarishga ta'siri

3.4. UVA va UVB nurlanishining mavjudligi yoki yo'qligida KC ning bir nechta qisman ekstrakti bilan ishlov berilgan keratinotsitlar apoptozini solishtirish.

Keratinositlar shikastlanishining ishonchli ko'rsatkichi bo'lgan apoptozni aniqlash uchun keratinotsitlar propidiy yodid bilan birgalikda Annexin V bilan bo'yalgan. Keratinositlarda apoptoz tezligini tekshirish uchun flüoresein izotiyosiyanat (FITC) Annexin V/O'lik hujayra apoptozi to'plami ishlatilgan. UVA va UVB nurlanishi Annexin V ni bo'yash faolligini osonlashtirdi, KCR, KCS, KCL va KCF esa UVA va UVB nurlanishida Annexin V bo'yash faolligini pasaytirdi. Faqat KCR, KCS, KCL va KCF (0.5 mg/mL) Annexin V bo'yash faolligini keltirib chiqarmadi. Oqim sitometriyasining miqdoriy ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, UVA va UVB nurlanishi keratinotsitlarning apoptoz darajasini 46,3 ga oshirdi.± 1,5 foiz va 48,7 foiz ± 1,0 foiz, mos ravishda, nazorat bilan solishtirganda (5,0 foiz) ± 0,7 foiz ). Muhimi shundaki, apoptoz darajasi UVA yoki UVB nurlanishida KCL > KCR > KCS > KCF tartibida KC ekstraktlari tomonidan bostirilganligi tasdiqlandi (4A, B-rasm). Umuman olganda, UVA va UVB nurlanishi keratinotsitlarning shikastlanishiga va KC ning bir nechta qisman ekstraktlari ultrabinafsha nurlanishidan kelib chiqqan keratinotsitlarning zaiflashishiga olib keldi.

Shakl 4. KCR, KCS, KCL va KCF ekstraktlarining UVA, UVB yoki nurlanmagan keratinotsitlardagi apoptozga ta'siri.

3.5. -MSH bilan davolash mavjud yoki yo'qligida KC ning bir nechta qisman ekstraktlari bilan ishlov berilgan melanotsitlarning hujayra ichidagi melanin tarkibi va tirozinaz faolligini taqqoslash

KCR, KCS, KCL va KCF ning MSH tomonidan qo'zg'atilgan melanogenezdagi biologik potentsialini o'rganishdan oldin, KCR, KCS, KCL va KCF (0.5 mg/mL) davolashdan so'ng hujayra hayotiyligi baholandi. -MSH bilan yoki bo'lmagan B16F10 melanotsitlarida CCK-8 tahlili. KCR, KCS, KCL va KCF (0,5 mg/ml) -MSH bor yoki yo'qligida hujayra hayotiyligini o'zgartirmadi (5A-rasm). -MSH melanokortin 1 retseptorlari bilan bog'lanish va adenilat siklazani faollashtirish orqali hujayra ichidagi melanin miqdorini oshirishi mumkin bo'lgan muhim melanogen agentdir. KCR, KCS, KCL va KCF ning melanotsitlardagi melanogenezga ta'sirini o'rganish uchun hujayra ichidagi melanin tarkibi vizual kuzatish va biokimyoviy o'lchovlar bilan aniqlandi. 5B-rasmda ko'rsatilganidek, hujayra ichidagi melanin miqdori -MSH tomonidan sezilarli darajada oshdi. Biroq, KCR, KCS, KCL va KCF bilan birgalikda davolash -MSH bilan davolash bilan solishtirganda hujayra ichidagi melanin tarkibining sezilarli darajada kamayganligini ko'rsatdi. Hujayra ichidagi melanin tarkibini inhibe qilishni ko'rsatadigan biokimyoviy o'lchovlar ketma-ketligi quyidagicha edi: KCL > KCR > KCS > KCF (5B-rasm). Hujayra ichidagi tirozinaza faolligi tahlili hujayra ichidagi melanin miqdori tahliliga muvofiq amalga oshirildi. -MSH-stimulyatsiya qilingan melanotsitlarning hujayra ichidagi tirozinaza faolligi oshdi, KCR, KCS, KCL va KCF bilan davolash qilingan -MSH-stimulyatsiya qilingan melanotsitlarning faolligi pasaydi. Hujayra ichidagi tirozinazaktivlikni inhibe qilishni ko'rsatuvchi biokimyoviy o'lchovlar ketma-ketligi quyidagicha edi: KCL > KCR > KCS > KCF (5C-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, KC ning bir nechta qisman ekstrakti hujayra ichidagi melanin tarkibini sezilarli darajada kamaytirdi va hujayra hayotiyligini o'zgartirmasdan tirozinaz faolligini inhibe qildi.

