1-qism: Cistanche Tubulosa feniletanoid glikozidlari gepatotsellyulyar karsinoma hujayralarining apoptozini qo'zg'atadi va antitumor ta'sirini kuchaytiradi

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Pengfey Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Chjou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Vang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, va Jinyao Li, PhD1

Abstrakt

Cistanche tubulosa xitoy o'simlik tibbiyotining bir turi bo'lib, turli biologik funktsiyalarni bajaradi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdikiCistanche tubulosa feniletanoid glikozidlari(CTPG) turli xil o'simta hujayralariga antitumor ta'sir ko'rsatadi. Biroq, CTPG ning HepG2 va BEL{1}} gepatotsellyulyar karsinoma (HCC) hujayralariga antitumor ta'siri haligacha tushunarsiz. Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, CTPG HepG2 va BEL{3}} hujayralarining o'sishini hujayra siklini to'xtatish va apoptozni qo'zg'atish orqali sezilarli darajada inhibe qilgan, bu p38, JNK ning yuqori tartibga solinadigan fosforillanishi bilan tavsiflangan MAPK yo'llarining faollashishi bilan bog'liq edi. va ERK1/2 va mitoxondriyal membrana potentsialining kamayishi bilan tavsiflangan mitoxondriyaga bog'liq yo'l. Sitoxrom c ning chiqarilishi va kaspaza -3, -7, -9 va PARPning bo'linishi keyinchalik CTPG bilan davolash orqali oshirildi. Bundan tashqari, CTPG matritsa metalloproteinaza-2 va qon tomir endotelial o'sish omillarini kamaytirish orqali HepG2 migratsiyasini sezilarli darajada bostirdi. Qizig'i shundaki, CTPG nafaqat splenotsitlarning proliferatsiyasini kuchaytirdi, balki sisplatin tomonidan qo'zg'atilgan splenotsitlarning apoptozini ham kamaytirdi. H22 o'simta sichqonchasi modelida CTPG sisplatin bilan birgalikda H22 hujayralarining o'sishini yanada inhibe qildi va sisplatinning yon ta'sirini kamaytirdi. Birgalikda CTPG to'g'ridan-to'g'ri antitumor ta'siri va bilvosita immunitetni kuchaytiruvchi ta'sir orqali HCC o'sishini inhibe qildi va sisplatinning antitumor samaradorligini oshirdi.

Kalit so'zlarCistanche tubulosa feniletanoid glikozidlari, apoptoz, MAPK yo'li, mitoxondriyaga bog'liq yo'l, sisplatin, immunitetni kuchaytirish

Cistanche o'smaga qarshi ta'sirga ega.

Cistanche mahsulotlari va Cistanches uchun bosing

Kirish

Jigar saratoni 2018-yilda dunyodagi eng koʻp tashxis qoʻyilgan saraton kasalligidan oltinchi oʻrinda va saraton kasalligidan oʻlimning toʻrtinchi asosiy sababi boʻlishi bashorat qilingan, Janubi-Sharqiy Osiyoda (Moʻgʻuliston, Kambodja va Vetnam) har yili taxminan 841 000 ta yangi holat va 782000 kishi oʻlim bilan kasallangan. .1 Xitoyda jigar saratoni 2015 yilda saraton bilan bog'liq o'limning uchinchi asosiy sababi edi.2 Dunyo bo'ylab birlamchi jigar saratonining 90 foizdan ortig'i gepatotsellyulyar karsinoma (HCC) hisoblanadi. Hozirgi vaqtda gepatektomiya, jigar transplantatsiyasi va perkutan ablasyon HCCni davolashning asosiy usullari hisoblanadi. Afsuski, bu muolajalar erta jigar saratoni tashxisi qo'yilgan bemorlarning 30 foizida samarali bo'ladi, o'tkir jigar saratoni tashxisi qo'yilgan bemorlar (40 foizni tashkil etadi) omon qolish vaqtini uzaytirish uchun palliativ davoga tayanishi kerak.3,4 Sorafenib jigar bilan birgalikda. arterial kimyoemboliya Osiyo-Tinch okeani mintaqasida rivojlangan HCC bilan og'rigan bemorlarning ko'pchiligi uchun muhim va keng tarqalgan palliativ terapiya hisoblanadi.5 Sorafenib, 2006 yilda FDA tomonidan rivojlangan jigar saratonini davolash uchun tasdiqlangan, o'simta hujayralari ko'payishi va qon tomirlarini inhibe qiluvchi ko'p kinaz inhibitori. ishlab chiqarish va o'simta hujayralari apoptozini rag'batlantiradi. Sorafenib bemorning yashash vaqtini sezilarli darajada 3 oydan 5 oyga uzaytiradi, lekin jiddiy yon ta'sirga ega va dori qarshiligining paydo bo'lishi bilan chambarchas bog'liqdir.6 Shu sababli, HCC uchun yangi dorilar yoki strategiyalarni ishlab chiqish zarur.

