1-QISM: Cistanche ekstraktlari yangi mutant DJ-1-transfektsion neyroblastoma uyali modellarida vodorod peroksid keltirib chiqaradigan neyrotoksiklikni yaxshilaydi

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com

1.KIRISH

Asosiy neyrodegenerativ kasalliklarga quyidagilar kiradiAltsgeymer kasalligikasallik, Parkinson kasalligi (PD), Huntington kasalligi va boshqalar. Ushbu kasalliklar orasida PD bilan kasallanish darajasi (Parkinson kasalligi) dunyoda ikkinchi o'rinda turadi va 60 yoshdan oshgan odamlarda 1 foizdan -2 foizga etadi (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). PDning asosiy nevrologik xarakteristikasi sifatida substantia nigra pars compacta tarkibidagi dopaminerjik neyronlar progressiv degenerativdir (Glizer va MacDonald, 2016), bu Lyui tanalari (Chjan, An, Chjan va Pu) deb ataladigan -sinuklein qo'shimchalarining paydo bo'lishi bilan birga keladi. , 2010). PD patogenezida klinikada dam olish titroqlari, qattiqlik, bradikineziya va postural buzilishlar PDning asosiy belgilari sifatida tashxis qilinadi. Dopaminerjik neyronlarning aniq progressiv degenerativ mexanizmlari tushunarsiz bo'lsa-da, atrof-muhit sabablari, shu jumladan insektitsidlar, neyrotoksik moddalar va og'ir metallar ta'siri yoki Parkin mutatsiyalari (Kitada va boshq., 1998), sinuklein (Polymeropoulos va boshqalar) kabi genetik sabablar. boshq., 1997) va DJ-1 (Biosa va boshq., 2017; Bonifati va boshq., 2003) PD paydo bo'lishiga olib keladi deb ishoniladi. Bugungi kunga kelib, DJ-1 gen mutatsiyasidan kelib chiqqan noto'g'ri mutatsiyalar, ramka o'zgarishi mutatsiyalari va katta fragmentlarni o'chirish soni 10 dan oshadi (Andres-Mateos va boshq., 2007; Bonifati va boshq., 2003; Hague va boshq., 2003). DJ-1 oqsilida Leucine166Proline (L166P) ni almashtirish muhim ahamiyatga ega. Bundan tashqari, oksidlovchi stress PDda paydo bo'lishi (Dexter va boshq., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley va Sontakke, 2009) va uning patogenezida ishtirok etishi ham ko'rsatilgan (Hague va boshq., 2003).

Sakkiz ekzonni o'z ichiga olgan DJ-1 geni 24 kb dan ortiq taqsimlanadi, odamlarda 1p36 xromosomasida joylashadi (Bonifati va boshq., 2003) va 189 aminokislotadan iborat yuqori darajada saqlanib qolgan oqsilni kodlaydi. Protein ThiJ/PfpI oilasiga tegishli bo'lib, homodimer shaklida mavjud. Korteks va substantia nigra va striatum ichidagi glial hujayralar DJ-1 oqsili hududlarida joylashgan asosiy hujayralardir (Olzmann va boshq., 2007). Ushbu hujayralarda DJ-1 quyidagi rollarni bajaradi, masalan, onkogen (Nagakubo va boshq., 1997), transkripsiyani tartibga solish (Kim va boshq., 2005; Niki, Takahashi-Niki, Taira, Iguchi-Ariga va Agria, 2003). ), antioksidant stress (Taira va boshq., 2004; Zhou & Freed, 2005), chaperon (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete va Abeliovich, 2004; Chjou, Zhu, Wioson, Petsko va Fink, 2006) va proteaz (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lis va Vud, 2003).

Neyrodegenerativ kasalliklarni davolash: cistanche ekstrakti

Cistanchean'anaviy xitoy tabobati bo'lib, asrlar davomida asosan andrologik kasalliklarni davolash uchun ishlatilgan. Asosiy faol moddalarCistanchefenil glikozidlar, jumladan 34 ta birikmalar, masalan, akteozid, echinakozid va boshqalar. Farmakologik ta'siriCistanche ekstraktlarijinsiy funktsiyani yaxshilash, qarishga qarshi, o'rganish va xotira qobiliyatini oshirish, neyroproteksiya, immunomodulyatsiya, charchoqqa qarshi, ishemik va jigarni himoya qilishni o'z ichiga oladi (Tu va boshq., 2011). Kofe kislotasi Cistanche ning asosiy metabolitlaridan biridir (Yan, 2018).