3.6. KC ning bir nechta qisman ekstrakti bilan ishlov berilgan melanotsitlarda tirozinaza, TRP-1 va TRP-2 ning transkripsiya va tarjima darajalarini bor yoki yo‘qligida solishtirish.- MSH bilan davolash

KCR, KCS, KCL va KCF ning melanogenez markerlarining (tirozinaz, TRP-1 va TRP-2) oqsil va mRNK ifoda darajalarini pasaytirishga ta'sirini o'rganish uchun melanotsitlar KCR bilan ishlov berildi. , KCS, KCL va KCF -MSH mavjudligi yoki yo'qligi. 6A–C-rasmda ko'rsatilganidek, tirozinaza, TRP-1 va TRP-2 ning mRNK darajalari -MSH bilan davolash orqali sezilarli darajada oshdi. Aksincha, -MSH davolash bilan solishtirganda, KCR, KCS, KCL va KCF tirozinaz, TRP-1 va TRP-2 ning mRNK ifodasini pasaytirdi. Bundan tashqari, faqat KCR, KCS, KCL va KCF tirozinaza, TRP-1 va TRP-2 mRNK darajalariga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. Western blot tahlili real vaqtda PCR bilan hamkorlikda amalga oshirildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, -MSH bilan davolash tirozinaza, TRP-1 va TRP-2 oqsillarini ifodalash darajasini oshirdi va bu darajalar KCR, KCS, KCL va KCF bilan birgalikda davolash orqali kamaydi (6D-rasm). ). Miqdoriy real vaqtda PCR va tirozinaz, TRP-1 va TRP-2 mRNK va oqsil ifodasini g'arbiy blotindikator inhibisyonu ketma-ketligi quyidagicha edi: KCL > KCR=KCS > KCF (rasm) 6). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, KC ning bir nechta qisman ekstraktlari melanogenez belgilarining pasayishi bilan ko'rsatilgan anti-melanogenezni rag'batlantirish potentsialiga ega.

3.7. -MSH bilan davolash mavjud yoki yo'qligida KC ning bir nechta qisman ekstraktlari bilan ishlov berilgan melanotsitlarning MITF ifodasi va CREB fosforillanishini taqqoslash

Tirozinaza, TRP-1 va TRP-2 melanogenezda muhim ahamiyatga ega. Ularning ifodasi MITFexpression va CREB fosforillanishi bilan tartibga solinadi [17,21]. Western blot tahlili shuni ko'rsatdiki, KCR, KCS, KCL va KCF -MSH bilan davolash natijasida kelib chiqqan MITF protein darajasining oshishini samarali ravishda inhibe qilgan. Bundan tashqari, KCR, KCS, KCL va KCF faqat MITF protein ifodasini deyarli aniqlay olmadi. MITF oqsilini ifodalash darajalarining inhibisyonini ko'rsatadigan miqdoriy hisoblangan western blot natijalari ketma-ketligi quyidagicha edi: KCL > KCR > KCS > KCF (7A-rasm). Bundan tashqari, KCR, KCS, KCL va KCF -MSH davolashning CREB fosforillanishiga ta'sirini o'zgartirdi. Faqatgina KCR, KCS, KCL va KCF CREB fosforillanishiga kam ta'sir ko'rsatdi. CREB fosforillanish darajasining inhibisyonini ko'rsatadigan miqdoriy hisoblangan western blot natijalari ketma-ketligi quyidagicha edi: KCL > KCR > KCS > KCF (7B-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatdiki, KC ning bir nechta qisman ekstraktlari MITF ifodasi va CREB fosforilatsiyasi orqali hech bo'lmaganda qisman melanogenez inmelanotsitlarini bostiradi.