An'anaviy xitoy tibbiyoti (TCM) yakka o'zi yoki boshqa strategiyalar bilan birgalikda HCCni davolashda qo'llanilgan va omon qolish muddatini uzaytirish, hayot sifatini yaxshilash, salbiy reaktsiyalarni kamaytirish va hokazolarni o'z ichiga olgan klinik afzalliklarni ko'rsatdi.7,8CistancheO'z ichiga feniletanoid glikozidlar (PhGs), iridoidlar, lignin va polisakkaridlarni o'z ichiga olgan TCM bo'lib, ular turli xil biologik funktsiyalarga ega bo'lib, ular oksidlanishga qarshi, yallig'lanishga qarshi, qarishga qarshi, xotirani kuchaytirish va immunitetni kuchaytirish funktsiyalari sifatida qabul qilingan. Cistanche ning asosiy faol komponentlari bo'lib, ko'plab funktsiyalarga ega, jumladan, antioksidlanish, yallig'lanishga qarshi, apoptozga qarshi, gepatoproteksiya va neyroproteksiya.10-12 Bizning guruhimiz buni xabar qilgan edi.Cistanchetubulosa feniletanoid glikozidlari(CTPG) in vitro yoki in vivo tashqi yoki ichki signalizatsiya yo'llari orqali melanoma B16-F10 hujayralari, qizilo'ngach karsinomasi Eca-109 hujayralari va HCC H22 hujayralarining o'sishini inhibe qilishi mumkin; Bundan tashqari, CTPG immunostimulyator ta'sirga ega edi.13-15

Ushbu tadqiqotda biz CTPG ning HepG2 va BEL{1}} hujayralarida o'smaga qarshi ta'siri va mexanizmini in vitroda o'rgandik, CTPG ning in vitro va in vivo immunomodulyatsion funktsiyasini tahlil qildik va CTPG ning kimyoterapiya bilan birgalikda terapevtik ta'sirini qo'shimcha baholadik. in vivo HCC H22 o'simta sichqonlarida dori sisplatin. Biz CTPG mitoxondriyaga bog'liq apoptoz va MAPK signalizatsiya yo'li orqali HepG2 va BEL{4}} hujayralarining o'sishini inhibe qilishi mumkinligini aniqladik. CTPG matritsa metalloproteinaz-2 (MMP-2) ​​va qon tomir endotelial o'sish omili (VEGF) darajasini pasaytirish orqali HepG2 hujayralarining migratsiyasini sezilarli darajada inhibe qildi. Bundan tashqari, CTPG immunitet hujayralarining ko'payishi va faollashishiga yordam berdi va sichqonlarning immunitetini oshirdi. Muhimi, sisplatin bilan birgalikda CTPG in vivo H22 hujayralarining o'sishini yanada inhibe qilishi va sisplatinning nojo'ya ta'sirini kamaytirishi mumkin.