PD ning keng tarqalgan bo'lib qo'llaniladigan uyali modellari 1-metil-4-fenil piridiniy ioni bilan qo'zg'atilgan PC12 hujayralari (Abou-Sleiman va boshq., 2003) va vodorod peroksid (H2O2) tomonidan qo'zg'atilgan neyroblastoma (SH-SY5Y) hujayralarini (Zhang va boshqalar) o'z ichiga oladi. ., 2009). Biroq, bu modellarda PDning tipik patologik xususiyatlari mavjud emas. PD ning fiziologik jihatdan mosroq uyali modelini ishlab chiqish uchun ushbu tadqiqotda biz H2O2 bilan induktsiyalangan L166P va C106S DJ-1-transfektsion SH-SY5Y hujayralarini yaratdik va ularning ta'sirini o'rgandik.Cistanche ekstraktlariva asosiy bioaktiv birikmalar, jumladan, akteozid, echinacoside, kofein kislotasi vaCistanche umumiy glikozidlaribu ikki modelda, birinchi marta.

Cistanche ekstrakti neyrodegenerativ kasalliklarga qarshi

2. MATERIALLAR VA USULLAR

2.1|Plazmidlar, dorilar, kimyoviy moddalar va hujayralar

FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 plazmidlari va anti-DJ-1 poliklonal antikorlari Xokkaydo universiteti farmatsevtika fanlari oliy maktabi doktori Xiroyoshi Ariga tomonidan taqdim etilgan. Suvsizlangan minimal muhim vosita (MEM) va F-12 muhiti Gibco'dan sotib olingan. Lipofektin Invitrogendan olingan. FastDigest Xho I va FastDigest EcoR men Fermentasdan edim. Endotoksinsiz plazmid tayyorlash to'plami biotexnologiyadan edi. SH-SY5Y hujayra liniyasi Xitoy Tibbiyot fanlari akademiyasining Hujayra bankidan edi. BCA proteinini tahlil qilish reaktivi to'plami Pirsdan edi. PVDF membranalari Millipore'dan edi. Anti-FLAG poliklonal antikori GeneTexdan olingan.Cistanche ekstraktlari, jumladan akteozid, echinacoside, kofein kislotasi va Cistanche umumiy glikozidlari Pekin universiteti farmatsevtika fanlari fakultetining tabiiy dori-darmonlar bo'limi tomonidan ta'minlangan.

2.2|Plazmidlarni kuchaytirish, ekstraktsiyalash va tozalash

Escherichia coli JM109 xujayralari LB suyuq muhitida OD600=0.5 gacha yetishtirilgandan so'ng, kaltsiy xlorid usuli yordamida vakolatli hujayralar tayyorlandi. Keyin vakolatli E. coli issiqlik zarbasi usuli yordamida plazmid DNK bilan o'zgartirildi, shundan so'ng transformatorlar ampitsillin o'z ichiga olgan LB plitalarida 37 daraja haroratda 16-24 soat davomida o'stirildi. Muvaffaqiyatli o'zgartirilgan monoklonal koloniya tanlab olindi va 50 ug/ml ampitsillinni o'z ichiga olgan LB suyuq muhitida 37 daraja haroratda qo'shimcha 12 soat davomida yetishtirildi. Plazmidlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq endotoksinsiz plazmid tayyorlash to'plami yordamida ekstraksiya qilindi va tozalandi.

2.3|Plazmid identifikatsiyasi

Ekstraksiya qilingan plazmidlar enzimatik hazm qilishdan o'tkazildi, shundan so'ng plazmidlar va hazm qilingan qismlar 1 foizli agaroz jel elektroforezi yordamida tekshirildi. Olingan jel xona haroratida 20-25 daqiqa davomida EB eritmasida bo'yalgan va suratga olingan.

2.4|SH-SY5Y hujayralariga plazmid transfeksiyasi

Tozalangan plazmid DNK 10 foiz xomilalik sigir zardobini o'z ichiga olgan MEM/F-12 muhitida yetishtirilgan SH-SY5Y hujayralariga transfektsiya qilindi. Keyin transfektsiyalangan hujayralar 400 ug/ml G418 ni o'z ichiga olgan muhitda tanlab olindi, shundan so'ng 200 ug/ml G418 barqaror transfektsion hujayra chizig'ini saqlab qolish uchun ishlatilgan.

2.5|Western blot orqali transfektsion hujayralarni aniqlash

Transfektsiyalangan SH-SY5Y hujayralari RIPA buferida lizing qilindi. Lizat santrifüj qilingandan so'ng, supernatantdagi umumiy oqsil kontsentratsiyasi BCA protein tahlili reaktivi to'plami yordamida aniqlandi. Keyin teng miqdordagi protein ekstrakti 12,5 foizli SDS-poliakrilamid gel elektroforeziga duchor bo'ldi va PVDF membranasiga o'tkazildi. PVDF membranasi TBST eritmasida 5 foizli yog'siz quruq sut bilan to'sib qo'yildi va immunodeteksiya uchun qayta ishlandi. Anti-FLAG va anti-DJ-1 asosiy antikorlar sifatida ishlatilgan va HRP-konjugatsiyalangan IgG ikkilamchi antikor edi. Maqsadli oqsillarni aniqlash uchun kengaytirilgan xemiluminesansni aniqlash tizimi qo'llanildi.