4. Munozara

UV nurlanishining ko'payishi tufayli terini oqartirishning mashhurligi butun dunyo bo'ylab ortib bormoqda va kelgusi o'n yilliklarda estetik maqsadlarda yuqori nisbatlarga erishishi mumkin [8]. Kojik kislota va arbutin kabi ko'plab sayqallash vositalari kosmetika va farmatsevtika bozorlarida ishlatilgan. Bundan tashqari, tabiiy ekstraktlar potentsial antioksidant, yallig'lanishga qarshi, o'smaga qarshi, antibakterial va boshqa faolliklari tufayli tobora ortib bormoqda [26,27]. Antioksidantlar va fotoprotektiv va anti-melanogenez xususiyatlariga asoslanib, bir nechta kosmetik va farmatsevtik nomzodlar ishlab chiqilgan. Ma'lumki, oqartuvchi nomzodlarning bu xususiyatlari kosmetik va farmatsevtika tadqiqotlari va ishlanmalariga ajralmas hissa qo'shadi [28]. TDM ko'p komponentli va ko'p maqsadli xususiyatlarga ega va insonning biologik samaradorligi va hayot sifatini sezilarli darajada yaxshilaydi [29]. Zamonaviy fitokimyoviy tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, KC tarkibida turli xil ingredientlar mavjud bo'lib, asosiy tarkibiy qismlar lignanlar va terpenoidlardir [30]. Dibenzosi-klooktadien lignanlari, Spirobenzofuranoid dibenzotsiklooktadien lignanlari, arilnaftalin lignanlari, kadlongilakton triterpenoidlari va seskiterpenoidlar [31,32] kabi 202 dan ortiq birikmalar aniqlangan. KC ning quruq ildizlari, poyalari va barglari TDMda revmatoid artrit, o'n ikki barmoqli ichak yarasi, oshqozon-ichak kasalliklari va ginekologik muammolarni davolashda keng qo'llaniladi. KC ning quritilgan ildizlari, issiqlikni tozalash va toksinlarni yo'q qilish, shishni olib tashlash uchun diurezni keltirib chiqaradigan harakatlar bilan. KC mevalari asosan yangi mevalar, sharbatlar va mevali vinolar shaklida iste'mol qilinadi, bu ularning inson salomatligi uchun foydali ekanligini ko'rsatadi [7,33,34]. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, u yuqori ozuqaviy va dorivor ahamiyatga ega bo'lgan lignanlar, triterpenoidlar, flavonoidlar, fenolik kislotalar, steroidlar va aminokislotalar kabi bioaktiv moddalarga boy [3,35]. Ushbu tadqiqotda KC ning turli qismlari qazib olindi. Shunisi e'tiborga loyiqki, KC barglari va ildizlarida polifenol va flavonoidlarning umumiy miqdori poya va mevalarnikidan ancha yuqori edi. Barglari va ildizlarida poya va mevalarga qaraganda ikki baravar ko'p polifenollar va flavonoidlar mavjud. Natijada, biz umumiy polifenollar va flavonoidlar KC ning fotoprotektiv va anti-melanogen ta'siriga katta hissa qo'shadi deb hisoblaymiz.

UV nurlanishidan kelib chiqqan teri fototoksikligi, birinchi navbatda, hujayra sitotoksisitesi, hujayra ichidagi ROS to'planishi va keratinotsitlarda apoptoz bilan bog'liq. Shuning uchun UVA va UVB nurlangan keratinotsitlarda hujayra sitotoksikligini, hujayra ichidagi ROS to'planishini va apoptozni inhibe qilishga e'tibor qaratish maqsadga muvofiqdir [36,37]. Ushbu tadqiqotda [10,38] tasvirlanganidek, foto-sitotoksisite (UVA: 20 J/sm2, UVB: 50 mJ/sm2) natijalariga KC ekstrakti bilan aralashuv KC ekstraktlari hujayra sitotoksisitesini, hujayra ichidagi ROS to'planishini va apoptoz. Oldingi natijalarga muvofiq, KC barglari va ildizlarining foto-himoya ta'siri poya va mevalarga qaraganda ancha yuqori edi. Bundan tashqari, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, KC ekstraktlari antioksidant faollikni oshirish orqali yuqorida aytib o'tilgan ta'sirlarni ko'rsatadi. Melanogenez ko'pincha UV nurlanishidan keyin kuzatiladi va birinchi navbatda pigmentatsiya yoki giperpigmentatsiya bilan bog'liq [39]. Oldingi tadqiqotlarga ko'ra, -MSH yordamida melanogenezni qo'zg'atish usuli keng e'tirof etilgan va qo'llanilgan. Shuning uchun, bu tadqiqot -MSH [24,39] bilan rag'batlantirilgan melanotsitlar modelini qurishga asoslangan edi. Biz KC ekstraktlari -MSH tomonidan stimulyatsiya qilingan hujayra ichidagi melanin tarkibi va tirozinaz faolligini bostirishini aniqladik. Bundan tashqari, KC ekstraktlari tirozinaza, TRP-1 va TRP-2 kabi melanogenez belgilarining -MSH bilan ogohlantirilgan melanotsitlarda transkripsiyasi va tarjimasini pasaytirdi. Bundan tashqari, biz -MSH-stimulyatsiya qilingan melanotsitlarda MITF oqsilining ifodalanishi va CREB fosforillanishini tekshirdik. Xuddi shunday, ushbu tadqiqotda biz KC ekstraktlari melanotsitlarda -MSH vositachiligida MITF oqsilining ifodalanishini va CREB fosforillanishini bostirishini aniqladik. Fotoprotektiv natijalarga muvofiq, KC barglari va ildizlarining anti-melanogen ta'siri poya va mevalarga qaraganda ancha yuqori edi.

cistanche bo'laklari

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun bu yerni bosing.

5. Xulosalar

Umuman olganda, ushbu tadqiqotda KC ekstraktining potentsial fotoprotektiv va anti-melanogen ta'siri aniqlandi. Yuqori polifenol va flavonoid tarkibiga ega KC ekstrakti keratinotsitlar va melanotsitlarga foto-himoya va anti-melanogen ta'sir ko'rsatishi mumkin. Ushbu tadqiqot tabiiy oqartirish va fotoprotektiv vositalar uchun kosmetik va farmatsevtik aralashuvlar uchun mantiqiy va tadqiqot strategiyasini taqdim etadi.