Cistanche immunitetni oshiradi.

Materiallar va uslublar

Hayvonlar

Taxminan 6-8 haftalik erkak BALB/c, Kunming sichqonlari va urg'ochi C57BL/6 sichqonlari Shinjon tibbiyot universiteti (Urumchi, Shinjon, Xitoy) Hayvon laboratoriya markazidan sotib olindi va xona haroratida Shinjon universitetining hayvonlar muassasasiga joylashtirildi. (RT) 25±3 daraja va 12/12 soat yorug'lik-qorong'i davr.

Hujayra chiziqlari va hujayra madaniyati

Sichqoncha H22 xujayralari Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Uxan, Xubey, Xitoy) dan sotib olingan va inson HCC HepG2 va BEL{2}} hujayralari Shinjon biologik resurslar va genetik muhandislik asosiy laboratoriyasidan olingan. Shinjon universiteti (Urumchi, Shinjon, Xitoy) va RPMI 1640 muhitida (Gibco, AQSh) yoki Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM) (Gibco) 10 foiz issiqlik bilan inaktivlangan homila sigir zardobida (MRC, Xitoy), 1 foiz L-da o'stirilgan. glutamin (100mM), 100U/ml penitsillin va 100ug/ml streptomitsin 37 daraja haroratda 5 foiz CO2 namlangan atmosferada.

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC)

CTPG ning asosiy birikmalari (Upbio Tech Co., Ltd., Shanxay, Xitoy) avval xabar qilinganidek HPLC tomonidan kvalifikatsiya qilingan va miqdori aniqlangan.13 ZORBAX SB-C18 ustuni (250×4,6 mm; 5 mkm) ishlatilgan. va mobil faza 23 foizdan 31 foizgacha bo'lgan gradient bilan 0,2 foiz chumoli kislota eritmasi va metanoldan iborat edi. Jami 10 mkl namuna AOK qilindi va 330 nm da aniqlandi. CTPG komponentlarini tahlil qilish uchun echinakozid va akteozid standartlari (Yuanye, Shanxay, Xitoy) ishlatilgan.

echinacoside

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

CTPG ning HepG2 va BEL{1}} hujayralariga antitumor ta'siri MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, -7404 yordamida baholandi. }}difenil-2-H-tetrazolium bromid). HepG2 va BEL-7404 hujayralari 96-quduq plitalari (5 × 104 hujayra/quduq) ichiga joylashtirildi va 0, 200, 400 va 600 ug/ml CTPG mos ravishda 24 va 48 soat davomida, 24 soatlik inkubatsiyadan keyin 37 daraja. Ijobiy nazorat sifatida taxminan 35 ug/ml sisplatin (Yuanye) ishlatilgan. Keyin har bir quduqqa 100 mkL MTT (0,5 mg/ml, FBS muhitisiz muhit bilan suyultiriladi) qo'shildi va 3 soat davomida 37 daraja va 5 foiz CO2 da o'stirildi. Inkubatsiyadan so'ng, plitalar 7 daqiqa davomida 1200 rpm tezlikda santrifüj qilindi, vosita olib tashlandi va hosil bo'lgan formazan kristallarini eritish uchun har bir quduqqa 200 ug / ml DMSO qo'shildi. OD490 qiymatlari 96-quduqli mikroplata o'quvchi (Bio-Rad Laboratories, CA, AQSH) tomonidan o'lchandi. CTPG ning splenotsitlarga ta'sirini baholash uchun hujayralar C57BL/6 sichqonlaridan ajratildi va 1 × 105 hujayra/quduq zichligidagi 96-quduq plitalariga qo'yildi. Splenotsitlar mos ravishda 0, 200, 400 va 600 ug / ml 24, 48 va 72 soat davomida davolandi. Hujayra hayotiyligi quyidagi formula bo'yicha hisoblab chiqilgan: Hujayra hayotiyligi (foiz)=(OD bilan ishlov berilgan/Odalanmay qolgan) × 100 foiz.