2.6|Transfektsion hujayralarni immunotsitokimyoviy aniqlash

Transfektsion SH-SY5Y hujayralari 4 foizli paraformaldegid eritmasi bilan fiksatsiya qilindi, 0.3 foiz Triton X-100 eritmasi bilan o'tkazuvchanlashtirildi va 10 foizli echki zardobi bilan bloklandi. Bloklangan hujayralar avval anti-FLAG va anti-DJ-1 poliklonal antikorlari bilan, so'ngra FITC bilan konjugatsiyalangan echkiga qarshi quyonlarga qarshi ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. Hujayra yadrolari Hoechst 33342 bilan bo'yalgan va hujayralar teskari floresan mikroskop (IX-71, Olympus) ostida ko'rsatilgan.

2.7| Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

Transfektsiyalanmagan va transfektsiyalangan SH-SY5Y hujayralari 96- ekstraktlarga, jumladan akteozid, echinakozid, kofein kislotasi va Cistanche umumiy glikozidlariga (mos ravishda 1{6}}, 20 va 40 ug/ml) qo'shildi va hujayralar qo'shimcha 1 soat davomida 0,2 mM H2O2 bilan davolashdan oldin 6 soat davomida inkubatsiya qilindi. Muhit tashlandi va hujayra hayotiyligi yuqorida ta'riflanganidek MTT yordamida tekshirildi.

2.8|Cistanche ekstraktining hujayra hayotiyligiga ta'siri

ekstraktlar, shu jumladan akteozid, echinakozid, kofein kislotasi va Cistanche umumiy glikozidlari (hammasi mos ravishda 10, 20 va 40 ug/ml) qo'shildi va hujayralar 0,2 mM H2O2 bilan ishlov berishdan oldin 6 soat davomida inkubatsiya qilindi. qo'shimcha 1 soat. Muhit tashlandi va hujayra hayotiyligi yuqorida ta'riflanganidek MTT yordamida tekshirildi.

2.9|Statistik tahlil

Ma'lumotlar uchta mustaqil tajribaning o'rtacha ± SD sifatida ifodalanadi. Guruhlar orasidagi farqlar bir tomonlama ANOVA va SPSS 22.0 dasturi bilan LSD usuli yordamida tahlil qilindi. p < 0.05="" qiymatlari="" muhim="" deb="">

Cistancheo't

3|NATIJALAR

3.1|Plazmidlar muvaffaqiyatli o'zgartirildi va tozalandi. E. coli JM109da alohida ifodalangandan so'ng plazmidlar ekstraksiya qilindi va cheklovchi ferment bilan hazm qilingandan so'ng 1 foizli agaroz jel elektroforezi yordamida tekshirildi (1-rasm). 6,2 kb plazmidlar 5,4 va 0,8 kb chiziqli DNK bo'laklariga bo'lindi, bu L166P va C106S DJ-1 plazmidlari muvaffaqiyatli ifodalangan va tozalanganligini tasdiqladi.

3.2|Western blotting usuli bilan transfektsion hujayralarni aniqlash. 2-rasmda ko'rsatilganidek, biz FLAG-L166P DJ-1 va FLAG-C106S DJ-1 diapazonlarini taxminan 70 kDa aniqladik. Transfektsiyalangan SH-SY5Y hujayralarida FLAG-belgilangan oqsilning yuqori darajalari L166P va C106S DJ-1 mutantlari tegishli transfektantlarda kuchli ifodalanganligini ko'rsatadi.

3.3|Transfektsion hujayralarni immunotsitokimyoviy aniqlash. Anti-DJ-1 yoki anti-FLAG antikorlari bilan inkubatsiyadan so'ng transfektsion SH-SY5Y hujayralaridan kuchli lyuminestsent signallarni ko'rsatadi. Bu transfektantlarda ifodalangan L166P va C106S DJ-1 ning yuqori darajasini tasdiqlaydi.

3.4|Transfektsiyalangan hujayralar H2O2 ga o'tkazilmagan hujayralarga qaraganda ko'proq sezgir edi. H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} darajali konsentratsiyalari mavjud boʻlganda 1 soat davomida inkubatsiyadan soʻng. },5 va 1 mM), L166P yoki C106S DJ-1 bilan transfektsiyalangan SH-SY5Y hujayralarining hayotiyligi transfektsiyalanmagan hujayralarga nisbatan dozaga bog'liq ravishda kamaydi.

3.5|Cistanche ekstraktlari H2O2 sabab bo'lgan pasayishlarni inhibe qildi, SH-SY5Y hujayra hayotiyligini dozaga bog'liq holda davolash orqali inhibe qildi.Cistanche ekstraktlari, shu jumladan akteozid, echinacoside, kofein kislotasi va Cistanche umumiy glikozidlari (hammasi mos ravishda 10, 20 va 40 ug/ml).

Cistanche