Ki-67ni aniqlash

Ki{0}} ni aniqlash avvalgi tadqiqotimizga muvofiq amalga oshirildi.16 Qisqasi, BEL-7404 hujayralari turli konsentratsiyalarda (0, 200, 400 va 600ug/ml) CTPG bilan ishlov berildi. yoki sisplatin (35ug/ml). 24 soatdan so'ng hujayralar yig'ib olindi va PBS bilan yuvildi, so'ngra ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Foxp3 binoni tampon to'plami (eBioscience, AQSh) bilan mahkamlandi va o'tkazuvchan bo'ldi. Hujayra ichidagi binoni FITC konjugatsiyalangan Ki-67 antikori (BD Biosciences, San-Xose, CA, AQSH) yordamida RT da 15 daqiqa davomida amalga oshirildi. Namunalar oqim sitometriyasi bilan tahlil qilindi (BD FACSCalibur, CA, AQSh).

Hujayra apoptozi va hujayra siklini tahlil qilish

HepG2 va BEL -7404 hujayralari 2,5 × 105 hujayra / tovoq zichligida ekilgan va bir kechada 37 daraja inkubatsiya qilingan. Hujayralar tripsinlanadi va 2 soat davomida turli konsentratsiyali CTPG bilan ishlov berilgandan so'ng santrifüjlash yo'li bilan yig'ib olindi yoki kaspaza inhibitori (Z-VAD-FMK) yoki kaspaza inhibitori (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Xitoy) bilan oldindan ishlov berildi. CTPG bilan davolash. 24 soatdan keyin apoptoz oqim sitometriyasi orqali aniqlandi. Qisqacha aytganda, to'plangan hujayralar sovuq PBS (Gibco) bilan yuvildi va 2,5 mkL Annexin V-FITC va 5 mkL PI-PE bo'yash eritmasi (Solarbio, Pekin, Xitoy) bilan aneksin bog'lovchi buferda qayta suspenziya qilindi va keyin hujayralar RT da inkubatsiya qilindi. qorong'i joyda 15 daqiqa. Hujayra siklining taqsimlanishini tahlil qilish uchun hujayralar CTPG bilan ishlov berishdan so'ng yig'ib olindi va 30 daqiqa davomida 4 daraja sovuq 70 foizli etanolda o'rnatildi. Hujayralar 30 daqiqa davomida qorong'ida PI (BD Biosciences) bilan bo'yalgan. Namunalar oqim sitometri (BD FACSCalibur) yordamida tahlil qilindi. Hujayra apoptozi va tsikl bilan bog'liq oqsillarning ifoda darajalari Western blot tomonidan aniqlandi.

Western Blot

Western blot bizning oldingi tadqiqotimizga ko'ra amalga oshirildi.17HCC 24 soat davomida CTPG bilan davolandi. Muzdek sovuq PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, barcha yopishgan va suzuvchi hujayralar yig'ildi va RIPA Lysis Buferida (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 20daqiqa muz ustida lizing qilindi. 10 daqiqa davomida 12000 rpm 4 daraja santrifüjdan so'ng oqsil kontsentratsiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, AQSH) yordamida aniqlandi. Proteinlarning bir xil konsentratsiyasi 12 foiz SDS-PAGE bilan ajratildi va PVDF membranalariga o'tkazildi. PBST buferi (0,05% Tween-20 bilan PBS) bilan yuvilgandan so'ng, membranalar 1 soat davomida 37 daraja haroratda 5 foiz yog'siz sut bilan bloklandi va keyin birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi (Cell Signaling Technology, MA, AQSh) to'g'ri seyreltmelerde bir kechada 4 daraja. PBST bilan 3 marta yuvilgandan so'ng, membrana mos keladigan HRP-konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar (eBioscience) bilan 2 soat davomida 37 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Maqsadli oqsillar ECL tahlil to'plami (Beyotime) yordamida aniqlandi. Kulrang skanerlash ma'lumotlari Image J tomonidan olingan.

Mitoxondriyal membrana potentsialini tahlil qilish (Dsm)

Dsm membrana o'tkazuvchan JC{1}} bo'yoq (Beyotime) bilan aniqlangan. Qisqacha aytganda, HepG2 va BEL{3}} hujayralari 24 soat davomida turli konsentratsiyali CTPG (0, 200, 400 va 600ug/ml) bilan ishlov berildi. Barcha hujayralar yig'ildi va JC-1 yuvish buferi bilan yuvildi. Hujayralar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq JC-1 lyuminestsent probi bilan RTda 20 daqiqa davomida bo'yalgan. PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, barcha namunalar oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur) bilan tahlil qilindi.

Hoechst 33342 binoni

Hoechst 33342 bo'yalishi avvalgi tadqiqotimizga ko'ra amalga oshirildi.16 Yadrolarning morfologik o'zgarishlari membranani o'tkazuvchi DNK bilan bog'lovchi bo'yoq Hoechst 33342 (Beyotime) yordamida tekshirildi. Qisqacha aytganda, hujayralar 6-quduq plastinkasida 2 ml muhitda 1×105 hujayra/quduq konsentratsiyasida emlangan. Qo'shilish 70% dan 80% gacha bo'lganida, hujayralar 24 soat davomida 200, 400 va 600 ug / ml CTPG yoki sisplatin bilan ishlov berildi. Hujayralar PBS bilan yuvilib, 4 foiz muzli paraformaldegid bilan 4 daraja haroratda 10 daqiqa davomida mahkamlangan. PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar 10 daqiqa davomida 4 daraja Hoechst 33342 bilan bo'yalgan. Namunalar floresan invertli mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E, Yaponiya) yordamida kuzatildi.

cistanche ekstrakti

Migratsiya tahlili

HCC hujayralari migratsiyasi yarani davolash tahlili orqali aniqlandi. Qisqacha aytganda, HepG2 xujayralari (2×104/quduq) 24-quduq plastinkasiga ekilgan. 8{16}} foiz qo‘shilishdan so‘ng, har bir quduqning o‘rtasi 20 mkl pipetka uchi bilan bir marta tirnalgan. PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar sisplatin (35ug / ml) yoki turli konsentratsiyali (0, 200, 400 va 600ug / ml) CTPG bilan 37 daraja haroratda ishlov berildi. 24 soatdan keyin har bir namunaning tasvirlari mikroskop ostida (Nikon Eclipse Ti-E) olindi. Hujayra migratsiyasining o'rtacha masofalari Image J tomonidan tahlil qilindi. Yaraning bitish foizi tenglama bo'yicha hisoblandi: yara bitishi (foiz )=(1−ko'rsatilgan vaqt nuqtasida tirnalgan joy/0 soatda tirnalgan maydon)×100 foiz. Hujayra migratsiyasi bilan bog'liq oqsillar MMP-2 va VEGFning ifoda darajalari Western blot yordamida aniqlandi.

Splenotsitlarning proliferatsiyasi va apoptozi

Proliferatsiya tahlili uchun splenotsitlar 3 ta C57BL/6 sichqonlaridan ajratilgan va CFSE (eBioscience) bilan bo'yalgan. CFSE etiketli hujayralar har bir quduq uchun 1 ml muhitda 2 × 106 hujayra zichligidagi 24-quduq plastinkalariga ekilgan va turli konsentratsiyali CTPG (200, 400 va 600 ug/ml) bilan ishlov berilgan yoki 35 ug bilan birlashtirilgan. 72 soat davomida / ml sisplatin. Oqim sitometriyasi tahlili CD3-APC va CD19-PE (BD Biosciences) bilan bo'yalganidan keyin amalga oshirildi. Apoptoz tahlili uchun splenotsitlar har bir quduq uchun 1 ml muhitda 2 × 106 hujayra zichligidagi 24-quduq plastinkalariga ekilgan va turli konsentrasiyalarda CTPG (200, 400 va 600 ug/ml) bilan ishlov berilgan yoki birlashtirilgan. sisplatin 24 soat davomida. Oqim sitometriyasi tahlili 2,5 mkL Annexin V-FITC va 5 mkl PI-PE eritmasi bilan bo'yalgandan so'ng amalga oshirildi.

In Vivo CTPG ning xavfsizlikni baholash va immunostimulyatorlik faoliyati

CTPG ning in vivo immunostimulyator faolligini baholash uchun 6-8 haftalik erkak Kunming sichqonlari tasodifiy ravishda 7 guruhga bo'lingan (5 sichqon/guruh). Teri ostiga yuborish (sk, 200, 400 mg/kg), qorin bo‘shlig‘iga yuborish (ip, 200, 400 mg/kg) va oshqozon ichiga yuborish (ig, 200, 400 mg/kg) har 2 kunda jami 7 marta qo‘llanilgan. , nazorat guruhi esa hech qanday davolanishni olmagan. Sichqonlar har kuni tortishdi va sichqonlarning holati har kuni kuzatildi. CTPG davolashdan so'ng sichqonlarning organlari ajratildi va tortildi. Organ indekslari quyidagi formula bo'yicha hisoblab chiqilgan: organ indeksi=organ og'irligi (mg)/tana vazni (g). Splenotsitlar to'plangan, hisoblangan va anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC yoki anti-CD4-APC, anti-CD{{ bilan bo'yalgan. 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Namunalar oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur) yordamida aniqlandi.

CTPG ning H22 o'simtali sichqonlarda sisplatin bilan birgalikda o'smaga qarshi samaradorligi Taxminan 6-8 haftalik erkak BALB/c sichqonlariga teri ostiga H22 hujayralari yuborildi (100 mkl PBSda sichqon uchun 1,{7}} × 106). O'simta hajmi taxminan 60 mm3 ga etganida, o'simtali sichqonlar tasodifiy 4 guruhga bo'lingan (6 sichqon / guruh) va sisplatin (4 mg / kg), CTPG (400 mg / kg), sisplatin (4 mg / kg) va CTPG ( 400 mg/kg) yoki davolashsiz (nazorat guruhi). O'simta sichqonlari 5, 7, 9, 11 va 13-kunlarda CTPG bilan intraperitoneal AOK qilingan. Sisplatin 7 va 11-kunlarda tomir ichiga yuborildi. O'simta hajmi va tana vazni har kuni o'lchanadi. O'simta hajmi quyidagicha hisoblandi: o'simta hajmi (V)=a × b2/2, bunda a va b mos ravishda nonius kaliper bilan o'lchangan o'simtaning eng uzun va eng qisqa diametrini bildiradi. 20-kuni organlar va o'smalar ajratilib, vazni o'lchanadi. Splenotsitlar to'plangan, hisoblangan va anti-CD3-APC va anti-CD19-PE yoki anti-CD4-FITC va anti-CD8-APC yoki anti-CD11b-PE va anti-Gr-1-APC yoki anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC va anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Keyinchalik, chastotalar va hujayralar soni oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur) bilan tahlil qilindi.

Cistanche o'smaga qarshi ta'sirini kuchaytiradi va immunitetni yaxshilaydi.

Qo'shimcha ma'lumot olish uchun rasmni bosing.

Statistik tahlil

Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± standart xato (SEM) sifatida ifodalangan. Statistik tahlil Prism5.0 dasturi yordamida bir/ikki tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) yordamida amalga oshirildi. P<.05 was="" considered="" statistically="">

2-QISM UCHUN SHU YERGA BOSING